Gallardo MKK

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACUTICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGA QUMICA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA APLICADA
Patrocinante Directores
Q. Jos Mario Romero Reyes Q.F Luis Lpez Valladares
Q. Jos Mario Romero Reyes
Departamento de Ciencia de los Departamento de Ciencia de
los
Alimentos y Tecnologa Qumica Alimentos y Tecnologa
Qumica
Universidad de Chile. Universidad de Chile.
Accin antimicrobiana de un desinfectante de uso industrial y domstico sobre

cepas de Staphylococcus aureus y Escherichia coli
Memoria para optar al ttulo de Ingeniero en Alimentos
MARA DANIELA GALLARDO TRONCOSO
Santiago, Chile
2006
1
NDICE
I. RESUMEN 3
II. SUMMARY 4
III. INTRODUCCIN 6
IV. OBJETIVOS 8
4.1 Objetivo general 8
4.2 Objetivos especficos 8
V. MATERIALES Y MTODOS 9
5.1 MATERIALES 9
5.1.1 Desinfectante 9
5.1.2 Neutralizante 9
5.1.3 Cepas 9
5.2 MTODOS 10
5.2.1 Recuento inicial de cepas 10
5.2.2 Determinacin de la actividad antimicrobiana 10
5.2.3 Control del neutralizante 12
VI. RESULTADOS 13
6.1 Control del neutralizante 13
6.2 Actividad antimicrobiana 13
6.2.1 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre 13

Escherichia coli salvaje

Staphylococcus aureus salvaje
Escherichia coli ATCC 25922

Staphylococcus aureus ATCC 29213
VII. DISCUSIN 23
2
7.1 Resumen velocidad especfica de muerte (k) 23
7.2 Accin germicida del desinfectante frente a las cepas estudiadas 25
7.3 Valores de coeficiente de dilucin () 30
7.4 Anlisis estadstico 31
VIII. CONCLUSIONES 32
IX. BIBLIOGRAFA 34
I. RESUMEN.
La desinfeccin de verduras y frutas es un tratamiento, destinado a reducir la

microflora presente en forma natural en estos alimentos o aquella que se incorpora a
travs de las distintas etapas que ocurren desde su cultivo, hasta que el producto sea
expendido y consumido. La desinfeccin tambin abarca las superficies y equipos de
3
trabajo, donde se procesan y manipulan alimentos, para as asegurar la inocuidad al
consumidor.
Se realiz un estudio comparativo in vitro de la actividad germicida de un
desinfectante, compuesto por una mezcla de monoster de propilenglicol, cido lctico
y cido ctrico, entre otros. Este fue probado a diferentes tiempos de accin y
concentraciones, incluyendo la recomendada por el fabricante.
Las pruebas se realizaron frente a cepas de Staphylococcus aureus salvaje y

ATCC 29213 y Escherichia coli salvaje y ATCC 25922. Se determin la cintica de
muerte de los microorganismos para as evaluar la eficacia germicida del desinfectante,
la velocidad especfica de muerte, coeficiente de dilucin y el tiempo de reduccin de
los microorganismos.
La eficiencia germicida in vitro del desinfectante a 400 ppm fue de 99,999%,

para Escherichia coli salvaje, Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus
ATCC 29213 a los 15 minutos, lo cual demuestra que es un buen bactericida, para
dichas cepas. Sin embargo, para Staphylococcus aureus salvaje solo se observ un
99,850% de eficacia a la misma concentracin y tiempo.
Staphylococcus aureus salvaje y ATCC 29213 result ms resistente que

Escherichia coli salvaje y ATCC 25922 lo cual se demuestra por los valores obtenidos
para el tiempo de reduccin decimal y velocidad especfica de muerte.
4
II. SUMMARY.
Antimicrobial action of a disinfectant used at the food industry and at home, against
Staphylococcus aureus and Escherichia coli strains.
The disinfection of vegetables and fruits is a treatment aimed to reduce the

microflora that grows naturally in these foodstuffs or that is incorporated through
different occurring stages from cultivation until the product is sold and consumed.
Disinfection also must be carried out on the working surfaces and equipments where
food is processed and manipulated, to ensure the safety for the consumer.
In this study, an in vitro comparative study of the germicide activity of a disinfectant

composed of a mixture of monoester of propylene glycol, lactic acid and citric acid
among others, was performed. This product was tested at different action times and
concentrations, including those recommended by the manufacturer.
The tests were carried out against wild type and ATCC strains of Staphylococcus
aureus (ATCC 29213) and Escherichia coli (ATCC 25922). The evaluated parameters
were the kinetics of death of the microorganisms, the germicide efficacy of the
disinfectant, the specific death rate, the dilution coefficient and the reduction time of the
microorganisms.
The in vitro germicide efficiency of the disinfectant at 400 ppm during 15 minutes of
contact was 99,999%, for the wild type of Escherichia coli, for Escherichia coli ATCC
25922 and for Staphylococcus aureus ATCC 29213. This fact demonstrates that the
disinfectant has a good bactericide effect on the assayed microorganisms; however, for
the wild type of Staphylococcus aureus only a 99, 850% of efficacy using the same
concentration and time was observed.
5
The wild type of Staphylococcus aureus and the ATCC 29213 strain showed a
greater resistance than the two strains of Escherichia coli, which is demonstrated in the
results obtained for the decimal reduction time and specific death rate.
6
III. INTRODUCCIN.
La contaminacin microbiolgica de los alimentos, es un problema permanente

en la industria. Sin embargo, hoy en da con el establecimiento de estndares
microbiolgicos cada vez ms exigentes y el avance tecnolgico, se ha logrado
solucionar, en parte, este problema. ltimamente se han desarrollado una gran
variedad de productos detergentes y desinfectantes, que aplicados en adecuados
programas de sanitizacin, ayudan a prevenir y reducir la contaminacin microbiolgica
(Ureta, 1997).
Los desinfectantes se utilizan tanto en los alimentos como tambin en las

superficies de trabajo, equipos utilizados en la industria de alimentos y manipuladores.
Para la industria de alimentos, la formacin de biopelculas en la maquinaria puede
provocar la contaminacin del producto con patgenos, es por eso que se necesitan
mejores prcticas sanitarias y tratamientos en su elaboracin, de modo que sean ms
seguros al consumo humano (Betancourth et al., 2004).
Un reporte del FDA revela que en el 70% de restaurantes monitoreados durante

un estudio, se observ que no se realiza una sanitizacin efectiva del equipo y
superficies de trabajo (Flynn, 2000).
Se ha difundido el uso de productos naturales y biodegradables, en la industria

de alimentos, debido a que stos generan un mnimo de corrosin a los equipos, no
daan al personal que los emplea y su efecto residual es fcilmente controlable,
adems estos productos han sido aprobados por el FDA. El uso de estos compuestos
en comparacin con los productos de sntesis qumica ha demostrado una serie de
ventajas. Entre los usos que se le dan en la agroindustria, estn en trminos
principales, la disminucin o eliminacin de riesgos microbiolgicos. Actan por
contacto, pueden aplicarse a travs de aspersiones, inmersiones, nebulizaciones y
mezclas con otros productos afines, asegurando aun ms su eficacia.
7
Los extractos ctricos han logrado en el ambiente agrcola, pecuario e industria
de proceso, sustituir a los agentes qumicos de uso comn para eliminar las
contaminaciones fngicas y bacterianas, pero sin afectar a las materias primas y/o los
consumidores finales (www.organicitrus.s5.com).
Este es el caso del producto natural orgnico compuesto en sus inicios por
extracto de semilla y pulpa de toronja. Posee accin bactericida y fungicida de amplio
espectro, presenta efecto antioxidante, es biodegradable y no se acumula en los tejidos
ni deja residuos. Otras ventajas son las de no conferir olor, color, ni sabor a los
alimentos, en las concentraciones recomendadas. Puede presentar diversas
aplicaciones en la industria pesquera, industria lctea, quesera y de helados,
agroindustria y otros (www.engormix.com). Debido a los resultados demostrados por
este producto, se comenz a sintetizar llegando en la actualidad a encontrarse una
gama de productos 100% sintticos. Siendo un ejemplo de esto el producto compuesto
por una mezcla de: glicerol, monoster de propilenglicol, cido lctico, cido ctrico,
cido ascrbico, cloruro de sodio y cido propinico.
Escherichia coli es un microorganismo que se encuentra generalmente en el

intestino del hombre y de los animales y por esto se lo considera un indicador de
contaminacin de origen fecal, si se detecta su presencia en productos alimenticios
(Dontorou et al.,2003).
Otro microorganismo de importancia en alimentos es Staphylococcus aureus el

cual puede causar enfermedades y muerte en poblaciones de alto riesgo (Griffin &
Tauxe, 2002). Puede estar presente en piel de animales y personas, adems en sus
fosas nasales y garganta. Los manipuladores de alimentos pueden favorecer su rpida
extensin, por lo cual es fundamental su supervisin y control a nivel de industria
elaboradora de alimentos (Griffin & Tauxe, 2002).
En el presente estudio se determinar la accin biocida de dicho producto de

uso industrial y domstico frente a cepas salvajes y de coleccin de microorganismos
Gram (+) Staphylococcus aureus y Gram (-) Escherichia coli.
8
IV. OBJETIVOS.
4.1 Objetivo General

- Determinar el efecto biocida de un desinfectante de uso industrial y domstico
frente a cepas de coleccin de Staphylococcus aureus ATCC 29213,
Escherichia coli ATCC 25922 y cepas salvajes de Staphylococcus aureus y
Escherichia coli.
4.2 Objetivos especficos

- Realizar pruebas de accin germicida del producto desinfectante.
- Determinar la cintica de accin germicida y eficiencia germicida porcentual
(E%), mediante pruebas in vitro a distintas concentraciones y tiempos de accin
del desinfectante.
- Establecer parmetros cinticos de destruccin para los microorganismos,
velocidad especfica de muerte (t-1) y tiempo de reduccin decimal (TRD) (min).
- Comparar la accin del desinfectante sobre cepas salvajes y cepas de
coleccin.
Hiptesis:
- El desinfectante presenta una actividad germicida a la concentracin y tiempo
recomendado frente a cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus de
coleccin y salvajes, siendo estas ltimas ms resistentes a la accin del
desinfectante.
9
V. MATERIALES Y MTODOS
5.1 MATERIALES
5.1.1 Desinfectante
- El desinfectante estudiado es un producto comercial compuesto por una mezcla
de glicerol, monoster de propilenglicol, cido lctico, cido ctrico, cido
ascrbico, cloruro de sodio y cido propinico. Este fue probado a diferentes
tiempos de accin y concentraciones, incluyendo los recomendados por el
fabricante. Las concentraciones ensayadas fueron 300, 400 y 500ppm y los
tiempos 5, 10 y 15 minutos.
5.1.2 Neutralizante
Compuesto por:
- Tween 80 30ml/100ml Diluyente:
- NaHSO3 6,25ml (40%) - Peptona 1g
- Na2S2O3 3,92g - NaCl 8,5g
- Triptona c.s.p. 250ml - H2O 1000ml
5.1.3 Cepas
Las cepas utilizadas en este estudio fueron:
- Escherichia coli ATCC 25922
- Escherichia coli (cepa salvaje)
- Staphylococcus aureus ATCC 29213
- Staphylococcus aureus (cepa salvaje)
10
5.2 MTODOS.
5.2.1 Recuento inicial de las cepas.
La cuantificacin se realiz por el mtodo de conteo en Placa Petri, segn las
especificaciones de ICMSF (1978). En cada caso las placas fueron incubadas a 35C
durante 24 horas.
5.2.2 Determinacin de la actividad antimicrobiana.

La metodologa utilizada fue la recomendada por la AOAC (1984), para medir
efectividad de desinfectantes sobre microorganismos de prueba. Se trabaj con un
cultivo puro de 24 horas de incubacin de la cepa en estudio, de ste se extraa una
alcuota de 1 mL para realizar el recuento inicial detallado en punto 5.2.1.
De forma paralela, se extrajo otra alcuota de 1mL y se puso en contacto con 99
mL de desinfectante, a las concentraciones en estudio. De esta suspensin se tomaron
alcuotas de 1 mL a los tiempos determinados, y se inactivaron en las soluciones de
neutralizante correspondientes; luego se efectuaron sucesivas diluciones decimales de
estas alcuotas para realizar el recuento de microorganismos sobrevivientes; para lo
cual se utiliz como medio de cultivo, Tryptona soya agar (TSA). Las placas fueron
incubadas a 35C durante 24 horas, y se efectu el recuento de las colonias
desarrolladas.
Los ensayos fueron realizados por triplicado y los resultados corresponden a la
media de ellos, calculndose tambin su desviacin estndar.
Los resultados obtenidos son expresados en funcin de:
A) velocidad especfica de muerte (minutos1).
La cintica de muerte de los microorganismos se expresa de acuerdo a la
siguiente expresin, donde k es la velocidad especfica de muerte y corresponde a la
pendiente de la recta resultante del grfico ln Nt vs t.
ln (Nt / No) = - k t
Donde: No = nmero de microorganismos iniciales.

Nt = nmero de microorganismos sobrevivientes al tiempo t.
11
t = tiempo de contacto entre el desinfectante y el microorganismo.
k = velocidad especfica de muerte.
La recta obtenida en el grfico ln Nt vs t, presenta algunas desviaciones de la
linealidad debido a que la velocidad especfica de muerte no permanece constante, ya
que la concentracin del desinfectante va disminuyendo a medida que ste acta en el
tiempo.
Valores elevados de velocidad especfica de muerte, implican menor resistencia
de los microorganismos a la accin de un determinado desinfectante.
B) eficiencia germicida porcentual (%).
El valor de la eficiencia germicida corresponde al porcentaje de
microorganismos que son destruidos por la accin del desinfectante, y se obtiene a
partir de la siguiente expresin:
Eficiencia (%) = No Nt x 100
No
Donde: No = nmero de microorganismos iniciales.

Nt = nmero de microorganismos sobrevivientes al tiempo t.
Como criterio de eficacia, se utiliz el test de Chambers, el cual seala que se

acepta como buen desinfectante un producto que, a la concentracin recomendada,
cause un 99,999% de muerte a una cantidad entre 7,5 x 107 y 1,3 x 108 clulas/mL, en
30 segundos (Ayres, 1980).
C) tiempo de reduccin decimal (TRD).
El tiempo de reduccin decimal (TRD) indica, el tiempo necesario para disminuir
en un ciclo logartmico la cantidad de microorganismos presentes en una muestra de
ensayo (Ureta, 1997).
El tiempo de reduccin decimal queda determinado por la siguiente expresin:
TRD = 2.3
k
Donde: k = velocidad especfica de muerte.
Por ltimo se calcul, el coeficiente de dilucin (), el cual expresa la relacin
entre la actividad y la concentracin del desinfectante frente a un determinado
microorganismo, de acuerdo a la siguiente expresin:
12
C t = constante
Donde: C = concentracin del desinfectante.
t = tiempo de accin para disminuir en un determinado porcentaje la
contaminacin inicial de microorganismo.
= coeficiente de dilucin.
Luego, el coeficiente de dilucin se obtiene a partir de la siguiente expresin:

= (log t2 log t1)
(log c1 log c2)
Donde: t = tiempo.
c = concentracin.
Un valor elevado del coeficiente de dilucin () significa una gran dependencia
de la accin del desinfectante con la concentracin del producto. (Hugo, 1971).
Los resultados se analizaron a travs de un anlisis de varianza multifactorial
mediante el software Statgraphics Plus 4.0, con un nivel de confianza del 90%.
5.2.3 Control del neutralizante.

Esta prueba se realiz para verificar que el neutralizante usado en los ensayos
con el desinfectante, no tiene efecto bactericida y que cumple su efecto neutralizador.
La metodologa empleada fue la recomendada por Russel (1998).
13
VI. RESULTADOS.
6.1 Control del Neutralizante

Tabla 1
Control del Neutralizante.
Escherichia
Recuento Escherichia coli Staphylococcus Staphylococcus
coli ATCC
ATCC salvaje aureus salvaje aureus ATCC 29213
25922
Recuento inicial 3,3x 103 ufc/mL 2,4x 103 ufc/mL 3,4 x 103 ufc/mL 3,7 x 103 ufc/mL
Recuento
3,1 x 103 ufc/mL 2,4x 103 ufc/mL 3,3 x 103 ufc/mL 3,5 x 103 ufc/mL
sobrevivientes
La tabla 1 muestra los valores promedios del recuento de microorganismos

iniciales y sobrevivientes para el control del neutralizante. Los recuentos de
3
microorganismos sobrevivientes, para ambas cepas, son del orden de 10 ufc/mL, lo cual
demuestra que el neutralizante inactiva en forma eficaz el desinfectante estudiado y no
presenta efecto bactericida sobre las cepas estudiadas.
6.2 Actividad antimicrobiana.

6.2.1 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre Escherichia coli cepa
salvaje.
8
7
6
log (ufc/ml)
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15
Tiempo (min)
300ppm 400pm 500pm
Figura 1: Efecto in vitro del desinfectante a 300, 400 y 500 ppm,

sobre Escherichia coli (cepa salvaje).
14
La Figura 1 presenta el efecto in vitro del desinfectante sobre Escherichia coli
(cepa salvaje) a las diferentes concentraciones y tiempos estudiados. A 300 ppm se
logra una reduccin de 3 ciclos logartmicos a los 5 min de accin, aumentando a 4
ciclos a los 10 min y a ms de 5 ciclos a los 15 min. Sin embargo a 400 y 500 ppm se
reduce la poblacin microbiana en 6 ciclos a partir de los 5 min de accin. No se
aprecia diferencia en la accin germicida a las concentraciones de 400 y 500 ppm.
Tabla 2
Actividad antimicrobiana del desinfectante a distintas concentraciones sobre
Escherichia coli (cepa salvaje).
300 ppm
N
Tiempo (min) E (%) k (min -1) TRD (min)
(ufc/mL)
0 3,81E+07 - - -
5 2,75E+04 99,812 1,41 1,69
10 1,1E+02 99,997 1,04 2,20
15 5E+01 99,997 0,87 2,65
400 ppm
N
(ufc/mL)
0 2,9E+07 - - -
5 <10 >99,999 3,40 0,67
10 <10 >99,999 1,69 1,35
15 <10 >99,999 1,13 2,02
500 ppm
N
(ufc/mL)
0 4,3 E+07 - - -
5 <10 >99,999 3,45 0,66
10 <10 >99,999 1,72 1,31
15 <10 >99,999 1,14 2,01
Tiempo recomendado por el fabricante: 15 minutos
Concentracin recomendada por el fabricante: 400 ppm.
Nota: Valores de k y TRD fueron calculados para cada tiempo respecto del recuento inicial a
tiempo cero.
15
Los datos presentados en Tabla 2 muestran los valores de E(%), K y TRD para
Escherichia Coli (cepa salvaje) a diferentes concentraciones y tiempos estudiados. A
300 ppm se logra solo un 99,997 % de eficacia a los 15 min, mientras que a 400 y 500
ppm se logra una eficacia mayor del 99,999% a los 5 min.
Para las concentraciones de 400 ppm y 500 ppm, y a los 15 minutos, los TRD
fueron similares, y menores al obtenido a 300 ppm al mismo tiempo de accin. Igual
situacin se observa en los valores de k, donde tambin hubo diferencias entre los
resultados de 300 ppm con respecto a las otras dos concentraciones.
6.2.2 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre Staphylococcus

aureus cepa salvaje.
9
8
7
Log (ufc/ml)
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15
Tiempo (min)
300ppm 400 pm 500 ppm
Figura 2: Efecto in vitro del desinfectante a 300, 400 y 500 ppm,

sobre Staphyloccus aureus (cepa salvaje).
La Figura 2 presenta el efecto in vitro del desinfectante sobre Staphylococcus

Aureus (cepa salvaje) a las diferentes concentraciones y tiempos estudiados. En
promedio, la cantidad inicial de microorganismos en las tres experiencias realizadas es
del orden de 107 ufc/mL.
En esta cepa de origen salvaje, se observa un efecto ms diferenciado entre las

concentraciones de desinfectante ensayadas. Tanto a 300 ppm, 400 ppm y 500 ppm se
16
evidencia a los 5 min de accin la mayor velocidad de destruccin. Luego comienza a
decrecer la velocidad hasta llegar a los 15 min. Frente a esta cepa la eficacia del
producto es menor, ya que no se logra reducir 5 ciclos logartmicos al tiempo mximo
estudiado, 15 min. Esto estara demostrando la resistencia de esta cepa a la accin del
desinfectante.
Tabla 3
Staphylococcus aureus (cepa salvaje).
300 ppm
N
(ufc/mL)
0 2,2E+07 - - -
5 1,9E+06 89,402 0,50 2,12
10 2,62E+05 97,368 0,41 3,12
15 9,95E+04 99,211 0,38 3,84
400 ppm
N
(ufc/mL)
0 4,1E+07 - - -
5 1,72E+05 99,540 1,08 2,12
10 2,7E+04 99,923 0,74 3,12
15 5,5E+03 99,985 0,60 3,84
500 ppm
N
(ufc/mL)
0 1,6E+07 - - -
5 2,2E+04 99,853 1,32 1,74
10 5,45E+03 99,965 0,79 2,87
15 3,26E+02 99,998 0,73 3,13
Tiempo recomendado por el fabricante: 15 minutos.

tiempo cero.
Los datos presentados en Tabla 3 muestran los valores de E(%), k y TRD para
Staphylococcus aureus (cepa salvaje), a diferentes concentraciones y tiempos
estudiados.
17
Respecto a la eficiencia, se observa que a 300 ppm apenas se reduce en 2
ciclos la poblacin inicial, luego de 15 min de contacto con el producto. A 400 ppm, la
eficiencia aumenta solo en un ciclo al mismo tiempo y a 500 ppm, ya se observa una
disminucin de 4 ciclos al mximo tiempo ensayado. Cabe destacar que a ninguna de
las concentraciones probadas se logra un 99,999% de destruccin bacteriana.
-1 -1
Los valores de k varan de 0,5 min a 300 ppm hasta 1,32 min al usar 500
ppm a los 5 min de accin. Igual situacin sucede con los TRD, donde no se aprecia
mayor diferencia entre concentraciones, lo que estara demostrando la mayor
resistencia a la accin germicida de este microorganismo.
De acuerdo a los resultados que se presentan en las tablas 2 y 3, se observa

que la cepa salvaje de Escherichia coli es ms sensible que la cepa salvaje de
Staphylococcus aureus, a cualquiera de los tiempos y concentraciones usadas del
desinfectante.
6.2.3 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre Escherichia

coli ATCC 25922.
6
Log (ufc/ml)
0
0 5 10 15
Tiempo (min)
300 ppm 400ppm 500ppm
Figura 3: Efecto in vitro del desinfectante usado a 300, 400 y 500 ppm,
sobre Escherichia coli ATCC 25922.
18
La Figura 3 presenta el efecto in vitro del producto desinfectante sobre
Escherichia coli ATCC 25922 a las distintas concentraciones y tiempos estudiados,
incluyendo los recomendados por el fabricante. La cantidad inicial de microorganismos
observada en las tres experiencias realizadas es del orden de 107. Luego de 15
minutos, se observan valores <10 ufc/mL para las concentraciones de 300 y 400 ppm.
A la concentracin de 500 ppm, se llega a niveles <10 ufc/mL, lo que representa una
eficacia mayor al 99,999%. Lo que significa una reduccin de ms de 5 ciclos
logartmicos. Cabe mencionar sin embargo, que este producto no cumple con lo
establecido por el test de Chambers, si se considera el tiempo de accin requerido.
19
Tabla 4
Actividad antimicrobiana del desinfectante a distintas concentraciones
sobre Escherichia coli ATCC 25922.
300 ppm
N
(ufc/mL)
0 2,8E+07 - - -
5 4,3E+03 99,982 1,77 1,30
10 4,9E+02 99,998 1,11 2,07
15 <10 >99,999 1,14 2,01
400 ppm
N
(ufc/mL)
0 2,3E+07 - - -
5 <10 >99,999 3,31 0,66
10 <10 >99,999 1,71 1,34
15 <10 >99,999 1,14 2,01
500 ppm
N
(ufc/mL)
0 2,1E+07 - - -
5 <10 >99,999 3,31 0,69
10 <10 >99,999 1,65 1,38
15 <10 >99,999 1,10 2,08
tiempo cero.
Escherichia coli ATCC 25922, a las diferentes concentraciones y tiempos estudiados
(incluyendo los recomendados por el fabricante).
Para todas las concentraciones estudiadas, a los 15 minutos se observan
eficiencias mayores a 99,999%. Esto representa una disminucin de por lo menos 6
ciclos logartmicos, al tiempo recomendado por el fabricante.
Con respecto al TRD, a los 15 minutos de accin, para las concentraciones de
300 y 400 ppm, se obtiene valores menores a los obtenidos en la experiencia con
Staphylococcus aureus ATCC 29213.
20
La rapidez de destruccin en el caso de Escherichia coli ATCC 25922 no es
constante a travs del tiempo, lo que se evidencia a travs de los valores de k. Los
promedios de stos son de 0,87; 1,49 y 1,12 min-1 a las concentraciones de 300, 400 y
500 ppm, respectivamente. En este caso, se puede apreciar de manera ms clara la
existencia de una correlacin inversamente proporcional entre el aumento de la
concentracin y el tiempo de contacto del desinfectante con respecto a la disminucin
de la flora microbiana.
6.2.4 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre Staphylococcus

aureus ATCC 29213.
9
8
7
Log (ufc/ml)
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15
Tiempo (min)
300 ppm 400 ppm 500 ppm
Figura 4: Efecto in vitro del desinfectante usado a 300, 400 y 500 ppm,
sobre Staphylococcus aureus ATCC 29213.
La Figura 4 presenta el efecto in vitro del producto desinfectante sobre ATCC

29213 a las concentraciones y tiempos estudiados, incluyendo los recomendados por
el fabricante. Al igual que para Escherichia coli ATCC 25922 tanto la concentracin y
tiempo recomendado es 400 ppm, y de 15 minutos, respectivamente. La cantidad
inicial de microorganismos en las tres experiencias realizadas es del orden de 107
ufc/mL.
Para las concentraciones de 400 ppm y 500 ppm, luego de 15 minutos de
accin, se observa una reduccin significativa, llegando a valores <10ufc/mL, lo que
representa una disminucin de 6 ciclos logartmicos. Esto evidencia una eficacia mayor
21
al 99,999% en el tiempo recomendado. Sin embargo, los porcentajes de eficiencia para
Staphylococcus aureus ATCC 29213, son menores a los obtenidos para Escherichia
coli ATCC 25922.
Tabla 5
Staphylococcus aureus ATCC 29213.
300 ppm
N
(ufc/mL)
0 3,4E+07 - - -
5 5,53E+05 98,281 0,81 2,84
10 3,30E+04 99,893 0,69 3,31
15 4,07E+02 99,998 0,76 3,01
400 ppm
N
(ufc/mL)
0 5,2E+07 - - -
5 2,9E+04 99,880 1,38 1,60
10 4,5E+03 99,980 0,90 2,57
15 4,2E+01 99,999 0,93 2,47
500 ppm
N
(ufc/mL)
0 3,90E+07 - - -
5 3,79E+04 99,858 1,38 1,69
10 3,86E+03 99,987 0,91 2,52
15 <10 99,999 1,15 1,99
tiempo cero.
Staphylococcus aureus ATCC 29213, a las diferentes concentraciones y tiempos
estudiados (incluyendo los recomendados por el fabricante).
Se observan diferencias con respecto a los valores de E(%), k y TRD obtenidos

en las experiencias realizadas. Las eficiencias obtenidas en este caso, no son
elevadas y no se aprecia un buen efecto germicida, a las 400 ppm y a los 15 minutos
22
se obtiene una eficiencia de 99,999%, lo mismo ocurre a las 500 ppm (100 ppm ms
de la recomendada por el fabricante) y a los 15 minutos de accin. A 300 ppm solo se
alcanza un 99,998% de destruccin al mismo tiempo de contacto. El TRD promedio
para Staphylococcus aureus ATCC 29213 obtenido en este estudio a los 15 minutos de
accin, para las tres concentraciones estudiadas es de 2,49 minutos; A los 10 minutos
a 400 ppm y 500 ppm el TRD es de 2,57 y 2,52 minutos respectivamente.
Con respecto a la velocidad especfica de muerte, se observa que a los 5

minutos es cuando se logra la mayor rapidez de destruccin del Staphylococcus
aureus ATCC 29213 y luego decrece de manera paulatina. De manera general, se
puede apreciar la existencia de una correlacin inversamente proporcional entre el
aumento de la concentracin del desinfectante y la disminucin de la flora microbiana
en los ensayos realizados.
De acuerdo a los resultados que se presentan en las Tablas 4 y 5, se observa

de manera clara que Escherichia coli ATCC 25922 es menos resistente que
Staphylococcus aureus ATCC 29213, a cualquiera de las concentraciones y tiempos de
accin estudiados para el desinfectante.
23
VII. DISCUSIN
7.1 Velocidad especfica de muerte (k).
Tabla 6
Resumen velocidad especfica de muerte de las diferentes cepas frente al
desinfectante estudiado.
k (min-1)
Concentracin Tiempo Escherichia Staphylococcus Escherichia coli Staphylococcus
(ppm) (min) coli salvaje aureus salvaje ATCC 25922 aureus ATCC
29213
5 1,41 0,50 1,77 0,81
300 10 1,04 0,41 1,11 0,69
15 0,87 0,38 1,14 0,76
5 3,4 1,08 3,31 1,38
400 10 1,69 0,74 1,71 0,90
15 1,13 0,6 1,14 0,93
5 3,45 1,32 3,31 1,38
500 10 1,72 0,79 1,65 0,91
15 1,14 0,73 1,10 1,15
Segn Tabla 6 se observa que ambas cepas de Escherichia coli, salvaje y

ATCC 25922 presentan una resistencia similar a la accin del desinfectante, a
cualquier concentracin probada. Tambin se observa que a medida que transcurre el
tiempo disminuye k, lo cual es lo esperado debido a que la concentracin del
desinfectante va disminuyendo conforme pasa el tiempo. Ambas cepas de
Staphylococcus aureus presentan valores comparables entre iguales concentraciones.
Al efectuar una comparacin entre Escherichia coli y Staphylococcus aureus
salvaje se aprecia una mayor resistencia por parte de Staphylococcus aureus salvaje
24
frente al desinfectante usado. En el caso de Staphylococcus aureus ATCC 29213 este
presenta una mayor resistencia al desinfectante estudiado que la cepa de coleccin de
Escherichia coli ATCC 25922 a cualquiera de las concentraciones probadas.
Escherichia coli salvaje muestra una resistencia mayor al desinfectante estudiado que
Escherichia coli ATCC 25922, esto concuerda con lo esperado, ya que la cepa de
coleccin debiera presentar una mayor sensibilidad al efecto del desinfectante. Este
resultado tambin se observ en las cepas de Staphylococcus aureus salvaje y ATCC
29213, lo cual se comprueba al ver los valores de k, los cuales son menores para el
caso de la cepa salvaje, a cualquiera de las concentraciones estudiadas.
Finalmente se presenta en orden decreciente, la resistencia de las cuatro cepas

estudiadas frente a la accin del desinfectante estudiado:
Staphylococcus aureus salvaje > Staphylococcus aureus ATCC 29213 >
Escherichia coli salvaje Escherichia coli ATCC 25922.
25
7.2 Accin germicida del desinfectante frente a las cepas estudiadas.
Tabla 7
Resumen de Eficiencia germicidas porcentuales del desinfectante frente a diversos
microorganismos.
% Eficiencia
Concentracin Tiempo Escherichia Staphylococcus Escherichia Staphylococcus

(ppm) (min) coli salvaje aureus salvaje coli ATCC aureus ATCC
25922 29213
5 99,812 84,402 99,982 98,281

300 10 99,997 97,368 99,998 99,893
15 99,997 99,211 >99,999 99,998
5 >99,999 99,540 >99,999 99,880
400 10 >99,999 99,923 >99,999 99,980
15 >99,999 99,985 >99,999 99,999
5 >99,999 99,853 >99,999 99,858
500 10 >99,999 99,965 >99,999 99,987
15 >99,999 99,998 >99,999 99,999
Para todas las cepas se utiliz la dosis recomendada por el fabricante, 0,4 mg en
1 litro de agua, es decir una concentracin de 400 ppm, con un tiempo de contacto de
15 minutos, adems concentraciones adicionales de 300 ppm y 500 ppm, junto a otros
tiempos adicionales. La cantidad inicial de microorganismos observada en las tres
experiencias realizadas para cada cepa fue del orden de 107 ufc/ml.
Para una concentracin de 300 ppm y 15 minutos de accin del desinfectante,

se logra una reduccin significativa de 6 ciclos logartmicos solo para Escherichia coli
ATCC 25922, llegando a niveles de 101 ufc/mL, lo que representa una eficiencia mayor
al 99,999%. De acuerdo a los datos de Tabla 7 se puede observar, que a 300 ppm y a
los tiempos estudiados, ninguna de las cepas restantes logr una eficiencia del
99,999%, siendo la ms resistente Staphylococcus aureus salvaje con una eficacia de
26
99,211%. Datos similares son presentados por Acevedo (2006) a 300 ppm y a 15
minutos de accin sobre Escherichia coli O157:H7, en el cual se alcanza una eficiencia
de 99,999%, lo que representa una disminucin en 6 ciclos logartmicos en el tiempo
recomendado por el fabricante y a una concentracin menor a la recomendada.
Cabe mencionar otra investigacin sobre la inactivacin de Listeria

monocytogenes CECT 4032 en la superficie de tomates utilizando agua electrolizada
neutra (NEW), en la cual informa una reduccin superior a los 6 ciclos logartmicos
dentro de los 5 minutos de exposicin, a una concentracin de 90 mg/L de cloro activo.
Dicha investigacin, realizada por Deza et al., (2003), informa poblaciones iniciales de
microorganismos en la superficie de tomates, del orden de 107 ufc/mL, similares a las
obtenidas en el presente estudio in vitro. Esto evidencia que dicho desinfectante tiene
mejor efecto germicida que el usado en este estudio, sobre la bacteria Gram (+)
Staphylococcus aures ATCC 29213 y salvaje.
Para una concentracin de 400 ppm y 15 minutos de accin del desinfectante,
se observa una reduccin de 6 ciclos logartmicos para Escherichia coli ATCC 25922,
llegando a valores <10 ufc/mL, lo que evidencia una eficacia mayor a 99,999%. Cabe
destacar que para la misma cepa y a la misma concentracin, pero a un tiempo menor
al recomendado, es decir a 5 y 10 minutos de accin del desinfectante, tambin se
logro disminuir la contaminacin inicial, logrando valores <10 ufc/mL, es decir se
obtuvo una eficacia mayor al 99,999%. A la concentracin y tiempo recomendado, para
el desinfectante, es decir a 400 ppm y 15 minutos, tambin se logr reducir la
contaminacin inicial, para Escherichia coli salvaje, cuya eficacia fue mayor a 99,999%.
A tiempos menores de accin al recomendado para el desinfectante (5 y 10 minutos),
se logr reducir 6 ciclos logartmicos, llegando a valores <10 ufc/mL, estos valores
evidencian una eficacia mayor al 99,999%. En esta experiencia no se observa una
mayor diferencia entre la sensibilidad de las cepas frente al desinfectante. Para ambas
cepas de Escherichia coli se logra reducir la contaminacin inicial a un tiempo menor al
recomendado por el fabricante. Esto concuerda con los datos observados en un
estudio in vitro realizado por Ureta (1997), en el cual se alcanza una eficiencia de
99,999% sobre Escherichia coli ATCC 25922 a los 10 minutos de accin del mismo
producto, a una concentracin de 400 ppm.
27
En el estudio realizado por Deza et al., (2003), se observaron resultados sobre
Escherichia coli O157:H7 CECT 4267, con una reduccin mayor a los 6 ciclos
logartmicos dentro de los 5 minutos de exposicin a NEW. Esto evidencia que dicho
desinfectante tiene mejor efecto germicida que el usado en este estudio.
Para Staphylococcus aureus salvaje no se logr una eficiencia satisfactoria a la

concentracin recomendada; 400 ppm a ninguno de los tiempos estudiados, 5, 10 y 15
minutos de accin. La mxima eficacia obtenida se obtuvo a los 15 minutos de accin,
y cuyo valor fue de solo 99,985%. Estos resultados evidencian una baja accin
germicida del desinfectante frente a dicha cepa. No as para la cepa de coleccin
Staphylococcus aureus ATCC 29213, cuya eficacia fue 99,999% a los 15 minutos,
tiempo de accin recomendado. Esto deja entrever la mayor sensibilidad que muestran
las cepas de coleccin en comparacin con las cepas salvajes frente a la accin de
desinfectantes. Estos resultados son similares a los obtenidos por Ureta (1997), en un
estudio in vitro sobre Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Streptococcus faecalis
ATCC 33186. En ambos microorganismos, Gram positivos, se reportan eficiencias de
99,999% a 400 ppm de concentracin, pero a los 10 minutos de accin del mismo
desinfectante.
Los primeros valores mostrados en Tabla 7, ponen nuevamente en evidencia el

buen efecto germicida del desinfectante sobre Escherichia coli ATCC 25922 y salvaje,
no as para la cepa de Staphylococcus aureus salvaje. Para una concentracin de 500
ppm, del desinfectante estudiado, despus de 5 minutos de accin, se observan
valores <10ufc/mL, lo que representa una disminucin de 6 ciclos logartmicos. Esto
evidencia una eficacia mayor al 99,999% en un tiempo menor al recomendado para
Escherichia coli ATCC 25922, lo mismo se observ a los 10 y 15 minutos de accin.
Con respecto a Staphylococcus aureus ATCC 29213 se observan valores de

1
10 ufc/mL, es decir se logra disminuir 6 ciclos logartmicos la contaminacin inicial, lo
que representa una eficacia de 99,999%, a una concentracin de 400 ppm y 15
minutos de accin, concentracin y tiempo recomendados. Para Staphylococcus
aureus salvaje, se obtuvo un valor de 3,2x102 ufc/mL , lo que representa una eficacia
28
de 99,998%. Estos valores evidencian una menor sensibilidad de parte de la cepa de
salvaje en comparacin a la cepa de coleccin, frente a la accin del desinfectante
estudiado.
Investigaciones realizadas en el Stadslaboratorium Gent (1988), sobre

Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Streptococcus faecium DVG 8582, arrojan
eficiencias de 99,999% a los 5 minutos de accin de un producto desinfectante mixto
(cloruro de alquildimetil benzilamonio, glutaraldehdo, glioxal, formaldehdo, isopropanol
y excipientes), a una concentracin de 0,1% (concentracin recomendada por el
fabricante entre 0,25 a 0,5%). Esto estara demostrando una mayor eficacia que la del
desinfectante estudiado en este trabajo, ya que se logran mejores resultados para
Staphylococcus aureus en menor tiempo de accin.
Eficiencias menores a las observadas en este estudio, son las reportadas por
Diez de Medina (1983), con valores de 99,325% y 96,311% para Escherichia coli y
Pseudomonas aeruginosa, respectivamente, a la concentracin de 400 ppm y a los 10
minutos de accin de un compuesto de amonio cuaternario. Para un compuesto
anfoltico a 1500 ppm y al mismo tiempo de contacto, se obtiene una eficiencia de
79,810% sobre Escherichia coli.
Ureta (1997), en un estudio similar sobre una cepa de Staphylococcus aureus

ATCC 6538 obtiene una eficacia de 99,999% a los 10 minutos de accin y a una
concentracin de 400 ppm del mismo desinfectante. Esto difiere de los resultados
obtenidos en este estudio, esto podra deberse a que las cepas no son idnticas, ya
que el nmero de coleccin es diferente.
Segn las eficiencias presentadas en Tabla 7, a una concentracin de 300ppm,

Escherichia coli salvaje es ms sensible que Staphylococcus aureus salvaje con una
eficacia de 99,997% y de 99,211%, respectivamente a los 15 minutos de accin,
(tiempo recomendado). Sin embargo, ninguna de las cepas obtiene una eficacia
satisfactoria. De igual manera Escherichia coli ATCC 25922 es ms sensible en
comparacin con Staphylococcus aureus ATCC 29213, lo que se evidencia en los
29
valores de sus eficiencias, siendo estas de 99,999% y 99,998%, respectivamente, a
una concentracin de 300 ppm. Estos valores ponen de manifiesto la sensibilidad de
las cepas de coleccin con respecto a las cepas salvajes, tanto para Escherichia coli
salvaje como para Staphylococcus aureus salvaje, se obtienen valores menores de
eficiencia que sus pares de coleccin. Ya sea Escherichia coli salvaje versus
Escherichia coli ATCC 25922 o Staphylococcus aureus ATCC 29213, o bien sobre
Staphylococcus aureus salvaje versus Staphylococcus aureus ATCC 29213 o
Escherichia coli ATCC 25922. La accin bactericida del desinfectante estudiado
resulta ser mayor al aumentar la concentracin en 100 ppm, es decir a 400 ppm, sobre
Escherichia coli ATCC 25922 y Escherichia coli salvaje y Staphylococcus aureus
ATCC 29213, lo cual queda de manifiesto por los valores de sus eficiencias 99,999%,
para todas las cepas mencionadas anteriormente, sin embargo no se logr obtener una
eficacia satisfactoria para Staphylococcus aureus salvaje, la cual obtuvo un valor de
solo 99,985%. Este valor en comparacin a la eficiencia obtenida a una concentracin
de 300 ppm (99,211%) es superior, por lo tanto, se puede apreciar de manera ms
clara la existencia de una correlacin inversamente proporcional entre el aumento de la
concentracin y el tiempo de contacto del desinfectante con respecto a la disminucin
de la flora microbiana.
No se evidencian diferencias entre cepas salvajes y de coleccin para una

concentracin de 400 ppm. Sin embargo, cabe destacar que para Escherichia coli
ATCC 25922 y Escherichia coli salvaje se obtienen eficiencias mayores a 99,999%, a
tiempos menores al recomendado. No as para Staphylococcus aureus ATCC 29213,
ya que solo a los 15 minutos, tiempo recomendado logra reducir 5 ciclos logartmicos,
es decir obtiene una eficacia de 99,999%. Lo cual demuestra nuevamente que las
cepas de coleccin son ms sensibles a la accin bactericida del desinfectante. En
esta experiencia sigue siendo ms sensible la bacteria Gram (-), Escherichia coli ATCC
25922 que la bacteria Gram (+), Staphylococcus aureus ATCC 29213. La correlacin
inversamente proporcional entre el aumento de la concentracin y el tiempo de
contacto del desinfectante con respecto a la disminucin de la flora microbiana, queda
claramente demostrada al aplicar una concentracin de 500 ppm del desinfectante
estudiado sobre las cepas. En esta experiencia se logra reducir ms de 5 ciclos
30
logartmicos para Escherichia coli ATCC 25922 y Escherichia coli salvaje y
Staphylococcus aureus ATCC 29213, lo que pone en evidencia nuevamente el buen
efecto germicida del desinfectante, para estas cepas. Sin embargo, nuevamente no se
logra la eficacia deseada para Staphylococcus aureus salvaje.
En ninguna de las experiencias realizadas se logra el 99,999% de eficiencia

sugerida por Chambers. Se debe considerar que este indicador es demasiado riguroso,
ya que 30 segundos es un tiempo muy breve para la accin de un desinfectante, sobre
todo si es a nivel de superficies; adems los tiempos empleados en la industria de
alimentos para efectuar el proceso de desinfeccin, son de 10 minutos o ms, con lo
que se asegura que los desinfectantes logren su mxima eficacia.
7.3 Valores de coeficiente de dilucin ().
Tabla 8
Valor de coeficiente de dilucin () para el desinfectante
Staphylococcus
Escherichia Staphylococcus Escherichia coli
Desinfectante aureus ATCC
coli salvaje aureus salvaje ATCC 25922
29213
Producto
2,4 2,5 3,02 0,67
estudiado
Un valor del coeficiente de dilucin igual a 1 implica que la actividad del

desinfectante vara en potencia de 1 con la concentracin (Hugo, 1971).
De acuerdo a los valores de coeficiente de dilucin () presentados en Tabla 8,

se observa que el desinfectante presentara la mayor dependencia con respecto a la
concentracin frente a Escherichia coli ATCC 25922 y la menor frente a
Staphylococcus aureus ATCC 29213. Escherichia coli y Staphylococcus aureus
salvajes presentan valores de coeficiente de dilucin intermedios.
31
7.4 Anlisis estadstico.
Con los valores del recuento de microorganismos sobrevivientes, de

Escherichia coli salvaje (Tabla 2), Escherichia coli ATCC 25922 (Tabla 4)
Staphylococcus aureus salvaje (Tabla 3), y Staphylococcus aureus ATCC 29213 (Tabla
5), se realiz un anlisis de varianza multifactorial considerando la concentracin y el
tiempo de contacto como los factores en cada caso, para determinar la existencia de
diferencias significativas con un intervalo de confianza del 95% (ANEXO 1).
Segn ANEXO 1, para Escherichia coli (cepa salvaje) y Escherichia coli

ATCC 25922, con respecto al factor tiempo de contacto, no se estableci la
existencia de diferencias significativas, con un nivel de confianza del 95%. Esto se
comprueba al observar los valores de p-value para los factores estudiados, los
cuales son mayores que 0,05% para ambas cepas. Sin embargo para el factor
concentracin si hubo diferencia significativa con un 95% de confianza, para
Escherichia coli (cepa salvaje), lo cual se observa en tabla de Rangos Mltiples,
donde a 300 ppm existe diferencia significativa con respecto a la media obtenida a
una concentracin de 400 ppm y 500 ppm. Esto queda demostrado en los
recuentos realizados para Escherichia coli (cepa salvaje), los cuales se ven
disminuidos al aumentar la concentracin del desinfectante estudiado.
Segn ANEXO 1, para Staphylococcus aureus (cepa salvaje), con respecto al

factor tiempo de contacto, al igual que para el caso de las cepas de Escherichia coli, no
se estableci la existencia de diferencias significativas, con un nivel de confianza del
95%. Lo cual se comprueba al observar el valor de p-value para el factor estudiado.
Este resulta mayor al 0,05%, para dicha cepa de Staphylococcus aureus. No obstante,
para Staphylococcus aureus ATCC 29213, si existi diferencia significativa, con un
nivel de confianza del 95%, para el factor tiempo. Lo cual claramente se evidencia al
disminuir la cantidad de microorganismos sobrevivientes, al aumentar el tiempo de
contacto del desinfectante. Para el factor concentracin aplicado a ambas cepas de
Staphylococcus aureus, salvaje y ATCC 29213, no se observo la existencia de
diferencias significativas con un nivel de confianza del 95%. Lo cual se comprueba al
observar los valores de p-value para el factor estudiado.
32
VIII. CONCLUSIONES.
El neutralizante empleado no presenta actividad bactericida sobre las cepas

bacterianas probadas en este estudio y acta inhibiendo completamente al producto
desinfectante.
El desinfectante estudiado, a las condiciones de concentracin y tiempo

recomendado por el fabricante, es decir a 400 ppm y 15 minutos de accin, presenta
una buena accin germicida in vitro frente a Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia
coli salvaje y Staphylococcus aureus ATCC 29213. Logrando una reduccin de 6 ciclos
logartmicos. Sin embargo, presenta una dbil accin germicida in vitro frente a
Staphylococcus aureus salvaje a las condiciones mencionadas anteriormente.
Logrando una reduccin de 4 ciclos logartmicos.
Las eficacias obtenidas para Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli
salvaje, Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Staphylococcus aureus salvaje fueron
>99,999%, >99,999%, 99,999% y 99,985%, respectivamente.
Los valores de velocidad especfica de muerte y tiempo de reduccin decimal

calculados permiten concluir que, las cepas de Staphylococcus aureus ATCC 29213 y
la salvaje resultaron ms resistente que las de Escherichia coli ATCC 25922 y salvaje.
Los valores de coeficiente de dilucin demuestran que, el efecto desinfectante

con mayor dependencia de la concentracin es sobre Escherichia coli ATCC 25922
y el menor sobre Staphylococcus aureus ATCC 29213; Escherichia coli y
Staphylococcus aureus salvajes presentaron valores intermedios.
33
Solo para Escherichia coli se estableci diferencia estadsticamente significativa
entre las concentraciones probadas, con un nivel de confianza del 95%.
Para la cepa Staphylococcus aureus ATCC 29213, segn factor tiempo se
estableci diferencia estadsticamente significativa con un nivel de confianza del
95%.
La limpieza y sanitizacin requieren de una adecuada demostracin

experimental de su eficacia, por lo que es indispensable efectuar estudios de este tipo
a fin de llegar a seleccionar adecuadamente los productos a emplear.
34
IX. BIBLIOGRAFA.
1. Acevedo, M., (2006). Estudio comparativo de la eficacia de desinfectantes de

uso industrial sobre Listeria innocua ATCC 33090 y Escherichia coli O157:H7-
VT(N) NCTC 12900 Memoria para optar al ttulo de Ingeniero en Alimentos,
Universidad de Chile. Santiago de Chile.
2. AOAC, (1984). Official Methods of Analysis of the Association of Official
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3. Betancourth, M., Botero, J. y Rivera, S., (2004). Biopelculas: una comunidad
microscpica en desarrollo. Colombia Mdica. 35 (3) Supl1: 35-39.
4. Deza, M.A., Araujo, M. y Garrido, M.J., (2003). Inactivacin de Escherichia
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utilizando agua activada electroqumicamente. Instituto de Investigacin y
Anlisis Alimentario. Universidad de Compostela. Santiago de Compostela.
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5. Diez de Medina, Dafne (1983). Evaluacin de la Eficacia Germicida de
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Universidad de Chile. Santiago de Chile.
6. Dontorou, C., Papadopoulou, C., Filioussis, G., Economou, V.,Apostolou, I.,
Zakkas, G., et al. (2003). Isolation of Escherichia coli O157:H7 from foods in
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7. Flynn, J.F.,(2000). FDA Study Declares Unsanitized Food Preparation
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Chlorine Chemistry Council.
8. Griffin, P. M., Tauxe, R. V. (2002).The Epidemiology infection caused by
Escherichia coli O157:H7, other enterohemoragic Escherichia coli, and
associated hemolytic uremic syndrome. Epidemiological Review, 13:60-96.
35
9. Hugo, W.B., (1971) Chemical Disinfectants, Antiseptics and Preservatives.
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10. ICMSF, (1978). Microorganisms in Foods, their significance and methods of
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11. Russel, A.D.,(1998). Bacterial resistance to disinfectantants: present knowledge
and future problems. J. Hosp. infect. Supl 43: 57- 68.
12. Stadslaboratorium Gent, (1988). Determination of the anti-microbial power of
the formutation CID-20 (according to the European Suspension Test method
(EST). Belgium.
13. Ureta, F., (1997).Evaluacin de la actividad germicida de cido lctico, cido
peractico y extracto de semilla de toronja. Memoria para optar al ttulo de
Ingeniero en Alimentos, Universidad de Chile. Santiago de Chile.
14. http://www.organicitrus.s5.com
15. http://www.engormix.com
36
ANEXO 1

Anlisis de la Varianza para E.Coli salvaje - Sumas de Cuadrados de Tipo III
--------------------------------------------------------------------------------
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor
--------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
A:Tiempo 1,12482 2 0,562411 1,00 0,4444
B:Concentracin 7,50136 2 3,75068 6,67 0,0532
RESIDUOS 2,24964 4 0,562411

--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORREGIDO) 10,8758 8
--------------------------------------------------------------------------------
Los cocientes F estn basados en el error cuadrtico medio residual.
El StatAdvisor
--------------
La tabla ANOVA descompone la variabilidad de Coli salvaje en las
contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha elegido la
suma de cuadrados Tipo III (valor por defecto), se ha medido la
contribucin de cada factor eliminando los efectos del resto de los
factores. Los P-valores comprueban la importancia estadstica de cada
uno de los factores. Dado que ningn P-valor es inferior a 0,05,
ninguno de los factores tiene efecto estadsticamente significativo en
Coli salvaje para un nivel de confianza del 95,0%.
Tabla de Medias por mnimos cuadrados para E.Coli salvaje

con 95,0 Intervalos de confianza
--------------------------------------------------------------------------------
Error Lmite Lmite
Nivel Frecuencia Media Estndar Inferior Superior
--------------------------------------------------------------------------------
Media Total 9 1,64556
Tiempo
5 3 2,09667 0,432978 0,894522 3,29881
10 3 1,60667 0,432978 0,404522 2,80881
15 3 1,23333 0,432978 0,0311887 2,43548
Concentracin
300 3 2,93667 0,432978 1,73452 4,13881
400 3 1,0 0,432978 -0,202145 2,20214
500 3 1,0 0,432978 -0,202145 2,20214
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
Esta tabla muestra la Coli salvaje media para cada nivel de
factores. Tambin presenta el error estndar de cada media, lo cual
es una medida de su variabilidad en la muestra. Las dos columnas de
la derecha muestran 95,0% intervalos de confianza para cada una de las
medias. Puede visualizar estas medias e intervalos seleccionando
Grfico de Medias de la lista de Opciones Grficas.
37
Contraste Mltiple de Rangos para E.Coli salvaje segn Tiempo
--------------------------------------------------------------------------------
Mtodo: 95,0 porcentaje Duncan
Tiempo Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogneos
--------------------------------------------------------------------------------
15 3 1,23333 0,432978 X
10 3 1,60667 0,432978 X
5 3 2,09667 0,432978 X
--------------------------------------------------------------------------------
Contraste Diferencias
--------------------------------------------------------------------------------
5 - 10 0,49
5 - 15 0,863333
10 - 15 0,373333
--------------------------------------------------------------------------------
* indica una diferencia significativa.
El StatAdvisor
--------------
Esta tabla aplica un procedimiento de comparacin mltiple para
determinar las medias que son significativamente diferentes unas de
otras. La mitad inferior de la salida muestra la diferencia estimada
entre cada para de medias. No hay diferencias estadsticamente
significativas entre ningn par de medias a un nivel de
confianza.95,0%. En la parte superior de la pgina, se identifica un
grupo homogneo segn la alineacin del signo X en la columna. Dentro
de cada columna, los niveles que tienen signo X forman un grupo de
medias entre las cuales no hay diferencias estadsticamente
significativas. El mtodo actualmente utilizado para discernir entre
las medias es el procedimiento de Duncan de comparaciones mltiples.
Con este mtodo, hay un 5,0% de riesgo de considerar uno o ms pares
como significativamente diferentes cuando su diferencia real es igual
a 0.

Anlisis de la Varianza para E.Coli salvaje - Sumas de Cuadrados de Tipo III
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
A:Concentracin 7,50136 2 3,75068 6,67 0,0299
RESIDUOS 3,37447 6 0,562411

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
La tabla ANOVA descompone la variabilidad de Coli salvaje en las
uno de los factores. Dado que un p-valor es inferior a 0,05, este
factor tiene efecto estadsticamente significativo en Coli salvaje
para un 95,0%.
38
Tabla de Medias por mnimos cuadrados para E.Coli salvaje
--------------------------------------------------------------------------------
Error Lmite Lmite
--------------------------------------------------------------------------------
Concentracin
300 3 2,93667 0,432978 1,8772 3,99613
400 3 1,0 0,432978 -0,0594629 2,05946
500 3 1,0 0,432978 -0,0594629 2,05946
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
Esta tabla muestra la Coli salvaje media para cada nivel de
Contraste Mltiple de Rangos para E.Coli salvaje segn Concentracin
--------------------------------------------------------------------------------
Concentracin Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogneos
--------------------------------------------------------------------------------
500 3 1,0 0,432978 X
400 3 1,0 0,432978 X
300 3 2,93667 0,432978 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
300 - 400 *1,93667
300 - 500 *1,93667
400 - 500 0,0
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
entre cada para de medias. El asterisco que se encuentra al lado de
los 2 pares, indica que stos muestran diferencias estadsticamente
significativas a un nivel de confianza 95,0%. En la parte superior de
la pgina, se identifican 2 grupos homogneos segn la alineacin del
signo X en la columna. Dentro de cada columna, los niveles que tienen
signo X forman un grupo de medias entre las cuales no hay diferencias
estadsticamente significativas. El mtodo actualmente utilizado para
discernir entre las medias es el procedimiento de Duncan de
comparaciones mltiples. Con este mtodo, hay un 5,0% de riesgo de
considerar uno o ms pares como significativamente diferentes cuando
su diferencia real es igual a 0.
39
Anlisis de la Varianza para Staphylococcus aureus salvaje - Sumas de Cuadrados de Tipo
III
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
A:Tiempo 4,50407 2 2,25203 2,55 0,1578
RESIDUOS 5,29493 6 0,882489

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
La tabla ANOVA descompone la variabilidad de Staphy salvaje en las
Staphy salvaje para un nivel de confianza del 95,0%.
Tabla de Medias por mnimos cuadrados para Staphylococcus aureus salvaje

--------------------------------------------------------------------------------
Error Lmite Lmite
--------------------------------------------------------------------------------
Media Total 9 4,61
Tiempo
5 3 5,24667 0,542368 3,91954 6,5738
10 3 4,96 0,542368 3,63287 6,28713
15 3 3,62333 0,542368 2,2962 4,95046
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
Esta tabla muestra la Staphy salvaje media para cada nivel de
Contraste Mltiple de Rangos para Staphylococcus aureus salvaje segn Tiempo
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
15 3 3,62333 0,542368 X
10 3 4,96 0,542368 X
5 3 5,24667 0,542368 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
5 - 10 0,286667
5 - 15 1,62333
10 - 15 1,33667
--------------------------------------------------------------------------------
40
El StatAdvisor
--------------
a 0.

Anlisis de la Varianza para Staphylococcus aureus salvaje - Sumas de Cuadrados de Tipo
III
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
A:Concentracin 3,86987 2 1,93493 1,96 0,2215
RESIDUOS 5,92913 6 0,988189

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
La tabla ANOVA descompone la variabilidad de Staphy salvaje en las
Staphy salvaje para un nivel de confianza del 95,0%.
Tabla de Medias por mnimos cuadrados para Staphylococcus aureus salvaje

--------------------------------------------------------------------------------
Error Lmite Lmite
--------------------------------------------------------------------------------
Media Total 9 4,61
Concentracin
300 3 5,49 0,573931 4,08564 6,89436
400 3 4,42333 0,573931 3,01897 5,82769
500 3 3,91667 0,573931 2,51231 5,32103
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
Esta tabla muestra la Staphy salvaje media para cada nivel de
41
Contraste Mltiple de Rangos para Staphylococcus aureus salvaje segn Concentracin
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
500 3 3,91667 0,573931 X
400 3 4,42333 0,573931 X
300 3 5,49 0,573931 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
300 - 400 1,06667
300 - 500 1,57333
400 - 500 0,506667
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
a 0.
Escherichia Coli ATCC 25922

Anlisis de la Varianza paracoli coleccin - Sumas de Cuadrados de Tipo III
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
A:Tiempo 1,13076 2 0,565378 0,55 0,6024
RESIDUOS 6,14427 6 1,02404

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
La tabla ANOVA descompone la variabilidad de coli coleccin en las
coli coleccin para un nivel de confianza del 95,0%.
42
Tabla de Medias por mnimos cuadrados para E.coli coleccin
--------------------------------------------------------------------------------
Error Lmite Lmite
--------------------------------------------------------------------------------
Tiempo
5 3 1,86 0,58425 0,430388 3,28961
10 3 1,53333 0,58425 0,103721 2,96295
15 3 1,0 0,58425 -0,429612 2,42961
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
Esta tabla muestra la coli coleccin media para cada nivel de
Contraste Mltiple de Rangos para E.coli coleccin segn Tiempo

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
15 3 1,0 0,58425 X
10 3 1,53333 0,58425 X
5 3 1,86 0,58425 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
5 - 10 0,326667
5 - 15 0,86
10 - 15 0,533333
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
a 0.
43
Escherichia coli ATCC 25922
Anlisis de la Varianza para E.coli coleccin - Sumas de Cuadrados de Tipo III
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
A:Concentracin 3,88276 2 1,94138 3,43 0,1014
RESIDUOS 3,39227 6 0,565378

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
La tabla ANOVA descompone la variabilidad de coli coleccin en las
coli coleccin para un nivel de confianza del 95,0%.
Tabla de Medias por mnimos cuadrados para E.coli coleccin

--------------------------------------------------------------------------------
Error Lmite Lmite
--------------------------------------------------------------------------------
Concentracin
300 3 2,39333 0,434119 1,33108 3,45559
400 3 1,0 0,434119 -0,0622536 2,06225
500 3 1,0 0,434119 -0,0622536 2,06225
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
Esta tabla muestra la coli coleccin media para cada nivel de
Contraste Mltiple de Rangos para E.coli coleccin segn Concentracin
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
400 3 1,0 0,434119 X
500 3 1,0 0,434119 X
300 3 2,39333 0,434119 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
300 - 400 1,39333
300 - 500 1,39333
400 - 500 0,0
--------------------------------------------------------------------------------
44
El StatAdvisor
--------------
a 0.
Anlisis de la Varianza paraStaphy coleccin - Sumas de Cuadrados de Tipo III
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
A:Tiempo 16,3291 2 8,16454 17,36 0,0032
RESIDUOS 2,822 6 0,470333

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
La tabla ANOVA descompone la variabilidad de Staphy coleccin en
las contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha
elegido la suma de cuadrados Tipo III (valor por defecto), se ha
medido la contribucin de cada factor eliminando los efectos del resto
de los factores. Los P-valores comprueban la importancia estadstica
de cada uno de los factores. Dado que un p-valor es inferior a 0,05,
este factor tiene efecto estadsticamente significativo en Staphy
coleccin para un 95,0%.
Tabla de Medias por mnimos cuadrados para Staphylococcus aureus coleccin

--------------------------------------------------------------------------------
Error Lmite Lmite
--------------------------------------------------------------------------------
Tiempo
5 3 4,89333 0,395952 3,92447 5,86219
10 3 3,87667 0,395952 2,90781 4,84553
15 3 1,66667 0,395952 0,697805 2,63553
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
Esta tabla muestra la Staphy coleccin media para cada nivel de
45
Contraste Mltiple de Rangos para Staphylococcus aureus coleccin segn Tiempo
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
15 3 1,66667 0,395952 X
10 3 3,87667 0,395952 X
5 3 4,89333 0,395952 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
5 - 10 1,01667
5 - 15 *3,22667
10 - 15 *2,21
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
entre cada para de medias. El asterisco que se encuentra al lado de
los 2 pares, indica que stos muestran diferencias estadsticamente
significativas a un nivel de confianza 95,0%. En la parte superior de
la pgina, se identifican 2 grupos homogneos segn la alineacin del
signo X en la columna. Dentro de cada columna, los niveles que tienen
signo X forman un grupo de medias entre las cuales no hay diferencias
estadsticamente significativas. El mtodo actualmente utilizado para
discernir entre las medias es el procedimiento de Duncan de
comparaciones mltiples. Con este mtodo, hay un 5,0% de riesgo de
considerar uno o ms pares como significativamente diferentes cuando
su diferencia real es igual a 0.

Anlisis de la Varianza para Staphylococcus aureus coleccin - Sumas de Cuadrados de Tipo
III
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
A:Concentracin 2,66196 2 1,33098 0,48 0,6383
RESIDUOS 16,4891 6 2,74819

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
La tabla ANOVA descompone la variabilidad de Staphy coleccin en
las contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha
elegido la suma de cuadrados Tipo III (valor por defecto), se ha
medido la contribucin de cada factor eliminando los efectos del resto
de los factores. Los P-valores comprueban la importancia estadstica
de cada uno de los factores. Dado que ningn P-valor es inferior a
0,05, ninguno de los factores tiene efecto estadsticamente
significativo en Staphy coleccin para un nivel de confianza del
95,0%.
46
Tabla de Medias por mnimos cuadrados para Staphylococcus aureus coleccin
--------------------------------------------------------------------------------
Error Lmite Lmite
--------------------------------------------------------------------------------
Concentracin
300 3 4,24333 0,957112 1,90136 6,58531
400 3 3,17 0,957112 0,828026 5,51197
500 3 3,02333 0,957112 0,681359 5,36531
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
Esta tabla muestra la Staphy coleccin media para cada nivel de
Contraste Mltiple de Rangos para Staphylococcus aureus coleccin segn Concentracin
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
500 3 3,02333 0,957112 X
400 3 3,17 0,957112 X
300 3 4,24333 0,957112 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
300 - 400 1,07333
300 - 500 1,22
400 - 500 0,146667
--------------------------------------------------------------------------------
El StatAdvisor
--------------
a 0.
47
48

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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACUTICAS

Accin antimicrobiana de un desinfectante de uso industrial y domstico sobre

Memoria para optar al ttulo de Ingeniero en Alimentos

MARA DANIELA GALLARDO TRONCOSO

4.1 Objetivo general 8

4.2 Objetivos especficos 8

5.2.1 Recuento inicial de cepas 10

5.2.2 Determinacin de la actividad antimicrobiana 10

5.2.3 Control del neutralizante 12

6.1 Control del neutralizante 13

6.2 Actividad antimicrobiana 13

6.2.1 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre 13

6.2.2 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre 15

6.2.4 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre 20

7.3 Valores de coeficiente de dilucin () 30

7.4 Anlisis estadstico 31

La desinfeccin de verduras y frutas es un tratamiento, destinado a reducir la

Las pruebas se realizaron frente a cepas de Staphylococcus aureus salvaje y

La eficiencia germicida in vitro del desinfectante a 400 ppm fue de 99,999%,

Staphylococcus aureus salvaje y ATCC 29213 result ms resistente que

The disinfection of vegetables and fruits is a treatment aimed to reduce the

In this study, an in vitro comparative study of the germicide activity of a disinfectant

La contaminacin microbiolgica de los alimentos, es un problema permanente

Los desinfectantes se utilizan tanto en los alimentos como tambin en las

Un reporte del FDA revela que en el 70% de restaurantes monitoreados durante

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Escherichia coli es un microorganismo que se encuentra generalmente en el

Otro microorganismo de importancia en alimentos es Staphylococcus aureus el

En el presente estudio se determinar la accin biocida de dicho producto de

4.1 Objetivo General

4.2 Objetivos especficos

5.2.2 Determinacin de la actividad antimicrobiana.

Donde: No = nmero de microorganismos iniciales.

Donde: No = nmero de microorganismos iniciales.

Como criterio de eficacia, se utiliz el test de Chambers, el cual seala que se

Luego, el coeficiente de dilucin se obtiene a partir de la siguiente expresin:

5.2.3 Control del neutralizante.

6.1 Control del Neutralizante

La tabla 1 muestra los valores promedios del recuento de microorganismos

6.2 Actividad antimicrobiana.

Figura 1: Efecto in vitro del desinfectante a 300, 400 y 500 ppm,

6.2.2 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre Staphylococcus

300ppm 400 pm 500 ppm

Figura 2: Efecto in vitro del desinfectante a 300, 400 y 500 ppm,

La Figura 2 presenta el efecto in vitro del desinfectante sobre Staphylococcus

En esta cepa de origen salvaje, se observa un efecto ms diferenciado entre las

Tiempo recomendado por el fabricante: 15 minutos.

De acuerdo a los resultados que se presentan en las tablas 2 y 3, se observa

6.2.3 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre Escherichia

300 ppm 400ppm 500ppm

6.2.4 Accin del desinfectante a distintas concentraciones sobre Staphylococcus

300 ppm 400 ppm 500 ppm

La Figura 4 presenta el efecto in vitro del producto desinfectante sobre ATCC

Se observan diferencias con respecto a los valores de E(%), k y TRD obtenidos

Con respecto a la velocidad especfica de muerte, se observa que a los 5

De acuerdo a los resultados que se presentan en las Tablas 4 y 5, se observa

7.1 Velocidad especfica de muerte (k).

Segn Tabla 6 se observa que ambas cepas de Escherichia coli, salvaje y

Finalmente se presenta en orden decreciente, la resistencia de las cuatro cepas

Concentracin Tiempo Escherichia Staphylococcus Escherichia Staphylococcus

5 99,812 84,402 99,982 98,281

Para una concentracin de 300 ppm y 15 minutos de accin del desinfectante,