Como Purificar

Pesquisa PROTEÍNAS?
O exemplo das defensinas antifúngicas de ervilha

Marcius S. Almeida árias doenças decorrem da Em muitos casos, as preparações

Departamento de Bioquímica Médica,
modificação da estrutura e/ protêicas são usadas diretamente na
Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ, ou da atividade de diferen- terapêutica. Essas proteínas podem ser
msalmeida@bioqmed.ufrj.br tes proteínas. Atualmente, obtidas a partir de sua fonte natural,
o tratamento dessas doen- como é o caso da albumina, obtida a
Eleonora Kurtenbach
Departamento de Bioquímica Médica, ças é baseado na inibição ou na ativação partir do plasma humano, ou a partir de
Instituto de Ciências Biomédicas, da(s) enzima(s) em questão ou de sua produção em organismos genetica-
Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ, receptor(es), através da interação des- mente modificados, sendo rotuladas ge-
tas com o princípio ativo presente nos nericamente de proteínas recombinan-
medicamentos. tes.
Tanto para o estudo da atividade de
uma enzima frente a substâncias passí-
veis de ser usadas em formulações tera-
pêuticas, como para o uso direto como
medicamento, existe a necessidade de
purificação da proteína de interesse,
uma vez que qualquer célula contém
milhares de proteínas diferentes, que
apresentam uma ampla faixa de ativida-
de biológica.
Atualmente, o meio científico vive a
denominada Era Pós-Genômica. Após o
seqüenciamento de diversos genes de
diferentes organismos, incluído o geno-
ma humano completo (Lander e cols.,
2001), começa uma busca frenética,
para a determinação da atividade das
proteínas codificadas para cada um dos
genes descritos, a fim de inferir sua
função biológica e, finalmente, correla-
cioná-las com diversas doenças. Esse
grande desafio para a ciência é denomi-
Figura 1 – Coluna de troca catiônica em sistema de leito expandido utiliza- nado de proteoma, quando o objetivo é
da para clarificação de meio de cultura contendo uma defensina recombi- a análise e posterior caracterização das
nante de ervilha que possui atividade antifúngica, expressa heterologamente proteínas expressas em uma determina-
em P.pastoris (Almeida e cols., 2001). O meio de cultura (50 ml) é diluído da situação de um grupo de células ou
2x; o pH ajustado para 3,0 (a maioria das proteínas assumirão carga líquida de genoma estrutural; quando o enfo-
positiva, pois possuem pI maior do que 3,0) e aplicado, com fluxo ascen- que é a análise da estrutura tridimensi-
dente, em uma coluna contendo 95 mL de resina Toyopearl SP-650 M, pre- onal de diferentes proteínas, com a
viamente equilibrada com citrato de sódio 20 mM, pH 3,0. O material não finalidade de se inferir sua atividade
biológica através de análises de homo-
ligado, como sais e leveduras é eluído com o mesmo tampão e, finalmente,
logia estrutural. Para ambos os casos, é
as proteínas ligadas são eluídas com fluxo descendente de tampão HEPES
necessária a obtenção das proteínas de
50 mM pH 8,0. A absorbância do eluído é monitorada a 280 nm (linha interesse com alto grau de pureza.
cheia) e o pH de cada fração verificado com tiras de indicador de pH (linha Tipicamente, o processo de purifica-
pontilhada). A seta indica a regeneração da coluna através da passagem de ção de uma proteína é composto por
NaCl 1 M. O pico que possui a atividade antifúngica (que contém a defensi- múltiplas etapas cuidadosamente defi-
na recombinante) é marcado com um asterisco. No gráfico, também é apre- nidas, que têm como fundamento a
sentada esquematicamente, a coluna utilizada nesse sistema
30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
distinção das proteínas forma, é razoável minimizar
com base na seqüência as condições oxidantes do
de aminoácidos, no con- meio, por exemplo, através
teúdo de carboidratos e da adição de agentes redu-
de lipídeos-estrutura tri- tores, como o β-mercaptoe-
dimensional, e na sua ati- tanol, ou, simplesmente, se
vidade biológica, entre evitando a formação exces-
outras características des- siva de bolhas. Muitas vezes
sas macromoléculas. Esse as proteínas são instáveis
processo deve ser associ- quando estão em solução
ado com o acompanha- muito diluídas ou muito con-
mento de alguma carac- centradas, por exemplo, abai-
terística marcante da pro- xo de 10 µM ou acima de 1
teína como, por exem- mM, respectivamente (Deuts-
plo, sua atividade (ativi- cher, 1990).
dade proteolítica da trom- O requerimento inicial
bina) ou sua coloração para a purificação de uma
(citocromo C que possui proteína é a liberação da
coloração vermelha). As mesma de sua fonte natural,
cromatografias em colu- como, por exemplo, do en-
na de gel, filtração ou dosperma de sementes ou
adsorção (Deutscher, de células que a expressam
1990), são os sistemas heterologamente. Essa fra-
mais utilizados para a dis- ção é denominada de extra-
tinção entre proteínas e, to bruto. Os tecidos são ge-
apesar de existir uma ló- ralmente triturados ou moí-
gica no emprego desses dos e as bactérias, as levedu-
métodos, geralmente a Figura 2 – Esquema geral da purificação de duas defensinas ras ou as células animais
otimização de um proto- (Psd1 e Psd2) de sementes de ervilha que possuem ativida- provenientes de cultura são
colo de purificação en- de antifúngica (Almeida e cols., 2000). Em cada fração é lisadas por sonicação, varia-
volve muita experimen- verificada a presença de atividade antifúngica. Uma fração ções repentinas de pressão e
tação do tipo tentativa e contendo Lectinas (proteínas com afinidade por açúcares) se osmolaridade, forte agitação
erro, especialmente pelo liga à resina Sephadex G-75 (composta de um polímero na presença de esferas de
fato de que mesmo quan- glicídico) e é deslocada somente após a lavagem com solu- vidro ou por enzimas citolí-
do se conhece as carac- ção de glicose. Os asteriscos indicam as frações com ativida- ticas. Se a proteína desejada
terísticas físico-químicas de antifúngica. A purificação das defensinas é acompanhada está restrita a uma organela
das proteínas a serem por eletroforese em gel de poliacrilamida (Fig. 5) em particular, como núcleo,
purificadas, é muitas ve- mitocôndria ou até ligada a
zes imprevisível o com- membrana plasmática, uma
portamento delas no decorrer do pro- passa, muitas vezes, no decorrer de anos purificação substancial é obtida a partir
cesso de purificação. Nesse caso, duran- e o protocolo final deverá ser resultado do isolamento dessas estruturas celula-
te a purificação, não raramente ocorrem dos seguintes compromissos, definidos res, geralmente por centrifugação dife-
mudanças na estrutura das proteínas, no desenho do processo: custo, veloci- rencial em gradiente de sacarose, perco-
que podem provocar desde pequenas dade e pureza. ll, etc. O uso de detergentes não iônicos
alterações nas suas características físi- (triton X, tween, etc.) facilita a liberação
co-químicas até modificação ou perda CONSIDERAÇÕES INICIAIS das proteínas, especialmente quando
de sua atividade biológica. estas se encontram no interior de orga-
O grande desafio dos processos de É essencial considerar que, na maio- nelas. Muito freqüentemente, são inclu-
purificação de proteínas é o exaustivo ria dos casos, as proteínas são macro- ídos diversos aditivos durante a obten-
trabalho para se encontrarem as melho- moléculas muito frágeis, ou seja, sofrem ção do extrato bruto, com o intuito de
res estratégias, e, se for o caso, a ade- facilmente alterações físico-químicas que evitar a degradação química ou enzimá-
quação da metodologia para a escala de levam a modificação ou perda de sua tica da proteína de interesse, uma vez
produção pretendida, garantindo que o atividade. Até mesmo a exposição a que, no ato da destruição celular, são
produto final tenha todas as caracterís- temperaturas moderadas (como 37oC) liberados vários compostos altamente
ticas necessárias para seu uso, seja em pode causar lenta e gradativa desnatu- oxidantes como o peróxido de hidrogê-
humanos, ou para diagnóstico, ou uso ração de algumas proteínas. As proteí- nio (H2O2) ou enzimas proteolíticas.
veterinário ou para processos analíticos nas também são sensíveis à oxidação, Aditivos comumente utilizados são os
de interesse para a pesquisa básica, especialmente as citoplasmáticas, que agentes redutores como o β-mercapto-
como o estudo da estrutura tridimensi- se encontrem, naturalmente, em um etanol, estabilizantes como o glicerol e
onal da proteína por ressonância mag- meio com potencial redutor relativa- inibidores de proteases como o ácido
nética nuclear de alta resolução ou mente alto e que possuam resíduos de etileno-diamino-tetraacético (EDTA), um
cristalografia por Raios-X. Tudo isso se cisteína passíveis de ser oxidados. Dessa inibidor de enzimas dependentes de

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002 31

 nantes adsorvem na resina, enquanto as
células saem pela parte superior da
coluna, uma vez que a tela existente na
parte superior da coluna é aberta o
suficiente para permitir a saída dos res-
tos celulares e de outras partículas que
estiverem presentes; 3 – lavar a resina de
baixo para cima, com o tampão de
lavagem, para remoção dos restos celu-
lares e das proteínas que não se adsor-
veram na resina; 4 – eluir a proteína de
interesse invertendo-se o fluxo pela
coluna, ou seja, com o leito sedimenta-
do, como em uma cromatografia con-
vencional; 5 – por fim, a coluna é limpa
e regenerada para um novo uso.

A ESCOLHA DOS MÉTODOS

DE PURIFICAÇÃO

Antes de dar prosseguimento à puri-

ficação da proteína a partir do extrato
bruto definido acima, deve-se planejar a
estratégia a ser utilizada, onde, além da
Figura 3 – Cromatograma de filtração em gel usada num dos passos interme-
estabilidade da proteína, devemos tam-
diários da purificação das defensinas de semente de ervilha (Almeida e cols.,
bém considerar os seguintes itens (Ho,
2000). O precipitado protéico F2 (600 mg) é dissolvido em água destilada
e cols., 2000):
(para 8 ml finais), filtrado e aplicado em uma coluna (1,6 x 100 cm) empaco- · aplicação final do produto:
tada com gel Sephadex G-75 Superfine. As amostras são eluídas com tampão humano, veterinário, diagnós-
Tris-Cl 25 mM pH 7,5 a um fluxo de 0,7 ml/min. A absorbância a 280 nm tico, etc.
(linha sólida) e a atividade antifúngica (linha pontilhada) das frações coletadas · escala de manufatura neces-
são monitoradas. Frações contendo proteínas de baixo peso molecular e alta sária à demanda do produto
atividade antifúngica são agrupadas (F-PII) para posterior purificação por purificado.
HPLC. No gráfico, é representada uma partícula de gel usada nesse tipo de . eficiência do processo, geral-
cromatografia , onde os poros são indicados em preto mente expresso em termos de
enriquecimento e recuperação
da proteína de interesse 1.
íons metálicos divalentes. como a obtenção de uma solução ainda · viabilidade econômica, levan-
Em alguns casos, esse passo inicial particulada, entupimento das membra- do-se em conta o gasto envol-
não é necessário, como, por exemplo, nas de filtração, manipulação de um vido em cada técnica de puri-
quando proteínas recombinantes ex- grande volume num tempo excessiva- ficação.
pressas na levedura Pichia pastoris são mente longo e custo elevado. Pensando · existência de facilidades de
secretadas para o meio de cultura, um nesses transtornos, foram desenvolvi- produção, devendo ser consi-
sistema cada vez mais usado para se das resinas cromatográficas que, ao con- derada, a preexistência de
obter grande quantidade de proteínas já trário das convencionais, permitem a material necessário à terceiri-
em solução aquosa (Almeida e cols., adsorção de amostras contendo materi- zação da produção, etc.
2001). ais particulados e/ou células. Esse novo · adequação às especificações
O passo seguinte consiste na clarifi- conceito é conhecido como sistema de determinadas pela farmacopéia
cação da amostra. Essa etapa representa leito expandido (Janson e Rydén, 1998) de referência, Ministério da
um grande problema a ser solucionado e, como ilustrado na Figura 1, consiste Saúde e órgãos reguladores.
especialmente em purificações de gran- basicamente em: 1 - equilibrar a fase
de escala ou em escala industrial. Na estacionária (resina adsorvente) na for- O esquema ideal de purificação vai
maioria das vezes, utilizam-se técnicas ma expandida, com o tampão de equi- depender não só das características da
de centrifugação ou de filtração. Ainda líbrio; 2 – aplicar a amostra contendo as proteína de interesse, como já citado
assim, tais técnicas podem não resolver células, no sentido de baixo para cima, antes, mas também das características
o problema de clarificação da sua amos- no leito estabilizado. Dessa forma, a dos contaminantes presentes no extrato
tra, trazendo uma série de transtornos proteína de interesse e alguns contami- bruto. A linha geral a se seguir em um
1
O enriquecimento (E) é dado pela equação E = AEF/AEB, onde AEF é a atividade específica da fração e AEO é a atividade
específica no extrato bruto de proteínas, ambos expressos em Unidades/mg proteína total. A recuperação (Rec) é dada
pela equação Rec(%) = [EnzF]/[EnzB] x 100, onde EnzF se refere à quantidade de enzima obtida em cada passo de
purificação e EnzB à quantidade de enzima encontrada no extrato bruto, geralmente expressas em Unidades ou mg de
enzima. Um passo de purificação eficiente proporciona um aumento no enriquecimento da enzima sem diminuir muito
sua recuperação. Uma Unidade de enzima representa a conversão de 1 µM de substrato por minuto (Deutscher, 1990).
32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
processo de purificação pode palmente, a faixa de peso
ser dividida em três fases in- molecular a ser separado)
dicadas abaixo (Janson e que apresenta poros de
Rydén, 1998; Deutscher, uma determinada faixa de
1990). Neste artigo, usare- tamanho. Moléculas com
mos como exemplo a purifi- diâmetro molecular 3 me-
cação de duas defensinas an- nor do que o do poro serão
tifúngicas purificadas a partir capazes de penetrar na re-
de semente de ervilhas. A sina, percorrendo então um
Figura 2 apresenta o esque- caminho mais sinuoso e
ma de purificação utilizado maior do que as moléculas
(Almeida e cols., 2000). que apresentam diâmetro
molecular superior ao do
(I) Os primeiros passos de poro, que não seriam reti-
purificação geralmente das (Figura 3). No caso do
são aqueles que possu- exemplo escolhido neste
em um menor poder de artigo foi possível separar
Figura 4 – Cromatografia de fase reversa em sistema de
resolução, porém que basicamente uma fração
permitem o tratamento
HPLC para purificar duas defensinas antifúngicas de se- contendo proteínas de alto
de grande quantidade mentes de ervilha (Psd1 e Psd2) (Almeida e cols., 2000). peso molecular (Pico I) de
de material como a diá- A fração F-PII (280 µg) obtida da cromatografia de filtra- uma fração contendo pro-
lise, através de mem- ção em gel é aplicada em uma coluna de fase reversa teínas com baixo peso mo-
brana com porosidade semipreparativa C8-VYDAK, previamente equilibrada lecular (Pico II) utilizan-
inferior ao tamanho da com 0,1% (v/v) de TFA e 22,5% (v/v) de acetonitrila. As do-se uma coluna de gel
proteína de interesse; a proteínas retidas são eluídas com um gradiente linear filtração Sephadex G-75.
desnaturação por calor, crescente de concentração de acetonitrila (22,5 – 35 % Como observado na Figu-
quando a enzima de in- (v/v)) e, finalmente, liofilizadas ra 3, proteínas apresentan-
teresse é estável a alta do atividade antifúngica
temperatura (geralmen- são eluídas junto ao Pico
te acima de 70oC), ou a precipita- aumento considerável de tempera- II, aqui denominada F-PII. As
ção com grande concentração de tura. Além disso, a solução final colunas de adsorção possuem,
etanol, acetona, sais inorgânicos, não apresenta alta densidade, faci- em suas matrizes, grupamentos
etc., que perturbam a distribuição litando a obtenção do precipitado químicos responsáveis pela inte-
de cargas e grupamentos hidrofó- protéico após centrifugação. Esse ração com a proteína. Incluem-
bicos das proteínas, aumentam a primeiro passo na purificação de se nesse caso as matrizes que
constante dielétrica da água e/ou proteínas tem como vantagem possuem grupamentos ionizados
diminuem a quantidade efetiva de aumentar a concentração de pro- (carregados positivamente ou ne-
moléculas de solvente disponíveis teína na amostra e/ou preparar a gativamente) nas cromatografi-
devido à mobilização deste em amostra para ser aplicada em uma as de troca iônica; que apresen-
suas camadas de solvatação. Pode- cromatografia. tam grupamentos hidrofóbicos
se, inclusive, induzir uma precipi- (II) Esta é a fase mais eficiente da (geralmente hidrocarbonetos li-
tação fracionada das proteínas pre- purificação de proteínas, uma vez neares) nas cromatografias de
sentes no extrato bruto adicionan- que se exploram diferentes carac- fase reversa ou interação hidro-
do-se sais para concentrações fi- terísticas físico-químicas das pro- fóbica e que possuem ligantes
nais definidas e, posteriormente, teínas. Muito freqüentemente com- específicos (como Ni+2, hepari-
separando-se o precipitado protéi- preende o uso de diferentes técni- na, glutationa) nas chamadas cro-
co formado em cada concentração cas de cromatografia em coluna matografias de afinidade. As pro-
de sal do sobrenadante que con- que são classificadas de acordo teínas retidas na coluna são elu-
tém aquelas com maior capacida- com a característica protéica sele- ídas gradualmente e, o que é
de de solvatação. O sulfato de cionada (Tabela I). A filtração em mais importante, seletivamente,
amônio é um dos agentes precipi- gel consiste na passagem de uma através da passagem de um gra-
tantes amplamente usados nessa solução proteíca em uma coluna diente de concentração de uma
etapa. Apresenta como caracterís- preenchida com uma resina (o tipo substância que compete pela li-
ticas a capacidade de precipitar de resina especifica a resolução 2, gação da proteína com os grupa-
irreversivelmente as proteínas sem a velocidade do processo e, princi- mentos químicos da resina (por

2
A resolução (R) de uma coluna cromatográfica está diretamente relacionada com a separação obtida (S - determinada em
unidades de volume ou tempo) entre dois picos de amostra eluídas de uma coluna cromatográfica e inversamente
proporcional à largura de cada pico (L – determinada em unidades de volume ou tempo). Dessa forma: R = S/L. Quando
R > 1,2, diz-se que se obteve uma separação com resolução a nível da linha de base (Janson e Rydén, 1998).
3
O diâmetro molecular está diretamente relacionado com o peso molecular das substâncias, incluídas as proteínas. Para
uma proteína globular (formato mais próximo de uma esfera do que um bastão, por exemplo) de 5.5 kDa, seu diâmetro
molecular é de, aproximadamente, 30 Å.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002 33
 exemplo: sais para as
resinas de troca iôni- Durante a fase II de puri-
ca, solventes orgâni- ficação, devem-se levar em
cos para fase reversa e conta os seguintes itens: 1 –
solução contendo li- para uma purificação mais
gante específico para eficiente, é aconselhável a
as de afinidade). Na escolha de técnicas que ex-
Figura 4, apresenta- plorem seqüencialmente di-
mos, como exemplo, ferentes propriedades físico-
o último passo croma- químicas das proteínas; 2 – a
tográfico aplicado na atividade da proteína deve
purificação das defen- ser acompanhada em todos
sinas de ervilha. Nesse os passos de purificação, as-
caso, as defensinas sim como a quantidade total
(Psd1 e Psd2) são elu- de proteína, uma vez que
ídas separadamente de esses parâmetros, em con-
uma coluna de fase Figura 5 – Análise do conteúdo protéico dos passos de junto, são cruciais para a ava-
reversa por meio de liação da eficiência da purifi-
purificação de duas defensinas de ervilha (Psd1 – 5,5 kDa
um gradiente com cação. A atividade da proteí-
e Psd2 – 5,9 kDa) por eletroforese em gel de poliacrilami-
concentrações cres- na deve ser verificada pelo
centes de um solvente
da 18 %, na presença de SDS e β-mercaptoetanol (Almeida método mais simples e sensí-
orgânico (Acetonitri- e cols., 2000). As proteínas são visualizadas por incorpora- vel possível. A quantificação
la). ção de prata. Amostra 1, padrão de peso molecular; amos- protéica pode ser estimada
(III) A fase final inclui, tra 2, extrato bruto; amostra 3, fração precipitada com sul- pela absorção de luz na faixa
geralmente, um único fato de amônio F2; amostras 4 e 5, frações de proteínas de do ultravioleta (209-295 nm)
passo, que retira quais- alto peso molecular (PI) e, de baixo peso molecular (F- 4
ou através do uso de subs-
quer contaminantes PII), respectivamente eluídas da cromatografia de filtração tâncias que ou se ligam a
que porventura ainda em gel Sephadex G75 SF; amostras 6 e 7, Psd1 e Psd2 proteínas (como o corante
estejam presentes na eluídas da cromatografia de fase reversa C8 em sistema de Azul de Coomassie) ou rea-
amostra . Pode ser uma HPLC, último passo de purificação dessas defensinas gem com essas, resultando
liofilização que permi- em um produto colorido
ta a retirada de conta- (como o sulfato de cobre II
minantes voláteis sob baixas pres- pequeno diâmetro (por exemplo, presente no Reagente de Lowry). Essas
sões (em torno de 15 bar); uma 20 Å), forçada por pressão, entre duas últimas são técnicas mais específi-
diálise para excluir sais ou outras outras técnicas. No exemplo ado- cas, porém mais trabalhosas; 3 – a puri-
moléculas não voláteis da solução tado as defensinas Psd1 e Psd2 ficação também pode ser acompanhada
protéica, ultrafiltração, que encer- eluídas da coluna de fase-reversa usando-se anticorpos específicos, tanto
ra o mesmo propósito que a diáli- são liofilizadas com vistas a elimi- por “Dot Blotting” como por “Western
se, porém tem como princípio a nar a acetonitrila e o ácido trifluo- Blotting” 5; especialmente no caso de
filtração da solução de proteína racético (TFA) usado no processo proteínas cuja atividade não seja co-
por uma membrana com poros de cromatográfico. nhecida, 4 – o conteúdo protéico de

4
Proteínas absorvem luz na faixa do ultravioleta por duas vias principais: em torno de 280 nm, ocorre a absorção por
grupamentos aromáticos presentes na cadeia lateral do triptofano, tirosina e fenilalanina e, em torno de 210 nm, ocorre
a absorção de luz pelas ligações amídicas da proteína, conhecidas especificamente como ligações peptídicas (Deutscher,
1990).
5
Técnicas onde se avalia a presença de uma proteína por reconhecimento do anticorpo primário feito especificamente
para tal proteína. A revelação é feita usando-se um anticorpo secundário que reconheça a porção FAB do anticorpo primário
e que esteja conjugado geralmente a uma enzima que participe de uma reação onde um de seus produtos apresente
coloração. O “Dot Blotting” diferencia-se do “Western Bloting”, pois, no primeiro caso, a amostra a ser analisada é aplicada
simplesmente em um suporte (geralmente membrana de nitrocelulose); já no segundo caso, a amostra provém de um gel
de eletroforese, de onde as amostras são transferidas para o suporte por ação de um campo elétrico.
6
Na eletroforese sob condições desnaturantes, as proteínas inicialmente são tratadas com um detergente aniônico (SDS
– dodecil-sulfato de sódio), que se liga não covalentemente às proteínas tornando-as espécies negativamente carregadas,
além de desenovelá-las. Essas proteínas tratadas são então aplicadas no início de um gel (que funcionará como uma espécie
de peneira molecular) e, finalmente, submetidas a um campo elétrico que impulsionará tais proteínas através do gel.
Proteínas de grande peso molecular farão em percurso menor que proteínas de menor peso molecular. Na eletroforese
bidimensional, as proteínas são aplicadas em um gel com formato bem alongado que possua um gradiente de pH
(estabelecido por eletrólitos anfotéricos previamente submetidos à eletroforese) e submetidas a um campo elétrico que
as impulsionará até a faixa do gel que possua o pH igual ao pI (ponto isoelétrico) de cada proteína. Nesse ponto, as proteínas
pararão de migrar no gel, pois assumirão carga média nula. Finalmente, esse gel é colocado de lado no início de outro gel
para separar por eletroforese as proteínas de diferentes pesos moleculares. Em ambas as técnicas, a proteína é evidenciada,
na maioria dos casos, por coloração com Azul de Coomassie ou pela impregnação de Prata.
34 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
 Tipo de Característica da
Cromatografia Proteína
Gel Filtração Volume molecular
Troca Iônica Carga
Interação Hidrofobicidade
Hidrofóbica
Fase Reversa Hidrofobicidade
Afinidade Especificidade à
ligantes
Tabela I – Classificação das técnicas de cromatografia líquida de acordo com a característica físico-química que é explo-
rada das proteínas. A condição inicial necessária para a realização da técnica, os eluentes mais comuns e as condições em
que a solução de proteína ficará após sua eluição da coluna são citados. O custo geral do processo é classificado levando-
se em conta os valores aproximados das colunas e dos acessórios geralmente empregados em cada técnica
todas as etapas deve ser avaliado por
eletroforese unidimensional (Figura 5)
ou bidimensional em gel de poliacrila-
mida 6. Através dessas análises é possível
verificar se a amostra se encontra no
grau de pureza desejado, ou se novos
passos de purificação serão necessários;
5 - é comum sacrificar razoavelmente a
recuperação da proteína em prol de um
grande enriquecimento; desse modo,
uma boa prática é iniciar a purificação
com passos simples e com menor reso-
lução, que geralmente são baratos e de
maior capacidade, e, no decorrer do
processo, ir aumentando a seletividade
e a resolução dos passos de purificação,
que são mais caros e possuem menor
capacidade; 6 – procure manter o pro-
cesso de purificação o mais simples
possível, de maneira que barateiem e
encurtem o processo, além de aumenta-
rem a recuperação da proteína em ques-
tão.
QUALIFICAÇÃO DA PUREZA
Para se atestar a pureza final da
proteína, podem ser usadas várias técni-
casque apresentem sensibilidades varia-
das.
Uma das maiores provas de que a
proteína está livre de contaminantes
protéicos é obtida por seqüenciamento
peptídico automático, onde se deve
identificar apenas uma seqüência. Pode-
se identificar outras impurezas além das
de natureza protéica por espectrometria
de massa, onde deve constar apenas um
íon molecular (ou os derivados de sua
clivagem), e/ou por ressonância mag-
nética nuclear de alta resolução, onde
Condição Inicial Eluentes
da Amostra
Volume da amostra Qualquer solução
<5% do volume da aquosa
coluna
Baixa concentração Soluções salinas ou
iônica com pHs distintos
da condição inicial
Alta concentração Soluções com baixa
de sal concentração salina
Não pode conter altas Solvente orgânico
concentrações de sais
Condições específicas Alta concentração de
para ligação ligante ou sais
devem ser identificados apenas os sinais
de ressonância da proteína.
Existem diversas outras técnicas ana-
líticas bem mais simples e baratas para
se atestar com boa certeza a pureza da
amostra. O procedimento mais comum
é a eletroforese em gel de poliacrilamida
(Figura 5), que é um método rápido e
sensível, especialmente se o gel for
corado por impregnação de prata (sen-
sibilidade de até 10 ng de proteína por
banda), porém não tão confiável, pois
separa as proteínas apenas por um tipo
de característica físico-química (peso
molecular). Outro procedimento muito
empregado é a eletroforese bidimensio-
nal, que já é muito mais confiável, pois
distingue as proteínas de duas maneiras
diferentes (peso molecular e ponto iso-
elétrico).
Adicionalmente, a pureza da amos-
tra pode ser indicada com ótima confi-
abilidade por algum tipo de cromato-
grafia em coluna quando realizado em
sistemas de HPLC, que dispõem de
diversos detectores altamente sensíveis
(como detectores tipo “diode array”,
que determinam a absortividade do elu-
ído da coluna em todo espectro de luz
visível e de ultravioleta). Esse último
método carrega a vantagem de poder
ser um passo final da purificação da
amostra.
Em resumo, deve-se ter em mente
que não existe um protocolo definido
para purificação de proteínas. É neces-
sário desenvolver um protocolo especí-
fico, utilizando-se os diversos métodos
de purificação existentes de uma forma
coerente com as características do ma-
terial de onde se deseja purificar a
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Condição Final da Custo
Amostra
Amostra diluída em +
eluente
Amostra concentrada ++
em solução salina
Amostra concentrada ++
em solução salina
Amostra sem sais em +++
solventes voláteis
Amostra concentrada +++
contendo ou não
ligante
proteína de interesse, as propriedades
da própria proteína e sua finalidade.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Katia S. Cabral, Luis
E. Diaz, Melissa A.F. Silva e Roberto P.
Campelo por valiosas sugestões e pela
verificação ortográfica.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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