PRODUCCIN DE LEVADURA (Cndida utilis) A PARTIR DE MELAZA DE

CAA (Saccharum officinarum) EN UN BIORREACTOR DE AGITACIN

MECNICA

ISAURA MARA LORENA LATORRE AGUILERA

UNIVERSIDAD INCCA DE COLOMBIA

FACULTAD DE INGENIERA, CIENCIAS BSICAS Y ADMINISTRACIN
PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS
BOGOT
2017
PRODUCCIN DE LEVADURA (Cndida utilis) A PARTIR DE MELAZA DE
CAA (Saccharum officinarum) EN UN BIORREACTOR DE AGITACIN
MECNICA

ISAURA MARA LORENA LATORRE AGUILERA

Proyecto final para aprobar la asignatura de bioingeniera

Docente
Sandra Ximena Rangel Ortega
M. Sc. Ingeniera Qumica

UNIVERSIDAD INCCA DE COLOMBIA

FACULTAD DE INGENIERA, CIENCIAS BSICAS Y ADMINISTRACIN
PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS
BOGOT
2017
 TABLA DE CONTENIDO

pg.

1. PROBLEMTICA .............................................................................................. 1
2. JUSTIFICACION ............................................................................................... 2
3. ALCANCE ......................................................................................................... 3
4. OBJETIVOS ...................................................................................................... 4
Objetivo general .......................................................................................... 4
4.2. Objetivos ESPECFICOS ............................................................................ 4
5. MARCO REFERENCIAL ................................................................................... 5
MARCO CONCEPTUAL ............................................................................. 5
5.1.1 Melazas de caa .................................................................................. 5

5.1.2 Levadura Cndida utilis . ..................................................................... 8

5.1.3 Protena unicelular. ............................................................................ 10

5.1.4 Biorreactores para la fermentacin . ................................................. 11

5.2. MARCO TERICO ................................................................................... 14

5.2.1. Antecedentes . .................................................................................. 14

5.2.2. Ecuacin del proceso ......................................................................... 17

6. METODOLOGA .............................................................................................. 24
DETALLES DEL PROCESO EXPERIMENTAL ........................................ 24
6.1.1. Medio de cultivo. ................................................................................ 24

6.1.2. Microorganismo . ............................................................................... 25

6.1.3. Diseo de experimentos . ................................................................... 26

6.1.4. Anlisis y mtodos ............................................................................. 28

7. presupuesto global .......................................................................................... 32

8. Cronograma de actividades............................................................................. 33
9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................ 35
10. ANEXOS ...................................................................................................... 38
Anexo 1 (Ficha tcnica levadura c. utilis ATCC 9950) .............................. 38
10.2. Anexo 2 (Instrucciones del conteo de la cmara de neubauer) ................ 40
10.3. anexo 3 (contenido de protena cruda) ..................................................... 43
 LISTA DE TABLAS

pg.

Tabla 1. Composicin de la melaza de caa de azcar ........................................... 6

Tabla 2. Composicin promedio de diferentes levaduras ........................................ 9
Tabla 3. Condiciones que deben medirse y controlarse durante una fermentacin
discontinua ............................................................................................................. 13
Tabla 4. Matriz de coeficientes medidos ................................................................ 20
Tabla 5. Matriz de moles medidos ......................................................................... 20
Tabla 6. Matriz de coeficientes calculados ............................................................ 20
Tabla 7. Matriz inversa de los coeficientes calculados .......................................... 21
Tabla 8. Matriz moles calculadas ........................................................................... 21
Tabla 9. Moles necesarias de cada compuesto para llevar a cabo el proceso
biotecnolgico ........................................................................................................ 22
Tabla 10. Cantidad en gramos de los compuestos que intervienen en la
fermentacin .......................................................................................................... 22
Tabla 11. Caractersticas del diseo experimental ................................................ 27
Tabla 12. Diseo multifactorial Modelo I ................................................................ 27
Tabla 13. Mtodos oficiales de la A.O.A.C. ........................................................... 30
 LISTA DE FIGURAS

pg.

Figura 1. Tincin de Gstein para la levadura Cndida utilis ................................... 8

Figura 2. Posibles derivados del aprovechamiento industrial de los principales
componentes de la biomasa bacteriana ................................................................ 11
Figura 4. Tratamiento previo del medio de cultivo ................................................. 25
 1. PROBLEMTICA

Cada da el hombre busca alternativas de cambio para dar solucin al sin nmero
de dificultades que se manifiestan para lograr su progreso y uno de ellos es la
obtencin de alimentos ricos en protena. Actualmente, se registra que la
poblacin mundial supera los siete mil millones de habitantes (EFE, 2015), donde
segn la FAO, an hay prevalencia de desnutricin y subalimentacin en pases
en desarrollo, exponiendo una cifra de alrededor de 780 millones de personas
subalimentadas para el 2015 (FAO; FIDA & PMA, 2015, pg. 8-10); a su vez,
dicha institucin revela que a pesar de que las cifras disminuyen y se est dando
cumplimento a los objetivos que se han propuesto de reducir el hambre y
desnutricin en el mundo, se est presentando un desperdicio de 1300 millones de
toneladas de alimentos al ao en el mundo (FAO, 2012, pg. 4), siendo esta cifra
un tercio de la produccin mundial anual de alimentos.
Debido a este hecho, los cientficos han propuesto la alternativa de usar la
protena unicelular para ofrecer de esta forma un sustituto a las protenas de
consumo humano actual, que ms all de ser de difcil acceso para las
poblaciones de bajos recursos, se han convertido a su vez, en uno de los mayores
productores de gases de invernadero, degradantes de los suelos y de los recursos
hdricos (FAO, 2006, pg. 1). Es por este motivo y debido a que la protena
unicelular puede proporcionar un apoyo en el manejo y aprovechamiento de
grandes cantidades de desechos orgnicos de origen agrcola, que sta es
considerada como una alternativa recurrente para convertir estos desechos, los
cuales actan como fuentes de contaminacin, en materiales tiles desde el punto
de vista econmico, nutricional e industrial (GIRALDO, Mara, 2008, pg. 1).

1
 2. JUSTIFICACION

Con base a dicha problemtica, se plantea el aprovechamiento de subproductos

tales como melazas, aguas residuales, desechos orgnicos, entre otros para que
acten como sustratos en los procesos biotecnolgicos aplicados para algas,
hongos, bacterias y levaduras (GERHARD, Jagnow & et all, 1991, pg. 57-65).
Esto con la finalidad de reducir la produccin de protenas alimenticias y sustituir
parcialmente las protenas de cereales, soya, leche, huevos y de otras fuentes en
la elaboracin de subproductos lcteos como helados y quesos, adems de
sustituir el uso de huevo en mayonesas o productos de panadera, entre otros
(GARCA, G; LPEZ, M & QUINTERO, R., 1993), buscando combatir la
desnutricin que actualmente representa uno de los problemas ms graves a nivel
mundial; puesto que fuentes convencionales provenientes de reas como la
agricultura, ganadera y pesca, no satisfacen completamente los requerimientos
proteicos de la poblacin a partir de animales y que de acuerdo a la FAO son los
alimentos que llegan en menor cantidad a los pases en desarrollo y poblaciones
de bajos recursos (FAO; FIDA & PMA, 2015), es por ello que se propone el
consumo y uso de las protenas unicelulares (SCP) ya que estos microorganismos
ofrecen numerosas ventajas como productores de protenas tales como: utilizan
como sustratos de carbono fuentes naturales o subproductos que pueden causar
dao al medio ambiente, la mayora de los microorganismos cultivados poseen
altos niveles de protenas (4080% de protena cruda en base seca, dependiendo
de la especie) y tienen un tiempo de generacin muy corto, donde pueden doblar
su masa celular bajo condiciones ptimas de cultivo en un mximo de 6 horas
para las algas, 2 horas las bacterias y 3 horas las levaduras (TACON, 1989).
Tomando estos factores en cuenta y con el propsito de incentivar una alternativa
diferente de produccin de protenas para el consumo humano, se propone llevar
a cabo una fermentacin aerobia en un biorreactor de agitacin mecnica a escala
piloto tipo batch, haciendo aprovechamiento del uso de subproductos de la caa,
como lo es la melaza, puesto que Colombia es el segundo pas que presenta
mayor produccin en el mundo de esta materia prima y actualmente utiliza de
forma limitada las mieles de caa, de forma casi exclusiva como alimento para el
sector agropecuario y como fuente de carbono para la produccin de alcoholes
(OSORIO, G., 2007, pg. 30).

2
 3. ALCANCE

El desarrollo del proyecto se genera desde un punto de vista terico, el cual debe
ser aplicado posteriormente a escala de laboratorio debido a las cantidades y a la
perspectiva que se maneja en el desarrollo del mismo. La finalidad de llevar a
cabo la presente investigacin, es ofrecer una perspectiva diferente al uso de
levaduras, encaminando su proceso de fermentacin aerbica a la obtencin de
su biomasa y no a la produccin exclusiva de etanol de segunda generacin como
se evidencia principalmente en la actualidad (CABALLERO, Jhon, 2015, pg. 7)
Como tal, en el proyecto se busca consultar las condiciones adecuadas de
operacin para producir levadura C. utilis variando los porcentajes del inculo a
utilizar y la agitacin aplicada en el proceso con el propsito de proporcionar los
mejores resultados.
Es por ello que se considera fundamental el hecho de encaminar la pregunta de
investigacin al siguiente problema: El porcentaje del inculo y la velocidad de
agitacin del biorreactor interactan como parmetros que pueden optimizar la
produccin de levadura C. utilis?

3
 4. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL
Analizar la produccin de biomasa de levadura Cndida utilis a partir de
melaza de caa como fuente de carbono.

4.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Caracterizar la melaza de caa midiendo sus grados Brix, pH, viscosidad,

azcares fermentables y densidad.

Identificar las condiciones de pH, temperatura, Brix y aireacin ms

adecuadas para la produccin de biomasa de levadura Cndida utilis.

Realizar el diseo experimental del proyecto con base en los antecedentes

y estudios consultados.

Seleccionar el material del biorreactor y sus condiciones de operacin de

acuerdo a la informacin proporcionada por los estudios y antecedentes
consultados.

Ejecutar el diseo experimental del proyecto.

Realizar la extraccin y purificacin de la levadura C. utilis

Efectuar la caracterizacin final de la levadura C. utilis a partir de la

determinacin de protena cruda, cenizas, grasas, carbohidratos, humedad
y fibra cruda.

Calcular el rendimiento en base seca del proceso de fermentacin con

respecto al consumo de sustrato.

4
 5. MARCO REFERENCIAL

MARCO CONCEPTUAL

5.1.1 Melazas de caa

5.1.1.1 Definicin De acuerdo a la NTC 587 se define como: jarabe o

lquido denso y viscoso separado de la masa cocida final, del cual no es posible
cristalizar ms azcar por los mtodos usuales. (ICONTEC, 2003)

En cuanto a su definicin por proceso, se define como melaza o miel de caa al

efluente final obtenido en la preparacin del azcar mediante una cristalizacin
repetida, donde el proceso de evaporacin y cristalizacin es generalmente
repetido tres veces hasta el punto en el cual el azcar invertido y la alta viscosidad
de las melazas ya no permitan una cristalizacin adicional de la sacarosa (SWAN,
H & KARALAZOS, A., 1990).

Finalmente, desde el punto de vista qumico y de composicin, se considera a la

melaza como una mezcla compleja que contiene sacarosa, azcar invertido, sales
y otros compuestos solubles en lcali, los cuales normalmente estn presentes en
el jugo de caa localizado o son formados durante el proceso de manufactura del
azcar (HONIG, P, 1974). La melaza de caa cuenta con azcares fermentables
tales como sacarosa, glucosa, fructosa y rafinosa y sustancias no fermentables
como grasas, cenizas, vitaminas, protenas y minerales (Tabla 1) (FAJARDO, E. &
SARMIENTO, S., 2007).

5.1.1.2 Clasificacin y composicin Existen dos tipos de melazas, de

acuerdo a la NTC 587, se clasifican como melazas de Grado 1 y melazas de
Grado 2; aquellas que presentan un valor mnimo de grados Brix de 85 C a 20 C,
las cuales se recomiendan en la produccin de alcoholes, levaduras e industrias
afines y aquellas que presentan un valor mnimo de grados Brix de 79,5 C a 20
C, las cuales se recomiendan en la elaboracin de alimentos para animales,
respectivamente.

5
Tabla 1. Composicin de la melaza de caa de azcar

COMPONENTES CONSTITUYENTES CONTENIDO en (p/p)

Materia seca 78 %
Protenas 3%
Sacarosa 30-63 % p/p
Azcares reductores 3-5 % p/p
Componentes mayores Sustancias disueltas 4-8 % p/p
(diferentes azcares)
Agua 16 %
Cenizas 9%
Grasas 0,40%
Calcio 0,74 %
Magnesio 0,35 %
Contenido de minerales Fsforo 0,08 %
Potasio 3,67 %
Glicina 0,10 %
Leucina 0,01 %
Contenido de Lisina 0,01 %
aminocidos Treonina 0,06 %
Valina 0,02 %
Colina 600 ppm
Niacina 48,86 ppm
cido pantotnico 42,90 ppm
Contenido de vitaminas Piridoxina 44 ppm
Riboflavina 4,40 ppm
Tiamina 0,88 ppm
Fuente: FAJARDO, E. & SARMIENTO, S., 2007

5.1.1.3 Propiedades fisicoqumicas

5.1.1.3.1 Viscosidad La viscosidad de las soluciones saturadas de azcar

impuro, aumenta con mayor velocidad debido al contenido de impurezas, ya que
stos incrementan la concentracin de slidos. El efecto de las sales minerales
sobre la viscosidad de las soluciones de azcar y el enriquecimiento de iones Ca2+
generalmente aumenta la viscosidad, mientras que un incremento de iones K+, la
disminuye (SWAN, H & KARALAZOS, A., 1990)

Esta propiedad suele verse afectada por los componentes de alto peso molecular
puesto que pueden incrementarla considerablemente (SWAN, H & KARALAZOS,
A., 1990). A su vez, la viscosidad aparente se ve altamente influenciada por la
aireacin en el proceso de fermentacin, ya que disminuye con el aumento de aire
6
a nivel molecular (FAJARDO, E. & SARMIENTO, S., 2007). Finalmente, en cuanto
a los efectos que tienen la concentracin y la temperatura sobre la viscosidad de
las melazas, se conoce que la viscosidad de las melazas decrece a una
temperatura dada, con una disminucin de la concentracin, y tambin cuando la
concentracin es constante y la temperatura aumenta (FAJARDO, E. &
SARMIENTO, S., 2007).

5.1.1.3.2 pH Las melazas de caa tienen un pH entre 5.5 y 6.5, lo cual indica
que suelen ser un poco cidas. Cuando se observa un pH bajo suele atribuirse a
la presencia de cidos alifticos y al bajo pH de la clarificacin (SWAN, H &
KARALAZOS, A., 1990). Sin embargo, es importante tomar en cuenta el hecho de
que el pH de las melazas cambia con la temperatura y depende de la naturaleza y
de la cantidad de material estabilizador del pH que posea, el cual depende del
contenido de compuesto que no son azcares y de las caractersticas que posea
la melaza (SWAN, H & KARALAZOS, A., 1990)
En cuanto a la estabilizacin del pH en las melazas de caa se conoce que cuenta
con un patrn uniforme en el cual no existen variaciones irregulares debidas a
relaciones de cambio de peso entre las sustancias que intervienen, por lo tanto, la
actividad estabilizadora se modifica (SWAN, H & KARALAZOS, A., 1990)

5.1.1.3.3 Densidad Pruebas o anlisis de viscosidad o consistencia son

fundamentales en el momento de desarrollar un experimento con las melazas de
caa, ya que este fluido presenta un comportamiento semi-slido; pero, es
importante a su vez analizar la densidad del mismo, puesto que puede brindar una
informacin valiosa de las mieles de caa y la dependencia de su densidad con
otros parmetros, las cuales resultan fundamentales en el momento de desarrollar
los experimentos deseados. Es por ello que resulta importante identificar que los
valores de densidad en muestras de miel de caa se presentan entre 1357 kg/m3 y
1356 kg/m3 cuando se tienen mieles a 50Brix y 18C; y que en el momento en
que se aumenta tanto la temperatura como la concentracin de slidos solubles se
aprecia que sta disminuye, llegando a valores entre 1220 kg/m 3 y 1222 kg/m3
para una concentracin de 70Brix y una temperatura de 55C. Esto significa que
la densidad de las muestras de miel est influenciada por la concentracin y
temperatura (NARANJO, W., 2008).

5.1.1.3.4 Azcares reductores Se consideran como los azcares que

pueden ser oxidados por agentes oxidantes dbiles, debido a que pueden revertir
a la forma de cadena abierta, en general todos los monosacridos son azcares
reductores (BADUI, Salvador, 1990, pg. 51)
Las melazas se componen por un 68% de estos azcares, de los cuales la
glucosa, que se encuentra formando la sacarosa, es uno de los ms importantes,

7
ya que es usado por las levaduras en su proceso metablico de respiracin como
fuente de energa.

5.1.2 Levadura Cndida utilis La levadura Cndida utilis (levadura torula o

forrajera), se obtiene a partir de la fermentacin aerbica a partir de sustratos
residuales como fuente de carbono. Su composicin puede variar en dependencia
del sustrato que se utilice para su crecimiento y del proceso industrial al que se
somete (RODRGUEZ, B. et all, 2011). Una de las caractersticas ms importantes
de esta levadura es su capacidad de crecer rpidamente y su facilidad de cultivo
sobre una gran diversidad de materiales, entre los cuales se emplean como
sustrato para su produccin, el licor de prensa, que es obtenido de la fabricacin
de la pulpa de ctricos, melazas de caa o remolacha, licor residual de sulfito de la
industria papelera, madera sacarificada (tanto hexosas como pentosas), residuos
de frutos y vinazas de destileras (SOTO, E., 2002).
La levadura Cndida utilis desecada posee un alto valor como fuente de protena,
adems de un alto valor nutritivo, sabor agradable, buena apariencia y abundantes
minerales, vitaminas B y vitamina D en caso de irradiarse (SMITH, G., 1963).
Puede aportar un 39% de protena en su composicin, por lo que se considera
como un concentrado proteico, en cuanto a los contenidos de lpidos y total de
cenizas son de 1.95% y de 18.20%, respectivamente (Rochn,1993).
Esta levadura utiliza como azcares fermentables tanto pentosas como hexosas,
no requiere la adicin de factores precursores de crecimiento al medio y adems,
puede utilizar NH4+ o NO3- (o ambos) como fuente de nitrgeno creciendo en
condiciones favorables a un pH de 4. Conjuntamente, en su proceso de
crecimiento forma hifas verdaderas o falsas con abundantes clulas en gemacin
o blastosporas, formando en ocasiones pelculas y creciendo rpidamente con
tiempos de duplicacin cortos entre 2 a 6 horas (SOTO, E., 2002).

Figura 1. Tincin de Gstein para la levadura Cndida utilis

Fuente: ROCHA, R., 2006, 29 p

8
Tabla 2. Composicin promedio de diferentes levaduras

Protena unicelular Sustrato Composicin promedio (% por peso)

H2O CP EE CF NFE Cenizas Ca P
Torulopsis utilis, 7.0 48.0 2.7 2.1 32.2 8.0 0.49 1.52
seca
Candida utilis, seca Licor de 8.3 47.3 5.2 1.1 30.8 7.3 - -
sulfito
Candida boidinii, Metanol 6.2 26.4 7.2 10.0 34.5 5.7 - -
seca
Candida Suero 10.0 57.6 5.0 4.5 13.9 9.0 - -
pseudotrophus, seca
Candida spp., seca Melazas 7.6 43.3 0.2 8.1 33.7 7.1 0.20 1.42
de
Ctrico
Levadura (S. Melazas 9.2 46.8 5.7 1.6 30.5 6.2 - -
cerevisiae), seca
Levadura de cerveza Malta 8.6 45.0 1.2 3.9 34.3 7.0 0.17 1.45
(Saccharomyces seca
cerevisiae)
*CP= Protena Cruda; EE= Lpidos o Extracto de Eter; CF= Fibra Cruda; NFE= Extractos Libres de
Nitrgeno; Cenizas; Ca= Calcio; P= Fsforo
Fuente= TACON, 1989, Segunda parte, protenas unicelulares, Tabla 21.

5.1.2.1 Produccin de levadura C. utilis Esta levadura tiene una alta tasa
de crecimiento que ninguna especie ha logrado superar, ya que a pesar de que
requiere de un sustrato rico en azcares o fuentes de carbono, posee una
capacidad singular de utilizar una variedad de fuentes de carbono rpidamente
(MORA, R & BRAVO, C., 2014, pg. 22). Debido a este hecho, muchas
investigaciones se han realizado con este microorganismo, de las cuales cabe
destacar la produccin de protena unicelular; en stas, la levadura C. utilis ha sido
cultivada tanto en tanques sumergidos como en tanques de sustrato slido; y ha
sido cultivada en batch, fed batch y en sistema continuo, demostrando una alta
produccin desde cualquier perspectiva (BUM-KYU, Lee & JOONG KYUN, Kim,
2001).
Una de las caractersticas de Candida utilis es que forma hifas verdaderas o falsas
con abundantes clulas en gemacin o blastosporas, algunas veces formando
pelculas que le permiten crecer rpidamente (SOTO, E., 2002, pg. 23). Adems,
posee tiempos de duplicacin cortos entre 2 a 6 horas y se recuperan mas
fcilmente del medio de fermentacin por tratamientos fsicos como centrifugacin,
filtracin y secado (SOTO, E., 2002, pg. 31)

9
5.1.3 Protena unicelular Se denomina protena unicelular bioprotena a
aquella que es obtenida de la biomasa microbiana de algas, bacterias, levaduras y
hongos filamentosos, cultivados en condiciones fermentativas apropiadas y
controladas que garanticen una adecuada tasa de crecimiento, por medio del
aprovechamiento de sustratos econmicos compuestos por o enriquecidos con
carbono, nitrgeno y fsforo (TACON, 1989; CHACN, A., 2004, 94 p).
El trmino protena unicelular deriva de la contraccin de protena de organismos
unicelulares, que sera el trmino ms adecuado. Sin embargo, en la literatura
cientfica se refiere a la protena unicelular empleando el trmino SCP, el cual
deriva del trmino anglosajn single cell protein (CHACN, A., 2004).
Las investigaciones sobre las SCP comenzaron hace un siglo cuando Max
Delbruck y sus colegas encontraron la alta cantidad de levadura cervecera que se
desperdiciaba al finalizar el proceso y su posible aplicacin como suplemento
de alimentacin para animales. En 1919, Sak en Dinamarca y Hay Duck en
Alemania inventaron un mtodo denominado Zulaufverfahren donde se
alimentaba una solucin de azcar a una suspensin aireada de levadura
(SUMAN, G., 2015).
Por otra parte, las levaduras Candilaarborea y C. utilis fueron utilizadas durante la
segunda guerra mundial y alrededor del 60 por ciento del pas reemplaz la
entrada de alimentos. A partir de la dcada de los 60 se inici el desarrollo de
tecnologas en los procesos de elaboracin de aceite de tal forma que se pudiera
dar aprovechamiento de las ceras n-parafinas para alimentar levaduras y de esta
forma producir protena unicelular, el primer ejemplar de investigacin fue
realizado por Alfred Champagnatar y BPs Lavera, en una refinera de aceite
en Francia en 1963 (SUMAN, G., 2015), a partir de esta investigacin se
empezaron a desarrollar diferentes experimentos encaminados a encontrar los
suplementos y fuentes adecuadas para su produccin; de esta forma, varias
pesquisas se llevaron a cabo utilizando residuos de celulosa y hemicelulosa como
sustrato para aumentar la produccin de potenas, lo que llev no solo al avance
tecnolgico de su fermentacin, sino que proporcion a una mejora en las tcnicas
utilizadas para hidrolizar los compuestos (SUMAN, G., 2015).

10
Figura 2. Posibles derivados del aprovechamiento industrial de los
principales componentes de la biomasa bacteriana

Fuente= CHACN, A., 2004, pg. 95

5.1.4 Biorreactores para la fermentacin El biorreactor, es sin duda, uno de

los equipos fundamentales de la microbiologa industrial, ya que es en ste en el
cual se lleva a cabo el proceso de fermentacin de los procesos biotecnolgicos.
Es en ste equipo en el cual toman lugar las transformaciones de la materia prima
al producto de inters (MORA, R & BRAVO, C., 2014, pg. 24); es por ello, que su
diseo debe ser tal, que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los
microorganismos, garantizando la maximizacin en la conversin y rentabilidad del
bioproceso. (MAZARIEGOS, H., 2013, pg. 11).
Las tareas que realiza el biorreactor pueden resumirse del siguiente modo:

a) Mantener las clulas uniformemente distribuidas. El tener una distribucin

homognea en todo el volumen de cultivo se lleva a cabo con la finalidad de
prevenir la sedimentacin o la flotacin.
b) Mantener un control constante de la temperatura. Los biorreactores deben
contar con sistemas de control de temperatura para garantizar que el
bioproceso se realiza de forma adecuada y permite el mejor desarrollo del
mismo.
c) Suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo. Cuando
se realiza un bioproceso en estado aerobio, es fundamental controlar la
velocidad en la cual se suministra el oxgeno, para asegurarse de esta
forma que se beneficia de forma exclusiva al microorganismo que se
encuentra en estudio.

11
 d) El diseo debe ser tal que permita mantener el cultivo puro. Es una
prioridad del proceso asegurar que el biorreactor se encuentra en estado
estril para su posterior siembra, puesto que de esta forma se asegura que
en dicho proceso crecer de forma exclusiva el microorganismo a estudiar.
e) Facilitar la transferencia de calor. El crecimiento microbiano es
generalmente exotrmico, por lo que, se debe facilitar la transferencia de
calor, del medio hacia las clulas y viceversa, tomando en cuenta que a
medida que se produce el crecimiento celular, se debe mantener estable la
temperatura deseada.
f) El consumo de energa debe de ser el mnimo posible. Cualquier proceso
biotecnolgico de nivel industrial tuvo que haber pasado por operaciones en
laboratorio y en una planta piloto, el objetivo de realizar este escalamiento
es proporcionar el diseo de un biorreactor que satisfaga las necesidades
del proceso, desde el punto de vista del bioproceso tomando en cuenta en
todo momento el inters econmico del mismo.

5.1.4.1 Principios del diseo de un biorreactor Para satisfacer los cinco

primeros literales del ttulo anterior, es necesario que el biorreactor est provisto
de un sistema de agitacin o de un sistema que inyecte aire en el cultivo (sistema
air lift), donde, en el primero la agitacin se realiza mecnicamente mediante un
eje provisto de turbinas accionado por un motor y en el segundo, el aire se inyecta
por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee
pequeos orificios espaciados regularmente (MAZARIEGOS, H., 2013, pgs. 11-
12). Adems, el biorreactor debe complementar el sistema de agitacin se con
deflectores, los cuales tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular
que imprimen las turbinas al lquido, generando de este modo mayor turbulencia y
mejor mezclado (MAZARIEGOS, H., 2013, pg. 12).

El tanque puede estar rodeado por una camisa por la que circula agua, lo que
permite controlar la temperatura; en el caso de tanques mayores que 1000 o 2000
litros, este sistema ya no es eficiente y es reemplazado por un intercambiador de
calor, generalmente en forma de serpentn, el cual circula adyacente a la pared
interior del tanque (MAZARIEGOS, H., 2013, pg. 13). Finalmente, cuando se
lleva a cabo el diseo de un biorreactor o fermentador a escala piloto, se
recomienda que el material del tanque sea de vidrio; pero en el caso dado de que
se diseen tanques para una escala industrial, el material ms recomendado, es el
acero inoxidable, puesto que es un material que se encuentra pulido, es fcil de
limpiar, esterilizar y adems no reacciona con la materia orgnica que tenga
contacto con l (MORA, R & BRAVO, C., 2014, pg. 27).

12
5.1.4.2 Proceso de fermentacin La mayora de las fermentaciones son
procesos discontinuos o en Batch, lo cual permite que los equipos sean operados
en intervalos para que al finalizar el tiempo estipulado del proceso se proceda a
realizar la recuperacin de la levadura por centrifugacin. Se considera como un
sistema cerrado que presenta facilidad en sus operaciones por la disminucin de
los requerimientos para obtener su completa esterilizacin, evitando as, el riesgo
de prdidas financieras y facilitando el manejo de materias primas (FAJARDO, E.
& SARMIENTO, S., 2007).
Como desventaja de este sistema, se muestra la decreciente productividad en la
fermentacin debido al largo tiempo de rotacin y retraso en el crecimiento inicial;
ya que a lo largo de toda la fermentacin no se adiciona nada a excepcin de
oxgeno (en forma de aire), agentes antiespumantes y cidos o bases que
permitan controlar el pH. Esto conlleva al hecho de que la composicin del medio
de cultivo, la concentracin de la biomasa y la concentracin de metabolitos,
cambie en forma continua como resultado del metabolismo de las clulas
(DORAN, P., 1995)

Tabla 3. Condiciones que deben medirse y controlarse durante una

fermentacin discontinua

Variables Smbolo Unidades

Temperatura T C
Tiempo t Horas
Grados Brix Bx g slidos/100 g dilucin
Concentracin del inculo Cx g clulas/ 100 g dilucin
Potencial de hidrgeno pH -
Masa de clulas X g clulas
Sustrato S g sustrato
Tasa especfica de crecimiento h-1
Tasa de consumo de sustrato QS g l-1 h-1
Tasa de produccin de protena cruda QCP g l-1 h-1
Rendimiento de biomasa sobre YX/S g clulas/g sustrato
sustrato
Rendimiento especfico de protena YCP/X g protena cruda/g clulas
cruda
Agitacin mecnica A rpm
Basado en las Fuentes= RAJOKA, M. et all, 2003, pg. 297; VIEIRA, E. et all,
2013, pg. 554

13
5.2. MARCO TERICO

5.2.1. Antecedentes El seguimiento que se realiza en el presente proyecto con

respecto al estudio e investigaciones que se han realizado tanto a la levadura C.
utilis como a la produccin de protena unicelular parte desde el ao 2003, con el
propsito de consignar las investigaciones ms recientes que se han realizado y
contar con informacin que sea acorde a lo que se pretende desarrollar en el
proyecto.
Como se ha venido mencionando, la levadura C. utilis ha sido estudiada en
sistemas de fermentacin sumergida y en estado slido; adems cuenta con una
alta variedad de sustratos que se han analizado para que acten como fuente de
carbono. Cada una de estas investigaciones han tenido como propsito, ya sea
mejorar u optimizar el proceso de produccin de la levadura, o tomar desechos
orgnicos que resultan de los procesos agropecuarios.
Tomando en cuenta el aprovechamiento de desechos orgnicos, se puede hacer
mencin del trabajo realizado por Rajoka en el 2003 donde utiliz como sustrato
cascarilla de arroz con la finalidad de sustituir la alimentacin en las aves de corral
y mejorar la economa de la alimentacin en pases como Pakistn; en este
estudio llev a cabo la fermentacin en matraces agitados y en un fermentador de
14 litros para optimizar las condiciones de fermentacin antes de producir biomasa
en un fermentador de 50 litros. De esta forma obtuvo que la levadura manifest
valores mximos de 0.224 h1, 0.94, 1.35, 1.75, 2,12 g l1 h1, 0,62 g clulas/g
sustrato utilizado y g1 0,38 g para su tasa de crecimiento, produccin de protena
verdadera, produccin de protena cruda, produccin total de clulas, tasa de
consumo de sustrato, rendimiento de clulas, rendimiento de protena cruda,
respectivamente (RAJOKA, M. et all, 2003). Para el ao 2005, Rosma et al publica
en la revista de microbiologa de Malasia un artculo en el cual proponen optimizar
la produccin de protena unicelular usando extracto de jugo de residuos de pia;
para ello, aplican la metodologa de superficie de respuesta y establecen un
diseo factorial de tres niveles, analizando dos variables: el tamao del inculo
2.0-10.0 % (v/v) y el total de slidos solubles en el medio (1-5 Brix) por un tiempo
de fermentacin de treinta horas; con base a dichas variables obtuvieron un
mximo contenido de protena en la levadura de un 66,61% (w/w) de un tamao
ptimo de inculo de 7.83% (v/v) y un nivel de 3,02 Brix; en cuanto al mayor nivel
de biomasa, vitaminas B, 5ribonucletidos y contenido total de azcar,
incrementaron en un 216,8%, 17,5%, 38,0% y 60,8% respectivamente despus de
la optimizacin (ROSMA, A. et all, 2005). De esta forma, partiendo del proceso
investigativo realizado en el 2005, Rosma y Cheong publican para el 2007 un
estudio de la suplementacin de nitrgeno en la produccin de biomasa de
levadura C. utilis usando de igual forma extracto de pia como medio de cultivo;
en este trabajo incorporan varias fuentes de nitrgeno, de forma orgnica e
inorgnica para identificar cmo puede afectar la posterior produccin de biomasa.
Basndose en lo observado en la experimentacin, identifican que al usar
diferentes suplementos de nitrgeno tales como extracto de levadura, peptonas,
14
amonio dihidrgeno de fosfato, amonio de sulfato y nitrato de potasio al medio de
cultivo se aprecia generalmente una relacin entre el incremento en la produccin
de biomasa con el incremento de la cantidad de suplemento de nitrgeno
adicionado, lo cual les lleva a concluir que la adicin de una fuente de nitrgeno
mejora de forma significativa la produccin de biomasa, donde finalmente, de
acuerdo a los resultados ,definen que al adicionar amonio dihidrgeno de fosfato
en un porcentaje del 0.09% (m/v) como fuente de nitrgeno, se incrementa la
produccin de biomasa en un 53.7%, siendo este compuesto inorgnico el que
manifiesta mejores resultados en comparacin a los dems (CHEONG, M &
ROSMA, A., 2007). Por su parte, Gualtieri en ese mismo ao, busca comparar la
produccin de biomasa de Saccharomyces cerevisiae y C. utilis usando residuos
de pulpa de caf (Coffea arabica L.) con el objetivo de incentivar el uso de los
residuos de pulpa de caf, los cuales son ricos en materia orgnica, como sustrato
para la produccin de biomasa de levaduras por procesos de fermentacin
aerbica. Sin embargo, dichos residuos de caf antes de ser utilizados fueron
sometidos a hidrlisis con una solucin de cido sulfrico al 2%, en una relacin
10:1 (lquido:slido), con un tamao de partcula 2 mm., operando a presin
atmosfrica, ebullicin a reflujo, durante 4 horas; esto con el fin de obtener un
extracto, el cual fue filtrado y ajustado a pH 4,5 para ser posteriormente
esterilizado a 120 C por 15 minutos. Finalmente, la fermentacin fue realizada en
un medio de cultivo de extracto de caf enriquecido con sales nutritivas; donde
obtuvieron que el medio de cultivo enriquecido con extracto de caf hidrolizado 1L,
urea 3g/L, fosfato cido de potasio 2g/L, extracto de malta 1,3g/L y melaza 30g/L,
aport los mejores resultados alcanzando una produccin de biomasa de 10 g/L
con un incremento proteico de 7,39 a 42,5% en un tiempo total de fermentacin de
8 horas (GUALTIERI, M. et all, 2007).
En este mismo ao, Fajardo y Sarmiento encaminan una investigacin para
analizar y evaluar cmo acta la melaza de caa como sustrato para la produccin
de Saccharomyces cerevisiae. Para ello, realizaron cultivos en erlenmeyers
utilizando diferentes concentraciones de melaza de caa (10%, 20% y 30% (p/v))
con el fin de determinar la concentracin adecuada para obtener la mayor
concentracin de biomasa. Los investigadores determinaron el consumo de
sustrato por medio de la tcnica de DNS con previa hidrlisis de la sacarosa y
cuantificaron la biomasa obtenida por medio de la tcnica de absorbancia y peso
seco y evaluaron la viabilidad del microorganismo por medio de recuentos en
placa en agar YPG; al finalizar el proceso y sus anlisis obtuvieron un mayor
crecimiento de biomasa a una concentracin del 20% (p/v) de melaza de caa,
con un pH inicial de 5.0, temperatura de 30C, 150rpm, durante 20 horas en un
biorreactor de 1.5 L (FAJARDO, E. & SARMIENTO, S., 2007). Tres aos ms
tarde, Carrillo et all en el 2010 evalan de igual forma la melaza como sustrato,
pero en el presente informe la analizan para producir levadura C. utilis ATCC 9256
como inculo para ser utilizada en alimentos para consumo humano. Con el fin de
determinar el mejor tratamiento y lograr el mayor rendimiento, usaron un diseo
factorial 2X2 (2 y 4 Brix de concentracin de azcares y 10 y 15 ml de inculo)
donde incubaron a 30C durante 2 horas a 200 rpm; de esta forma, el mayor
15
rendimiento de biomasa lo present el tratamiento de 15 ml de inculo y 2 Brix
con 13.8 g l-1 en base seca. A partir de la biomasa producida determinaron su
calidad analizando su contenido de protenas, lpidos y carbohidratos (mtodos de
Kjeldahl, Soxhlet y, Eynon y Lane, respectivamente), as como humedad por el
mtodo de calentamiento en estufa. Los resultados del anlisis bromatolgico de
la biomasa fueron: 57.2 % de protena, 7.0 % de lpidos y 10.9 % de carbohidratos,
los cuales se compararon con el contenido nutrimental de los principales alimentos
consumidos como fuente de protena (CARRILLO, M, et all., 2010). Continuando
con el anlisis de la melaza como sustrato, para el ao 2011 Cajo et all plantean el
uso de la misma como suplemento para apoyar a las vinazas producidas de
destilera para producir biomasa de C. utilis, de esta forma, iniciaron aislando las
levaduras de panca de Zea mays L. maz en agar Sabouraud glucosado, el cual
fue identificando con un 40.23 % como C. utilis. Luego, las cultivaron en vinaza
con 30 g/L de melaza, a 28 C, durante 24 horas; pesaron la biomasa y
seleccionaron la levadura C. utilis MKJ12, debido a que alcanz el mayor valor de
7.667 g/L. Esta levadura en concentraciones de 25, 50 y 75 mL/L de inculo se
cultiv en biorreactores tipo tanque, en lote discontinuo, con un contenido de 300
mL de vinaza con 10, 30, y 50 g/L de melaza a 28 C, durante 20 horas; al finalizar
la fermentacin determinaron que con 50 mL/L de inculo y 50 g/L de melaza se
produce el menor tiempo de generacin (2.88 h) y los mayores valores en el
nmero de generaciones (6.95); adems de producir 11.78 g/L de biomasa y con
un 40.15 % de protena (CAJO, L., NIZAMA, L. & CARREO, C., 2011).
Desde otra perspectiva, se han venido desarrollando investigaciones que buscan
identificar cmo afecta la forma en que se cultiva el microorganismo, adems de
los nutrientes que ste requiere; es decir, buscan hallar cmo influye el tipo de
biorreactor. Desde un punto de vista general, Palmern et all en el ao 2011
proponen identificar qu levadura proporciona las mejores caractersticas para
producir protena unicelular para consumo humano a escala laboratorio, usando
para este fin matraces agitados; de esta forma, con el desarrollo investigativo en
matraces agitados a 200 rpm, 30 C y a concentraciones de etanol, de 1 g/L a 40
g/L, determinan que la concentracin ptima de sustrato es de 16 g/L y obtienen
que la concentracin de protena en la levadura Cndida utilis es 52.5% del total
de protenas, sugiriendo as, que el etanol es una fuente prometedora de alta
calidad de protena unicelular (PALMERN, D. & et all, 2011).
Por su parte, Pinheiro en el 2013 proporciona una investigacin de gran
importancia y complejidad, puesto que en sta identifica el metabolismo y la
morfologa del crecimiento de la levadura C. utilis bajo presiones que varan hasta
los 12 bares. Se llev a cabo la fermentacin en un reactor presurizado con aire
creciente hasta 6 bar de presin, comparando el efecto de la presin de aire total
en un cultivo fed batch de alta densidad, elevando la presin total de 1 bar a 12
bar. Los resultados mostraron que el ascenso de aire a presin, condujo a una
mejora sustancial de la produccin de biomasa. Por otra parte, la formacin de
etanol se vio reducida significativamente en las presiones de 6 bar en proceso por
batch y de 12 bar por fed-batch. Para clasificar las clulas de C. utilis basado en
su morfologa desarrollaron un mtodo usando anlisis de imagen automtico
16
teniendo en cuenta parmetros como caractersticas de las clulas individuales y
su crecimiento, el factor de tamao y el factor de alargamiento de la clula; una
vez realizado el anlisis de imagen no observaron diferencias significativas en la
distribucin de tamao de clula y se evidenci que las clulas de levadura
conservan la forma tpica de oval incluso a 12 bar de presin de aire. De esta
forma concluyeron que es posible afirmar que la levadura C. utilis puede soportar
una tensin hiperbrica, lo que significa que el uso de presin de aire creciente es
un mtodo adecuado para mejorar la oxigenacin de cultivos de alta densidad
(PINHEIRO, R. et all, 2013).
Finalmente, en el ao 2015 en Cuba Julin y Ramos analizan el crecimiento de la
levadura C. utilis en un biorreactor tambor rotatorio continuo exponiendo que la
fermentacin en estado slido en biorreactores continuos ha sido muy poco
estudiada debido a los problemas significativos que se presentan en la
transferencia de calor; pero es por ello, que, este modo de operacin puede
significar una oportunidad para resolverlos y ofrecer adems una alternativa de
anlisis del crecimiento de la levadura Cndida utilis. En ste, estudian la
influencia del tiempo de residencia de las partculas y del flujo especfico de aire.
Despus de simular el crecimiento de la levadura Cndida uitilis sobre bagazo de
caa de azcar el modelo predice que se obtienen buenos resultados para un
biorreactor de 2 m de dimetro y 20 m de longitud, con un tiempo de residencia de
10 h y un flujo especfico de aire aproximadamente igual a 2 L/kg min (JULIN, M.
& RAMOS, L., 2015).

5.2.2. Ecuacin del proceso Para dar lugar al desarrollo del presente proyecto
se debe identificar la ecuacin qumica del proceso de produccin de biomasa de
levadura Cndida utilis con melaza de caa como sustrato y fuente de carbono y
adicin de amonio dihidrgeno de fosfato como fuente de nitrgeno (CHEONG, M
& ROSMA, A., 2007).
En primera instancia, se realizar la conversin de la masa de melaza de caa a
utilizar para el desarrollo del proyecto, la cual ser de 30 g/L a moles (CAJO, L.,
NIZAMA, L. & CARREO, C., 2011) (CARRILLO, M, et all., 2010) (GUALTIERI, M.
et all, 2007); tomando en cuenta que en el proyecto se tiene como finalidad
estudiar la produccin de biomasa de C. utilis, para su posterior uso en la industria
de alimentos y se desea seleccionar el biorreactor indicado para el desarrollo del
proyecto, decidindose establecer un ensayo con un volumen de 5 L (los 5 litros
se deciden de acuerdo al diseo experimental, puesto que se llevarn a cabo
cinco experimentos de 1 L efectivo cada uno), para ser llevado a cabo a escala de
laboratorio. De acuerdo al volumen a desarrollar se debe proceder tambin a
tomar en cuenta que la fuente de nitrgeno se ver influenciada por dicha
cantidad, ya que se establece que se adicionar como suplemento de nitrgeno
amonio dihidrgeno de fosfato en una fraccin de 0,09% gramos de amonio
dihidrgeno de fosfato/volumen (litros) del ensayo (CHEONG, M & ROSMA, A.,
2007), se proceder a calcular inicialmente las moles que alimentan al principio
como fuente de nitrgeno en el inculo para establecer de esta forma las moles
17
que se producirn o necesitarn de oxgeno, biomasa, cido fosfrico, agua y
dixido de carbono.

Ecuacin 1. Reaccin qumica en base mol-C del proceso biotecnolgico

para la obtencin de biomasa de C. utilis

2 + 2 + (4 )2 4 = 2 + 2 + 1,83 0,46 0,19 + 3 4

Tomando en cuenta la ecuacin 1 y las cantidades especificadas de melaza de

caa y del amonio dihidrgeno fosfato se llevar a cabo el clculo necesario para
identificar las moles que sern necesarias para realizar el presente proceso
biotecnolgico. Para ello se remitir a la tabla peridica y se tomarn en cuenta los
pesos moleculares de dichos compuestos; de esta forma se obtiene que la
glucosa pesa 30 g/mol-C y el amonio dihidrgeno de fosfato 115,02 g/mol. Se
calcularn las moles necesarias de glucosa, teniendo en cuenta la siguiente
ecuacin:

Ecuacin 2. Conversin de gramos a moles

=

*PM= Peso molecular del compuesto

30
5
=

30

= 5
0,09
5

=
115,02

= 3,912 103

Como se indic anteriormente, tanto la fuente de carbono, en este caso la glucosa,

como la fuente de nitrgeno, la cual es el amonio dihidrgeno de fosfato se ven
afectadas por los 5 litros que se prepararn como medio de cultivo para el
experimento. Despus de calcular correctamente la cantidad de moles necesarias
de glucosa y de amonio dihidrgeno de fosfato se proceder a calcular las moles
correspondientes de los compuestos faltantes; este clculo se realizar siguiendo
18
el mtodo de matrices por Excel. Sin embargo, antes de realizarlo se deben
identificar los grados de libertad para corroborar que dicho mtodo se puede
realizar y, adems se deben identificar las diferentes matrices necesarias para su
desarrollo.

Ecuacin 3. Grados de libertad

*GL= Los grados de libertad siempre deben dar como resultado cero para poder desarrollar el
mtodo de matrices
*VT= Variables totales, es la sumatoria de todas las variables que se encuentran en la ecuacin del
proceso; de acuerdo a la Ecuacin 2, el proceso de fermentacin para la obtencin de biomasa C.
utilis posee 7.
*BA= Balances atmicos, es la sumatoria de la cantidad de elementos presentes en la ecuacin del
proceso; de acuerdo a la Ecuacin 2, el proceso de fermentacin para la obtencin de biomasa C.
utilis posee 5.
*VM= Variables medidas, es la sumatoria de la cantidad de compuestos que pueden ser medidos
de forma sencilla en el laboratorio o para el desarrollo del proyecto; en el presente proyecto se
encuentran 2 variables, las cuales son: glucosa y amonio dihidrgeno de fosfato, siendo su valor
de 5 mol-C y 3,912*10-3 moles respectivamente.
= 7 5 2

= 0

Despus de medir los grados de libertad del proceso, se deben especificar las
matrices necesarias y la ecuacin que permite calcular las moles de los
compuestos faltantes.

Ecuacin 4. Ecuacin de matrices

+ = 0

= 1

*Em= Matriz de coeficientes medidos

*Ec= Matriz de coeficientes calculados
*qm= Matriz de moles medidos
*qc= Matriz de moles calculadas

19
Tabla 4. Matriz de coeficientes medidos

C 1 0

H 2 6

Em= O 1 4

N 0 1

P 0 1

CH2O (NH4)H2PO4

Tabla 5. Matriz de moles medidos

qm

CH2O -5

(NH4)H2PO4 -3,912*10-3

Esta matriz, es obtenida a travs del clculo previo realizado de las moles
necesarias de las fuentes de carbono y nitrgeno (ver solucin de la Ecuacin 2)

Tabla 6. Matriz de coeficientes calculados

C 0 1 1 0 0

H 0 1,83 0 2 3

O 2 0,46 2 1 4
Ec=
N 0 0,19 0 0 0

P 0 0 0 0 1

O2 CH1,83O0,46N0,19 CO2 H2O H3PO4

20
Tabla 7. Matriz inversa de los coeficientes calculados

-1 -0,25 0,5 6,4605 -1,25

0 0 0 5,2632 0

1 0 0 -5,2632 0
Ec-1=
0 0,5 0 -4,8158 -1,5

0 0 0 0 1

Tabla 8. Matriz moles calculadas

O2 -4,9777

CH1,83O0,46N0,19 0,0206

qc= CO2 4,9794

H2O 4,9870

H3PO4 0,003912

Con las moles de cada uno de los compuestos implicados en el proceso, se

pueden reemplazar los coeficientes que acompaan cada compuesto en la
Ecuacin 2. Adems, por medio de la Tabla 8 se puede prever de esta forma la
cantidad en gramos de los compuestos que se generarn una vez finalizado el
proceso de fermentacin.

21
Tabla 9. Moles necesarias de cada compuesto para llevar a cabo el proceso
biotecnolgico

Compuesto Coeficiente en la Ecuacin 2. Moles necesarias del compuesto

CH2O a 5

(NH4)H2PO4 b 3,912*10-3

O2 c 4,9777

CH1,83O0,46N0,19 d 0,0206

CO2 e 4,9794

H2O f 4,9870

H3PO4 g 0,003912

Ecuacin 5. Reaccin qumica en base mol-C del proceso biotecnolgico para la

obtencin de biomasa de C. utilis con sus respectivas moles

+ , + , ( ) = , + , +
, , , , + ,

Tabla 10. Cantidad en gramos de los compuestos que intervienen en la

fermentacin

Compuesto Moles necesarias del compuesto Cantidad en gramos

CH2O 5 150

(NH4)H2PO4 3,912*10-3 0,44988

O2 4,9777 159,28

CH1,83O0,46N0,19 0,0206 0,4911

CO2 4,9794 219,094

H2O 4,9870 89,7665

H3PO4 0,003912 0,3834

22
De esta forma se puede decir que por cada 150 gramos de glucosa que se
consuman producirn 0,44988 gramos de levadura. Aunque la relacin indique a
simple vista que la produccin no es muy alta y por el contrario halla una
generacin superior de CO2 esto puede inducir al planteamiento de aprovechar de
alguna forma este metabolito generado en el proceso.

23
 6. METODOLOGA

La presente metodologa se expone como base al proyecto para especificar los

pasos y requisitos para la obtencin de levadura C. utilis. En sta, se da
explicacin del medio de cultivo que comprender el proceso de fermentacin, el
microorganismo que se usar, los biorreactores, se especificar el diseo
experimental y finalmente los anlisis y mtodos necesarios para evaluar el
experimento.

DETALLES DEL PROCESO EXPERIMENTAL

6.1.1. Medio de cultivo Se utilizar melaza de caa grado 1, es decir, melaza

con un valor superior a 85 Bx. sta se obtendr del Ingenio Mayagez S.A. sede
de oficinas en Bogot.

6.1.1.1. Tratamiento previo a la fermentacin Se tomar inicialmente la

melaza de caa y se diluir en agua hasta llegar a 3Bx. Para ello se tomarn 150
gramos de la melaza y se diluirn en 5 litros de agua a una temperatura de 80C
para facilitar la sedimentacin de las impurezas; a su vez se aplicar cido
clorhdrico o cido sulfrico, esto con el fin de ayudar al proceso de decantacin,
pero tambin para apoyar el proceso de hidrlisis de la sacarosa de la melaza de
caa, para que la levadura pueda dar aprovechamiento a la glucosa que se
obtiene a partir de la inversin de este azcar.
Despus de realizar la dilucin, homogenizacin y sedimentacin de la miel de
caa, se enfriar la mezcla a una temperatura de 30C, se medir su pH para
cerciorarse de que el mismo se encuentra en 4 (en caso dado, de que el pH est
ms bajo a causa de la adicin previa del cido, se adicionar bicarbonato de
sodio hasta llegar al pH deseado; en caso contrario, si el pH es superior a 4 se
adicionar cido clorhdrico). A continuacin, se hace la adicin del amonio
dihidrogeno de fosfato en una concentracin de 0,09% (p/p) y finalmente despus
de homogenizar la mezcla se dividir en diez partes, para poner aproximadamente
500 mL de la dilucin en fermentadores de 1 litro.

24
Figura 3. Tratamiento previo del medio de cultivo

6.1.2. Microorganismo Se utilizar la cepa de levadura Cndida utilis ATCC

9950 importada de Estados Unidos por la compaa Annar. Para su reactivacin
se seguirn las instrucciones que proporciona la empresa en la ficha tcnica del
producto (ANEXO 1) como procedimiento adecuado para la propagacin de las
clulas.

6.1.2.1. Tcnica de fermentacin El proceso de fermentacin se llevar a

cabo en matraces Erlenmeyer PIREX 4980 de 1000 mL debido a que la tcnica de
fermentacin se llevar a cabo en laboratorio; a cada matraz Erlenmeyer se le
adicionar de forma equitativa 500 mL del medio de cultivo (dilucin de melaza +
amonio dihidrogeno de fosfato), obteniendo finalmente diez matraces en total. Las
condiciones de temperatura, pH y Brix sern controladas de forma que cada uno
de los fermentadores cumplan con lo siguiente: temperatura entre 30 - 33C, la
cual se medir con termmetro, de preferencia digital; el pH ptimo de 4 ser
medido con un pHmetro HI 2221 de sobremesa marca Hanna instruments y 3Brix,
que sern medidos con refractmetro porttil. Antes de dar inicio a la fermentacin
se esterilizarn los fermentadores y los medios de cultivo a 121C por 15 minutos
(CARRILLO, M, et all., 2010, pg. 34; ROSMA, A. et all, 2005, pg. 19). Una vez
realizada la esterilizacin se har la inclusin de la levadura a matraz Erlenmeyer,
cuidando de que la concentracin celular de la misma sea de 10 6 clulas/mL
(SOTO, E., 2002, pg. 26). Estos matraces sern agitados por medio de un
sistema de agitacin mecnico de pala a escala de laboratorio de forma que se
logre controlar la velocidad de agitacin.
Tomando esto en cuenta, se realizar la fermentacin tipo batch, por un tiempo
estimado de 40 horas, donde se har una toma de datos a los 15 minutos, 30
minutos, 1 hora y posteriormente cada 5 horas, para determinar la cantidad de
clulas en el cultivo y la cantidad de protena cruda; donde se realizar el conteo
de clulas usando la cmara de Neubauer (Instrucciones de su uso en el ANEXO
25
2) y el contenido de protena cruda siguiendo las instrucciones de la FAO en los
anlisis proximales, (el cual est basado en el de Chow et al 1980) (Instrucciones
en el ANEXO 3)
Como variables de estudio, se establecern diferentes concentraciones de
inculos para ocho de los diez matraces, ya que dos de estos actuarn como
testigos. A su vez, se variar en estos cuatro fermentadores la velocidad de
agitacin mecnica, que se llevar a cabo con un agitador mecnico; y la
concentracin de los inculos de la levadura. Con estas dos variables establecidas
se estudiarn los cambios generados en la cantidad de biomasa producida y su
calidad de acuerdo al contenido de protena cruda, apoyndose en el modelo del
diseo experimental que se expondr en el siguiente numeral.

6.1.3. Diseo de experimentos Como se indic en el ttulo anterior se contarn

con dos variables dependientes, las cuales son produccin de biomasa y su
contenido de protena cruda. stas se analizarn de acuerdo a los posibles
cambios que puedan producir las variables independientes que se controlarn a lo
largo de la fermentacin en cada uno de los fermentadores; para ello, se propone
controlar la velocidad de agitacin mecnica aplicada al fermentador y la
concentracin del inculo adicionado.
Tomando esto en cuenta, se establecer un diseo experimental factorial de
variable fija con dos repeticiones, el cual se analizar mediante el anlisis de
varianza ANOVA para determinar las diferencias entre los tratamientos con un 5%
de significancia y mediante la prueba mltiple de Tukey para comparar las medias.
De esta forma, tomando en cuenta las variables se establecen las siguientes
hiptesis:

a) Hiptesis nula1= No hay diferencia significativa entre las medias en la

produccin de biomasa de los tratamientos.

b) Hiptesis alternativa1= Hay al menos un tratamiento que manifieste una

diferencia significativa en la media de su produccin de biomasa.

c) Hiptesis nula2= No hay diferencia significativa entre las medias de

contenido de protena cruda de los tratamientos.

d) Hiptesis alternativa2= Hay al menos un tratamiento que manifieste una

diferencia significativa en la media de contenido de protena cruda.

26
Tabla 11. Caractersticas del diseo experimental

Clase de diseo experimental Diseo multifactorial

Tipo de modelo experimental Modelo I (Efectos fijos)
Diseo del anlisis ANOVA
Nivel de confianza () 0.05
Orden de experimentos Aleatorio
Supuesto de la situacin experimental Error tipo I (Se rechaza la hiptesis
nula, siendo esta falsa)
Objeto de estudio Levadura C. utilis
Objeto experimental Medio de cultivo
Variables independientes Velocidad de agitacin mecnica
Concentracin del inculo
Variables dependientes Produccin de biomasa
Cantidad de protena cruda
Temperatura (C)
Variables de control pH
Bx

Tabla 12. Diseo multifactorial Modelo I

Tratamientos Factor A Factor B Interacciones

(Concentracin del (Velocidad de (Factor A-
inculo) agitacin) Factor B)

T1 4 % (v/v) 120 rpm 4 %-120 rpm

T2 4 % (v/v) 200 rpm 4 %-200 rpm

T3 10 % (v/v) 120 rpm 10 %-120 rpm

T4 10 % (v/v) 200 rpm 10 %-200 rpm

27
6.1.4. Anlisis y mtodos

6.1.4.1. Mtodo de Lane y Eynon para azcares reductores El mtodo se

utiliza como medida para identificar el consumo de azcares reductores por parte
de la levadura en el proceso de fermentacin, de esta forma se medir el
porcentaje de azcares reductores que tiene la melaza antes de dar inicio a la
fermentacin y al finalizar transcurridas las 40 horas; se utilizar este mtodo ya
que los azcares presentes en la melaza que la levadura posiblemente consumir
son reductores, los cuales son la glucosa y la fructosa. Este mtodo se basa en la
determinacin del volumen de una disolucin de la muestra que se requiere para
reducir completamente un volumen conocido del reactivo alcalino de cobre. El
punto final se determina por el uso de un indicador interno, azul de metileno, el
cual es reducido a blanco de metileno por un exceso de azcar reductor
(Laboratorio Nacional de la Secretara de Salubridad y Asistencia et all, 1978, pg.
1).
Este mtodo se aplicar a la melaza una vez acondicionada para el medio de
cultivo con el objetivo de identificar que hay una amplia disponibilidad de azcares
reductores en sta.

a) Procedimiento
1. Titulacin de la disolucin A + B
Disolucin A: Disolver 34.639 g de sulfato de cobre pentahidratado en 500
ml de agua destilada y filtrar a travs de lana de vidrio o papel.
Disolucin B: Disolver 173 g de tartrato doble de sodio y potasio y 50 g de
hidrxido de sodio en agua y diluir a 500 ml, dejar reposar dos das y
despus filtrar usando asbesto.
1.1. Neutralizar 10 ml de la disolucin de azcar invertido al 1 %: P/V (para su
preparacin se pesan 9.5 g de sacarosa, se disuelven en 50 ml de agua,
se aaden 5 ml de HCl concentrado y se diluyen con agua a 100 ml, se
guarda algunos das a temperatura ambiente y despus se completa el
volumen a 1000 ml) con hidrxido de sodio 1N, en un matraz volumtrico
de 100 ml y completar el volumen con agua.
1.2. Transferir la disolucin a una bureta, y titular una solucin que previamente
se depositar en un matraz Erlenmeyer que contenga una mezcla de 5 ml
de la disolucin A, 5 ml de la disolucin B y 50 ml de agua en ebullicin.
Agregar la disolucin de azcar invertido hasta un poco antes de la total
reduccin del cobre.
1.3. Agregar 1 ml de la disolucin de azul de metileno y completar la titulacin
hasta decoloracin del indicador; La titulacin debe efectuarse en 3
minutos cuando se emplea el reactivo de glucosa titular directamente.
1.4. El ttulo de la disolucin debe ser de 0.0505 a 0.0525:

28
Titulacin de la disolucin (10 ml de la disolucin A + B corresponden a X
gramos de azcar invertido): ml de disolucin requeridos en la titulacin x la
concentracin en g/ml

2. Determinacin de los reductores directos

2.2. Pesar la muestra (de 5 a 10 g) y colocarla en un matraz volumtrico de
250 ml., aadir 100 ml de agua, agitar lo suficiente para que todo el
material soluble en agua quede disuelto.
2.3. Aadir 2 a 10 ml de la disolucin saturada de acetato neutro de plomo,
agitar y dejar sedimentar.
2.4. Aadir poco a poco oxalato de sodio o potasio hasta la total
precipitacin del acetato de plomo. Completar el volumen con agua,
agitar y filtrar.
2.5. Transferir el filtrado obtenido a una bureta y titular.

3. Determinacin de reductores totales

3.1. Pesar la muestra (de 5 a 10 g) y colocarla en un matraz Erlenmeyer de
250 ml, aadir 100 ml de agua y agitar.
3.2. Aadir de 2 a 10 ml de disolucin saturada de acetato neutro de plomo,
agitar y dejar sedimentar.
3.3. Aadir poco a poco oxalato de sodio o de potasio hasta la total
precipitacin del acetato de plomo. Filtrar recibiendo el filtrado en un
matraz volumtrico de 250 ml.
3.4. Lavar tres veces el matraz Erlenmeyer y el filtro con 20 ml de agua,
recibir el agua de lavado en un matraz volumtrico.
3.5. Aadir 10 ml de HCl concentrado al matraz volumtrico que contiene el
filtrado obtenido en la determinacin de reductores directos. Calentar a
65 C durante 15 minutos y enfriar.
3.6. Neutralizar con hidrxido de sodio 1N y completar el volumen con agua.
3.7. Transferir a una bureta y titular.

4. Clculos

% de azcares reductores directos = 25000 T / V P

T = Ttulo de la disolucin A + B en gramos de azcar invertido.
V = Volumen de la disolucin problema, empleado en la titulacin de 10 ml de la
disolucin A + B en mililitros.
P = Peso de la muestra, en gramos

Fuente= (Laboratorio Nacional de la Secretara de Salubridad y Asistencia et all, 1978, pgs. 1-5)

29
6.1.4.2. Obtencin de biomasa por peso seco Para llevar a cabo la
obtencin de biomasa por peso seco se realizar el procedimiento propuesto por
Soto, 2002. En este a 40 mililitros de medio de cultivo, los cuales se centrifugaron
a 2500 rpm durante 5 minutos, se desecha el lquido supernadante y se
resuspende el slido en agua. Posteriormente se filtra con un papel filtro Whatman
# 20, que debe ser pesado con anterioridad. El residuo con el papel se lleva a
secado por 2 horas a 65 C, cumplido este tiempo se pesa nuevamente y por
diferencia se obtiene en gramos los slidos secos por mililitros.
Para disminuir el porcentaje de error del mtodo se realiza el mismo procedimiento
para el medio de cultivo testigo; con la finalidad de eliminar el residuo aportado por
los slidos suspendidos en el medio de cultivo y as determinar el peso seco inicial
(SOTO, E., 2002, pg. 30).

6.1.4.3. Mtodo de purificacin de la biomasa Al concluir el tiempo de

fermentacin de los matraces inoculados con 500 ml, la mezcla obtenida se
centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos a 30C y finalmente se separar y se
obtendr la biomasa del sustrato por decantacin (CARRILLO, M, et all., 2010,
pg. 35).
Para la reduccin de cidos nucleicos, la biomasa de C. utilis ser sometida a un
tratamiento con HClO4 en caliente para generar una una lisis celular utilizando una
centrfuga durante ocho minutos a 3000 rpm, donde se realizar un lavado, para
separar y recopilar el sobrenadante resultante. Una vez obtenida la biomasa se
deber eliminar el exceso de HClO4 realizando 3 lavados con agua destilada,
centrifugando y eliminando el sobrenadante de la misma manera en que se obtuvo
de forma general la biomasa (CARRILLO, M, et all., 2010, pg. 35).

6.1.4.4. Caracterizacin de la protena celular La caracterizacin de la

protena unicelular se realizar por medio de los Anlisis basados en los mtodos
especificados en A.O.A.C. para cereales (SOTO, E., 2002, pg. 30).

Tabla 13. Mtodos oficiales de la A.O.A.C.

Parmetro Mtodo
Humedad 925.10
Protena 979.09
Extracto etreo 939.05
Cenizas 923.03
Fuente= SOTO, E., 2002, pg. 35, Tabla 3

30
6.1.4.5. Rendimiento de la biomasa y de la protena unicelular Una vez
alcanzada la fase estacionaria, la cual ser identificada la realizar el conteo de
clulas; se tomarn muestras de 40ml de la biomasa, en tubos plsticos, que
sern llevados a centrifugacin a 3000 rpm por un lapso de 30 minutos. Terminada
la centrifugacin el efluente puede ser vertido y lo que queda se coloca en cajas
Petri previamente pesadas; stas se pesarn de nuevo con la biomasa hmeda la
cual se secar en la estufa a 60 C, hasta llegar a un peso constante. El
rendimiento se calcular restando el peso de biomasa seca a la biomasa hmeda,
dividiendo sobre los 500 mL que se tratarn en cada biorreactor (MORA, R &
BRAVO, C., 2014, pg. 38).

31
 7. PRESUPUESTO GLOBAL

Fuentes
Descripcin Total ($)
UNINCCA Otros
PERSONAL
Investigador 230000 230000
EQUIPOS
Refractmetro 17000 17000
pHmetro 20000 20000
Estufa de secado 50000 50000
Centrfuga 20000 20000
Cmara de Neubauer 15000 15000
Unidad de digestin y destilacin
20000 20000
Kjeldahl.
Fermentadores de agitacin
1200000 2200000
mecnica
SOFTWARE
Statgraphics 90000 90000
MATERIALES Y SUMINISTROS
Melaza de caa 10000 10000
Levadura C. utilis 80000 80000
Reactivos 50000 50000
Filtros Whatman 10000 10000
MATERIAL BIBLIOGRFICO 80000 80000
TOTAL 2892000

32
 8. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Actividades Abreviacin de las Fecha de Duracin Fecha de

Actividades Inicio (Das) Terminacin
Bsqueda de informacin Bsqueda de info. 01-06-17 90 30-08-17
Construccin del documento Construccin del doc. 01-06-17 90 30-08-17
Compra de materiales y Compra de materiales 01-06-17 15 16-06-17
equipos y equipos
Acondicionamiento de Acond. Biorreactores 17-06-17 15 02-07-17
biorreactores
Compra de materias Compra materias 17-06-17 8 25-06-17
Reactivacin de levadura Reactivacin de 26-06-17 4 30-06-17
levadura
Preparacin del cultivo Preparacin del cultivo 30-06-17 1 01-07-17
Inicio de la fermentacin Inicio de la 01-07-17 2 03-07-17
fermentacin
Conteo de clulas y protena Conteo de clulas y 01-07-17 2 03-07-17
cruda protena cruda
Toma de Brix, temepratura Toma de Brix, 01-07-17 2 03-07-17
y pH temepratura y pH
Clculo de consumo de Cal. Azcares 01-07-17 3 04-07-17
azcares reductores reductores
Obtencin de biomasa seca Obtencin de X seca 03-07-17 1 04-07-17
Purificacin de biomasa Purificacin de X 04-07-17 1 05-07-17
Caracterizacin de protena Caract. De CP 05-07-17 1 06-07-17
cruda
Rendimiento de biomasa y Y de X y CP 06-07-17 1 07-07-17
protena cruda

33
34
 9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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37
 10. ANEXOS

10.1. ANEXO 1 (FICHA TCNICA LEVADURA C. UTILIS ATCC 9950)

38
39
10.2. ANEXO 2 (INSTRUCCIONES DEL CONTEO DE LA CMARA DE
NEUBAUER)

Fig 1. Detalle de la rejilla de una cmara de Neubauer Improved

Conteo Celular, paso a paso

PASO 1. Preparacin de la muestra.

Dependiendo del tipo de muestra a medir, se ha de habr de preparar una muestra con
una concentracin apta para su recuento. Tpicamente, el rango de concentraciones que
permite contar el hematocitmetro est entre 250.000 clulas y 2,5 millones de clulas por
ml.
Se intentar que la muestra tenga una concentracin en torno a 106 (1 milln) aplicando
las diluciones correspondientes.
Por debajo de 250.000 clulas / ml (2,5 * 105) la cantidad de clulas contadas no es
suficiente para poder dar una estimacin lo suficientemente fiable de la concentracin
celular.
Por encima de 2,5 millones (2,5 * 106) la probabilidad de cometer errores de conteo crece
demasiado, y tambin el tiempo y esfuerzo necesario para realizar un recuento con
fiabilidad. Por encima de esta concentracin es conveniente diluir la muestra para acercar
la concentracin al rango ptimo.

PASO 2. Introduccin de la muestra en la cmara de Neubauer

Se toman 10 uL de la mezcla preparada en el paso 1 con la micropipeta.
1) Se coloca un cubreobjetos sobre la cmara de Neubauer, y se coloca en posicin
horizontal sobre la mesa, en un lugar donde sea cmodo pipetear.
2) Se introduce una punta desechable en el extremo de la micropipeta,
3) Se ajusta la micropipeta para succionar 10 uL de lquido. Generalmente este ajuste se
realiza guirando el botn del embolo para seleccionar el volumen deseado.
4) Se introduce la punta de la micropipeta en la muestra

40
5) Se pulsa el pistn o embolo superior de la pipeta suavemente hasta que se siente
como el pistn llega al final de su recorrido.
6) Se saca la punta de la pipeta de la muestra, y siempre mantenindola en posicin
vertical se lleva hasta la cmara de Neubauer.
7) Se coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de la
cmara de Neubauer.
Se trata de dejar que el lquido penetre entre la cmara y el cubreobjetos desde el lateral,
por capilaridad.
8) Se suelta el pistn suavemente mientras se supervisa que el lquido est entrando
correctamente y de forma uniforme en la cmara.
9) En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo no haya
salido bien, repetir la operacin. Con esto la cmara de Neubauer cargada, lista para el
recuento celular.

PASO 3. Preparacin y enfoque del microscopio.

1. Colocar la cmara de Neubauer en la bandeja del microscopio. Si el microscopio
dispone de pinza de sujecin, fijar la cmara con ella.
2. Encender la luz del microscopio.
3. Enfocar el microscopio hasta que pueden verse ntidas las clulas mirando por el
binocular.
4. Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. Para mayor entendimiento
se emplear un ejemplo, en el cual se contarn 5 cuadros grandes de una cmara de
Neubauer Improved de 0,1mm de profundidad.
5. Realizar el recuento de clulas en el primer cuadro.
Existe una convencin por la cual, si las clulas tocan el lmite superior o el lmite
izquierdo del cuadro, deben contabilizarse, pero no se contabilizan si tocan el lmite
inferior o el lmite derecho.

Fig 2. Conteo de un cuadro grande de cmara de Neubauer; Fig 3. Recuento con alta
concentracin celular.

En caso de que la concentracin celular sea muy alta, y sea fcil perderse en el recuento,
se suele utilizar un orden de conteo en forma de zig-zag, como el descrito en la Fig 3.

41
6. Anotar en una hoja de resultados la cantidad de clulas contadas en el primer cuadro.
7. Repetir el proceso para el resto de los cuadros que deseamos contar, anotando el
resultado de cada uno de ellos. Cuantos ms cuadros contemos, ms precisin
obtendremos en nuestra medida.

Fig 4. Recuento de 5 cuadros grandes de cmara de Neubauer Improved

PASO 4. Clculo de la concentracin.

La frmula del clculo de concentracin celular:

Concentracin = nmero de clulas / volumen (en mL)

El nmero de clulas es la suma de todas las clulas contadas en todos los cuadros.
El volumen es el volumen total de todos los cuadros donde se ha realizado el recuento.

Como el volumen de 1 cuadro grande es:

0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie
0,01 cm2 * 0,1 mm (profundidad) = 0,01 cm2 * 0,01 cm = 0,0001 cm3 = 0,0001 ml

La frmula para recuento con cuadros grandes y dilucin en cmara de Neubauer:

Concentracin = nmero de clulas x 10.000 / nmero de cuadros x dilucin

La dilucin, se toma en cuenta en el caso de que se llev a cabo una dilucin y por ello
debe transformarse la concentracin obtenida durante el recuento celular en la
concentracin de la muestra original.

Ejemplo:
Para una dilucin de 1:10. Dilucin = 0,1
Para una dilucin de 1:100, Dilucin = 0,01

FUENTE= http://www.celeromics.com/es/resources/docs/Articles/Conteo-Camara-
Neubauer.pdf

42
 10.3. ANEXO 3 (CONTENIDO DE PROTENA CRUDA)

Por su costo es este el nutriente ms importante en la dieta en una operacin

comercial; su adecuada evaluacin permite controlar la calidad de los insumos
proteicos que estn siendo adquiridos o del alimento que se est suministrando.
Su anlisis se efecta mediante el mtodo de Kjeldahl, mismo que evala el
contenido de nitrgeno total en la muestra, despus de ser digerida con cido
sulfrico en presencia de un catalizador de mercurio o selenio.

Mtodo simple propuesto por Chow et al. (1980)

Reactivos
Oxido de mercurio, grado reactivo.
Sulfato de potasio o sulfato de sodio anhidro, grado reactivo.
cido sulfrico (98%), libre de Nitrgeno.
Parafina.
Solucin de hidrxido de sodio al 40%; disolver 400 g de hidrxido de sodio
en agua y diluir a 1,000 ml.
Solucin de sulfato de sodio al 4%.
Solucin indicadora de cido brico; agregue 5 ml de una solucin con
0.1% de rojo de metilo y 0.2% de verde de bromocresol a un litro de
solucin saturada de cido brico.
Solucin estndar de cido clorhdrico 0.1N.

Materiales y Equipo

Unidad de digestin y destilacin Kjeldahl.

Matraces Kjeldahl de 500 ml.
Matraces Erlenmayer de 250 ml.
Perlas de ebullicin.

Procedimiento

1. Pese con precisin de miligramos 1g de muestra y colquelo en el matraz

Kjeldahl; agrguele 10g de sulfato de potasio, 0.7g de xido de mercurio y
20 ml de cido sulfrico concentrado.
2. Coloque el matraz en el digestor en un ngulo inclinado y caliente a
ebullicin hasta que la solucin se vea clara, contine calentando por media
hora ms. Si se produce mucha espuma, adicinele un poco de parafina.
3. Deje enfriar; durante el enfriamiento adicione poco a poco alrededor de 90
ml de agua destilada y desionizada. Ya fro agregue 25 ml de solucin de
sulfato de sodio y mezcle.

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 4. Agregue una perla de ebullicin y 80 ml de la solucin de hidrxido de sodio
al 40% manteniendo inclinado el matraz. Se formarn dos capas.
5. Conecte rpidamente el matraz a la unidad de destilacin, caliente y colecte
50 ml del destilado conteniendo el amonio en 50 ml de solucin indicadora.
6. Al terminar de destilar, remueva el matraz receptor, enjuague la punta del
condensador y titule con la solucin estndar de cido clorhdrico.

Clculos:

A = cido clorhdrico usado en la titulacin (ml)

B = Normalidad del cido estndar
C = Peso de la muestra (g)

Nitrgeno en la muestra (%) = 100[((A B) / C) 0.014]

Protena cruda (%) = Nitrgeno en la muestra * 6.25

Fig 1. Diagrama de flujo de la determinacin de protena cruda por el mtodo Kjeldahl.

Fuente= http://www.fao.org/docrep/field/003/AB489S/AB489S00.htm#TOC

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