Tujuan Untuk Masa Depan

Kemajuan pengambangan di bidang teknologi berbasis Cas9 selama delapan belas bulan terakhir
begitu menarik untuk diamati namun masih banyak pertanyaan yang harus dipecahkan dan
aplikasi menarik yang masih harus terus dieksplorasi.

Pertama metode untuk memperluas jangkauan penargetan Cas9 berdasarkan RNA akan menjadi
sangat penting untuk mendorong terjadinya HDR atau NHEJ yang tepat serta untuk menerapkan
strategi pasangaan ganda lainnya. Seperti yang disebutkan diatas, sumber utama rentang
pembatasan untuk Cas9, pasangan potongan cas9, dan penggabungan dCas9 merupakan
kebutuhan mengenai kesesuaian urutan PAM denagan bentuk NGG. Kemampuan untuk
mengeksploitasi urutan PAM alternatif dari bentuk NAG atau NNGG telah dicatat,tetapi
penelitian yang lebih lanjut diperlukan untuk memastukan seberapa kuat urutan sekuens ini benar
berat utut atau teratur. Platform gRNA-Cas9 lainnya dengan urutan PAM yang berbeda yang
diisolasi dari Streptococcus thermophilus, Neisseria meningitidis, dan Treponema denticola juga
telah dikarakterisasi dan identifikasi lebih lanjut mengenai sistem ini dari spesies lain selanjutnya
dapat diajadikan untuk memperluas platform penargetan

Yang kedua, pada kenyataannnya penting untuk menegmbangkan strtegi yang tidak bias untuk
menilai efek off-target dari nuklease Cas 9 atau potongan pasangan pada genom manapun yang
menarik. Metode tersebut akan sangat penting untuk mengevaluasi seberapa efektif perbaikan
dapat meningkatkan kekhususan platform. Tambahan lagi, meskipun tru-gRNA dan pasangan
potongan dapat menurunkan efek dari target., hal tersebut mungkin diperlukan untuk perbaikan
lebih lanjut terutama untuk penerapan terpeutik. Idealnya, strategi baru ini bisa dikombinasikan
dengan pendekatan yang ada, seperti potongan pasangan dan tru-gRNA. Contoh perbaikan
seperti ini mungkin memerlukan penggunaan protein untuk memodifikasi Cas9 dan atau
memodifikasi nukleotida yang digunakan oleh gRNA untuk memerantarai penegenalan pada sisi
DNA target. Sebagai alternatif, konstruksi bentuk dari Cas9 dan atau gRNA\ yang diinduksikan
munrgkin menyediakan sarana untuk mengatur konsentrasi aktif dari reagen dalam sel sehingga
dapat meningkatkan rasio efek on and off dari target.

Yeng ketiga, metode untuk mengekspresikan komponen CRISPR-Cas yang efisien pada sel
tertentu atau organisme tertentu perlu dioptimalkan. Beberapa tipe sel mungkin tahan terhadap
transfeksi atau infeksi oleh virus standar. Tantangan yang hadir adalah bagaimana
mengembangakan metode yang memungkinkan untuk jaringan tertentu,tipe sel tertentu atau
pengembangan ekspresi spesifik dari gRNA dan atau nuklease Cas9. Strategi yang
memungkinkan untuk ekspresi sejumlah besar gRNA yang efisien secara bersamaan dari satu
vektor, akan menjadi sebuah keuntungan ketika teknologi ini dimanfaatkan. Secara kolektif,
kemajuan ini akan penting dalam penggunaannya dalam bidang penelitian dan aplikasi
terapeutik.
Terakhir, strategi untuk mengalihkan keseimbangan dari mutasi indel yang dimediasi NHEJ
untuk menuju perubahan HDR tetap menjadi prioritas dalam pengembangan. Meskipun tingkat
HDR yang tinggi dapat dicapai dengan CRISPR RGNs dan single strand oligonukleotida DNA,
kompetisi mutagenik NHEJ juga terjadi secara bersamaan. Keterbatasan ini menjadi masalah
yang umum saat menggunakan HDR untuk menginduksi perubahan titik mutasi (berlawanan
dengan sisipan) pada bagian protospacer dari situs target; Alel alel ini berhasil dipilah ulang
secara efisien dan kemudian dirusak oleh NHEJ, sehingga mengurangi hasil urutan yang telah
disusun secara benar. Salah satu tantangan dalam mengembangkan rasio HDR:NHEJ adalah
penghambatan NHEJ cenderung tidak dapat ditolerir dengan baik oleh sebagian besar sel,
mengingat peran utamanya dalam memperbaiki DNA normal. Dalam pemanfaatan HDR secara
khusus untuk aplikasinya secara terapeutik, pengurangan atau eliminasi kompetisi NHEJ akan
menjadi persyaratan yanga sangan penting.

Sederhananya, efisiensi yang tinggi dan kemampuan penerapan yang luas dari sistem Cas9
berbasis RNA telah menempatkan teknologi ini dalam bidang biologi dan penelitian biomedik.
Kemudahan peneliti untuk membuat perubahan pada urutab atau ekspresi gen akan
memungkinkan pembalikan genetik dapat dilakukan pada hampir semua organisme atau
sel.kemampuan untuk membentuk perpustakan gRNA yang besar memeungkinkan pengeturan
genetika secara lebih maju. Semua sistem ini dapat mengekspresikan multiple gRNA pada single
sel, sehingga selanjutnya memperluas kompleksitas eksperimen genetika dimana hal tersebut
dapat dilakukan maju dan mundur. Meskipun efek off-target Cas9 tetap didefinisikan pada skala
genom, banyak kemajuan telah tercapai untuk memperbaiki spesifisitas dan kemajuan lebih
lanjut krmungkinan dapat segera terjadi mengingat intensnya upaya penelitian di bidang
ini.pengembangan dan pengoptimalan sistem bebasis Cas9 ini pada pengaturan genom dan
epigenom seyogyanya dapat diterapkan penggunaannya dalam bidang terapeutik terutama untuk
mengobati penyakit pada manusia.