Anda di halaman 1dari 25

Oleh :

A. Yuli Rohma NIM. P1505216006


Halima Hatapayo NIM. P1505216004

PROGRAM PASCASARJANA
FAKULTAS KEDOKTERAN - PROGRAM STUDY BIOMEDIK
KONSENTRASI KIMIA KLINIK
UNIVERSITAS HASANUDDIN
BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA

yang relatif pendek. Pengurutan (sequencing) asam nukleat memungkinkan kita

mengetahui kode genetik dari molekul DNA. Sequencing DNA atau pengurutan DNA

adalah proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA.

Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA, yang merupakan informasi paling

mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk

pembentukan tubuh makhluk hidup. Sequencing DNA dapat dimanfaatkan untuk

menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara

membandingkan sekuensnya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Teknik ini

digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan seperti kedokteran,

bioteknologi, forensik, dan antropologi.

Teknik Sequencing DNA mulai dikembangkan pada tahun 1970an dan telah

menjadi hal rutin dalam penelitian biologi molekular pada dekade berikutnya berkat dua

metode yang dikembangkan secara independen namun hampir bersamaan oleh tim

Walter Gilbert di Amerika Serikat dan tim Frederick Sanger di Inggris sehingga kedua

ilmuwan tersebut mendapatkan Penghargaan Nobel Kimia pada tahun 1980. Selanjutnya,

metode Sanger menjadi lebih umum digunakan dan berhasil diautomatisasi pada

pertengahan 1980an.

Teknologi Sequencing DNA kini terus dikembangkan dengan teknologi-teknologi

Sequencing yang semakin cepat dan semakin sensitif. Teknologi Sequencing DNA

tersebut kini dikelompokkan menjadi generasi pertama, generasi kedua, generasi ketiga,

Sequencung DNA 1
dan generasi keempat, Saat ini teknologi DNA Sequencing sudah memasuki tahap baru

yang mengarah pada large scale atau high-throughput sequencing, jutaan bahkan miliaran

basa nukleotida DNA dapat ditentukan urutannya dalam sekali putaran saja.

1.2 Rumusan masalah

Adapun rumusan masalah pada makalah ini yakni sebagai berikut:

1. Apakah itu Teknik Sequencing?

2. Bagaimana Perkembangan Teknologi Sequencing

1.3 Tujuan

Adapun tujuan dari makalah ini yakni sebagai berikut:

1. Memaparkan teori umum Teknik sequencing (Sejarah, pengertian, prinsip, prosedur)

2. Mengenal Generasi dari teknik sequencing dan perkembangan sequncing tahap terkini.

Sequencung DNA 2
BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Sequencing

Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA

yang relatif pendek, yang memungkinkan untuk dapat mengetahui kode genetic dari

molekul DNA.

2.2 Sejarah Sequencing DNA

Pada mulanya, Sequencing DNA dilakukan dengan mentranskripsikannya ke

dalam bentuk RNA terlebih dahulu karena metode Sequencing RNA telah ditemukan

sebelumnya. Pada tahun 1965, Robert Holley dan timnya dari Cornell University di

New York, Amerika Serikat, mempublikasikan sekuens tRNA alanin dari khamir yang

terdiri atas 77 nukleotida. Sequencing tRNA tersebut membutuhkan waktu 7 tahun dan

hasilnya merupakan sekuens molekul asam nukleat yang pertama kali dipublikasikan.

Sekuens DNA yang pertama kali dipublikasikan adalah DNA sepanjang 12 nukleotida

dari suatu virus, yaitu bakteriofag lambda, pada tahun 1971, yang ditentukan dengan

cara serupa oleh Ray Wu dan Ellen Taylor, keduanya juga dari Cornell University.

Pada tahun 1975, Frederick Sanger dan Alan Coulson dari laboratorium biologi

molekular Medical Research Council Inggris di Cambridge mempublikasikan metode

Sequencing DNA secara langsung yang disebut teknik plusminus. Dengan teknik

tersebut, tim mereka berhasil melakukan Sequencing DNA sebagian besar genom

bakteriofag X174 sepanjang 5.375 nukleotida yang dipublikasikan pada Februari

1977. Pada bulan yang sama, metode Sequencing DNA yang dicetuskan Allan Maxam

dan Walter Gilbert dari Harvard University di Cambridge, Massachusetts, Amerika

Serikat, dipublikasikan.

Sequencung DNA 3
Sejak pertengahan tahun 1980-an, metode Sanger menjadi lebih umum

digunakan. Pada tahun 1986, tim Leroy Hood di California Institute of Technology dan

Applied Biosystems berhasil membuat mesin Sequencing DNA automatis berdasarkan

metode Sanger.

2.3 Prinsip Dasar Sequencing DNA

DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction)

sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGTnya dijadikan

sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan

bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa

pereaksi tertentu, Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:

1. Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua

(sepasang) seperti PCR.

2. ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan

menghilangkan gugus 3OH pada ribose

Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA

salinan dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada

DNA cetakannya. Jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses

polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3-OH yang seharusnya

bereaksi dengan gugus 5-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan posfodiester.

Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmenfragmen DNA

dengan panjang bervariasi. Jika fragmenfragmen tersebut dipisahkan dengan

elektroforesis, maka akan terpisahpisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-

satu basa.

Sequencung DNA 4
2.4 Metode-Metode Sequencing

2.4.1 Metode Maxam-Gilbert

Metode Sequencing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang

dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Chemical

degradation method (Maxam and Gilbert, 1977): urutan molekul DNA untai ganda

ditentukan dengan menggunakan bahan kimia yang memotong molekul DNA pada

posisi nukleotida tertentu. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan

disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan

fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3. Metode Maxam-Gilbert

dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan

melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap.

Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan

piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan

menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya.

Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu.

Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G,

hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi

reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat

macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T,

dan ujung C.

Gambar 1. Contoh PAGE Sequencing dengan metode Maxam-Gilbert

Sequencung DNA 5
Dari hasil PAGE pada Gambar 1 dapat diketahui sekuens fragmen DNA yang

dipelajari atas dasar laju migrasi masing-masing pita. Lajur kedua berisi

fragmen-fragmen yang salah satu ujungnya adalah A atau G. Untuk memastikannya

harus dilihat pita-pita pada lajur pertama. Jika pada lajur kedua terdapat pita-pita

yang posisi migrasinya sama dengan posisi migrasi pada lajur pertama, maka dapat

dipastikan bahwa

pita-pita tersebut merupakan fragmen yang salah satu ujungnya adalah G.

Sisanya adalah pita-pita yang merupakan fragmen dengan basa A pada salah

satu ujungnya. Cara yang sama dapat kita gunakan untuk memastikan pita-pita

pada lajur ketiga, yaitu dengan membandingkannya dengan pita-pita pada lajur

keempat.

Seperti halnya pada elektroforesis gel agarosa, laju migrasi pita

menggambarkan ukuran fragmen. Makin kecil ukuran fragmen, makin cepat

migrasinya. Dengan demikian, ukuran fragmen pada contoh tersebut di atas dapat

diurutkan atas dasar laju/posisi migrasinya. Jadi, kalau diurutkan dari yang terkecil

hingga yang terbesar, hasilnya adalah fragmen-fragmen dengan ujung

TTGCCCCGCGTGGCGCAAAGG. Inilah sekuens fragmen DNA yang dipelajari.

Prinsip Kerja

Molekul DNA dihasilkan setelah diberi perlakuan dengan bahan kimia yang

memotong secara spesifik pada nukleotida tertentu.

Langkah Kerja

1. Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal

2. Pemberian label pada masing-masing ujung DNA untai tunggal.

3. Molekul diberi dimethyl sulfate yang menempelkan grup metil pada cincin purin

dari nukleotida G (terjadi modifikasi nukleotida G).

Sequencung DNA 6
Pemberian dimethyl sulfate hanya dalam jumlah kecil maka proses modifikasi

berlangsung lambat (1 per nukleotida). Pada stadium ini untai DNA masih utuh.

Pemotongan untai DNA akibat pemberian piperidine. Piperidine membuang cincin G

yang dimodifikasi dan memotong molekul DNA pada ikatan fosfodiester tepat pada

bagian atas dari cincin G yang dibuang.

Hasilnya adalah suatu set DNA yang terpotong-potong, ada yang terlabel dan

ada yang tidak. Potongan untai DNA yang dihasilkan tidak sama panjang (hasilnya

equivalent dengan hasil yang didapat dari metoda chain terminal). Potongan-potongan

DNA ini selanjutnya dielektroforesis dalam gel poliakrilamid.

Gambar 2. Hasil Chemical degradation method

Sequencung DNA 7
2.4.2 Metode Sanger

Dewasa ini metode Sequencing Maxam-Gilbert sudah sangat jarang

digunakan karena ada metode lain yang jauh lebih praktis, yaitu metode

dideoksi yang dikembangkan oleh F. Sanger dan kawan-kawan pada tahun 1977

juga. Chain termination method (Sanger et al., 1977): urutan molekul DNA untai

tunggal ditentukan dengan sintesis rantai polinukleotida komplementer secara

enzimatis.

Dewasa ini, hampir semua usaha Sequencing DNA dilakukan dengan

menggunakan metode terminasi rantai yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan

rekan-rekannya. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis

DNA in vitro yang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida

yang telah dimodifikasi.

Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi

rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan

oligonukleotida pendek yang disebut primer yang komplementer terhadap DNA pada

daerah situs tersebut. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase,

enzim yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer dan DNA polimerase,

diikutsertakan pula empat jenis basa deoksinukleotida (satuan pembentuk DNA), juga

nukleotida pemutus atau penghenti rantai (terminator rantai) dalam konsentrasi rendah

(biasanya di-deoksinukleotida). Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut

secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-

fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat

nukleotida tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu

dipisahkan menurut ukurannya dengan elektroforesis gel poliakrilamida, atau sekarang

semakin lazim dengan elektroforesis menggunakan tabung gelas berjari-jari kecil (pipa

kapiler) yang diisi dengan polimer kental.

Sequencung DNA 8
Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit

enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut

adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan

ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul

dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula

pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan

gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan

fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu

molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa

yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang

dibawa oleh molekul ddNTP.

Dengan dasar pemikiran itu Sequencing DNA menggunakan metode

dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi

dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-

masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang

polimerisasi akan terhenti di tempat-tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang

ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA

yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3nya selalu berakhir dengan basa yang

sama. Sebagai contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh

fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai basa

A pada ujung 3nya.

Pada Gambar 3. diberikan sebuah contoh Sequencing sebuah fragmen

DNA. Tabung ddATP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran tiga dan tujuh

basa; tabung ddCTP menghasilkan tiga fragmen dengan ukuran satu, dua, dan

empat basa; tabung ddGTP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran lima dan

sembilan basa; tabung ddTTP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran enam dan

Sequencung DNA 9
delapan basa. Di depan (arah 5) tiap fragmen ini sebenarnya terdapat primer, yang

berfungsi sebagai prekursor reaksi polimerisasi sekaligus untuk kontrol hasil

Sequencing karena urutan basa primer telah diketahui.

Untuk melihat ukuran fragmen-fragmen hasil Sequencing tersebut

dilakukan elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sehingga akan terjadi

perbedaan migrasi sesuai dengan ukurannya masing-masing. Setelah ukurannya

diketahui, dilakukan pengurutan fragmen mulai dari yang paling pendek hingga

yang paling panjang, yaitu fragmen dengan ujung C (satu basa) hingga fragmen

dengan ujung G (sembilan basa). Dengan demikian, hasil Sequencing yang

diperoleh adalah CCACGTATG. Urutan basa DNA yang dicari adalah urutan

yang komplementer dengan hasil Sequencing ini, yaitu GGTGCATAC.

Gambar 3. Skema Sequencing DNA


a) reaksi polimerisasi dan terminasi
b) PAGE untuk melihat ukuran fragmen

Sequencung DNA 10
Keunggulan Chain Terminal Method

Lebih mudah dikerjakan secara otomatis menggunakan mesin Sequencing,

bahan-bahan yang digunakan tidak toksik.

Prinsip Kerja Chain Termination Sequencing

1. berdasarkan perbedaan panjang molekul DNA untai tunggal yang dipisahkan

dengan elektroforesis gel poliakrilamid.

2. Dengan gel ini dapat dipisahkan sekelompok molekul mulai dari 10 1500

nukleotida ke dalam suatu seri pita DNA.

Langkah Kerja

1. Mempersiapkan molekul DNA untai tunggal yang identik sebagai cetakan.

2. Penempelan (annealing) primer pada DNA cetakan.

3. Reaksi perpanjangan rantai dengan bantuan enzim DNA polimerase.

4. Inkorporasi dNTP dan ddNTP pada rantai yang diperpanjang.

5. Elektroforesis pita DNA yang baru disintesis menggunakan gel poliakrilamid.

Setelah elektroforesis urutan DNA dapat dibaca langsung dari posisi pita pada gel .

Pita yang bergerak paling jauh merupakan pita DNA terkecil.

Sequencung DNA 11
Gambar 4. Hasil Elektroforesis Sequencing

2.4.3 Automathic Chain Termination

Prinsip

Menggunakan label radioaktif untuk melacak nukleotida yang diinkorporasikan.


33 35
Radioaktif yang digunakan adalah P atau S karena energi emisinya rendah

sehingga dapat menghasilkan resolusi yang tinggi. Label dikaitkan ke ddNTP dengan

warna yang berbeda untuk setiap nukleotidanya.

Sequencung DNA 12
Keunggulan

Reaksi Sequencing dapat dilakukan dalam 1 tube dan loading ke-4 molekul

nukleotida dilakukan dalam 1 lane gel poliakrilamid karena detektor fluorescent dapat

membedakan antara label-label yang berbeda.

Gambar 5. Hasil Automatic chain termination

Sequencung DNA 13
2.4.4 SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)

Metoda untuk mendeteksi mutasi 1 basa pada suatu untai DNA tunggal dari

suatu gen.

Prinsip Kerja

Terjadinya perubahan konformasi untai DNA tunggal akibat adanya mutasi yang

terdeteksi dari posisi pita DNA dalam gel poliakrilamid.

Langkah Kerja

Aplifikasi gen yang akan diamati dengan PCR. Denaturasi DNA untai ganda

menjadi untai tunggal. Elektroforesis DNA untai tunggal dalam gel poliakrilamide

selama 4 jam. Visualisasi pita-pita DNA dengan pewarnaan perak nitrat.

Gambar 6. Hasil SSCP

2.4.5 Cycle sequencing

Untuk memperoleh hasil reaksi berlabel yang dapat dideteksi dari DNA cetakan,

metode "Sequencing daur" (cycle sequencing) paling lazim dilakukan. Dalam metode

ini dilakukan berturut-turut penempelan primer (primer annealing), ekstensi oleh

polimerase DNA, dan denaturasi (peleburan atau melting) untai-untai DNA cetakan

secara berulang-ulang (2540 putaran). Kelebihan utama Sequencing daur adalah

lebih efisiennya penggunaan pereaksi Sequencing yang mahal (BigDye) dan

Sequencung DNA 14
mampunya mengurutkan templat dengan struktur sekunder tertentu seperti hairpin

loop atau daerah kaya-GC. Setiap tahap pada Sequencing daur ditempuh dengan

mengubah temperatur reaksi menggunakan mesin pendaur panas (thermal cycler)

PCR. Cara tersebut didasarkan pada fakta bahwa dua untai DNA yang komplementer

akan saling menempel (berhibridisasi) pada temperatur rendah dan berpisah

(terdenaturasi) pada temperatur tinggi. Hal penting lain yang memungkinkan cara

tersebut adalah penggunaan enzim DNA polimerase dari organisme termofilik

(organisme yang hidup di lingkungan bertemperatur tinggi), yang tidak mudah terurai

pada temperatur tinggi yang digunakan pada cara tersebut (>95 C).

2.4.6 Pyrosequencing

Pyrosequencing adalah teknik pemetaan DNA yang berdasarkan deteksi

terhadap pirofosfat (PPi) yang dilepaskan selama sintesis DNA. Teknik ini

memanfaatkan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh ATP sulfurilase dan luciferase

untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.

2.4.7 Sequencing DNA Skala Besar

Metode Sequencing DNA yang kini ada hanya dapat merunut sepotong pendek

DNA sekaligus. Contohnya, mesin Sequencing modern yang menggunakan metode

Sanger hanya dapat mencakup paling banyak sekitar 1000 pasang basa setiap

Sequencing. Keterbatasan ini disebabkan oleh probabilitas terminasi rantai yang

menurun secara geometris seiring dengan bertambahnya panjang rantai, selain

keterbatasan fisik ukuran dan resolusi gel.

Sekuens DNA dengan ukuran jauh lebih besar kerap kali dibutuhkan. Sebagai

contoh, genom bakteri sederhana dapat mengandung jutaan pasang basa, sedangkan

genom manusia terdiri atas lebih dari 3 milyar pasang basa. Berbagai strategi telah

dikembangkan untuk Sequencing DNA skala besar, termasuk strategi primer walking

Sequencung DNA 15
dan shotgun sequencing. Kedua strategi tersebut melibatkan pembacaan banyak

bagian DNA dengan metode Sanger dan selanjutnya menyusun hasil pembacaan

tersebut menjadi sekuens yang runut. Masing-masing strategi memiliki kelemahan

sendiri dalam hal kecepatan dan ketepatan; sebagai contoh, metode shotgun

sequencing merupakan metode yang paling praktis untuk Sequencing genom ukuran

besar, namun proses penyusunannya rumit dan rentan kesalahan.

Data sekuens bermutu tinggi lebih mudah didapatkan bila DNA bersangkutan

dimurnikan dari pencemar yang mungkin terdapat pada sampel dan diamplifikasi. Hal

ini dapat dilakukan dengan metode reaksi berantai polimerase bila primer yang

dibutuhkan untuk mencakup seluruh daerah yang diinginkan cukup praktis dibuat.

Cara lainnya adalah dengan kloning DNA sampel menggunakan vektor bakteri, yaitu

memanfaatkan bakteri untuk "menumbuhkan" salinan DNA yang diinginkan sebanyak

beberapa ribu pasang basa sekaligus. Biasanya proyek-proyek Sequencing DNA

skala besar memiliki persediaan pustaka hasil kloning semacam itu.

2.5 Perkembangan Generasi Sequencing DNA

Teknologi sekuensing DNA telah berkembang sedemikian pesat sejak 1977 dan

kini terus dikembangkan teknologi-teknologi sekuensing DNA yang semakin cepat dan

semakin sensitif. Teknologi sekuensing DNA tersebut kini dikelompokkan menjadi

generasi pertama, generasi kedua, generasi ketiga, dan generasi keempat (Madigan,

dkk, 2014).

Sequencung DNA 16
Generasi pertama teknologi sekuensing DNA dimulai dengan metode Sanger

yang menerapkan sekuensing berdasarkan sintesis DNA, yaitu dengan chain

termination method dan pelabelan prekusor. Pada metode ini, digunakan primer dan

DNA polimerase yang mengamplifikasi genom, digunakan ddNTPs

(dideoxynucleotide) yang tidak memiliki gugus hidroksi pada ujung karbon 3nya,

melainkan gugus hidrogen. Gugus ini menghasilkan terminasi dari pemanjangan untai

DNA. Dilakukan 4 reaksi pada 4 tabung yang berbeda. Pada 4 tabung yang berbeda

ditambahkan masing-masing ddNTPs yang berbeda (dANTPs, ddCTPs, ddTTPs,

ddGTPs). Pemanjangan akan dilakukan dan secara acak akan diterminasi bila DNA

polimerase menggunakan ddNTPs sebagai building block. Akan dihasilkan fragmen

DNA dengan panjang yang beragam. Keempat reaksi ini dielektroforesis dan akan

dihasilkan pita-pita yang mewakilkan tiap fragmen yang dihasilkan. Jarak migrasi tiap

pita mewakilkan seberapa panjang untai DNA tersebut (panjang ini dipengaruhi oleh

ddNTPs yang menterminasi proses pemanjangan) sehingga dapat diurutkan basa

nukleotida berdasarkan panjang migrasinya. Tiap ddNTPs juga dapat dilabeli dengan

senyawa fluorescent sehingga reaksi tidak perlu dilakukan pada 4 tabung yang

berbeda melainkan tiap ddNTPs akan memancarkan cahaya pada panjang gelombang

yang berbeda (Sanger dan Coulson, 1975). Dari sinilah dibuat kromatogram yang

Sequencung DNA 17
menunjukan urutan basa nukleotida pada DNA. Ilustrasi dari metode Sanger dapat

dilihat pada gambar dibawah.

Gambar 1. Metode Sanger konvensional (kiri) dan dengan pelabelan ddNTPs dengan
fluorescence (kanan) (Korinfo, 2015).

Dalam mempersiapkan DNA yang ingin disekuensing, terdapat metode Shotgun

dimana DNA yang ingin disekuensing dipotong menjadi fragmen-fragmen yang ingin

diamplifikasi. Fragmen-fragmen tersebut yang akan disekuensing. Keterbatasan dari

metode Sanger adalah keakuratan yang tidak pasti karena ditentukan oleh

kespesifikan primer untuk mengikat DNA, keakuratan hasil ditentukan oleh struktur

sekunder dari DNA, dan metode ini hanya dapat dilakukan untuk menentukan sekuen

Sequencung DNA 18
dengan panjang 700-900 basa karena semakin panjang elongasi DNA, semakin tidak

signifikan beda ukurannya (panjangnya) (Bhattacharya, dkk, 2012).

Generasi kedua ditandai dengan diterapkannya massively parallel method, yaitu

disekuensingnya sejumlah banyak sampel dalam waktu bersamaan. Generasi kedua

dari teknologi sekuensing dapat menghasilkan data 100 kali lebih tepat dari generasi

pertama. Metode yang paling banyak digunakan adalah 454 Life Sciences

Pyrosequncing, Illumina/Solexa sequencing, dan SOLiD/Applied Biosystems Method

(Madigan, dkk, 2014).

Pada 454 Life Sciences Pyrosequencing, DNA dipecah menjadi segmen-

segmen DNA untai tunggal dan masing-masing fragmen dilekatkan ke suatu butiran

kecil. DNA diamplifikasi dengan PCR sehingga masing-masing butiran memiliki

beberapa kopian DNA yang sama. Butiran kemudian diletakan ke pelat fiber-optic

yang mengandung sumur-sumur. Tiap sumur akan menyimpan satu butiran. Pada

metode pyrosequencing, disintesis untai komplemen dari DNA namun prinsipnya,

pada setiap penyambungan dari dNTPs, molekul pyrophosphate akan dilepaskan dan

enzim luciferase yang tersimpan dari tiap sumur akan teremisikan karena energi

pelepasan pyrophosphate. Pengemisian cahaya dari pelat akan menggambarkan

urutan sekuen dari DNA karena masing-masing nukleotida mengemisikan kekuatan

yang berbeda. Pada metode Illumina/Solexa, prinsip yang digunakan adalah

sequencing by synthesis. Deoxyribonucleotides membawa label fluorescent yang

berbeda dan tiap dNTPs memiliki gugus terminasi (Madigan, dkk, 2014). Pada SOLiD,

digunakan 16 8-mer oligonucleotide probes. Probe tersebut terlabel dengan senyawa

fluorescence yang sepsifik untuk tiap nukleotida. Saat polimerase berlangsung,

kemudian probe tersebut berhibridisasi pada DNA dengan bantuan ligase, maka

senyawa fluorosensi akan berpendar dan direkam oleh alat. (Bhattacharya, dkk,

2012).

Sequencung DNA 19
Generasi ketiga dari teknologi sekuensing DNA memiliki ciri khas

mensekuensing single molecule dari DNA. Pendekatannya dapat berdasarkan

mikroskopi atau nanoteknologi. Contoh-contohnya adalah HeliScope Single Molecule

Sequencer dan Pacific Biosciences SMRT. Pada HeliScope Single Molecule

Sequencer, fragmen untai tunggal dari DNA yang berkisar antara 32 basa tertempel

pada suatu larik pada pelat kaca. Saat komplemen dari DNA disintesis, cahaya

fluorescence dari dNTPs yang tersambung dimonitor melalui mikroskop. Komputer

kemudian akan menyusun fragmen-fragmen tersebut menjadi sekuen komplit. Pada

Pacific Biosciences SMRT (single-molecule real-time) diterapkan teknik zero-mode

waveguides. Pada metode ini, DNA polimerase memanjangkan untai DNA dengan

prekusor yang juga membawa label fluorosensinya masing-masing. Tiap nukleotida

yang tersambung pada untai akan mengemisikan cahaya fluorosensenya. Namun

pada metode ini reaksi dilakukan dalam nanocontainer (zero-mode waveguides).

Selain itu, label fluoroscence ini tertempel pada gugus pyrophosphate (Madigan, dkk,

2014).

Generasi keempat adalah generasi yang sedang berkembang dari teknologi

sekuensing DNA, diantaranya adalah ion torrent sequencing method dan nanopore

technology. Prinsip dari generasi keempat adalah post light sequencing dimana

deteksi optikal tidak diperlukan lagi. Pada ion torrent sequencing method diukur ion H+

yang dilepaskan tiap ada dNTPs yang disambungkan ke rantai. Pada nanopore

technology, digunakan nanopore detectors sehingga hanya satu untai DNA yang

mampu melewati pori nanopore. Selama molekul DNA melewati pori, detektor akan

merekam perubahan arus elektrik pada nanopore. Perubahannya akan berbeda tiap

basa yang berbeda (Madigan, dkk, 2014). Perkembangan teknologi sekuensing ini

akan terus berlanjut terutama dalam mencari metode yang praktis, murah, cepat, dan

akurat.

Sequencung DNA 20
BAB III

PENUTUP

Berdasarkan pembahasan di atas maka dapat disimpulkan bahwa:

1. Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang

relatif pendek yang memungkinkan kita mengetahui kode genetic dari molekul DNA..

2. Komponen-komponen yang terlibat dalam proses squencing meliputi:

a. Beberapa copy dari template DNA utas tunggal

b. Primer yang sesuai (sepotong DNA yang dapat berpasangan dengan DNA template

yang bertindak sebagai titik mulai untuk replikasi)

c. DNA polymerase (suatu enzim yang meng-kopi DNA, menambahkan nukleotid baru

pada ujung 3 dari template)

d. Suatu kolam berisi nukleotida normal

e. Sejumlah kecil dideoksinukleotida terlabel (radioaktif atau dengan pewarna

fluoresent

3. metode dasar yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA yaitu Metode

Maxam-Gilbert dan metode Sanger.

4. Hasil dari skuencing adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi, yang

satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen tersebut

kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam nukleat molekul DNA yang

diperiksa.

Sequencung DNA 21
DAFTAR PUSTAKA

1. Sawant SV, Singh PK, Gupta SK, Madnala R and Tuli R. 1999. Conserved nucleotide
sequences in highly expressed genes in plants. Journal of Genetics. Vol. 78 (2). 123-
13.

2. Campbell, Reece dan Mitchel. 2002. Biologi Terjemahan edisi kelima jilid 1. Jakarta.
Erlangga

3. Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta. Erlangga

4. Nejad AM, Narimani Z, Hosseinkhan N. 2013. Next Generation Sequencing and


Sequence Assembly. New York: Springer

5. Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification


of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. J Clin Microbiol 44(8):3008-11.

6. Bhattacharya, T., dkk. 2012. Impact of Genome Sequencing Technologies. Worcester:


WPI. Hal. 17-36.

7. Korinfo. 2015. The Sanger Method [Online]


http://www.mokkka.hu/drupal/en/gallery/8945, diakses tanggal 12 Juni 2017 pukul
17:00

8. Madigan, M.T. dkk. 2014. Brock Biology of Microorganism, 14th Ed. San Fransisco:
Pearson Education Inc. hal. 184-189

9. Sanger, F., dan Coulson, A.R. 1975. A rapid method for determining sequences in
DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol., Vol. 94 (3): 4418

Sequencung DNA 22
DAFTAR ISI

BAB I PENDAHULUAN 1

1.2 Latar Belakang 1

1.3 Rumusan Masalah 2

1.4 Tujuan 2

BAB II PEMBAHASAN 3

2.1 Pengertian Sequencing 3

2.2 Sejarah Sequencing DNA 3

2.3 Prinsip Sequencung DNA 4

2.4 Metode-Metode Sequencing 5

2.4.1 Metode Maxam Gilbert 5

2.4.2 Metode Sanger 8

2.4.3 Automatic Chain termination 12

2.4.4 SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism 14

2.4.5 Cycle sequencing 14

2.4.6 Pyrosequencing 15

2.4.7 Sequencing DNA Skala besar 15

2.5 Perkembangan generasi Sequencing DNA 16

BAB III PENUTUP DAN KESIMPULAN 21

DAFTAR PUSTAKA 22

Sequencung DNA 23
Sequencung DNA 24