DEFINISI
Senyawa organik yang tidak termasuk dalam protein,
karbohidrat, lemak yang terdapat dalam jumlah kecil
dalam bahan makanan tapi sangat penting peranannya
bagi tubuh
Senyawa organik dengan berat molekul rendah yang
dibutuhkan oleh manusia dan organisme hidup lainnya
sebagai sumber nutrisi yang diperlukan dalam jumlah kecil
untuk metabolisme normalnya.
Manusia tidak dapat mensintesis sebagian besar vitamin
dan kebutuhan akan vitamin diperoleh dari makanan dan
suplemen.
Kekurangan vitamin defisiensi
1
29/05/2017
ANALISA VITAMIN
Informasi komposisi vitamin makanan
diperlukan untuk menentukan intake guna
mengetahui kecukupan dan perbaikan status
gizi manusia.
Metode pengujian yang reliable (dapat
dipercaya/handal) sangat diperlukan untuk
menjamin akurasi food labeling
2
29/05/2017
KESTABILAN VITAMIN
Vitamin pH 7 pH<7 pH>7 O2 Sinar Panas %SM
Vit A S T S T T T 40
Vit C T S T T T T 100
Biotin S S S S S T 60
Karoten S T S T T T 30
Kolin S S S T S S 5
B-12 S S S T T S 10
Vit D S - T T T T 40
As.folat T T S T T T 100
KESTABILAN VITAMIN
3
29/05/2017
KETERANGAN
S = stabil
T = tidak stabil
SM = Susut akibat dimasak
EKSTRAKSI
Kecuali bioassay, analisa vitamin sebagian besar
melibatkan ekstraksi untuk memisahkan vitamin dari
matriks biologisnya
Secara umum meliputi satu atau beberapa perlakuan
seperti panas, asam, alkali, pelarut dan enzim.
Prosedur ekstraksi spesifik untuk setiap vitamin dan
didisain untuk menstabilkan vitamin.
Prosedur ekstraksi dapat diaplikasikan untuk beberapa
vitamin. Misalnya untuk tiamin dan riboflavin dan
beberapa vitamin larut lemak.
4
29/05/2017
Contoh
Asam askorbat : ekstraksi dingin dengan asam
metafosforat/asam asetat
V. B1 dan B2 pemanasan dalam asam + perlakuan enzim
Niasin autoklaving dalam asam (Non cereal) atau dalam
alkali (cereal)
Vitamin A, E dan D Pelarut organik, saponofikasi, dan
reekstraksi dengan pelarut organik.
Untuk vitamin-vitamin yang tidak stabil (A, E, D), perlu
ditambahkan antioksidan untuk menghambat oksidasi
ANALISA VITAMIN
Bioassay manusia dan hewan
Microbiological assay bakteri, yeast dan
jamur
Physicochemical assay spektrofotometri,
fluorometri, kromatografi, enzimatis, immunologi
dan radiometri
5
29/05/2017
BIOASSAY
Sampai saat ini baru digunakan untuk vitamin D
dan B12
Vitamin D Menggunakan Metode standard
dari AOAC yang dikenal dengan Metode Line
Test yang didasarkan pada pengapuran tulang.
Karena menggunakan pengapuran tulang
hanya terbatas pada uji hewan coba saja tidak
pada manusia
MIKROBIOLOGICAL ASSAY
Terbatas pada vitamin yang larut air
Sangat sensitif dan spesifik untuk tiap vitamin
Memakan waktu dan harus patuh pada
prosedur analisa untuk hasil yang akurat
6
29/05/2017
PRINSIP
Pertumbuhan mikroba sebanding dengan
kebutuhan akan vitamin.
Microbiological assay menguji pertumbuhan
mikroba dalam ekstrak sampel yang mengandung
vitamin dibandingkan dengan pertumbuhan
mikroba dalam vitamin dengan jumlah yang
diketahui.
Bakteri, yeast dan jamur digunakan sebagai
organisme uji
Pertumbuhan diukur dengan turbiditas (kekeruhan),
produksi asam, gravimetri dan respirasi
VITAMIN A
Sensitif terhadap cahaya (UV), udara (beberapa
prooksidan), suhu tinggi dan kelembaban
Perlu tahap-tahap untuk menghindari perubahan
yang merugikan seperti pengaruh dari
penggunaan barang pecah belah, nitrogen dan
vakum sebagaimana pengaruh dari suhu tinggi.
Direkomendasikan untuk menambahkan
antioksidan di awal prosedur
HPLC metode yang dapat diterima dalam
pengukuran Vitamin A (karena akurat)
7
29/05/2017
PRINSIP
Sampel disaponofikasi, vitamin A akan
terekstrak ke dalam larutan organik dan
terkonsentrasi. Semua trans-retinol dan 13-cis-
retinol ditentukan dengan HPLC dengan kolom
silika.
8
29/05/2017
PROSEDUR
Preparasi Sampel
Transfer sampel (makanan formula atau susu
cair) ke dalam tabung digesti 100 ml,
tambahkan 10 ml etanolik pirogallol (2%
pirogallol dalam 95% etanol) dan sabunkan
dengan etanolik KOH (10% KOH dalam 90%
etanol) pada suhu ruang selama 18 jam atau
pada suhu 70 C dengan menggunakan reflux
vessel.
PARAMETER KROMATOGRAFI
9
29/05/2017
PERHITUNGAN
Semua trans retinol (mg/ml)
= (At/Ast x Wt x DF)/V
Ket :
At = area puncak sampel
Ast= area puncak standar
Wt = berat sampel
V = volume sampel
DF = faktor pengenceran
VITAMIN E
10
29/05/2017
PRINSIP
Untuk produk makanan umumnya sampel
disabunkan dengan reflux, diekstrak dengan
heksan dan diinjeksi ke dalam fase normal kolom
HPLC yang disambungkan pada detektor
fluoresensi
Untuk Margarin dan Minyak nabati sampel
dilarutkan dalam heksan, MgSO4 ditambahkan
untuk mengganti air kemudian difilter dan diuji
dengan HPLC
Untuk minyak dilarutkan dalam heksan dan
diinjeksi secara langsung ke dalam kolom HPLC
11
29/05/2017
PROSEDUR
12
29/05/2017
PARAMETER KROMATOGRAFI
Kolom Hibar RT, Lichrosorb Si60 5m, 25
cmx4.6 mm
Fase mobil 0,9% isopropanol dalam
heksan
Flow 1 ml/menit
Detektor-fluoresensi, Ex = 290 nm, Em = 330
nm
13
29/05/2017
14
29/05/2017
VITAMIN C
Metode Titrasi 2,6 dicloroindophenol
Prinsip
L-asam askorbat dioksidasi menjadi L-asam
dehidroaskorbat. Pada akhir titrasi akan
menunjukkan warna merah muda.
Perhitungan :
mg asam askorbat/ml sampel =
Standard (mg/ml) x volume titrasi sampel x
(FP/berat sampel)
PROSEDUR
Preparasi sampel
Timbang dan ekstrak sampel dalam asam metafosforat-asam
asetat (15 g HPO4 dan 40 ml HOAc dalam 500 ml air), filter
dengan sentrifus dan encerkan sampai konsentrasi 10-100 mg
asam askorbat/100 ml.
Preparasi standard
Timbang 50 mg asam askorbat dan encerkan sampai 100 ml
dengan asam metafosforat-asam asetat
Titrasi
Titrasi sampel dan standard (3 ulangan) dengan
dikloroindophenol sampai berwarna merah muda sedikitnya 10
detik
15
29/05/2017
METODE MIKROFLOUROMETRIK
Prinsip
Metode ini mengukur asam askorbat dan
asam dehidroaskorbat
Asam askorbat dioksidasi membentuk asam
dehiroaskorbat dan direaksikan dengan o-
phenilenediamin membentuk komponen
fluoresen quinoxalin
PROSEDUR
Preparasi Sampel
Sama dengan metode titrasi, jumlahnya 100 ml
untuk standard dan sampel, tambahkan 2 asam
Norit, gojog dan saring
Preparasi blanko
Transfer 5 ml filtrate ke dalam tabung volumetrik
100 ml yang mengandung 5 ml H3BO3- NaOAc,
biarkan selama 15 menit, kocok. Transfer 2 ml
larutan ke dalam 3 tabung
16
29/05/2017
Penentuan Sampel
Transfer 5 ml standard dan sampel ke dalam tabung
volumetrik yang mengandung 5ml dari 50% NaOAc
trihidrid dan 27 ml air. Encerkan sampai volume dengan
air kemudian transfer 2 ml standard dan sampel ke dalam
tabung fluoresen
Pembentukan Quinoxalin
Tambahkan 2 ml dari 20 % larutan o-fenilenediamin-
aquades ke tiap tabung. Kocok dengan vortex dan
biarkan selama 35 menit pada suhu ruang
Pengukuran
Ukur fluoresen pada Ex = 356 nm dan Em= 440 nm
TIAMIN (B1)
Prinsip
Ekstraksi dan hidrolisis enzimatis dari ester-
ester tiamin fosfat dan pembersihan
Metode ini didasarkan pada pengukuran
fluoresensi dari bentuk oksidasi tiamin
(tiokrom)
17
29/05/2017
PROSEDUR
Preparasi Sampel
Timbang sampel yang mengandung 10-20g tiamin,
tambahkan HCl, campur, autoklaf selama 15 menit pada
121 C, atur pH sampai 4,5-5,0 dengan HCl,
Hidrolisis Enzim
Tambahkan larutan enzim dan inkubasi selama 3 hari
pada suhu 45-50 C, dinginkan sampel atur pH sampai
3,5, encerkan sampai volume dengan air, campur dan
saring. Larutan standard diperlakukan dengan enzim
yang sama.
18
29/05/2017
RIBOVLAFIN (B2)
Struktur mirip gula ribosa
Larut air dan memberi warna fluoresens
kuning kehijauan
Mudah rusak oleh cahaya dan sinar UV
Tahan panas, oksidator, asam namun sensitif
pada suasana basa
Prinsip
Ektraksi, pembersihan dan kompensasi adanya
substansi pengganggu
Ditentukan dengan fluorometer
Titik Kritis
Karena sensitif pada UV maka semua prosedur
dilakukan pada ruang minim cahaya.
Adanya proses oksidasi permanganat perlu
diperhatikan untuk hasil yang reliable
19
29/05/2017
PROSEDUR
Preparasi Sampel
Timbang sampel homogen, tambahkan 0,1N
HCl campur kemudian autoklaf selama 30
menit pada suhu 121 C dan dinginkan.
Endapkan substansi pengganggu dengan
mengatur pH 6 dan segera diikuti
pengaturan pH 4,5, encerkan sampai volume
dengan air dan saring
20
29/05/2017
21