1

BAB I
FOKUS PENELITIAN

1.1. Fokus Umum

Fokus umum dalam penelitian ini yaitu memperoleh informasi ilmiah
terhadap isolat bakteri dari tanah sawah yang memiliki aktivitas antibiotik.

1.2. Fokus Khusus

Fokus khusus dalam penelitian ini antara lain :
a. Mengkaji dan mengidentifikasi karakteristik dari isolat bakteri yang
diperoleh meliputi metode makroskopis yang dilihat dari bentuk dan warna
koloni bakteri, mikroskopis dengan pengecatan dan pengamatan di bawah
mikroskop serta uji reaksi biokimia meliputi uji fermentasi karbohidrat, uji
Triple Sugar Iron Agar (TSIA), uji indol, uji sitrat, dan uji Motilitas.
b. Mengidentifikasi metabolit sekunder yang dihasilkan oleh isolat bakteri
tanah sawah
c. Menguji aktivitas antibiotik dari isolat bakteri yang telah didapatkan
terhadap bakteri Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Candida
albicans.
 2

BAB II
BAHAN DAN PERALATAN PENELITIAN

2.1. Bahan Penelitian

Bahan penelitian adalah sejumlah bahan yang diperlukan dalam proses
pengumpulan data. Bahan-bahan tersebut ditunjukkan dalam Tabel 4.1. berikut :
Tabel 4.1. Bahan Penelitian
Kegunaan dalam
No Bahan Penelitian Wujud Bahan
Penelitian
1 Alkohol Cair Pereaksi
2 Asam asetat anhidrat Cair Perekasi
3 Aquadestilata Cair Pelarut
4 Dragendorff Cair Pereaksi
5 FeCl3 1% Cair Pereaksi
6 Gelatin Padat Medium
7 HCl pekat, 2%, 10% Cair Pereaksi
8 Hidrogen Peroksida Cair Pereaksi
9 H2SO4 Cair Pereaksi
10 Iodin Cair Pereaksi
11 Kapas Padat Penutup erlenmeyer
12 Kertas saring Padat Untuk menyaring
13 Kliger Iron Agar Padat Medium
14 Kloroform Cair Pereaksi
15 Kristal violet Cair Pereaksi
16 Logam Mg Cair Pereaksi
17 Manitol Padat Medium
18 Mayer Cair Pereaksi
19 Metanol Cair Pereaksi
20 Methyl Red Padat Medium
21 Methylen Blue Cair Pereaksi
22 Minyak emersi Cair Peningkat indeks bias
23 Motilitas Ornitin Padat Medium
24 NaCl 0,9 % Cair Pereaksi
25 Nigrosin Cair Pereaksi
26 Nutrient Agar Padat Medium
27 Nutrient Broth Cair Medium
28 Paper disk Padat Media uji antibiotik
29 Pepton Padat Medium
30 Potato Dextrose Agar Padat Medium
31 Potato Dextrose Broth Cair Medium
32 Safranin Cair Pereaksi
33 Simon Citrat Agar Padat Medium
34 Tanah Sawah Padat Sampel
 3

2.2. Peralatan Penelitian

Peralatan penelitian yaitu alat yang digunakan untuk mendapatkan data
penelitian. Sejumlah peralatan tersebut ditunjukkan pada Tabel 4.2. berikut :
Tabel 4.2. Peralatan Penelitian
No Nama alat Kegunaan dalam Penelitian
1 Autoklaf Sterilisasi alat dan medium
2 Batang Pengaduk Alat bantu mengaduk
3 Bunsen Alat penunjang aseptis
4 Cawan petri Wadah penumbuhan mikroba
5 Cover glass Penutup preparat
6 Erlenmayer Wadah
7 Gelas Ukur Alat mengambil cairan
8 Gelas kimia Wadah
9 Hot Plate Alat pemanas
10 Inkubator Inkubasi bakteri atau jamur
11 Jangka Sorong Mengukur diameter zona bening
12 Kaca Arloji Wadah penimbangan bahan
13 Laminar Air Flow Alat tempat pengerjaan aseptis
14 Mikroskop Alat pengamatan
15 Object glass Wadah meletakkan preparat
16 Ose bulat Alat pemindah biakan
17 Ose lurus Alat pemindah biakan
18 Oven Sterilisasi alat
19 Pinset Alat mengambil atau memindah
20 Pipet Tetes Alat pemindah cairan
21 Pipet Volume Untuk mengambil cairan
22 Pro pipet Mengambil larutan
23 Rak Tabung Reaksi Wadah tabung reaksi
24 Sendok Tanduk Alat mengambil bahan
25 Sentrifuge Untuk mendapatkan supernatan
26 Shaker Untuk homogenisasi
27 Spatel Alat mengambil bahan
28 Tabung Reaksi Wadah
29 Tabung Sentrifuge Wadah bahan untuk sentrifuge
30 Timbangan Analitik Untuk menimbang bahan
31 Vial Wadah
 4

BAB III
PROSEDUR PENELITIAN

3.1. Pengambilan Tanah Sawah

a. Tanah sawah diambil pada kedalaman 10-15 cm
b. Dimasukkan ke dalam botol yang telah steril

3.2. Pembuatan Pengenceran Sampel Tanah Sawah

a. Tanah sawah ditimbang sebanyak 1 gram
b. Ditambahkan dengan aquades sebanyak 9 mL di dalam tabung reaksi I
c. Diambil 1 mL dari tabung reaksi I dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi
II
d. Ditambahkan 9 mL aquades ke dalam tabung reaksi II ( pengenceran 10-1)
e. Dilakukan berulang hingga pengenceran 10-5

3.3. Pembuatan Medium

a. Ditimbang medium sesuai dengan hasil perhitungan
b. Ditambahkan dengan aquades
c. Diaduk diatas hot plate dan disterilkan

3.4. Isolasi Bakteri

a. Diambil 1 mL pada pengenceran 10-3 hingga 10-5 dan dimasukkan ke dalam
cawan petri steril
b. Ditambahkan dengan medium dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali
c. Diinkubasi selama 2-7 hari dengan suhu 37 oC.

3.5. Pemurnian Bakteri

a. Diambil 1 ose isolat bakteri
b. Ditumbuhkan kembali di atas permukaan medium Nutrient Agar
c. Diinkubasi selama 3 hari dengan suhu 37 oC

3.6. Pembenihan Mikroba

a. Diambil 1 ose isolat bakteri
b. Dimasukkan ke dalam Nutrient Broth sebanyak 100 mL di dalam
erlenmayer
c. Dilakukan pennggojokan dengan menggunakan shaker selama 2 hari
d. Disaring dan disentrifugasi larutan dan diambil supernatan

3.7. Karakterisasi Isolat Bakteri

a. Makroskopis
1) Diamati pola pertumbuhan bakteri dari atas cawan petri
2) Diamati pola pertumbuhan bakteri dari samping cawan petri
b. Mikroskopis
1) Diambil 1 ose isolat bakteri
2) Digoreskan di atas permukaan object glass
 5

3) Diamati dibawah mikroskop dengan menambahkan nigrosin (pengecatan

sederhana), methylen blue (pengecatan negatif) dan cat kristal violet, iodin,
alkohol serta safranin untuk pengecatan gram.
c. Uji Reaksi Biokimia
1) Diambil 1 ose isolat bakteri
2) Ditumbuhkan di dalam medium yang sesuai dengan uji reaksi biokimia ( uji
indol, fermentasi karbohidrat, Triple Sugar Iron Agar, uji sitrat, uji motilitas,
uji gelatin, katalase dan Methyl Red.
3) Diinkubasi dan diamati perubahan warna medium

3.8. Identifikasi Metabolit Sekunder

a. Hasil pembenihan bakteri diambil 3 tetes pada masing-masing tabung reaksi
b. Uji alkaloid dilakukan dengan menambahkan HCl 2%, pereaksi Dragendroff
dan pereaksi Mayer
c. Uji Flavonoid dilakukan dengan menambahkan 2 mL metanol, logam Mg
dan 4 tetes HCl pekat
d. Uji fenolik dilakukan dengan menambahkan 3 tetes FeCl3
e. Uji saponin dilakukan dengan menambahkan 10 mL aquades dan dilakukan
pengocokan hingga terbentuk busa, ditambahkan dengan 10 tetes HCl 10 %
f. Uji steroid dilakukan dengan menambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat,
kloroform dan H2SO4.

3.9. Pengujian Aktivitas

a. Direndam paper disk di dalam larutan hasil pembenihan isolat selama 30
menit
b. Diletakkan di atas permukaan medium yang telah berisi dengan suspensi
bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Candida
albicans
c. Diinkubasi dan diamati zona bening yang terbentuk.