UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

CENTRO UNIVERSITARIO DEL SUR OCCIDENTE

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO

TCNICO EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS
MICROBIOLOGA I
 NORMAS GENERALES DE LABORATORIO

1. Puntualidad: el estudiante debe estar presente a la hora en punto, en el

laboratorio de microbiologa (jueves a las 18:20 horas) o en horario de
acuerdo a instrucciones del docente.
2. Aspectos importantes a evitar dentro de las instalaciones del laboratorio:
bromas y juegos, as como estar comiendo, bebiendo o masticando
chicle.
3. El estudiante debe estar concentrado en la prctica que est
desarrollando, no debe realizar trabajos/tareas de otros cursos.
4. Leer detenidamente el instructivo, para obtener una idea clara de su
objetivo. Los resultados deben ser anotados de inmediato al obtenerlos.
5. La limpieza y el orden deben mantenerse antes, durante y al finalizar la
prctica. Todos los materiales de desecho (envolturas de algodn/papel
kraft, hisopos, etc.,) deben depositarse en bolsas en el contenedor de
basura.
6. Cada grupo de trabajo es responsable del orden y limpieza de su rea y
ser el responsable tambin de sus utensilios de trabajo, los cuales
deben quedar limpios al final de la prctica.
7. Antes de iniciar la prctica revisar si se cuenta con todo el material
necesario para ella, tambin se deben revisar etiquetas de los
compuestos para asegurarse que son los que se necesitan y determinar
los posibles riesgos de manipulacin.
8. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como
microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el
forzar sus mecanismos.
9. Los cubreobjetos y portaobjetos deben agarrarse por los bordes o con
pinzas para evitar que se engrasen.
10. Si utiliza autoclave, nunca deje funcionando esta sin supervisin.
debe permanecer siempre un estudiante encargado por grupo. Al
finalizar la prctica debe desconectar la autoclave.
11. Al finalizar la prctica asegrese que todos los equipos estn
apagados y cerradas las llaves de agua y gas.
 NORMAS BSICAS DE SEGURIDAD EN UN LABORATORIO DE
MICROBIOLOGA

Un laboratorio de microbiologa es un lugar convenientemente habilitado

donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe
ser llevado con una buena tcnica asptica y por tanto se requiere un ambiente
limpio y ordenado. Por ello, trabajar siempre en condiciones de esterilidad. En el
laboratorio de microbiologa se encuentran estas condiciones en cmaras de
seguridad biolgica, o bien, en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol
o de gas. Segn la capacidad de causar infecciones en humanos, los
microorganismos se clasifican en cuatro grupos de riesgo (ver la siguiente tabla).

Grupo de riesgo Riesgo infeccioso Riesgo de Profilaxis o

propagacin a la tratamiento eficaz
colectividad
1 Poco probable No Innecesario
que causen
enfermedad
2 Pueden causar Poco probable Generalmente
una enfermedad y posible
constituir un
peligro para los
manipuladores
3 Pueden provocar Probable Generalmente
una enfermedad posible
grave y constituir
un serio peligro
para los
manipuladores
4 Provocan una Elevado No conocido en la
enfermedad actualidad
grave y
constituyen un
serio peligro para
los
manipuladores

Los agentes biolgicos del grupo de riesgo 1 son los que habitualmente no
se asocian a enfermedades en humanos. El grupo de riesgo 2 lo constituyen
agentes asociados con enfermedades en el hombre, que raramente son serias, y
para las cuales existen por lo general medidas preventivas o teraputicas. El
grupo de riesgo 3 lo componen agentes que estn asociados con enfermedades
graves o mortales, para las cuales son posibles intervenciones de tipo preventivo o
teraputico (algo riesgo individual pero bajo para la colectividad). En un
laboratorio de prcticas de microbiologa, siempre se deber trabajar con
microorganismos del grupo 1.

Aunque los microorganismos con los que se trabaje no sean considerados

patgenos, todos los cultivos de todos los microorganismos deben manejarse con
precaucin. Por ello, nunca debe olvidarse la necesidad de cumplir estos dos
requisitos bsicos:
1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes
y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminacin.
2. Evitar que los microorganismos ambientales presentes en piel, pelo, aire,
ropa, etc., contaminen nuestras muestras.

Adems de un ambiente apto para el trabajo microbiolgico, el laboratorio de

microbiologa requiere una instrumentacin bsica para llevar a cabo estudios
elementales.

El laboratorio deber estar diseado de manera que permita fcilmente su

limpieza, con muebles (utilizados para realizar las prcticas) impermeables y
resistentes a cidos y disolvente orgnicos y con fregaderos y grifos. Equipo y
material mnimos necesarios:

- Autoclave
- Horno Pasteur
- Incubadora
- Bao Mara
- Microscopio
- Mechero Bunsen
- Asas de siembra
- Pipetas automticas y puntas estriles desechables o pipetas estriles
- Colorantes
- Medios de cultivo
 Normas Bsicas de Bioseguridad
Para estudiantes que realizan prcticas de laboratorio

1. Est prohibido comer, beber, masticar chicle, almacenar alimentos, fumar,

aplicarse cosmticos y manipular lentes de contacto en el laboratorio.
2. Siempre deben usar bata de manga larga, completamente abrochada.
3. El pelo largo debe llevarse recogido y las uas cortas y limpias.
4. El laboratorio debe mantenerse ordenado y limpio. En las superficies de
trabajo debe minimizarse el material que no sea pertinente al mismo. No
colocar sus pertenencias (bolsas, mochilas, etc.) sobre las mesas de
trabajo.
5. Deben lavarse las manos al inicio,durante y al final del trabajo en el
laboratorio, y cada vez que se sospeche contacto con material
contaminado.
6. Est terminantemente prohibido pipetear con la boca.
7. En caso necesario, deben usar guantes. Usar protectores de cara, lentes
de seguridad y/o mascarillas para proteger la cara o los ojos de
salpicaduras, sustancias corrosivas, luz UV u otras radiaciones.
8. Trabajar de manera tal de minimizar la creacin de aerosoles. Evitar
agitaciones y pipeteos bruscos, as como la introduccin de asas de cultivo
calientes dentro de medios de cultivo.
9. Los punzocortantes y el material contaminado debern colocarse en los
recipientes que para el efecto se proporcionan.
10. En caso de haber derramado material contaminado, debern proceder
inmediatamente a descontaminar el rea afectada.
11. Todos los accidentes o derrames de material que ocurran durante la
prctica, deben ser comunicados al docente que la imparte.
12. Est prohibido el uso de prendas de laboratorio en: biblioteca, cafetera,
aulas, salas de reuniones, oficinas administrativas, planta piloto y otras
reas comunes ajenas al laboratorio.
13. Trabajar cerca de la mesa de trabajo, adoptando una buena postura y
estando fsicamente cmodo.
14. Llevar un calzado apropiado, cerrado y de suela antideslizante en las reas
de laboratorio.
15. Evitar llevar en el laboratorio, accesorios que podran ser fuente de
contaminacin (por ejemplo joyas).
16. Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de
iniciar las actividades indicadas en la prctica. Si usted tiene alguna duda,
dirjase al profesor.
17. Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero. Nunca debe
dejar ste desatendido.
18. Debe trabajar en las proximidades del mechero, pero sin quemarse el
pelo.
19. Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.),
limpios y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la
actividad. Reporte cualquier dao de los mismos al profesor.
20. Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos
para tal fin. Lavarlos adecuadamente y luego esterilizarlos para eliminar
contaminacin.
21. Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con
microorganismos (como pipetas usadas, placa petri o tubos), deben
colocarse en bolsas de autoclave preparadas para tal efecto y proceder
posteriormente a su esterilizacin.
22. Los medios inoculados deben colocarse en la incubadora con su respectiva
identificacin. Nmero de grupo, nombre, naturaleza del espcimen.
23. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
24. Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivo o cultivos de
microorganismos, nunca deben abrirse en posicin vertical, sino lo ms
horizontal posible (inclinados) y para quitar el tapn se mantendrn
inclinados con una mano y se abrirn con la otra, que sostendr a su vez el
asa. Una vez abierto, se flamea por algunos segundos el orificio, repitiendo
dicha operacin una vez realizada la siembra (el tapn nunca debe dejarse
sobre la mesa).
25. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos, debe esterilizarse en la
flama del mechero antes y despus de uso.
26. Cuando trabaje con equipos/instrumentos de vidrio, como tubos o
termmetros, preste mucha atencin pues el vidrio es frgil y se rompe
fcilmente.
27. No toque nunca los compuestos qumicos con las manos, para manipular
utilice esptulas, cucharillas, pinzas, etc.
28. No arroje al lavadero cerillos, papel filtro o slidos poco solubles.
29. No usar ningn reactivo que no est debidamente identificado, verificar las
etiquetas de los mismos y estar seguro de cmo emplearlo. No devolver
sustancias a sus envases originales.
30. No pruebe o saboree un producto qumico o solucin.
31. Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar
a cabo experimentos no autorizados. Reportar inmediatamente cualquier
accidente al profesor (derrame de material contaminado, heridas,
quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.
32. Reducir al mnimo la formacin de aerosoles durante la realizacin de
cualquier trabajo prctico.
33. Emplear tcnicas aspticas para el manejo de cultivos de microorganismos.
34. Siga todas las instrucciones que el docente del curso les indique dentro del
laboratorio.
35. Para preparar una solucin acuosa de un cido (especialmente cido
sulfrico), vierta siempre lentamente el cido concentrado sobre el agua.
Nunca vierta agua sobre cido, pues puede producirse un accidente.
36. No inhale los vapores de alguna sustancia, si es necesario hacerlo ventile
con la mano suavemente hacia su nariz los vapores de la sustancia.
37. Si alguna sustancia qumica le salpica o cae en la piel o en los ojos, lvelos
inmediatamente con abundante agua y avise a su profesor.
 38. Cuando se caliente una sustancia en el tubo de ensayo, dirija el extremo
abierto del tubo hacia un lugar que no pueda ocasionar dao a usted y a
sus compaeros.
39. No site una llama cerca de un recipiente que contenga un material voltil o
flamable.
34 Si hay un principio de incendio, acte con calma. Aplique el extinguidor y
evite manifestaciones alarmistas innecesarias.
35 Deje el tiempo suficiente para que se enfren los materiales de vidrios.
36 Al finalizar la tarea, deben limpiar y descontaminar las superficies de
trabajo.
37 Lvese adecuadamente las manos antes de salir del rea de trabajo
(laboratorio).

MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA

A continuacin se presentan los pasos que se deben seguir en caso de que
ocurran los siguientes accidentes:

Derrame de material biolgico sobre el cuerpo:

- Remover la ropa inmediatamente.

- Lavar vigorosamente el rea expuesta con agua y jabn por un minuto.
- Reportar el incidente al profesor.
- Buscar atencin mdica si es necesario.
- La ropa contaminada debe ser colocada en una solucin desinfectante
antes de ser lavada.
- Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos:
Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del prpado
con abundante agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para
asegurar efectivamente el lavado, comenzando por los prpados.

Reportar el incidente al profesor.

Buscar atencin mdica inmediatamente.

Cortadas menores y heridas por pinchazo:

- Lavar vigorosamente la herida con agua y jabn por varios minutos.
- Aplicar un antisptico adecuado
- Reportar el incidente al profesor.

Buscar atencin mdica inmediatamente.

En el caso de derrames:

- Reportar el incidente al profesor.

- Colocarse guantes y cubrir con papel absorbente el rea del derrame.
- Verter un desinfectante adecuado y dejar actuar por el tiempo necesario.
 - Retirar el material absorbente junto al material roto y colocarlos en un
recipiente para residuos contaminados o bolsa de desechos, la cual debe
esterilizarse junto con los guantes utilizados.
- Limpiar y desinfectar nuevamente el rea empleando nuevas toallas de
papel y desinfectante.
- Lavarse las manos con abundante agua y jabn

Formas de Adquirir Infecciones

- Area (inhalacin de aerosoles)

- Ingestin
- Inoculacin directa
- Contacto de la piel y membranas mucosas

Ingestin
Objeto Boca Mano

Inoculacin Directa
- Punciones accidentales
- Cortadas con objetos
- Mordiscos o rasguos de animales y picaduras de insectos

Contacto de la piel y membranas mucosas

- Salpicaduras en ojos boca nariz
- Salpicaduras en la piel: intacta o no
- Contacto con superficies contaminadas, equipos o artculos.
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TCNICO EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS
MICROBIOLOGA I

PRCTICA DE LABORATORIO No.1

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

Introduccin
Los microorganismos como todo ser vivo, son susceptibles a todos los
cambios de condiciones ambientales y en la medida en que se han ido adaptando
a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hbitats incluyendo
los de condiciones extremas sobre todo de tipo fsico y qumico.

Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfeccin y

esterilizacin para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilizacin es un
mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismos y que asegura la ausencia
absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la desinfeccin es un proceso
que solo elimina formas vegetativas de los microorganismos.

Existen diferentes mtodos de esterilizacin de mayor utilizacin en

microbiologa, como la esterilizacin con calor seco y calor hmedo. En el caso de
la desinfeccin se pueden utilizar radiaciones con U.V. o compuestos qumicos en
forma lquida, como; fenoles, amonios cuaternarios, alcoholes, etc. Cada uno de
estos mtodos tiene sus ventajas y desventajas.

Objetivo

- Conocer los principios generales de las tcnicas de esterilizacin de

materiales de vidrio y medios de cultivo de uso comn en microbiologa.

Cristalera

5 cajas de Petri limpias (por grupo)

Materiales
Hisopos (de mango de madera y largos) 1 paquete por todo el grupo, no
esterilizados
Agua desmineralizada
Papel de envolver 4 pliegos por cada grupo
Cinta testigo 1 rollo por todo el grupo
Maske tape 1 rollo por todo el grupo
Jabn (para limpieza de cristalera y antibacterial para manos) 2 botes de jabn
por todo el grupo
Esponjas 1 por cada grupo
Alcohol (por grupo, para desinfectar)
Algodn (por cada grupo de trabajo, se utilizar para limpiar y desinfectar el rea)
Guantes
Mascarilla 1 por cada estudiante
Piceta
Vidrio reloj
Agua destilada
Papel mayordomo
Guantes de asbesto
Marcador permamente punto medio 1 por cada grupo

Equipo y utensilios
Autoclave
Balanza
Bao de mara

Reactivos
PCA (Plate Count Agar)
Soluciones amortiguadoras

Procedimiento
A Preparacin de material para esterilizar

1. Lavar perfectamente las cajas de petri o toda la cristalera a utilizar en la

prctica, con esponja y detergente. Enjuagar con suficiente agua potable.
2. Escurrir el exceso de agua en enjuagar el material con agua destilada con
una piceta, en la parte interna.
3. Dejar escurrir el material sobre una toalla. No se debe secar el material por
ningn otro medio.
4. Una vez seco el material, se proceder a envolver las cajas de petri o el
material a utilizar con papel de estraza (kraft, envolver). Para los tubos y
matraces se elaborarn tapones de algodn y gasa, procurando que
ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocar un capuchn
de papel.
B. Esterilizacin de materiales

1. Las cajas de petri o materiales envueltos para esterilizar se colocarn en el

autoclave con las condiciones adecuadas de esterilizacin. 121C por 15
min.
2. Sacar el material del autoclave y dejarlo enfrar, abrirlo en el momento que
se va a utilizar siempre cumpliendo normas de asepsia.
3. El proceso de esterilizacin en autoclave se realizar de acuerdo a las
siguientes instrucciones:
a.) Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador.
En caso necesario aadir agua destilada.
b.) Conectar el autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto.
Acomodar los medios y materiales en la canasta del autoclave y colocar
dentro.
c.) Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posicin
encontrada y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio del
purgado. Despus cerrar este orificio con la vlvula de seguridad.
d.) Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar las condiciones de
esterilizacin, 15 minutos, 121 C a 115 psi, revisando continuamente la
escala del manmetro. Una vez alcanzada esta temperatura deber
bajarse el nivel de calentamiento moviendo la perilla de control al nivel
medio o bajo.
e.) Mantener el equipo y material en estas condiciones por 15 minutos.
f.) Apagar el autoclave y dejar que baje la presin al valor 0. Quitar la
vlvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga
hmeda abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrs para
evitar quemaduras por la salida de vapor.

C. Preparacin de Plate Count Agar

Disolver 22.5 g en 1 litro de agua Desmineralizada, ajustar el pH a 6,5- 7,0 con u

potencimetro, calentando en bao de agua hirviendo o en corriente de vapor,
coloque en autoclave (15 min. a 121C) pH: 7,0 +-0,2 a 25C. Leer siempre
instrucciones del recipiente que contiene el agar. Utilice para preparar el agar un
erlenmeyer.

NOTA:
1. Leer las instrucciones de preparacin que se encuentran descritas en el
recipiente que contiene el agar.
Procedimiento
1. Prepare el agar PCA como lo indica las instrucciones. Siga las
instrucciones paso a paso.
2. Cerrar la boca del erlenmeyer con un tapn de algodn y colocarle sobre
este tapn de algodn papel kraft y asegurarlo con masketape.
3. Esterilizar tanto el agar preparado, cajas de petri, que va a utilizar e hisopos
(preparados para esterilizarlos). De acuerdo al procedimiento establecido
para esterilizacin.
4. Enfriar el agar hasta alcanzar aproximadamente 50 C., utilizando el bao
de mara.
5. Encender el mechero (tome las precauciones del caso), retire el papel que
cubre la boca del erlenmeyer y el tapn del algodn y pase esta por el
mechero, esto con el fin de evitar cualquier contaminacin.
6. Luego vierta el agar en cada una de las cajas de petri. Aproximadamente
de (15 a 20) ml en cada una. Coloque la tapadera.
7. Deje en reposo hasta que solidifiquen.

NOTA:

1. Instrucciones adicionales sern proporcionadas por el docente en el inicio y

durante la prctica, a las cuales deben ponerle la debida atencin.

2. Antes de iniciar a trabajar siempre limpie y desinfecte su rea de trabajo.

CUESTIONARIO

1. Cmo se clasifican los objetos que se esterilizan en microbiologa?

2. Cules son los mtodos de esterilizacin que existen? Describa cada uno
de ellos
3. Cules son los indicadores de comprobacin de la esterilidad? Explique
cada uno de ellos.
4. Realice un dibujo del autoclave
5. Funcionamiento del autoclave.
6. Fases del procedimiento completo de esterilizacin
7. Normas de seguridad para trabajar con autoclave
8. Defina medio de cultivo
9. Usos de Plate Count Agar y su composicin
10. Por qu se condensa el agua en el interior de la placa de Petri?
11. De dnde se obtiene el agar y cul es su composicin qumica?

Bibliografa
 1. Aquiahuatl R. Mara de los ngeles; Prez CH. Mara. 2004. Manual de
Prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. Universidad Autnoma
Metropolitana. 1era. edicin.
2. Trigoso, C. 1997. Bacteriologa Bsica. Ed. Huellas. Bolivia.

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MICROBIOLOGA I

PRCTICA DE LABORATORIO No.2

OMNIPRESENCIA DE MICROORGANISMOS
Introduccin

Vivimos inmersos en un ambiente compartido con microorganismos que

colonizan el entorno. Los microorganismos estn presentes en el ambiente: aire,
superficies, tierra, etc., y se observan en mayor nmero cuando encuentran las
condiciones que son favorables para su crecimiento y desarrollo.

Adems se pueden encontrar en el medio que nos rodea, as como en la

piel, nariz, manos, etc. Esto se debe a la ubicuidad.

En el laboratorio microbiolgico es importante mantener lo microorganismos

del ambiente fuera de los materiales de trabajo, para que no interfieran con el
aislamiento de los agentes buscados. Ello se logra mediante una serie de
medidas y cuidados en la manipulacin de medios de cultivo y de los implementos
de laboratorio, tendientes a obviar la contaminacin ambiental o la que se pudiera
aportar a partir de las manos, respiracin u otros. Adems la aplicacin correcta
de normas de bioseguridad que garanticen un trabajo correcto de laboratorio
evitar la contaminacin de los medios de cultivo y las posibles infecciones por
accidente de laboratorio. En conjunto esas medidas son llamadas tcnica
asptica.

Cuando se trabaja en un laboratorio de microbiologa es necesario para

todo el desarrollo del trabajo realizar todas las actividades de una forma asptica
con la finalidad de evitar contaminaciones.

Objetivos

1. Demostrar la ubicuidad de los microorganismos.

2. Conocer las formas de las colonias.

Materiales y cristalera

4 cajas de petri, (con agar PCA por grupo)

Hisopos (de mango de madera y largos)
Algodn
Alcohol
Marcador indeleble
Guantes

Equipo y utensilios
Mechero
Incubadora
Procedimientos
A. Primera etapa
1. Rotule/identifique cada una de las cajas de petri. Como se lo indicara el
docente del curso.
2. Quitar la tapa de una de las cajas que contiene el agar y exponerla al aire
del laboratorio durante 15 minutos y volver a cerrarla.
3. Remover la tapa, colocar la cabeza en posicin inclinada (de un estudiante
del grupo) sobre la caja de agar y sacudir el cabello. Cerrarla.
4. Con un marcador indeleble trace una lnea divisoria a la mitad del fondo
exterior de la tercera caja de agar. Levantar la capa y tocar la superficie de
una mitad de agar con la yema de sus dedos. Lavarse bien los dedos con
agua y jabn, repitiendo luego la operacin anterior con la otra mitad del
agar. Marque cada mitad con la leyenda correcta.
5. Con un marcador indeleble trace una lnea divisoria a la mitad del fondo
exterior de la cuarta caja de agar. En la primera mitad pase un hisopo
estril. En la otra mitad pasar un hisopo estril sobre la superficie de la
mesa de trabajo e inocular sobre la cuarta caja de agar frotando
masivamente. Cerrar la caja
6. Todas las actividades deben trabajarse cerca del mechero (con las debidas
precauciones).
7. Incubar todas las cajas a 37C. Observar crecimiento a las 24 horas y
luego a las 48 horas. Las cajas de Petri deben incubarse con el fondo
(agar) hacia arriba, para que el agua de condensacin que pueda formarse
no caiga sobre el cultivo.

B. Segunda etapa

1. Observar cada caja de Petri y anotar. Puede hacer uso de un

estereoscopio.
2. El nmero de unidades formadoras de colonias (UFC).
3. Los morfotipos coloniales: tamao, forma, color, elevacin, borde,
transparencia u opacidad de la colonia.
4. Sellar las cajas de petri y almacenarlas en refrigeracin si no se van a
utilizar en el momento. (servirn para los siguientes laboratorios)
5. Esterilizar las cajas de petri cuando dejen de servir y desechar su
contenido.
6. Dejar limpio todo el material.
Resultados: la siguiente informacin le puede ser de ayuda para elaborar sus
resultados del reporte de laboratorio.

1. Elabore un cuadro con la siguiente informacin

Crecimiento
Tipo de exposicin Positivo Negativo

2. Cuente el nmero de colonias por cada muestra tomada.

3. Corresponde el nmero de UFC en la caja de petri con los dedos sin lavar
y lavados a lo esperado? Qu sucedi al emplear jabn de manos
antibacterial? Explique.

Bibliografa.

1. Cano, Floridalma; Torres, Olga. 1986. Manual de Laboratorio de

Microbiologa General. Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia. USAC.

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MICROBIOLOGA I

PRCTICA DE LABORATORIO No.3

MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE
(OBSERVACIN MACROSCPICA)
Introduccin

Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin de

una Unidad Formadora de Colonia UFC- sobre un medio slido; aunque vara de
tamao generalmente es visible a simple vista. Una UFC puede ser un solo
microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie como
en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los
estafilococos o los estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos
color caractersticos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se
encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie
bacteriana que la forme.
Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren en varios grados y
combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes,
sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados. Sin embargo, adems de
stas caractersticas se requiere tambin estudiar la fisiologa y propiedades
inmunolgicas de las bacterias para poder realizar una identificacin completa.
La morfologa colonial es comparable a una estadstica ya que se deriva de una
clula individual pero es la caracterstica de la masa celular. As pues, por ejemplo,
la pigmentacin es aparente en la colonia, pero no en la clula individual, en el
caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la sustancia
capsular en aquellas bacterias con cpsula muy grande.
Medida de las colonias. Esta caracterstica es bastante constante dentro de las
especies y puede ir desde colonias muy diminutas hasta un dimetro de varios
milmetros.
Forma. Est determinada por su borde y su espesor. Se pueden observar varias
formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una
colonia seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia
viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata de
separarla del agar.
La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con
muescas concntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida
puede aparecer con textura granular o amorfa.
Pigmentacin. Esta caracterstica es muy comn en las bacterias saprfitas en las
que las colonias aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los
microorganismos patgenos uno de los pigmentados ms importantes es
Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se
aprecia en las clulas individuales a que se debe a grnulos intracelulares muy
pequeos para verse con luz transmitida.

Objetivo

Determinar las diferentes morfologas de colonias que se obtienen.

Materiales
 - Cajas de Petri con muestras de la prctica No.2
- Asas bacteriolgicas

Procedimiento

Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes

caractersticas:
- Forma: es la apreciacin general de su figura, puede ser:
o Puntiforme
o Circular y ovalada
o Filamentosa
o Irregular
o Rizoide
o fusiforme
- Tamao: dimetro en mm, los lmites de tamao de las colonias varan
desde fracciones de milmetros hasta 10 mm de dimetro. La mayora de
los microorganismos forman colonias de tamao limitado al tiempo de
incubacin. Grande (ms de 3 mm), mediana (2-3 mm), pequea (1-2 mm)
- Olor
- Borde o margen: se refiere al contorno de las colonias entero, puede ser:
o Entero
o Ondulado
o Lobulado
o Erosionado
o Filamentoso
o Rizado

- Elevacin: puede ser

o Plana
o Elevada
o Convexa
o Pulvinada
o Umbonada
o Montaosa
o Crateriforme
- Superficie: lisa, suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta
- Consistencia: (probarla con el asa): cremosa, membranosa
- Aspecto: hmedo, seco, algodonoso, pulverulento, aterciopelado, velloso,
granuloso
- Color: se usan trminos comunes para definirlo y se especifica si el
pigmento producido difusible o no. Puede ser:
o Blanco
 o Amarillo
o Negro
o Marrn
o Anaranjado, etc.
- Caractersticas pticas: luz transmitida (observar a travs de la colonia).
Opaca: no permite el paso de luz
Traslcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los
objetos observados a travs de la colonia.
Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos
observados a travs de la colonia.
- Luz reflejada (observar la superficie de la colonia): opaca, brillante.

Las siguientes figuras le ayudan a realizar las observaciones de la UFC.

TRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGA DE COLONIAS EN LA

SUPERFICIE DE UN MEDIO SLIDO
Forma

Elevacin
Borde

Bibliografa

- Brock, T. D., Madigan, M. T. Microbiologa. Sexta edicin. Prentice Hall

Hispanoamericana S.A. 1993.
- Departamento de Qumica Biolgica. Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales. Universidad de Buenos Aires. Gua de Trabajos Prcticos, 2010.
- Seeley, H. W. Jr., VanDemark, P. J., Lee, J. J.: Microbes in action. A
Laboratory Manual of Microbiology. W. H. Freeman and Company New
York. Fourth Edition. 1991.
- Tortora, G. J., Funke, B. R., Case, C. L.: Introduccin a la Microbiologa.
Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. 1993.
- Vullo, D., Wachsman, M., Alche, L. Microbiologa en Prctica. Manual de
tcnicas de laboratorio para la enseanza de Microbiologa bsica y
aplicada. Primera edicin Editorial Atlante S.R.L., Buenos Aires, 2000.
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
CENTRO UNIVERSITARIO DE SUR OCCIDENTE
TCNICO EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS
MICROBIOLOGA I

PRCTICA DE LABORATORIO No.4

TINCIN SIMPLE Y TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM

Introduccin
Para teir los microorganismos se dispone de un gran nmero de
compuestos orgnicos coloreados (colorantes). En general, estos compuestos
son un tanto complejos en cuanto a su estructura molecular. De acuerdo con esto
se pueden clasificar en grupos como colorantes de trifenilmetano, colorantes de
oxacina y colorantes de tiacina.

Una clasificacin ms prctica es de acuerdo con el comportamiento

qumico del colorante, es decir cido, bsico y neutro. Un colorante cido (o
aninico) es aquel donde la balanza de la carga sobre el ion colorante es negativa;
un colorante bsico (o catinico) es aquel donde la carga llevada por el ion
colorante es positiva. Un colorante neutro es una sal compuesta de un colorante
cido y un colorante bsico, como el eosinato de azul de metileno. En general, los
colorantes cidos tien a los componentes celulares bsicos y los colorantes
bsicos a los componentes celulares cidos.

El proceso de la tincin supone una reaccin de intercambio de iones entre

el colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula. Los iones
teidos del colorante reemplazan a otros iones en los componentes celulares.
Tinciones/coloracin simple
La coloracin de las bacterias por la aplicacin de una solucin
colorante simple en preparaciones fijas y teidas se conoce como
coloracin simple. El frote fijo se inunda con la solucin colorante
durante un periodo establecido, despus de lo cual el colorante se
arrastra con agua y la lmina se seca con papel secante.

Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas

tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo
que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante.
Ejemplo: Azul de metileno, safranina, etc.

Tinciones/coloracin diferencial

Los procedimientos de coloracin que ponen de manifiesto

diferencias entre las clulas bacterianas o en partes de una clula
bacteriana se conocen como tcnicas de coloracin diferenciales. Son
algo ms elaborada que la tcnica simple en la que las clulas se
someten a una sola solucin colorante o reactivo colorante.

En las tinciones diferenciales se emplean ms de un colorante, ya sean

juntos o separadamente, segn la tcnica de que se trate.

Las dos coloraciones diferenciales de mayor importancia en bacteriologa

son las de Gram y la de cido-resistencia.

La tincin de Gram, debe su nombre al Bacterilogo Dans Christian Gram

que la desarrollo en 1844.

En la coloracin de Gram se aplica al frotis una solucin de colorante

primario, cristal violeta o violeta genciana, seguida de lugol como mordiente; se
lava luego la preparacin con alcohol-acetona o alcohol al 95%, y finalmente se
aplica un colorante de contraste, como la safranina o fushina. Algunas bacterias al
ser lavadas con alcohol-acetona retienen el primer colorante, quedando de color
azul, y se les denomina Gram-positivo. Otras en cambio, pierden el primer
colorante al ser lavadas con alcohol-acetona siendo luego teidas con el segundo
colorante de un color que va de rosado a rojo, a estas ltimas de les denomina
Gram-negativo.

Es una tincin diferencial de gran importancia en Microbiologa porque

permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias, Gram-positivo y Gram-
negativo, segn se comporten ante esta tincin.

La teora actual sobre el Gram, es que las diferencias tintoriales se deben

principalmente a los diferentes grados de permeabilidad en las paredes celulares
de las distintas bacterias, durante el tratamiento con alcohol al 95% o alcohol-
acetona.

El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de

ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en
su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano
ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer
colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al
colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda
retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se teirn
despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Como resultado del tratamiento con alcohol, la pared de las bacterias Gram
negativo es disuelta o desorganizada, permitiendo que el complejo yodo-cristal
violeta, que es soluble en alcohol, escape de la clula. En cambio en las bacterias
Gram positivo por tener una composicin diferente, en lugar de disolverse o
desorganizarse la pared celular, sta disminuye de porosidad, reduciendo as su
permeabilidad y por consiguiente el complejo yodo-cristal violeta es difcil de
extraerse. Existen modificaciones de la coloracin de Gram, como la de Kopeloff,
usada para bacterias anaerbicas.

El examen con microscopio ptico de preparacin con tincin de Gram se

emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes
son cocos (esfricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas.

Objetivos

1. Emplear tcnicas bacteriolgicas simples.

2. Conocer el fundamento estructural de la Tincin de Gram
3. Utilizar colorantes y conocer su utilizacin.

Utensilios y materiales

Materiales:
UFC en Agar PCA
Bacterias del Yogurt (llevar un yogurt natural)
Mechero
Asa (por grupo)
Desinfectante (alcohol)
Microscopio
Cronmetro
Portaobjetos
Goteros (traer cuatro por cada grupo)
Bandeja para hacer tincin.
Reactivos/colorantes
Azul de metileno
Solucin Cristal violeta
Solucin de lugol
Alcohol-acetona
Solucin safranina
Aceite de inmersin

PROCEDIMIENTO 1:

1. Lavar con jabn y agua un portaobjetos.

2. Secar. Rotular e identificar la muestra haciendo un crculo en el
portaobjetos (como le explicar el docente).
3. Desinfectar el asa (aguja de inocular) en el mechero. Flamear el asa de
siembra hasta que adopte un color rojo, ya que de esa manera se esteriliza.
4. Preparacin del frotis: con un asa de siembra se toma una pequea
cantidad de yogurt y se mezcla sobre un portaobjetos con una gota de
agua, haciendo una extensin o un frotis, que se deja secar.
5. Fijacin: Se calienta suavemente el portaobjetos con un mechero (alcohol),
por la cara opuesta a la que contiene la extensin (sin que el portaobjetos
llegue a quemar sobre el dorso de la mano)
Antes de aadir el colorante hay que eliminar la grasa del yogurt, para lo
cual se lava la preparacin con la mezcla de alcohol-cloroformo o con
metanol que se adiciona con un gotero.
6. Tincin: Se cubre el frotis con azul de metileno durante 1-2 minutos, luego
lavar con agua para eliminar el exceso de colorante. Se deja secar la
preparacin.
7. Adicionar 1 gota de aceite de inmersin sobre la muestra.
8. Observar al microscopio, utilizando el objetivo de inmersin. Anotar los
resultados.

PROCEDIMIENTO 2:
1. Limpiar el portaobjetos con agua y jabn. Secar. Rotular e identificar la
muestra haciendo un crculo en el portaobjetos (como le explicar el
docente).
2. Desinfectar el asa (aguja de inocular) en el mechero. Flamear el asa de
siembra hasta que adopte un color rojo, ya que de esa manera se esteriliza.
3. Preparacin del frotis (cultivo con los microorganismos): sobre una lmina
limpia y fijarlos a la llama. Estos pueden estar en caldo (tubo con lquido) o
pueden estar sembrados en agar nutriente (placa Petri con medio que se ve
slido). Con el asa (desinfectada) obtener una gota de estos (si los mismos
estn en un caldo nutriente) o puede obtener con la aguja de inocular en
punta una pequea muestra del cultivo si estn en agar. Transfiera a la
laminilla limpia la muestra del cultivo. Desinfecte el asa nuevamente.
4. Si las bacterias estn en agar deber agregar una gota de agua estril al
portaobjetos antes de transferir las bacterias del agar a la laminilla.
5. Fijacin: Pasar el portaobjetos por la flama varias veces muy rpido y
esperar que la muestra se seque. La flama debe pasar por la parte de
abajo del portaobjetos (la muestra queda en la parte de arriba del
portaobjetos).
6. Tincin:
a.) Cubrir los frotis con solucin de cristal violeta durante 1 minuto. Lavar
muy breve y suavemente con agua corriente.
b.) Escurrir la lmina y cubrirla con solucin lugol durante un minuto.
Lavarla con agua del chorro.
c.) Agregar gotas de alcohol-acetona sobre la preparacin hasta que sta
deje de soltar color violeta (de 4 a 6 gotas), y lavar inmediatamente con
agua corriente.
d.) Cubrir la lmina con solucin de safranina durante un minuto. Lavar con
agua, escurrir y secar cuidadosamente con papel secante o al aire.
e.) Adicionar una gota de aceite de inmersin.
e.) Examinar la preparacin, empleando el objetivo de inmersin y anotar a
continuacin los resultados.
TINCION DE GRAM

Observacin de cada etapa:

La siguiente informacin le ayudar a presentar sus resultados.
- Reportar las observaciones de forma, agrupacin color y tamao relativo tal
como se indica en el cuadro de resultados. Hacer los dibujos de la
morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos.
- Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.

Tincin de Gram

Esquema

Descripcin

Forma: cocos, bacilos,

etc.)

Agrupamiento de clulas:
(solas, pares, cadenas,
etc.)

Reaccin Gram

CUESTIONARIO
1. Defina los siguientes trminos
 a.) Colorante
b.) Mordente
c.) Frotis
2. Con qu finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos
3. Mencione tres bacterias que tien Gram positivas y escriba la enfermedad
que causa cada una de ellas
4. Mencione tres bacterias que tien Gram negativas y escriba la enfermedad
que causa cada una de ellas
5. Cules son las fuentes de error ms comunes en la tincin de Gram?
6. Realice un cuadro en donde indique la reaccin y apariencia de las
bacterias Grampositivas y Gramnegativas en cada una de las soluciones
aplicadas (durante adicin de cada colorante).
7. Realice un cuadro indicando algunas caractersticas de las bacterias
Grampositivas y Gramnegativas.
8. Explique la tcnica de montaje hmedo y de la gota pendiente.
9. Explique frotes fijos y teidos
10. Explique mtodo de tincin de cidorresistencia
11. Coloraciones para descubrir estructuras celulares
12. Explique tincin negativa
13. Explique tincin selectiva
14. Que forman tienen las bacterias observadas en la tincin del yogurt y los
Gram
15. Aparecen aisladas o agrupadas
16. Tipo de Gram en el yogurt
17. Investigue a que morfolgicos pertenecen las bacterias observadas en la
preparacin del yogurt.
18. Defina bacterias auttrofas y hetertrofas. Clasifique las bacterias del
yogurt como auttrofas y hetertrofas.
19. Cmo es la respiracin de estas bacterias (yogurt) aerbica o anaerbica?
Explique su respuesta.
20. Defina bacterias simbiticas, parasitarias o saprofticas. Y clasifique las
bacterias del yogurt. Explique su respuesta.

Bibliografa

3. Aquiahuatl R. Mara de los ngeles; Prez CH. Mara. 2004. Manual de

Prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. Universidad Autnoma
Metropolitana. 1era. edicin.
4. Saenz C., Susana A. Prcticas de micobiologa. 2011. Prcticas de
Microbiologa, Universidad la Rioja. 2da. edicin.