BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur
dan sifat-sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir
tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di
suspensikan. Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah di identifikasi adalah dengan cara metode pengenceran atau pewarnaan.
Pewarnaan gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan
yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.
Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan
berikut : zat pewarna kristal violet, larutan iodin, larutan alkohol dan safranin.
Pada pengecatan bakteri dapat dibedakan menjadi tiga yaitu pengecatan
sederhana , pengecatan diferensial, dan pengecatan struktural. Pada praktikum
ini kami melakukan pengecatan diferensial. Pengecatan deferensial yaitu
dengan menggunakan kombinasi zat warna, hal ini berkaitan dengan perbedaan
kimia antar sel. Pengecatan ini mewarnai seluruh sel dari bakteri tipe tertentu.
Yang termasuk pengecatan ini adalah pengecatan gram karena dibagi menjadi
dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri
Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya
akan tampak berwarna ungu di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif
akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan
sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin
atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan
oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
B. Tujuan
Untuk menentukan gram positif dan gram negatif pada bakteri yang di uji.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
 Bakteri adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti
sel,bakteri berukuran sangat kecil dan memiliki peran besar dalam kehidupan
dibumi. Beberapa bakteri dikenal sebagai agen penyebab infeksi dan
penyakit,sedangkan agen lainnya bakteri dapat memberikan manfaat misalnya
dalam bidang pangan,pengobatan,dan industri. Adapun bentuk bakteri bermacam-
macam yaitu sebagai berikut :

Bakteri berbentuk bulat ( bola )

1. Bakteri bulat dinamakan juga kokus (coccus) dapat dibedakan atas :

a. Monokokus

b. Diplokokus

c. Sarkina

d. Sterpkokus

e. Stafilokokus

2. Bakteri berbentuk batang,b akteri berbentuk batang dinamakan basilus

(bacillus yang berarti batang). Bentuk basilus dapat pula dibedakan atas :

a. Basil tunggal

b. Diplobasil

c. Sterptobasil

3. Bakteri berbentuk melilit,bakteri berbentuk melilit,yang dinamakan

spirillum atau spiral. Ada 3 macam bentuk spiral,yaitu sebagai berikut :

a. Spiral
 b. Vibrio

c. Spirochaeta (Irianto,2006).

Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa
yaitu dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan
bergantung,menggunakan kondensor medan gelap dan lain-lain.Tetapi
pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat
bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal
tersebut maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwijoseputro, 2005).
Menurut Suriawiria (2006) ,pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba
banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara
tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah
untuk :

1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.

2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat
fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.
Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple
stain), pewarnaan khusus (special strain) dan pewarnaan diferensial (differential
strain). Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna
untuk mewarnai organisme tersebut. Pewarnaan khusus merupakan metode
pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti
bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan
Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum,
dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya.
(Aditya,2010).

Sedangkan Pewarnaan Diferensial (Gram) adalah Pewarnaan gram atau

metode gram adalah suatu metode empiris untukmembedakan spesies bakteri
mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dangram negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metodetersebut diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans ChristianGram (1853-1938)
yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untukmembedakan antara
Pneumococcus dan bakteri Klebsiella Pneumonia (Karmana,2008).

Menurut James (2002) ,pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu
gram positif dan gram negatif,tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta
safranin atau Kristal violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium
perfringens, Staphylococcusaureas,sedangkan bakteri gram negatif misalnya
adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan
gram, misalnya Mycobacterium sp , karena dinding selnya mengandung banyak
lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada
pewarnaan tersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan
berwarna hijau.

BAB III
METODE

A. Alat dan Bahan

Alat : - Gelas benda

- Gelas penutup
 - Pipet tetes
- Jarum ose
- Tabung reaksi
- Spiritus
- Mikroskop
- Tisu

Bahan : - Kultur murni Bacillus subtilis .

- Kultur murni Eschericia coli.
- Kristal violet
- Larutan Iodin
- Safranin
- Larutan Nacl fisiologis 0,85%
- Air
- Alkohol

B. Prosedur Kerja

Masing-masing kultur murni disiapkan terlebih dahulu(Bacillus subtilis

pada medium agar, dan Eschericia coli pada medium cair).

Gelas benda dan gelas penutup disterilkan dengan alkohol, lalu dikeringkan
dengan tisu.

Kultur murni Bacillus subtilis diletakkan diatas gelas benda menggunakan

jarum ose yang disterilkan dengan spirtus. Lalu diteteskan dengan larutan
Nacl fisiologis.

Kultur murni Eschericia coli diteteskan pada gelas benda sebanyak 3 tetes
menggunakan pipet tetes.

Kedua gelas benda difiksasi diatas nyala api sampai mengering.

Preparat diteteskan dengan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit.
Kemudian dibilas dengan dikeringkan.

Preparat diteteaskan dengan larutan Iodin dan dibiarkan selama 1 menit.

Kemudian dibilas dan dikeringkan.

Gelas objek dimiringkan, lalu disemprot dengan alkohol sampai warna biru
tidak luntur lagi.

Preparat diteteskan dengan safranin, dibiarkan 2 menit lalu dibilas dan

dikeringkan.

Bagian yang ada preparatnya ditutup dengan gelas penutup dan diamati
dibawah mikroskop lalu hasil pengamatan dari pengecatan gram dicatat.

BAB IV
 HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL

Parameter Gram(+) Gram(-)

Bentuk sel Coccus coccus

warna : merah
warna : biru keunguan ciri lain : kurang rentan
Pengamatan mikroskop
ciri lain : rentan penisilin
penisilin

Morfologi koloni Rantai rantai

Pembesaran 4x 100x

Gambar Gram (+)

Gambar Gram (-)

B. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini kami menggunakan pengecatan diferensial

.Pengecatan diferensial menggunakan kombinasi zat warna, hal ini berkaitan
dengan perbedaan kimia antar sel. Pengecatan ini mewarnai seluruh sel dari
bakteri tipe tertentu. Yang termasuk pengecatan ini adalah pengecata Gram.
Pengecatan Gram termasuk pengecatan diferensial karena dapat digunakan untuk
membedakan bakteri dalam dua kelompok besar, yaitu bakteri Gram Positif dan
Gram negatif.
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan
gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram
negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.

Ciri-ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif yaitu :

Gram positif :1) Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal
atau monolayer,2) Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),
peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan
lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat,3) Bersifat lebih rentan
terhadap penisilin,4) Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna
seperti ungu kristal,5) Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit,6) Lebih
resisten terhadap gangguan fisik,7) Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut,8)
Tidak peka terhadap streptomisin , 9)Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Gram negatif : 1)Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga
atau multilayer, 2)Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%),
peptidoglikan terdapat didalam, 3)Lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah
sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat, 4)Kurang rentan
 terhadap senyawa penisilin, 5)Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat
warna dasar misalnya kristal violet,6)Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif
sederhana, 7)Tidak resisten terhadap gangguan fisik, 8)Resistensi terhadap alkali
(1% KOH) lebih pekat, 9)Peka terhadap streptomisin, 10) Toksin yang dibentuk
Endotoksin.

Pada praktikum pengecatan Gram ini kita menggunakan bakteri Bacillus

subtilis dan Eschericia colli dengan menggunakan zat warna kristal violet,larutan
iodin, alkohol dan safranin . Hal pertama yang dilakukan adalah menyiapkan
masing-masing kultur murni (Bacillus subtilis pada medium agar, dan Eschericia
colli pada medium cair) lalu, gelas benda dan gelas penutup disterilkan dangan
alkohol agar bebas dari lemak dan debu dan dikeringkan dengan menggunakan
tisu. Kemudian kultur murni Bacillus subtilis diletakkan diatas gelas benda
menggunakan jarum ose yang disterilkan dengan spirtus, dengan cara
dipijarkan(dilewatkan) diatas apinya. Lalu diteteskan dengan larutan Nacl
fisiologis . Kultur murni Eschericia colli diteteskan pada gelas benda 3 tetes
menggunakan pipet tetas. Kemudian kedua gelas benda difiksasi diatas nyala api
sampai mengering. Preparat diteteskan dengan kristal violet dan dibiarkan selama
1 menit .Kemudian dibilas hingga kering(pembilasan bertujuan untuk mengurangi
kelebihan zat warna pada kristal violet) hasil yang terjadi adalah kedua bakteri
menjadi berwarna biru. Tidak ada perbedaan antara keduanya .Lalu,preparat
diteteskan dengan larutan Iodin dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dibilas
dan dikeringkan hasil yang terjadi baik Bacillus subtillis dan Eschericia coli
tampak berwarna biru. Gelas objek dimiringkan, lalu disemprot dengan alkohol
sampai warna biru tidak luntur lagi alkohol merupakan decolorizing agent
(senyawa peluntur warna) pada spesies bakteri tertentu. Setelah alkohol dicuci,
bakteri Bacillus subtillis tampak masih berwarna biru. Namun untuk
bakteri Eschericia coli menjadi tidak berwarna. Warna biru nya telah hilang.
Selanjutnya, preparat diteteskan dengan safranin, safranin merupakan zat warna
basa berwarna merah,kemudian dibiarkan 2 menit lalu dibilas dan dikeringkan.
Hasilnya adalah bakteri Bacillus subtillis berwarna biru keunguan sedangkan
bakteri Eschericia coli menjadi berwarna merah.Dari hasil pewarnaan gram, dapat
diketahui bahwa Bacillus subtillis digolongkan ke dalam Gram Positif dan
bakteri Eschericia coli digolongkan ke dalam Gram Negatif . Pewarnaan safranin
masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri
gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi
dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel
berwarna ungu.
Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung
lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol
(etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid
sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Perbedaan warna antara bakteri
Gram positif dan Gram negatif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada
dinding sel nya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung peptidoglikan
sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung
lipopolisakarida.Kompleks kristal ungu-iodin yang masuk ke dalam dinding sel
bakteri Gram positif tidak dapat dicuci oleh alkohol karena adanya lapisan
peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel, sedangkan pada bakteri Gram negatif,
alkohol akan merusak lipopolisakarida. Kompleks kristal ungu-iodin yang pada
dinding sel bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri
tampak transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin.
Untuk melihat morfologi bakteri, kita harus mengamatinya di bawah
mikroskop , pada pengamatan ini diperoleh hasil pada parameter bentuk sel pada
Gram positif dan Gram negatif adalah coccus adalah bakteri yang berbentuk bulat.
Bakteri kokus ada yang tersusun sendiri (monokokus), ada juga yang berbentuk
seperti rantai (streptokokus).

BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
 Pada pengecatan bakteri dapat dibedakan menjadi tiga yaitu pengecatan
sederhana , pengecatan struktural dan pengecatan diferensial. Pengecatan
deferensial yaitu dengan menggunakan kombinasi zat warna kristal violet,
larutan iodin, alkohol dan safranin. Yang termasuk pengecatan diferensial
adalah pengecatan Gram karena dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri
Gram positif dan bakteri Gram negatif . Pada pengecatan bakteri ini Bacillus
subtillis digolongkan ke dalam Gram positif karena pada hasil akhir setelah
pemberian safranin warna bakteri Bacillus subtillis tetap bewarna biru
keunguan dan bakteri Eschericia coli digolongkan ke dalam Gram negatif
karena pada hasil akhir setelah pemberian safranin warna bakteri Eschericia
coli berubah warna dari ungu menjadi warna merah. Dan perbedaan warna
antara bakteri Gram positif dan Gram negatif disebabkan oleh adanya
perbedaan struktur pada dinding sel nya.

B. Saran
Untuk praktikum berikutnya supaya alat disediakan lebih banyak, sehingga
praktikan dapat mempraktikan semua acara yang ada dan tidak
menghabiskan banyak waktu saat bergantian alat.

DAFTAR PUSTAKA

Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.

http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html.
Diakses pada 25 Mei 2015.
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.
Irianto Koes. 2006. Mikrobilogi Menguak dunia Mikroornisme.Yrama Widya.
Bandung.

James, Joyce. 2002. Prinsip-Prinsip Sains Untuk Keperawatan. Retno Indah,

Penerjemah. Erlangga: Jakarta. Terjemahan dari: Principles of Science for
Nurse.

Karmana, Oman. 2008. Biologi. PT Grafindo Media Pratama: Jakarta.

Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.