https://www.ncbi.nlm.nih.

gov/pmc/articles/PMC145378/

Dalam model murine imunisasi, rute hidung tampaknya memiliki keuntungan

merangsang kedua sistemik dan respon mukosa disebarluaskan, sehingga
sangat menarik untuk pengiriman vaksin terhadap infeksi mucosally menular.
Berbagai penelitian manusia telah melaporkan pengiriman hidung nonreplicating
antigen dari Shigella (9), difteri dan tetanus toxoid (1), toksin kolera B subunit (4,
21), Neisseria meningitidis (10, 12), Pseudomonas (14), dan Bordetella pertussis
(5, 6). Namun, tidak ada penelitian yang melaporkan induksi kekebalan yang
akan memenuhi kriteria vaksin-lisensi mapan. Selanjutnya, dilaporkan
immunoglobulin A (sIgA) respon sekretori di sekresi mukosa bervariasi antara
subyek dan situs anatomi (11), dan intranasal difteri toksoid di alum diinduksi
efek samping yang signifikan (1). Dengan demikian, sistem pengiriman yang
efektif dapat merangsang respon mukosa sistemik dan disebarluaskan untuk
antigen nonreplicating nasally disampaikan tanpa terjadi efek samping yang
signifikan tetap menjadi tujuan yang sangat diinginkan.

Mutan toksin difteri CRM197 mengandung substitusi asam menonaktifkan glisin-

to-glutamat pada posisi 52 dari enzimatik A subunit dan secara luas digunakan
pada manusia sebagai pembawa antigen polisakarida berlisensi. CRM197 secara
inheren tidak beracun dan tidak memerlukan inaktivasi kimia. Namun, dosis
rendah (0,18%) pengobatan formalin meningkatkan imunogenisitas untuk
imunisasi intranasal tikus dan kelinci percobaan (17) sambil menjaga integritas
dan kemampuan untuk menginduksi antibodi toksin-menetralkan sangat aktif
(17) struktural. Hal ini berbeda dengan konsentrasi yang lebih tinggi dari
formaldehid digunakan untuk menonaktifkan toksin difteri dalam penyusunan
vaksin saat ini, yang memiliki efek yang tidak diinginkan dari meningkatkan
reactogenicity kontaminan. Kationik polisakarida kitosan terutama agen
mukoadhesif, dan meningkatkan respon sistemik dan mukosa kekebalan pada
hewan model imunisasi intranasal dengan CRM197 (17) dan antigen influenza
(3). Chitosan meningkatkan transportasi transepitelial antigen pada jaringan
kekebalan mukosa hidung melalui efek pada persimpangan ketat dan dengan
mengurangi mukosiliar cukai (2). Kami melaporkan di sini penggunaan kombinasi
0,18% formaldehida-diperlakukan CRM197-chitosan untuk imunisasi hidung
relawan yang sehat dalam upaya untuk mendorong tingkat perlindungan dari
antibodi serum antitoksin, dan kami mempelajari induksi respon imun mukosa
sistemik dan lokal.

Berbagai penelitian telah mengkonfirmasi potensi untuk imunisasi intranasal

manusia dengan nonreplicating vaksin terhadap berbagai bakteri patogen (5, 6,
9, 10, 12, 14), termasuk C. diphtheriae (1). Selanjutnya, imunisasi intranasal
muncul untuk menawarkan keuntungan merangsang kekebalan sistemik dan
sekretori gabungan, termasuk di situs mukosa beragam, seperti paru-paru dan
saluran kelamin (4, 11, 21, 22). Kemampuan untuk menginduksi respon imun
campuran dan potensi untuk kekebalan sel T (6, 17) membuat imunisasi
intranasal sangat menarik untuk infeksi menular seksual, serta orang-orang yang
dimediasi oleh racun yang dihasilkan oleh patogen mucosally diperoleh seperti C.
diphtheriae. Namun, dalam rangka untuk mendapatkan penerimaan oleh otoritas
pengawasan vaksin, strategi baru vaksinasi tersebut harus menunjukkan khasiat
setidaknya setara dengan saat ini diterima standar perizinan. Kami percaya ini
menjadi studi pertama yang melaporkan penggunaan imunisasi hidung pada
manusia untuk menginduksi kekebalan protektif yang melebihi kriteria
peraturan-otoritas saat ini untuk perizinan vaksin yang diukur dengan aktivitas
racun-menetralkan langsung.

Imunogenisitas melekat CRM197 dan integritas struktural molekul setelah hanya

perawatan formaldehida ringan mungkin sebagian menjelaskan berkualitas
tinggi, fungsional racun-antibodi yang diinduksi melalui rute hidung dalam
penelitian ini (Gambar. (Gbr.2) 0,2 ). Chitosan diduga bertindak sebagai
bioadhesive (2) dan secara sementara dapat mengurangi tindakan mukosiliar,
yang dapat melokalisasi antigen dalam hidung dan memungkinkan untuk
penyerapan berkepanjangan. Selain itu, dengan transien membuka
persimpangan ketat, chitosan dapat meningkatkan transportasi transepitelial
langsung CRM197 ke NALT, baik meningkatkan respon imun (Gambar. (Gbr.2) 2)
dan lokalisasi itu dalam mukosa (Gbr. (Gbr.3 ) 0,3). Kemampuan kitosan untuk
memberikan CRM197 struktural utuh dengan sistem kekebalan tubuh terutama
jelas dalam uji toksin-menetralkan, di mana aktivitas setelah satu imunisasi
secara signifikan lebih besar daripada pada kelompok pengiriman manitol, dan
itu bisa lebih didorong oleh intranasal kedua imunisasi (Gbr. (Gbr.2) 0,2).
Chitosan tidak menyebabkan perubahan histologis dalam penelitian manusia
pengiriman hidung (2) atau ex vivo studi aplikasi langsung ke eksplan jaringan
(2). pelajaran kami ditoleransi pengiriman intranasal kitosan-CRM197 pada dua
kesempatan yang sangat baik, dengan gejala sementara dan ringan sampai
sedang saja. Ini berbeda secara signifikan dengan penelitian sebelumnya
pengiriman intranasal difteri toksoid dengan tawas adjuvant pada manusia, yang
mengakibatkan efek samping yang signifikan, dengan 73% melaporkan
"menyengat menyenangkan," 25% pelaporan berkepanjangan gejala sampai
beberapa hari, dan beberapa mata pelajaran pelaporan pendarahan hidung (1).
CRM197 dan kitosan banyak digunakan secara independen pada manusia.
Mengingat masalah keamanan dengan generasi baru sistem pengiriman hidung,
temuan ini bahwa intranasal imunisasi dengan CRM197 dalam sistem pengiriman
chitosan diinduksi tingkat tinggi kekebalan protektif sistemik merupakan
terobosan signifikan. Jika hasilnya diulang dalam penelitian yang lebih besar,
strategi ini akan memungkinkan perizinan yang cepat dari vaksin intranasal
subunit pertama dan membuka jalan untuk pengembangan vaksin intranasal
terhadap berbagai mukosa dan patogen nonmucosal. Sementara imunisasi
intranasal tampaknya sangat efektif meningkatkan pelajaran sebelumnya
intramuskular diimunisasi, studi dengan individu naif akan diminta untuk
mengatasi efektivitas untuk priming imunisasi awal.
The kejanggalan antara serum IgG dan hidung-lavage sIgA tanggapan ini sesuai
dengan konsep yang respon imun sistemik dan mukosa dapat terjadi secara
independen (7) dan durasi yang relatif singkat tanggapan mukosa sIgA. Dengan
demikian, meskipun semua mata pelajaran melaporkan intramuskular imunisasi
difteri sebelumnya dan memiliki terukur IgG preimmunization antitoksin dan
rendahnya tingkat aktivitas racun-penetral, tidak ada preimmunization antitoksin
sIgA terdeteksi dalam cairan lavage. Selain itu, hanya intranasal imunisasi
diinduksi sIgA tanggapan, tanpa antitoksin sIgA muncul dalam cairan lavage
setelah imunisasi intramuskular, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (10).
Demikian pula, imunisasi intramuskular sebelum tampaknya tidak perdana
terkait hidung limfoid jaringan (NALT) untuk respon sIgA, sebagai intranasal
unilateral priming-Meningkatkan memicu antitoksin sIgA respon lokal dalam
cairan dan beredar ASCs antitoksin IgA lavage-nasal hanya setelah imunisasi
kedua . Ini berarti bahwa priming hidung diperlukan untuk respon hidung
menggunakan sistem pengiriman ini dan sesuai dengan penelitian lain imunisasi
NALT (20).

Pengamatan tak terduga dan mencolok yang hidung priming pada dasarnya
terbatas pada lubang hidung yang divaksinasi (Gbr. (Fig.3b) 3b) adalah, kami
percaya, laporan pertama dari temuan ini. Kami tidak dapat menemukan studi
manusia sebelumnya di mana intranasal unilateral priming-meningkatkan
didampingi oleh lavage dari lubang hidung kiri dan kanan secara independen.
Kebanyakan penelitian menggunakan sediaan cair yang dapat mencapai situs
induksi lainnya, seperti adenoid dan tonsil, dan dari mana antigen dibersihkan
jauh lebih cepat daripada kitosan-dicampur CRM197 powder (24) atau yang telah
disampaikan secara bilateral, atau mereka tidak melaporkan priming yang
strategi -boosting. pengamatan kami adalah analog dengan orang-orang dalam
studi manusia mani injeksi langsung intratonsillar dari toksin kolera B subunit, di
mana respon IgA terbatas pada tonsil disuntikkan diamati (20) dan selanjutnya
meningkatkan lagi menyebabkan respon yang lebih tinggi di tonsil prima.
Perdagangan dari immunoblasts dalam "sistem kekebalan mukosa umum" diatur
oleh mengikat spesifik addressins limfosit seperti 47 ke venula reseptor
endotel seperti MadCAM-1 mapan (19). Dalam paradigma ini, tingkat
kompartementalisasi terjadi, dengan situs induktif mukosa tertentu istimewa
mengisi situs lain, jauh mukosa dengan sel memori. Studi imunisasi intranasal
telah menunjukkan perdagangan limfosit prima dan priming dari tempat yang
jauh, seperti saluran kelamin dan usus, seperti dijelaskan di atas (4, 11, 21, 22).
Namun, dalam sistem kekebalan tubuh mukosa tampaknya ada
subcompartmentalization lanjut, terutama dalam struktur cincin Waldeyer ini
(20). imunisasi intratonsilar langsung muncul untuk menginduksi dua populasi
plasmablasts-satu yang recirculates dan rumah ke tempat yang jauh dan lain
yang jatuh tempo di situ untuk istimewa utama untuk respon kekebalan
ipsilateral, mungkin diatur oleh addressin fenotip yang berbeda dari sel prima
(20). Apakah kitosan-disampaikan intranasal imunisasi menginduksi respons
yang sama dan bilangan prima situs mukosa jauh masih harus dijelaskan.
The kejanggalan antara serum IgA dan sIgA tanggapan menarik. Fungsi serum
IgA tetap sulit dipahami, tetapi kemampuan kedua intranasal dan parenteral
imunisasi untuk menginduksi serum IgA didokumentasikan dengan baik (1, 4, 9-
11, 14, 20-22). The kejanggalan antara kehadiran respon serum IgA dan
kehadiran sangat lokal dari respon sIgA dalam satu lubang hidung yang sangat
mencolok dalam penelitian ini. Ini menegaskan kemerdekaan respon imun
sistemik dan mukosa, karakter unik sIgA, dan transportasi spesifik di mukosa
oleh IgA reseptor polimer (8). Dalam salah satu model penyerapan antigen oleh
hewan pengerat NALT, perbedaan antara partikel dan larut antigen diamati (13,
23). Sedangkan antigen partikulat yang diambil oleh sel M dan disajikan ke sel B
dan T dalam NALT yang mengalir ke posterior kelenjar getah bening leher dan
menginduksi baik imunitas lokal dan sistemik, antigen larut diambil langsung ke
kelenjar getah bening leher yang dangkal, di mana toleransi lebih dari kekebalan
diinduksi. Kemampuan formulasi kering-bubuk untuk memasuki mantan jalur,
yang lebih ditingkatkan oleh kitosan, dapat menjelaskan kemampuan untuk
menginduksi imunitas lokal dan sistemik yang signifikan, serta menjelaskan
lokalisasi respon sIgA dalam NALT. Pentingnya hidung priming dalam induksi
respon sIgA lokal diamati di sini dan di tempat lain (20) dan sifat sepihak dari
respon berikutnya memiliki implikasi penting untuk desain priming-meningkatkan
strategi dengan bioadhesive atau bubuk formulasi. Selanjutnya, penelitian yang
sekresi hidung sampel harus memperhatikan dekat dengan prosedur sampling
untuk menghindari bias ketika kiri dan sampel kanan dikumpulkan atau lubang
hidung secara acak sampel independen.

Frekuensi ASCs antitoksin spesifik dari ~ 20 sampai 60 per 106 PBMC, dengan
lebih IgG dari IgA, adalah sesuai dengan penelitian lain dari imunisasi intranasal
manusia (9, 12, 20, 21). Berbeda dengan imunisasi lisan, yang menginduksi
limfosit beredar dengan fenotipe mukosa ditandai dengan ekspresi reseptor
integrin 47, dan imunisasi parenteral, yang menginduksi fenotipe dominan
sistemik ditandai dengan ekspresi l-selectin (CD62L) reseptor, imunisasi
intranasal dikaitkan dengan fenotipe campuran mukosa-sistemik limfosit beredar
mengungkapkan 47 integrin dan reseptor l-selectin (19). Kami juga
menemukan bahwa ~46% dari ASCs antitoksin yang l-selectin positif (Tabel
(Tabel 2), 2), dan ini sesuai dengan respon ASC IgG-IgA campuran disebabkan
oleh imunisasi intranasal dalam penelitian kami (Gbr. ( Gbr.4) 4) dan lain-lain (4,
9, 12, 20, 21). Kemampuan untuk menginduksi respon imun sistemik-mukosa
campuran, terutama di organ genital, sangat menarik untuk vaksin terhadap
infeksi sistemik mucosally diperoleh, seperti yang dengan human
immunodeficiency virus, di mana respon imun gabungan akan sangat penting
untuk strategi vaksinasi yang efektif. Tujuan homing dari IgA ASCs diamati dalam
penelitian ini tidak ditangani, tetapi asosiasi IgA ASCs muncul dalam darah
dalam jumlah yang signifikan dan maksimal hidung respon sIgA terlihat hanya
pada kelompok intranasal-chitosan menyarankan mereka mungkin homing ke
NALT . Namun, peredaran IgA ASCs dan tidak adanya respon sIgA dalam lubang
hidung diimunisasi tetap paradoks. penyelidikan masa depan harus menentukan
apakah intranasal imunisasi dengan formulasi kering bubuk kitosan-disampaikan
mampu melindungi situs mukosa jauh seperti saluran genital, seperti yang telah
ditunjukkan dalam penelitian lain dengan antigen enterotoksin (4, 11, 21, 22),
atau apakah respon sIgA tetap sangat lokal. Dalam kasus difteri, respon NALT
sIgA lokal selain respon IgG sistemik akan sangat menarik.

Kesimpulannya, studi klinis ini memberikan bukti prinsip pada manusia bahwa
teknologi ini tersedia untuk membuat vaksin mukosa yang diterima sesuai
dengan kebutuhan yang ada dari badan pengatur dan bahwa vaksin ini, selain
mendorong imunitas sistemik yang diperlukan, juga menginduksi mukosa lokal
tanggapan. Studi ini tidak hanya membuka jalan bagi pengembangan langsung
pada manusia vaksin mukosa terhadap difteri, dan antigen subunit berpotensi
lainnya, ia memiliki konsekuensi untuk desain sistemik-priming-mukosa-
meningkatkan strategi untuk pengembangan vaksin yang efektif terhadap
human immunodeficiency infeksi virus dan penyakit lain di mana imunitas
mukosa akan diinginkan. Jika data ini direproduksi dalam studi yang lebih besar,
vaksin intranasal difteri berdasarkan CRM197-chitosan bisa cepat berlisensi
untuk digunakan manusia. Namun, respon sIgA terbatas menunjukkan bahwa
perawatan harus diambil dalam strategi priming-meningkatkan dan teknik
pengambilan sampel klinis ketika mengevaluasi vaksin tersebut untuk induksi
kekebalan mukosa lokal.

Keamanan dan tolerabilitas dari vaksin hidung. Intranasal imunisasi

menggunakan tunggal menggunakan perangkat Valois adalah dapat ditoleransi,
dengan gejala sementara dan ringan sampai sedang saja. TA ble 1 memberikan
frekuensi gejala yang paling parah dicetak oleh subjek dalam 7 hari setelah
setiap imunisasi. Tidak ada pelajaran menarik diri dari penelitian atau menolak
untuk memiliki imunisasi hidung intra kedua.

respon antibodi serum. kekebalan protektif sistemik terhadap Corynebacterium

diphtheriae racun didefinisikan untuk tujuan cine-lisensi vaksin 0,01 internasional
neutralizing- unit antibodi / ml serum. Sebuah imunisasi tunggal hidung dengan
CRM197, dengan atau tanpa chitosan, diinduksi serum antitoksin IgG dan IgA
dan tingkat perlindungan dari antibodi toksin-menetralkan (14,8 dan 5,4 IU / ml,
masing-masing) (Gambar. 2) sebagai secara efektif sebagai imunisasi
intramuskular (6,3 IU / ml) (Gambar. 2). Sebuah imunisasi intranasal kedua
mendorong aktivitas netralisasi, yang secara signifikan lebih tinggi pada
kelompok pengiriman kitosan (peak, 20 IU / ml).

tanggapan sIgA. Sedangkan semua relawan memiliki bukti yang telah ada
sebelumnya IgG antitoksin serum dan, menarik, tingkat-tingkat yang terdeteksi
dari serum IgA dari vaksinasi intramuskular sebelumnya, tidak ada antitoksin
sIgA terdeteksi dalam cairan lavage-nasal pada rekrutmen atau setelah imunisasi
intramuskular (Gbr. 3a ). Uni- intranasal lateral yang priming-meningkatkan tidak
menimbulkan tidak bisa antitoksin lokal sIgA respon yang sangat signifikan
dalam cairan lavage-hidung, tetapi hanya setelah imunisasi kedua. Chitosan
secara signifikan pun semakin meningkat yang sIgA respon oleh 10 kali lipat
dibandingkan dengan kelompok mannitol (Gambar. 3a). Sebuah Pengamatan tak
terduga dan mengejutkan adalah bahwa respon sIgA terjadi hampir secara
eksklusif di lubang hidung divaksinasi. Bahkan ketika koreksi dibuat untuk
tingkat aliran sekresi hidung (dengan membagi spesifik unit IgA ELISA oleh total
IgA), mata pelajaran baik tidak me-mount respon sIgA atau melakukannya hanya
dalam lubang hidung diimunisasi (Gambar. 3b). Perbedaannya adalah lebih besar
untuk kelompok pengiriman chitosan karena tingkat yang lebih tinggi dari
antitoksin sIgA diinduksi; Namun, sebuah ILAR dan signifikan perbedaan kiri-
kanan sim- terlihat dengan kelompok pengiriman Nitol mandat. Tidak ada
perbedaan dalam konsentrasi albumin yang diamati antara kelompok atau
antara lubang hidung kiri dan kanan, menunjukkan bahwa perubahan dalam
transudasi pasif protein (misalnya, sebagai akibat dari peradangan hidung) tidak
ulang jawab untuk perbedaan diamati di tingkat sIgA antitoksin . Demikian pula,
tidak ada perbedaan dalam konsentrasi total IgA yang diamati antara kelompok
atau antara lubang hidung kiri dan kanan, sekali lagi menunjukkan bahwa
perbedaan dalam tingkat aliran hidung-sekresi atau variabel- pengenceran
mampu dari sekresi hidung selama washout tidak memperhitungkan perbedaan
diamati dalam tingkat antitoksin IgA spesifik dalam cairan lavage.

Induksi ASCs. Beredar ASCs antitoksin yang enu- merated oleh ELISPOT assay
(15) sebelum dan sesudah pemisahan manik magnetik immuno- atas dasar
permukaan ekspresi L-selectin (Tabel 2). Intramuskular dan intranasal tions
imunisasi kedua diinduksi beredar IgG antitoksin ASCs (Gambar. 4), seperti yang
diharapkan dari penelitian sebelumnya dari intranasal immu- nization (9, 12, 20,
21). Namun, hanya imunisasi kitosan-disampaikan diinduksi signifikan beredar
IgA ASC kembali tanggapan, dan kemudian hanya setelah imunisasi kedua.