BAKUPEMBANDINGFARMAKOPEINDONESIA

Baku Pembanding Farmakope Indonesia atau BPFI adalah senyawa yang telah dikarakterisasi,
seperti obat tertentu (senyawa obat, produk biologik, eksipien, cemaran, hasil urai, pereaksi
dan juga termasuk baku pembanding untuk verifikasi kinerja). Jika disahkan untuk digunakan
sebagai baku pembanding pada pengujian kualitatif atau kuantitatif (sebagai bagian dari
monografi) pada Farmakope Indonesia, BPFI bersifat resmi dan memiliki legalitas hukum di
Indonesia. Pemastian kesesuaian untuk pemakaian pada aplikasi lainnya ditentukan oleh
pengguna. BPFI adalah baku pembanding primer dalam wilayah hukum Republik Indonesia,
jika memungkinkan dikalibrasi atau dibandingkan terhadap baku pembanding internasional
seperti disediakan oleh World Health Organization. BPFI tidak digunakan untuk tujuan terapi.
BPFI disediakan untuk tujuan metrologi legal dan dapat membantu memastikan perbandingan
hasil dan ketertelusuran terhadap Satuan Internasional (SI), baik disertifikasi atau tidak.

JENIS BAKU PEMBANDING

Jenis-jenis baku pembanding di lndonesia antara lain:
Baku Pembanding untuk artikel Farmakope Indonesia
Baku Pembanding Cemaran
Bahan Pembanding Bersertifikat
Baku Pembanding Farmakope Indonesia untuk Produk Biologik
Baku Uji Verifikasi Kinerja Farmakope Indonesia

PENGGUNAAN BAKU PEMBANDINGFARMAKOPE INDONESIA

Penggunaan resmi Baku Pembanding Farmakope Indonesia ditetapkan dalam monografi dan
Ketentuan Umum Farmakope Indonesia, yaitu:
Penggunaan kuantitatif pada penetapan kadar dari zat aktif dan sediaan, uji batas,
atau blangko dan kontrol.
Penggunaan kualitatif (seperti uji identifikasi, uji kesesuaian sistem, atau penanda
puncak kromatografi).
Penggunaan metode khusus (seperti baku verifikasi kinerja, baku titik leleh, dan
penghitung partikel).

UJI BATAS MIKROBA

A. UJI ENUMERASI MIKROBA

Pendahuluan
Pengujian ini dirancang untuk menentukan suatu bahan atau sediaan memenuhi spesifikasi
mutu secara mikrobiologi yang telah ditetapkan, termasuk jumlah sampel yang akan
digunakan dan interpretasi hasil uji. Metode ini tidak dapat diaplikasikan untuk produk
yang mengandung mikroba viabel sebagai bahan aktif.

Metode Penghitungan
Pengujian dilakukan dengan metode Penyaringan Membran atau salah satu Metode Angka
Lempeng yang sesuai. Metode lain adalah Angka Paling Mungkin (APM) yang umum
digunakan untuk produk dengan tingkat kontaminasi rendah. Pemilihan metode pengujian
berdasarkan beberapa faktor antara lain jenis produk yang diuji, persyaratan yang ditentukan
dan ukuran sampel yang memadai untuk memperkirakan kesesuaian secara spesifik.
Kesesuaian metode yang dipilih harus ditetapkan.

UJI FERTILITAS, KESESUAIAN METODE PENGHITUNGAN DAN KONTROL

NEGATIF
Ketentuan Umum
Kemampuan metode untuk mendeteksi mikroba pada produk harus ditetapkan. Jika terjadi
perubahan kinerja pengujian pada produk yang mempengaruhi hasil uji, maka harus
dilakukan verifikasi terhadap kesesuaian metode.

Penyiapan Galur Mikroba Uji

Galur mikroba uji dipelihara dengan Teknik Biakan Lot Benih tidak lebih dari 5 pasase dari
master lot benih asli. Biakkan tiap galur bakteri dan kapang uji secara terpisah seperti tertera
pada Tabel 1. Untuk membuat suspensi mikroba uji gunakan Dapar Natrium Klorida-Pepton
pH 7,0 atau Dapar fosfat Ph 7,2; untuk memisahkan spora Aspergillus brasiliensis
tambahkan polisorbat 80 P 0,05% pada dapar. Gunakan dapar dalam waktu 2 jam atau dalam
24 jam jika disimpan pada 2 8. Setelah dipilih untuk menyiapkan suspensi segar sel
vegetatif A.brasiliensis atau B.subtilis, siapkan suspensi spora yang stabil dan gunakan untuk
inokulum dalam pengujian dengan volume yang sesuai. Suspensi spora yang stabil dipelihara
pada 2 8 untuk jangka waktu yang tervalidasi.

Kontrol Negatif
Untuk membuktikan kesesuaian kondisi pengujian kontrol negatif dilakukan menggunakan
pengencer yang sesuai seperti pada penyiapan larutan uji. Tidak boleh terjadi pertumbuhan
mikroba. Kontrol negatif dilakukan pada saat pengujian seperti tertera pada Pengujian
Sediaan.

Fertilitas Media
Inokulasi sejumlah kecil mikroba (tidak lebih dari 100 koloni per plate) ke dalam Soybean-
Casein Digest Broth, Soybean-Casein Digest Agar dan Sabouraud Dextrose Agar seperti
tertera pada Tabel 1. Inkubasi sesuai dengan kondisi yang tertera pada Tabel 1. Untuk media
padat, pertumbuhan yang diperoleh tidak boleh berbeda dua kali dari nilai hitung inokulum
standar. Pertumbuhan mikroba dan hasil uji fertilitas pada inokulum yang dibuat segar harus
sebanding dengan bets sebelumnya. bets media sebelumnya.
Kesesuaian Metode Penghitungan Mikroba dalam Sediaan

PENYIAPAN SAMPEL
Metode penyiapan sampel disesuaikan dengan sifat fisik sediaan yang diuji. Jika dengan
prosedur yang diuraikan di bawah ini tidak ada yang memuaskan maka harus dikembangkan
prosedur lain yang sesuai.

Sediaan Larut Air

Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan Dapar
Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2, atau Soybean-Casein
Digest Broth bila perlu atur pH hingga 6 - 8.
Sediaan Bukan Lemak yang Tidak Larut dalam Air
Suspensikan atau encerkan sediaan yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan
Dapar Natriu Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2, atau Soybean-
Casein Digest Broth. Dapat ditambahkan surfaktan seperti Polisorbat 80 1 g per L untuk
membantu mensuspensikan bahan yang sulit dibasahi, jika perlu atur pH hingga 6 - 8.

Sediaan Berlemak
Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji dalam isopropil miristat steril yang
disterilkan dengan cara penyaringan atau campurka sediaan yang akan diuji dengan sesedikit
mungkin surfaktan Polisorbat 80 steril atau surfaktan noninhibitor lain steril, jika perlu
hangatkan dalam tanga air pada suhu tidak lebih dari 40 atau pada kasus tertentu tidak lebih
dari 45. Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu dalam tangas air. Tambahkan
secukupnya pengencer yang telah dihangatkan hingga diperoleh pengenceran 1 dalam 10.
Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu dengan waktu sesingkat mungkin untuk
pembentukan emulsi. Lakukan pengenceran bertingkat dengan pengencer yang sesuai
mengandung surfaktan Polisorbat 80 P dengan kadar sesuai atau surfaktan non-inhibitor lain.

Cairan atau Padatan dalam bentuk Aerosol

Pindahkan seluruh isi sediaan dengan cara aseptic dalam penyaring membrane atau wadah
steril yang sesuai untuk pengambilan sampel. Gunakan seluruh isi atau sejumlah tertentu
sediaan dari tiap wadah yang diuji.

Transdermal Patches
Lepaskan lapisan, letakkan bagian berperekat menghadap ke atas pada lempeng kaca steril
atau baki plastik. Agar tidak saling menempel tutup permukaan berperekat dengan bahan
berpori steril yang sesuai (eq: kasa steril), kemudian pindahkan lembaran transdermal dalam
wadah berisi pengencer yang mengandung polisorbat 80 P atau lesitin dengan volume yang
sesuai. Kocok kuat selama tidak kurang dari 30 menit..

INOKULASI DAN PENGENCERAN

Tambahkan suspensi mikroba uji pada sampel dan suspensi kontrol (pengencer tanpa sampel)
seperti tertera di atas, untuk mendapatkan inokulum dengan jumlah tidak lebih dari 100
koloni. Volume suspensi inokulum tidak lebih dari 1% dari volume sediaan yang diencerkan.
Untuk menunjukkan perolehan kembali mikroba uji yang dapat diterima dari sediaan, faktor
pengenceran terendah dari sampel yang disiapkan harus digunakan untuk pengujian. Jika sifat
penghambatan pertumbuhan dari sampel tidak dapat dihindari, maka jumlah total suspensi
mikroba uji mungkin harus ditambah setelah proses netralisasi dengan pengenceran atau
penyaringan.

NETRALISASI/PENGHILANGAN AKTIFITAS ANTIMIKROBA

Jumlah perolehan kembali mikroba uji dari sampel yang disuspensikan diinkubasi mengikuti
prosedur, dibandingkan dengan jumlah mikroba uji yang diperoleh kembali dari suspensi
kontrol. Jika pertumbuhan terhambat (dengan faktor reduksi > 2), maka lakukan perubahan
prosedur untuk penghitungan khusus untuk meyakinkan validitas hasil. Beberapa contoh
perubahan prosedur yaitu dengan :
(1) Penambahan jumlah volume pengencer atau media biakan;
(2) Penambahan larutan penetral khusus atau umum pada pengencer;
(3) Penyaringan membran; atau
(4) Kombinasi perubahan di atas.

Zat Penetral
Zat penetral digunakan untuk menetralkan aktifitas senyawa antimikroba. Zat tersebut dapat
ditambahkan pada pengencer atau media yang sesuai sebelum disterilkan. Jika digunakan
metode tersebut, efikasi dan hilangnya toksisitas terhadap mikroba harus dibuktikan dengan
melakukan penambahan zat penetral pada blangko tanpa sediaan.
PEROLEHAN KEMBALI MIKROBA UJI DALAM SEDIAAN
Penyaringan Membran
Gunakan penyaring membran dengan porositas tidak lebih dari 0,45 m. Jenis bahan
penyaring dipilih sedemikian rupa sehingga kemampuan menahan bakteri tidak dipengaruhi
oleh kandungan sampel uji. Gunakan satu jenis membran penyaring untuk tiap mikroba uji.
Pindahkan sejumlah suspensi sampel (min. mengandung 1 g sediaan, atau < jika diperkirakan
jumlah koloni besar) saring segera dan bilas penyaring membran dengan sejumlah tertentu
volume pengencer. Untuk menentukan angka lempeng total mikroba aerob (ALT), pindahkan
penyaring membran ke permukaan lempeng media Soybean-Casein Digest Agar (SCDA).
Untuk menentukan AKK, pindahkan membran ke permukaan lempeng media Sabouraud
Dextrose Agar. Inkubasi cawan serta lakukan pengamatan dan penghitungan.

Metode Angka Lempeng Total

Metode angka lempeng total dilakukan setidaknya duplo untuk tiap media, dan hasil
merupakan rata-rata hitung jumlah koloni.

Metode Tuang
Gunakan cawan Petri berdiameter 9 cm, inokulasikan 1 ml suspensi sampel ke dalam tiap
cawan dan kemudian tambahkan 15 - 20 ml Soybean-Casein Digest Agar atau Sabouraud
Dextrose Agar pada suhu tidak lebih dari 45. Jika digunakan cawan Petri yang lebih besar,
sesuaikan jumlah media. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji. Inkubasi cawan dan hitung
jumlah koloni rata-rata dari tiap cawan media dan jumlah koloni inokulum awal.

Metode Sebar
Untuk lempeng media gunakan cawan Petri diameter 9 cm, diisi 15-10 ml Soybean - Casein
Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar pada suh lebih kurang 45 pada tiap cawan Petri,
dan biarkan memadat. Jika digunakan cawan Petri yang lebih besar, sesuaikan jumlah media.
Keringkan permukaan lempeng media dalam lemari laminar-airflow atau dalam inkubator.
Lakukan duplo untuk tiap mikroba. Inokulasikan 0,1 ml suspensi sampel yang disiapkan
Dengan menyebarkan pada permukaan lempeng media. Inkubasi dan hitung jumlah koloni.

Metode Angka Paling Mungkin (APM)

Presisi maupun akurasi Metode APM kurang dibandingkan dengan Metode Penyaringan
Membran atau Metode ALT. Hasilnya tidak dapat diandalkan terutama untuk penghitungan
khamir. Metode APM dapat digunakan untuk menghitung ALT jika tidak ada metode lain
yang sesuai dan jika telah ditetapkan sebagai metode pilihan. Siapkan minimal tiga seri
pengenceran (10-1, 10-2, 10-3) suspensi sediaan. Dari tiap tingkat pengenceran suspensi
sediaan inokulasikan masing-masing 1 ml ke dalam tiga seri tabung berisi 910 ml media
Soybean-Casein Digest Broth. Jika perlu tambahkan surfaktan seperti polisorbat 80 P atau
inaktivator zat antimikroba ke dalam media. Jika dibuat tiga tingkat pengenceran, maka
diperoleh 9 tabung terinokulasi. Inkubasi semua tabung yang telah diinokulasi pada suhu 30
- 35 selama tidak lebih dari 3 hari. Jika terdapat kesulitan dalam membaca hasil, atau
ketidakyakinan terhadap sifat dari sediaan yang diuji, lakukan sub-kultur pada media yang
sama atau Soybean Casein Digestic Agar selama satu sampai 2 hari pada suhu yang sama,
gunakan hasil ini. Dengan Tabel 3 dapat ditentukan APM per g atau ml sediaan uji.

HASIL DAN INTERPRETASI

Jika ada kesesuaian antara Metode Penyaringan Membran atau Metode Angka Lempeng,
hitung jumlah rata-rata mikroba uji dengan nilai penerimaan tidak > faktor 2 suspensi kontrol
tanpa sediaan. Jika ada kesesuaian dengan Metode APM nilai inokulum yang dihitung harus
dalam batas kepercayaan 95% dari nilai suspensi kontrol. Jika kriteria tersebut di atas tidak
dapat dipenuhi untuk satu atau lebih mikroba yang diuji dengan metode tersebut, maka
metode dan kondisi uji harus mendekati kriteria yang digunakan untuk menguji sediaan.
PENGUJIAN SEDIAAN
Jumlah Sediaan yang Digunakan untuk Pengujian
Jika tidak dinyatakan lain gunakan 10 g/10 ml sediaan uji. Untuk sediaan cairan atau padatan
dalam aerosol gunakan 10 wadah sampel, demikian juga untuk sampel transdermal
patches. Jumlah yang diuji dapat dikurangi untuk sediaan dengan bahan aktif yang dibuat
dalam tiap unit dosis (contoh tablet, kapsul, injeksi) < atau = 1 mg, atau jumlah per g/ml
(untuk penyiapan sampel tidak dalam unit dosis) < 1 mg. Dalam hal ini jumlah sampel yang
diuji tidak < 10 unit dosis atau 10 g/10 ml sediaan. Untuk bahan aktif dengan jumlah sampel
terbatas atau ukuran bets sangat kecil (misalnya < 1000 ml/1000 g) jumlah sampel yang diuji
harus 1% dari bets kecuali jumlah yang lebih kecil ditentukan atau dinyatakan dan disetujui.
Untuk sediaan dengan total keseluruhan bets < 200 unit (misal sampel untuk uji klinis),
ukuran sampel dapat dikurangi menjadi dua unit atau satu unit jika < 100 unit. Ambil sampel
secara acak dari ruahan sediaan atau dari wadah yang tersedia pada saat pengerjaan. Untuk
mendapatkan jumlah yang diperlukan, campurkan sejumlah isi wadah hingga mencapai
jumlah sampel yang cukup.

Pemeriksaan Sediaan

PENYARINGAN MEMBRAN
Gunakan alat penyaring yang sesuai dan siapkan, pindahkan sejumlah yang sesuai pada dua
penyaring membran, saring segera. Bilas tiap penyaringan sesuai dengan prosedur. Untuk
menentukan ALT, pindahkan satu penyaring membran ke permukaan Soybean-Casei Digestic
Agar. Untuk menentukan AKK, pindahkan satu penyaring membran yang lain ke permukaan
Sabouraud Dextrose Agar. Inkubasi cawan Soybean-Casein Digest Agar pada suhu 30 - 35
selama 3 - 5 hari dan cawan Sabouraud Dextrose Agar pada suhu 20 - 25 selama 5 - 7 hari.
Hitung jumlah koloni per g atau per ml sediaan. Untuk pengujian sampel transdermal
patches, secara terpisah saring 10% dari volume, gunakan dua penyaring membran steril.
Pindahkan satu membran pada Soybean-Casein Digest Agar untuk ALT dan membran
lainnya pada Sabouraud Dextrose Agar untuk AKK.

METODE ANGKA LEMPENG TOTAL

Metode Tuang
Siapkan sampel menggunakan metode yang sesuai. Siapkan untuk masing-masing media
sekurang-kurangnya dua cawan Petri untuk tiap tingkat pengenceran. Inkubasi cawan
Soybean-Casein Digest Agar pada 30-35 selama 3 - 5 hari dan cawan Sabouraud Dextrose
Agar pada suhu 20 - 25 selama 5-7 hari. Pilih cawan dari satu tingkat pengenceran dengan
jumlah koloni tertinggi yang kurang dari 250 untuk ALT dan 50 koloni untuk AKK. Hitung
jumlah rata-rata koloni dalam media biakan dan jumlah koloni/g atau / ml sediaan.

Metode Sebar
Siapkan sampel dengan metode yang sesuai. Siapkan sekurang-kurangnya dua cawan Petri
untuk tiap media dan tiap tingkat pengenceran. Untuk inkubasi dan penghitungan jumlah
koloni, lakukan seperti tertera pada Metode Tuang.

METODE ANGKA PALING MUNGKIN (APM)

Siapkan dan encerkan sampel. Inkubasi semua tabung selama 3-5 hari pada suhu 30 - 35.
Jika perlu lakukan subkultur, gunakan metode yang sesuai. Catat jumlah tabung yang
menunjukkan mikroba pada tiap tingkat pengenceran. Tentukan APM/g atau per ml sediaan .
Interpretasi Hasil
ALT dianggap sama dengan angka koloni yang ditemukan pada Soybean-Casein Digest Agar;
jika koloni jamur ditemukan pada media ini, dihitung sebagai bagian dari jumlah ALT. Total
jumlah AKK dianggap sama dengan jumlah koloni yang ditemukan pada Sabouraud Dextrose
Agar; jika koloni bakteri ditemukan pada media ini, maka dihitung sebagai bagian dari AKK.
Jika AKK diperkirakan melebihi kriteria penerimaan berdasarkan pertumbuhan bakteri, dapat
digunakan Sabouraud Dextrose Agar yang mengandung antibiotik. Jika penghitungan
dilakukan menggunakan metode APM maka nilai penghitungan yang diperoleh merupakan
angka total mikroba aerobik (ALT). Jika telah ditetapkan kriteria penerimaan untuk mutu
mikrobiologi, maka di-interpretasikan sebagai berikut:
- 101 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 20;
- 102 koloni: maksimal penghitungan yang dapa diterima = 200;
- 103 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 2000; dan seterusnya.

B. PENGUJIANMIKROBA SPESIFIK
PENDAHULUAN
Pada Bab ini akan dijelaskan tentang Uji Batas Mikroba Spesifik yang mungkin terdeteksi
dengan kondisi dan metode yang sesuai. Metode uji dirancang untuk menetapkan suatu
produk memenuhi kriteria mutu secara mikrobiologi. Metode pilihan termasuk metode
otomatik dimungkinkan untuk digunakan setelah dibuktikan kesetaraannya dengan metode
farmakope.

PROSEDUR UMUM
Penyiapan sampel dilakukan seperti pada Uji enumerasi mikroba. Jika produk yang akan
diuji memiliki aktifitas antimikroba, sebaiknya sifat antimikroba dihilangkan atau dinetralkan.
Jika digunakan surfaktan untuk penyiapan sampel, harus dapat dibuktikan sesuai dan tidak
toksik bagi mikroba dan sesuai dengan inaktivator yang digunakan dalam produk yang diuji.

FERTILITAS DAN DAYA HAMBAT MEDIA, KESESUAIAN UJI DAN KONTROL

NEGATIF
Penyiapan Galur Uji
Gunakan suspensi galur uji baku yang stabil. Galur uji dipelihara dengan Teknik Biakan Lot
Benih tidak lebih dari 5 pasase dari master lot benih asli.

MIKROBA AEROB
Biakkan masing-masing galur bakteri di bawah ini, pisahkan masing-masing dalam wadah
berisi media Soybean-Casein Digest Broth atau Soybean-Casein Digest Agar, pada suhu 30 -
35 selama 18 - 24 jam. Biakkan galur uji Candida albicans dalam Sabouraud Dextrose Agar
atau Sabouraud Dextrose Broth, pada suhu 20
- 25 selama 2 - 3 hari.

CLOSTRIDIA
Gunakan Clostridium sporogenes.Biakkan galur uji Clostridia dalam keadaan anaerob pada
Reinforce Medium for Clostridia pada suhu 30 - 35 selama 24 - 48 jam. Sebagai pilihan lain,
siapkan dan encerkan sel vegetatif dalam bentuk suspensi segar. Suspensi spora stabil pada
suhu 2 - 8 selama periode yang tervalidasi.

Kontrol Negatif
Kontrol negatif dilakukan menggunakan pelarut yang sesuai menggantikan sediaan uji. Tidak
boleh terjadi pertumbuhan mikroba. Kontrol negatif juga dilakukan pada saat dilakukan uji
terhadap sediaan. Apabila terjadi kegagalan pada kontrol negatif diperlukan investigasi.

Fertilitas dan Daya hambat Media

Uji setiap bets media siap-pakai, media yang disiapkan dari media kering atau dari komponen
media. Verifikasi sifat seperti tertera pada Tabel 1.

Uji Fertilitas Media Cair

Inokulasikan ke dalam media yang sesuai, mikroba uji dalam jumlah sedikit (tidak > 100
koloni), inkubasi pada suhu tertentu, tidak lebih dari periode terpendek yang tertera pada
prosedur uji. Untuk media cair, pertumbuhan mikroba uji harus terlihat jelas dan harus sama
dengan inokulum yang telah sesuai dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.

Uji Fertilitas Media Padat

Gunakan Metode Sebar dan Inokulasikan masing-masing cawan dengan sejumlah mikroba
uji yang sesuai (tidak > 100 koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu tidak lebih dari periode
terpendek seperti tertera dalam prosedur uji. Pertumbuhan mikroba sama dengan inokulum
yang telah sesuai dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.

Uji Daya Hambat Media Cair atau Padat

Inokulasikan sejumlah mikroba uji paling sedikit 100 koloni pada sejumlah media yang
diinkubasi pada suhu tertentu tidak < periode terpanjang. Tidak boleh ada pertumbuhan
mikroba uji.

Test for Indicative Properties

Gunakan Metode Sebar dan inokulasikan masing-masing cawan dengan mikroba sesuai
(tidak boleh > 100 koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu dalam batas uji. Ciri koloni
mikroba uji harus terlihat jelas dan harus sama dengan inokulum yang sebelumnya.

Kesesuaian Metode Uji

Untuk masing-masing sediaan baru yang diuji lakukan penyiapan sampel. Pada saat inokulasi
suspensi sampel,tambahkan masing-masing galur mikroba uji tidak > 100 koloni dalam
media pertumbuhan yang telah ditentukan. Lakukan uji dengan masa inkubasi terpendek.
Mikroba uji spesifik harus dapat dideteksi dengan reaksi dan sifat-sifat seperti dijelaskan
dalam Pengujian Sediaan. Modifikasi prosedur uji untuk menetralkan aktifitas antimikroba
harus dilakukan. Untuk sediaan yang telah diberi penetral aktivitas antimikroba dengan
mengacu pada prosedur yang sesuai, dan ternyata aktivitas antimikroba tidak dapat
dinetralkan, maka diasumsikan bahwa tidak ada mikroba yang terhambat dalam sediaan.

PENGUJIAN SEDIAAN
Uji Toleransi Empedu Bakteri Gram-negatif Penyiapan sampel dan prainkubasi
Siapkan sampel 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak > 1 g sampel diuji, gunakan
Soybean-Casein Digest Broth sebagai pengencer, campur, dan inkubasi pada suhu 20 - 25
selama waktu yang cukup untuk menumbuhkan bakteri tetapi tidak cukup untuk memicu
multiplikasi mikroba (biasanya 2 jam tapi tidak boleh > 5 jam).

Uji negatif
Gunakan 1 g sediaan, dalam media cair pengkaya Enterobacteriaceae Mossel. Inkubasi pada
suhu 30 - 35 selama 4 - 48 jam. Lakukan subkultur pada cawan Violet Red Bile Glucose
Agar. Inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam. Sampel memenuhi syarat bila tidak
ada pertumbuhan koloni.

Uji Kuantitatif
Seleksi dan subkultur Inokulasi sejumlah suspensi dengan penyiapan sampel langsung ke
dalam media Enterobacteria Enrichment Broth Mossel Encerkan suspensi sampel hingga
mengandung 0,1 g, 0,01 g dan 0,001 g (atau 0,1 ml, 0,01 ml dan 0,001 ml), dan inkubasi pada
suhu 30 - 35 selama 24 - 48 jam. Lakukan subkultur dengan menginokulasi masing-masing
biakan pada cawan media Violet Red Bile Glucose Agar, inkubasi pada suhu 30 - 35 selama
18 - 24 jam. Interpretasi Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan koloni. Catat
hasil positif pada jumlah terkecil sediaan dan hasil negatif pada jumlah terbesar sediaan.
Tentukan APM dari bakteri menggunakan Tabel 2.

Escherichia coli
Penyiapan sampel dan pra inkubasi
Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak kurang dari 1 g
sediaan diuji. Gunakan 10 ml atau sejumlah sesuai sampai 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dalam
media Soybean-Casein Digest Broth, dengan jumlah, campur dan inkubasi pada suhu 30 -
350 selama 18 - 24 jam.

Seleksi dan Subkultur

Kocok wadah, pindahkan 1 ml biakan Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 100 ml
MacConkey Broth, inkubasi pada suhu 42 - 440 selama 24 - 48 jam. Inokulasi biakan
MacConkey Broth pada cawan media Mac Conkey Agar, suhu 30 - 350 selama 18 - 72 jam.

Interpretasi
Pertumbuhan koloni menunjukkan adanya E.Coli yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni yang tumbuh.

Salmonella
Penyiapan sampel dan Pra-inkubasi
Siapkan sediaan uji dan gunakan jumlah yang sesuai, tidak < 10 g atau 10 ml dan inokulasi
ke dalam sejumlah volume Soybean-Casein Digest Broth yang sesuai, campur dan inkubasi
pada suhu 30 - 350 selama 18-24 jam.

Seleksi dan Subkultur

Pindahkan 0,1 ml biakan Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 10 ml media Rappaport
Vasiliadis Salmonella Enrichment Broth, inkubasi pada suhu 30 - 350 selama 18 - 24 jam.
Subkultur pada cawan Xylose Lysine Deoxycholate Agar, inkubasi pada suhu 30 - 350
selama 18 - 48 jam.

Interpretasi
Pertumbuhan koloni berwarna merah, dengan atau tanpa titik hitam di bagian tengah
menunjukkan karakteristik Salmonella yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi. Sediaan
memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh tidak seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji
konfirmasi identifikasi negatif.

Pseudomonas aeruginosa
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi
Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak > 1 g sediaan diuji.
Gunakan 10 ml atau jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dalam media
Soybean-Casein Digest Broth, dengan jumlah yang sesuai, campur dan inkubasi pada suhu
300 - 350 selama 18 - 24 jam. Untuk transdermal patches, gunakan membran penyaring
steril, saring sejumlah volume sampel yang sesuai dengan satu patch dan masukkan
penyaring membran ke dalam 100 ml media Soybean-Casein Digest Broth. Inkubasi pada
suhu 30 - 350 selama 18-24 jam.

Seleksi dan Subkultur

Lakukan subkultur pada cawan media Cetrimide Agar dan inkubasi pada suhu 300 - 350
selama 18 - 72 jam.

Interpretasi
Pertumbuhan koloni menunjukkan adanya P.aeruginosa yang dikonfirmasi dengan uji
identifikasi.Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh tidak seperti diuraikan di atas
atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

Staphylococcus aureus
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi
Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak < 1 g sediaan diuji.
Gunakan 10 ml atau jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dalam media
Soybean-Casein Digest Broth, dengan jumlah yang sesuai, campur dan inkubasi pada suhu
300 - 350 selama 18 - 24 jam. Untuk transdermal patches, gunakan membran penyaring
steril, saring sejumlah volume sampel yang sesuai dengan satu patch dan masukkan
penyaring membran ke dalam 100 ml media Soybean-Casein Digest Broth. Inkubasi pada
suhu 300 - 350 selama 18 - 24 jam.

Seleksi dan Subkultur

Lakukan subkultur pada cawan media Mannitol Salt Agar dan inkubasi pada suhu 300 - 350
selama 18 - 72 jam.

Interpretasi
Pertumbuhan koloni berwarna kuning atau putih dikelilingi zona kuning menunjukkan ada-
Nya S.aureus yang di konfirmasi dengan uji identifikasi. Sediaan memenuhi syarat uji jika
pertumbuhan koloni tidak seperti diuraikan atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

Clostridia
Penyiapan Sampel dan Perlakuan Panas
Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer (dengan total volume minimum
20 ml) tidak < 2 g atau 2 ml sediaan untuk diuji. Pisahkan sampel menjadi dua bagian,
sekurang-kurangnya 10 ml. Panaskan satu bagian pada 800 selama 10 menit, dinginkan
dengan cepat. Satu bagian lainnya tidak dipanaskan.

Seleksi dan Subkultur

Gunakan 10 ml atau jumla yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml kemudian keduanya diinokulasi
ke dalam sejumlah Reinforced Medium for Clostridia yang sesuai. Inkubasi pada kondisi
anaerob pada suhu 300 - 350 selama 48 - 72 jam.

Interpretasi
Pertumbuhan koloni anaerob bentuk batang (dengan atau tanpa endospora) memberikan
reaksi katalase negatif, menunjukkan adanya Clostridia yang dikonfirmasi dengan uji
identifikasi. Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni yang tumbuh atau jika hasil
uji konfirmasi identifikasi negatif.

Candida albicans
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi
Siapkan sediaan yang akan diuji. Gunakan 10 ml atau jumlah yang sesuai tidak < 1 g atau 1
ml, inokulasi ke dalam 100 ml media Sabouraud Dextrose Broth, campur dan inkubasi pada
suhu 300 - 350 selama 3 - 5 hari.

Seleksi dan Subkultur

Lakukan subkultur pada cawan Sabouraud Dextrose Agar, dan inkubasi pada suhu 300 - 350
selama 24 - 48 jam.

Interpretasi
Adanya pertumbuhan koloni berwarna putih menunjukkan adanya C.albicans. yang
dikonfirmasi dengan uji identifikasi. Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada pertumbuhan
koloni seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

UJI EFEKTIFITAS PENGAWET

Pengawet adalah zat antimikroba yang ditambahkan pada sediaan non-steril untuk
melindungi sediaan terhadap pertumbuhan mikroba yang ada atau mikroba yang masuk
secara tidak sengaja selama ataupun sesudah proses produksi. Dalam sediaan steril dosis
ganda, pengawet ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba yang mungkin
masuk pada pengambilan berulang.
Pengujian berikut dimaksudkan untuk menunjukkan efektivitas pengawet.
Penambahan pengawet harus dinyatakan pada etiket. Pengujian dan kriteria untuk efektivitas
berlaku hanya pada produk di dalam wadah asli belum dibuka yang didistribusikan oleh
produsen.

KATEGORI SEDIAAN
Untuk tujuan pengujian, sediaan dibagi menjadi 4 kategori. Kriteria efektifitas antimikroba
untuk sediaan tergantung cara pemberiannya.
MIKROBA UJI
Gunakan biakan mikroba berikut: Candida albicans, Aspergillus niger, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus .Mikroba hidup yang digunakan untuk
pengujian tidak boleh lebih dari lima pasase dari biakan ATCC asli. Untuk tujuan pengujian,
satu pasase didefinisikan sebagai transfer mikroba dari biakan yang ditetapkan, ke media
segar. Semua transfer dihitung. Dalam kondisi mikroba yang dipelihara dengan teknik lot
benih, maka setiap siklus pembekuan, pencairan, dan penumbuhan kembali dalam media
segar, ditetapkan sebagai satu transfer. Teknik lot benih hendaknya digunakan untuk
penyimpanan kultur jangka panjang.Biakan yang diterima dari ATCC harus diresusitasi
sesuai prosedur. Jika ditumbuhkan dalam media cair, sel diendapkan dengan cara sentrifus.
Suspensikan kembali dalam media cair segar (1:20) dan tambahkan dengan volume sama
campuran gliserol 20% (v/v dalam air) steril. Sel yang ditumbuhkan dalam media agar
dipanen dari permukaan media ke dalam media cair gliserol 10%. Bagikan suspensi ini dalam
jumlah kecil ke dalam vial steril. Simpan vial dalam nitrogen cair atau dalam freezer mekanik
pada suhu tidak lebih dari 50. Jika vial lot benih segar diperlukan, vial ini dapat digunakan
untuk menginokulasi serangkaian kultur kerja. Kultur kerja ini kemudian dapat digunakan
secara berkala (setiap hari untuk bakteri dan khamir) untuk memulai kultur inokula.

MEDIA
Seluruh media yang digunakan untuk pengujian harus diuji fertilitas. Gunakan mikroba
seperti tertera pada Mikroba uji.

PERSIAPAN INOKULA
Persiapan sebelum pengujian, inokulasikan masing-masing mikroba spesifik dari stok-biakan
segar pada permukaan media agar yang sesuai. Kondisi biakan untuk inokula dalam media
yang sesuai yaitu Soybean-Casein Digest atau Sabouraud Dextrose Agar. Untuk memanen
biakan bakteri dan C.albicans gunakan salin LP steril, cuci biakan yang tumbuh dipermukaan,
kumpulkan dalam wadah yang sesuai dan tambahkan salin LP steril secukupnya hingga
diperoleh suspensi dengan jumlah mikroba lebih kurang 1 x 108 koloni per ml. Untuk
memanen biakan A.niger gunakan salin LP steril yang mengandung 0,05% polisorbat 80 P
dan tambahkan salin LP steril secukupnya hingga diperoleh suspensi dengan jumlah mikroba
lebih kurang 1 x 108 koloni per ml. Cara lain, mikroba stok-biakan dapat ditumbuhkan dalam
media cair yang sesuai (misalnya Soybean Casein Digest Broth atau Sabouraud Dextrose
Broth) dan sel mikroba dipanen dengan cara sentrifus kemudian dicuci dan disuspensikan
kembali dalam salin LP steril secukupnya hingga diperoleh suspensi dengan jumlah mikroba
lebih kurang 1 x 108 koloni per ml. Tetapkan jumlah koloni per ml dari setiap suspensi,
menggunakan kondisi media dan waktu inkubasi untuk rekoveri untuk memastikan perkiraan
jumlah awal. Nilai perkiraan ini digunakan untuk mengkalibrasi ukuran inokula yang
digunakan dalam pengujian. Suspensi bakteri dan khamir harus digunakan dalam waktu 24
jam dari panen, tetapi untuk kapang dapat disimpan dalam lemari pendingin dalam waktu
sampai 7 hari.

PROSEDUR
Pengujian dapat dilakukan dalam tiap lima wadah asli bila volume sediaan tiap wadahnya
mencukupi dan wadah sediaan dapat ditusuk secara aseptik (dengan jarum dan alat suntik
melalui tutup karet elastomerik), atau dalam lima wadah bakteriologi bertutup steril,
berukuran mencukupi untuk volume sediaan yang dipindahkan. Inokulasi tiap wadah dengan
satu inokula baku yang telah disiapkan dan diaduk. Volume suspensi inokula yang digunakan
antara 0,5% dan 1,0% dari volume sediaan. Kadar mikroba uji yang ditambahkan pada
sediaan (Kategori 1, 2, dan 3) seperti halnya kadar akhir sediaan uji setelah diinokulasi antara
1 x 105 dan 1 x 106 koloni/ml. Untuk sediaan Kategori 4 (antasida) kadar akhir sediaan uji
setelah inokulasi antara 1 x 103 dan 1 x 104 koloni/ml. Kadar awal mikroba viabel dalam
setiap sediaan uji diperkirakan berdasarkan kadar mikroba dalam inokula standar ditetapkan
dengan metode angka lempeng total. Inkubasi wadah yang sudah diinokulasi pada 22,5
2,5. Ambil sampel dari setiap wadah pada interval yang sesuai. Catat setiap perubahan
penampilan yang diamati pada interval tersebut. Tetapkan dengan prosedur angka lempeng
total jumlah koloni yang ada dari setiap sediaan uji untuk interval yang digunakan. Pada uji
angka lempeng total atau pengenceran yang sesuai tambahkan inaktivator (penetral)
antimikroba spesifik. Kondisi ini digunakan untuk validasi sampel berdasarkan kondisi media
dan waktu inkubasi rekoveri mikroba. Dengan menggunakan jumlah koloni/ml terhitung pada
awal pengujian, hitung perubahan dalam nilai log jumlah koloni/ml untuk setiap mikroba
yang digunakan pada setiap interval uji dan nyatakan sebagai log reduksi.

KRITERIA EFEKTIVITAS ANTIMIKROBA

Persyaratan untuk efektivitas antimikroba dipenuhi jika kriteria spesifik dipenuhi: Tidak
terjadi peningkatan > dari log 0,5 unit terhadap nilai log mikroba awal.

UJI KINERJA RESISTENSI INDIKATOR BIOLOGI

PENGHITUNGAN ANGKA SPORA

Untuk indikator biologi dengan pembawa kertas, lepaskan tiga buah indikator biologi
yang relevan dari masing-masing wadahnya. Dispersikan kertas pembawa dengan
memasukkan ke dalam 250 ml blender steril berisi 100 ml Air Murni dingin, campurkan
hingga terbentuk suspensi homogen. Umumnya pencampuran dilakukan selama 15 menit
atau lebih untuk memperoleh perolehan kembali yang optimal. Pindahkan sejumlah 10 ml
alikuot suspensi ke dalam 16 x 125mm tabung bertutup ulir steril. Untuk Indikator Biologi
Sterilisasi Uap Basah dengan Pembawa Kertas, panaskan tabung berisi suspensi dalam
tangas air pada 95 - 100 selama 15 menit (syok panas) dimulai setelah suhu mencapai 95.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Panas Kering dengan Pembawa Kertas dan Indikator
Biologi Sterilisasi Etilen Oksida, dengan Pembawa Kertas, panaskan tabung berisi suspensi
dalam tangas air pada 80 - 85 selama 10 menit dimulai setelah suhu mencapai 80.
Dinginkan secara cepat dalam tangas air-es pada 0 - 4. Pindahkan 1 ml alikuot masing-
masing ke dalam dua tabung yang sesuai, dan lakukan seri pengenceran secukupnya dalam
Air Murni steril, pengenceran dipilih dengan hasil penghitungan 30 - 300 koloni, tetapi tidak
< 6, pada tiap pasangan lempeng dengan perlakuan sebagai berikut ini. Bila indikator biologi
mempunyai kadar spora rendah, mungkin seri pengenceran perlu dimodifikasi dan
menggunakan lempeng lebih banyak untuk tiap pengenceran. Siapkan seri terpisah lempeng
untuk tiap alikuot. Masukkan 1,0 ml suspensi dari tingkat pengenceran yang dipilih ke dalam
masing-masing dua cawan Petri 15 - 100 mm. Dalam waktu 20 menit tambahkan pada tiap
cawan 20 ml media Soybean-Casein Digest Agar cair dan telah didinginkan 45 - 50.
Campur dengan memutar cawan hingga suspensi homogen, dan kemudian dibiarkan
memadat. Inkubasikan lempeng dengan posisi dibalik pada 55 - 60, untuk Indikator Biologi
Sterilisasi Uap Basah dengan Pembawa Kertas. Amati lempeng setelah 24 dan 48 jam, catat
jumlah koloni tiap lempeng; dan gunakan jumlah koloni yang diamati setelah 48 jam untuk
menghitung hasil. Hitung jumlah rata-rata spora tiap indikator dari hasil penghitungan,
menggunakan faktor pengenceran yang sesuai. Pengujian dinyatakan absah bila log jumlah
spora per (kertas) pembawa pada 48 jam sama atau lebih besar dari log jumlah setelah 2 jam
dalam tiap wadah.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah, Pemanasan Kering, dan Gas,
dengan Pembawa Non-Kertas, lepaskan secara aseptik tiga buah pembawa dari masing-
masing kemasan asli atau wadahnya. Masukkan tiap pembawa ke dalam wadah steril yang
sesuai berisi 100 ml Air Murni dingin, dan sonikasi atau kocok dengan pengocok-resiprok
secukupnya. 15 menit atau lebih mungkin diperlukan untuk perolehan kembali yang optimal.
Sebaiknya telah dilakukan studi pendahuluan untuk memastikan bahwa metode perolehan
kembali menghasilkan sedikitnya 50%-300% perolehan kembali angka spora hidup.
Pindahkan sejumlah 10 ml alikuot suspensi ke dalam 16x125 mm tabung bertutup ulir steril.
Panaskan tabung berisi suspensi Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans
pada 80 - 85 selama 10 menit. Panaskan tabung berisi suspensi Geobacillus
stearothermophilus pada 95 - 100 selama 15 menit. Penghitungan waktu dimulai pada saat
tiap rentang suhu pemanasan mencapai yang terendah. Dinginkan segera dalam tangas air es
pada 0 - 4. Pindahkan masing-masing 1 ml alikuot ke dalam dua tabung yang sesuai, dan
lakukan seri pengenceran secukupnya dalam Air Murni steril, pengenceran dipilih dengan
hasil penghitungan 30 300 koloni, tetapi tidak kurang dari 6, pada tiap pasanga lempeng
dengan perlakuan sebagai berikut ini. Bila indikator biologi mempunyai kadar spora rendah,
mungkin seri pengenceran perlu dimodifikasi dan menggunakan lempeng lebih banyak untuk
tiap pengenceran. Siapkan seri terpisah lempeng untuk tiap alikuot. Masukkan 1 ml suspensi
dari tingkat pengenceran yang dipilih ke dalam masing-masing dua cawan Petri 15 - 100 mm.
Dalam waktu 20 menit tambahkan pada tiap cawan 20 ml media Soybean-Casein Digest Agar
cair dan telah didinginkan 45 - 50. Campur dengan memutar cawan hingga suspensi
homogen.

PENETAPAN NILAI-D
Lakukan seluruh pengujian seperti dijelaskan dalam bagian ini di bawah kondisi aseptik,
menggunaka peralatan steril untuk mikroba non-termofilik. Penetapan Nilai-D untuk
G.stearothermophilus dan B.coagulans dapat dilakukan di lingkungan tidak diklasifikasi
tetapi terkendali.

Survival time dan Kill time

Gunakan dua kelompok, masing-masing terdiri dari 10 indikator biologi yang relevan, dalam
wadah asli. Tempatkan spesimen tiap kelompok dalam rak spesimen yang memungkinkan
tiap spesimen terpapar kondisi sterilisasi pada lokasi khusus dalam bejana REIB. Lakukan
pemaparan spesimen untuk survival time yang disyaratkan, masukkan ke dalam bejana,
dan pisahkan wadah yang berisi 10 spesimen. Ulangi prosedur di atas segera, atau panaskan
sebelumnya bila selang waktu yang cukup telah dilampaui, sehingga wadah yang berisi 10
spesimen kedua diperlakukan sama seperti yang pertama kecuali untuk persyaratan kill
time. Survival time dan kill time untuk seluruh monografi indikator biologi dijelaskan
dalam masing-masing monografi.
UJI STERILITAS
Hal ini terutama harus disertai dengan validasi proses sterilisasi atau prosedur proses aseptik.
Pengujian digunakan untuk bahan, sediaan, alat sesuai dengan farmakope yang
dipersyaratkan harus steril. Hasil yang diterima menunjukkan bahwa tidak ada kontaminasi
mikroba ditemukan dalam sampel di bawah kondisi pengujian.