Anda di halaman 1dari 33

PETUNJUK PRAKTIKUM

BIOKIMIA II

Oleh :
Tim Biokimia

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG
2017
2
KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT. yang telah melimpahkan rahmat,
taufiq dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan Diktat
petunjuk Praktikum Biokimia. Diktat ini disusun untuk mempermudah proses
penyelenggaraan kegiatan Praktikum Biokimia II. Tujuan umum dari praktikum ini adalah
untuk memberikan bekal kemampuan bagi mahasiswa dalam rangka persiapan
pelaksanaan penelitian tugas akhir. Sedangkan tujuan khusus adalah pengaplikasian
teori biokimia yang sudah diperoleh mahasiswa di bangku kuliah.
Laboratorium Biokimia berusaha untuk mengatasi segala kesulitan yang
dihadapi pada saat persiapan dan pelaksanaan Praktikum biokimia. Persiapan ini
meliputi pembekalan atau breafing asisten dan praktikan. Diktat petunjuk praktikum ini
masih terdapat kekurangan di sana sini, untuk itu kritik dan saran yang bersifat
konstruktif selalu kami harapkan demi lebih sempurnanya diktat petunjuk praktikum
selanjutnya. Akhir kata, kami mengucapkan selamat bekerja dan mencoba. Semoga
diktat ini dapat memberikan manfaat bagi kita semua, Amin.

Malang, Februari 2017

Penulis

3
DAFTAR ISI

Kata Pengantar..................................................................................................3
Daftar Isi.............................................................................................................4

Percobaan 1 Uji Aktivitas Enzim Amilase........................................................5


Percobaan 2 Uji Aktivitas Enzim Proteolitik.....................................................9
Percobaan 3 Uji Aktivitas Enzim Lipase........................................................10
Percobaan 4 Uji Aktivitas Enzim Katalase.....................................................16
Percobaan 5 Elektroforesis SDS PAGE........................................................20
Percobaan 6 Uji Amilase dalam air Liur...................................................... 25
Percobaan 7 Pemeriksaan Glukosa dan Protein pada Urine .. .28

Lampiran..........................................................................................................32

4
PERCOBAAN I
UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE

A. Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk melakukan deteksi bakteri penghasil amilase secara
kualitatif dan menguji aktivitas enzimnya.

B. Dasar Teori
Amilase merupakan enzim pendegradasi pati. Enzim ini mendegradasi dengan
cara memutuskan ikatan glikosidik pada pati. Produk yang dihasilkan dapat berupa
oligosakarida rantai pendek, glukosa, maltose dan maltriosa. Amilase banyak terdapat
pada mikroorganisme, tanaman dan hewan. Enzim ini dapat dengan mudah diisolasi dari
bakteri seperti Bacillus subtilis dan jamur seperti Aspergillus oryzae. Amilase adalah
kompleks enzim yang terdiri dari tiga jenis enzim yaitu -amilase, -amilase, dan
glukoamilase.
Aktivitas amilase dapat ditentukan baik secara kualitatif dan kuantitatif. Analisis
amilase secara kualitatif dapat dilakukan dengan penambahan larutan iodin. Sedangkan
analisis secara kuantitatif dilakukan dengan metode dinitrosalisilat (DNS). Metode ini
didasarkan pada kemampuan enzim menghidrolisis substrat (polisakarida) menjadi
monosakarida dalam bentuk gula reduksi. Adanya aktivitas amilase ditunjukkan dengan
interaksi produk (gula reduksi) dan DNS untuk menghasilkan warna oranye hingga merah
kecoklatan. Satu unit enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan 1 moL
produk (gula reduksi) per menit. Sebagaimana sifat enzim pada umumnya, akivitas enzim
amilase dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain konsentrasi substrat, pH, suhu, dan
kofaktor.

5
C. Alat dan Bahan
Alat
Gelas beker Erlenmeyer
Tabung reaksi Pipet tetes
Cawan petri Shaker incubator
Pipet ukur Spektrofotometer
Bola hisap Neraca analitik

Bahan
Larutan iodin Larutan bufer pH 4, 5 dan 6
Kapas Reagen DNS (asam 3,5-dinitrosalisilat)
Media starch agar KNa-Tatrat 40%
Pati terlarut 1% Akuades
Media cair

D. Cara Kerja
1. Deteksi produksi amilase secara kualitatif
Isolat bakteri digoreskan pada media starch agar yang telah ditentukan dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Larutan iodin ditambahkan pada koloni
bakteri. Koloni yang mampu menghasilkan amilase akan membentuk zona bening di
sekitar biakan. Amati perubahan warna yang terjadi.

2. Ekstraksi enzim amilase


Bakteri diambil sebanyak 1 ose dan masukkan ke dalam 25 mL media cair. Kultur
bakteri diinkubasi pada shaker incubator selama 18 jam pada suhu 37 C. Kultur
disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Filtrat yang diperoleh
merupakan ekstrak kasar amilase.

6
3. Uji aktivitas amilase
Penentuan aktivitas amilase dilakukan secara kuantitatif dengan metode DNS.
Filtrat sebanyak 1 mL dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian, ditambahkan 1 mL
pati terlarut (telah dilarutkan dalam pH 4, 5, 6). Mulut tabung ditutup dengan aluminium
foil. Tabung reaksi diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Setelah itu, tambahkan
1 mL DNS dan kocok menggunakan vortex. Tabung reaksi dipanaskan dalam air
mendidih selama 15 menit hingga larutan berwarna merah kecoklatan. Selanjutnya,
ditambahkan 1 mL larutan KNa-Tatrat 40%. Tabung reaksi didinginkan, ditambahkan
aquades hingga volumenya menjadi 10 mL dan dihomogenkan. Larutan sampel diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.
Aktivitas enzim amilse dapat dihitung menggunakan rumus berikut.

Dimana, AE adalah aktivitas enzim (U/mL), C adalah konsentrasi glukosa, BM adalah


berat molekul glukosa, 180 gr/mol, t adalah waktu inkubasi (menit), H adalah volume total
enzim substrat (mL), dan E adalah volume enzim (mL).

4. Pembuatan Kurva Standar Glukosa


Larutan glukosa dibuat dengan berbagai konsentrasi yaitu 0, 200, 400, 600, 800
dan 1000 ppm. Diambil 1 mL larutan glukosa dengan berbagai konsentrasi dan
masukkan dalam tabung reaksi. Kemudian, ditambahkan 1 mL DNS dan dihomogenkan.
Mulut tabung reaksi ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan dalam dari mendidih
selam 15 menit hingga larutan berwarna merah kecoklatan. Setelah itu, tambahkan 1 mL
KNa-Tatrat 40%. Tabung reaksi didinginkan, ditambah akuades hingga volumenya
menjadi 10 mL dan dihomogenkan. Larutan sampel diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 540 nm menggunakan spektofotometer.
7
Daftar Pustaka
Aiyer, P.V. (2005): Amylases and Their Applications, Afr. J. Biotechnol., 4, 1525-1529.

Miller, G. L. (1959): Use of Dinitrosalicyclic Acid Reagent for Determination of Reducing


Sugar, Anal. Chem., 31, 426-428.

Sauza, P.M., dan Magalhaes, P.O. (2010): Application of Microbal -Amylase in Industry
A Review, Brazilian J. Microbiol., 41, 850-861.

8
PERCOBAAN II
UJI AKTIVITAS ENZIM PROTEOLITIK

A. Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas enzim proteolitik (papain).

B. Dasar teori
Enzim proteolitik merupakan kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk
menghidrolisis ikatan peptida. Enzim ini juga disebut sebagai peptidase, protease atau
proteinase. Protease terdapat pada semua makhluk hidup seperti manusia, hewan,
tanaman, dan mikroba (bakteri, jamur dan virus). Berdasarkan mekanisme kerjanya,
protease dapat dibagi menjadi exopeptidase dan endopeptidase. Exopeptidase
mengkatalisis proses hidrolisis ikatan peptide pada ujung rantai, sedangkan
endopeptidase menghidrolisis ikatan peptide pada tengah rantai.

Gambar 1 Hidrolisis enzim endopeptidase

Papain adalah salah satu enzim protease yang berperan aktif dalam proses hidrolisis
ikatan peptida. Enzim ini banyak ditemukan pada seluruh bagian pohon pepaya yang
meliputi daun, buah, getah dan akarnya. Papain merupakan enzim sederhana yang
terdiri dari 212 asam amino dengan 4 ikatan disulfide. Papain banyak digunakan
diberbagai bidang industri terutama industri farmasi.

C. Alat dan Bahan


9
Alat
Waterbath Gelas beker 250 mL
Buret Pipet volume 10 mL
Neraca analitik Pengaduk
Erlenmeyer Pipet tetes
Gelas ukur 50 ml Blender
Corong Penyangga + statif
Bola hisap Neraca analitik

Bahan
Buah pepaya muda Akuades
Susu skim 5% Indikator pp
Formaldehida NaOH 0,1 N
Kertas saring

D. Cara Kerja
1. Ekstraksi enzim papain
Lima puluh gram buah pepaya dipotong kecil-kecil ditambahkan 100 mL akuades.
Setelah itu, dihaluskan menggunakan blender dan diambil filtratnya. Filtrat yang diperoleh
merupakan ekstrak kasar enzim papain. Filtrat dibuat tiga konsentrasi yang berbeda yaitu
20%. 30% dan 40%.

2. Uji Aktivias Enzim Papain


Susu skim 5% dimasukkan ke dalam empat erlenmeyer (E1, E2, E3 dan E4) yang
masing-masing berisi 40 mL larutan. Kemudian, tiga buah erlenmeyer (E1, E2, E3)
dimasukkan dalam waterbath pada suhu 37 C selama 10 menit, sedangkan erlenmeyer
sisa (E4) dibiarkan pada suhu ruang. Ketiga erlenmeyer (E1, E2 dan E3) masing-masing
ditambahkan 10 mL ekstrak kasar enzim papain, sedangkan erlenmeyer sisa (E4)
ditambahkan 10 mL akuades. Semua erlenmeyer diinkubasi pada suhu 37 C selama 1

10
jam dan ditambah 2 mL formaldehida. Kemudian, ditambahkan 3 tetes indikator pp dan
dititrasi menggunakan NaOH 0,1 N.
Aktivitas enzim dapat ditentukan menggunakan persamaan berikut.

Dimana, ts adalah titrasi sampel, tb = titrasi blanko (E4), berat sampel adalah berat susu
skim dalam gram, Fp adalah faktor pengenceran.

Daftar Pustaka
Amri, E., dan Mamboya, F. (2012): Papain, a Plant Enzyme of Biological Importance: A
Review, American Journal of Biochemistry and Biotechnology , 8(2), 99-104.

Hitesh, P., Manjobhai, B., Mayuri, B., Ashvinkumar, D., dan kiraben, D. (2012): Extraction
and Application of Papain Enzyme on Degradation of Drug, Research Article
Pharmaceutical Sciences, 2(3), 113-115.

Jisha, N.V., Smitha, R.B., Pradep, S., Sreedevi, S., Unni, K.N., Sajith, S., Priji, P., Josh,
M.S., dan Benjamin, S. (2013): Versatility of Microbial Proteases, Advances in Enzyme
Research, 1 (3), 39-51.

Macalood, J.S., Vicente, H.J., Boniao, R.D., Gorospe, J.G., dan Roa, E.C. (2013):
Chemical Analysis of Carica papaya L. Crude Latex. American Journal of Plant Science ,
4, 1941-1948.

Motyan, J.A., Toth, F., dan Tozser, J. (2013) Research Applications of Proteolytic
Enzymes in Molecular Biology, Biomolecules, 3, 923-942.

11
PERCOBAAN III
UJI AKTIVITAS ENZIM LIPASE

A. Tujuan percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas lipase dari dedak padi dan kacang
tanah.

B. Dasar teori
Lipase (triacylglycerol acylhydrolase) termasuk dalam keluarga hydrolase. Lipase
mengkatalisis hidrolisis trigliserida menjadi gliserol dan asam lemak bebas. Produk hasil
hidrolisis yang lain adalah monogliserida dan digliserida. Enzim ini larut dalam air dan
menghidrolisis substrat yang tidak larut menjadi produk yang lebih polar. Enzim lipase
diproduksi oleh tanaman, hewan dan mikroorganisme. Lipase banyak diaplikasikan di
berbagai bidang industri, seperti industri makanan, deterjen, kertas, dan kosmetik. Reaksi
hidrolisis trigliserida oleh lipase adalah sebagai berikut.

Penelitian lipases telah banyak dilakukan dari berbagai sumber. Beberapa sumber
lipase diantaranya dedak padi dan kacang tanah. Lipase dari kacang tanah banyak
tersimpan dalam biji selama masa perkecambahan, sedangkan lipase pada padi banyak
terdistribusi pada kulit padi (dedak).

12
C. Alat dan Bahan
Alat
Corong Pipet volume 10 mL
Magnetik stirer Bola hisap
Sentrifugasi Gelas ukur 50 ml
Mortar Gelas beker 250 ml
Waterbath Buret
Erlenmeyer 100 mL Pengaduk
Neraca analitik Pipet tetes
Inkubator Shaker incubator

Bahan
Dedak padi Akuades
Kacang tanah Etano
Susu sapi segar Indikator pp
Petroleum eter NaOH 0,1 N
Bufer fosfat 50 mM pH 7 Kertas saring
Bufer fosfat 50 mM pH 6,5

D. Cara Kerja
1. Ekstraksi enzim lipase dari dedak padi
Sebanyak 5 gr dedak padi ditambah 25 mL petroleum eter dan diaduk-aduk untuk
melarutkan lemak. Saring campuran tersebut dan ambil bagian ampasnya. Ampas yang
diperoleh ditambah dengan 20 mL bufer fosfat 50 mM pH 7. Campuran tersebut dishaker
selama 30 menit. Selanjutnya, disaring campuran tersebut dan disentrifugasi pada
kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak
kasar enzim lipase.

2. Ekstraksi enzim lipase dari kacang tanah


Kacang tanah sebanyak 2,5 gram dihaluskan menggunakan mortar. Kemudian,
ditambahkan dengan 25 mL petroleum eter sambil diaduk-aduk. Campuran tersebut
disaring dan diambil bagian residu (ampas). Residu ditambahkan 25 mL bufer fosfat 0,1
13
M pH 6,5. Campuran tersebut diaduk menggunakan shaker selama 10 menit, disaring
dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Filtrat yang diperoleh
merupakan ekstrak kasar enzim lipase.

3. Uji aktivitas enzim lipase


Susu sapi segar dipanaskan suhu 100 oC selama 10 menit. Susu hasil pemanasan
diambil sebanyak 4 mL dan dimasukkan dalam erlenmeyer dan diseimbangkan suhu air
dalam waterbath 37 oC. Sampel ditambahkan 1 mL ekstrak kasar enzim dan diinkubasi
pada suhu 37 oC selama 30 menit. Setelah itu, ditambahkan 20 mL etanol.
Blanko dibuat dengan mengambil 4 mL susu hasil pemanasan ditambah 2 mL
bufer fosfat (pH disesuaikan dengan sampel). Setelah itu, ditambah 20 mL etanol tanpa
dilakukan proses inkubasi. Masing-masing sampel dan blanko ditambah 2 tetes indikator
pp dan dititrasi menggunakan NaOH 0,1 N hingga berubah warna menjadi merah muda.
Aktivitas enzim dinyatakan dalam moL/menit mL enzim atau Unit/mL. Adapun
penentuan aktivitas enzim dilakukan menggunakan persamaan berikut.

Dimana, ts adalah volume titrasi sample, tb adalah volume titrasi blanko, t adalah waktu
inkubasi (menit). Angka 1000 merupakan hasil dari konversi 1 mmol menjadi 1000 mol.

Daftar Pustaka
14
Bhardwaj, K., Raju, A., dasn Rajaseharan, R. (2001): Identifikasi, purification, and
characterization of a thermally stable lipase from Rice bran. A New member of the
(Phospho) Lipase Family, Plant Physiology, 127, 1728-1738.

Huang, A.H., dan Moreau, R.A. (1978): Lipases in the storage tissues of peanut and other
oil seeds during germination, Planta, 141(1), 111-116.

Lason, E., dan Ogonowski, J. (2010): Lipase - Characterization, applications and


methods of immobilization, CHEMIK 2010, 64(2), 97-102.

Sharma, M.K. (2011): Aqueous Two phase extraction - of Lipase from Rice Bran,
Advance in Applied Science Research, 2(2), 265-271.

Sharma, R., Chisti, Y., dan Banerjee, U.C. (2001): Production, purification,
characterization and applications of lipases, Biotechnology Advances, 19, 627-662.

Thakur, S. (2012): Lipase, Its Sources, Properties and Applications: A Review,


International Journal of Scientific & Engineering Research , 3(7), 1-29.

Tseng, C.G. (2005): Characterization of Rice Bran Lipase and Its Application, Journal of
Engineering Technology and Education, 2(4), 413-426.

15
PERCOBAAN IV
UJI AKTIVITAS ENZIM KATALASE

A. Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas enzim katalase secara kualitatif.

B. Dasar Teori
Katalase adalah enzim yang memiliki kemampuan sebagai antioksidan karena
enzim ini dapat mendegradasi hidrogen peroksida (H 2O2). Enzim ini terdapat pada
peroksisom sel mamalia, seperti manusia dan hewan. Selain itu, enzim katalase dapat
diisolasi dari tanman dan mikroorganisme seperti bakteiri dan jamur. Di dalam makhluk
hidup, katalase dapat menguraikan zat-zat oksidatif yang berbahaya seperti fenol, asam
format, alkohol dan H2O2. Hidrogen peroksida merupakan produk yang biasa dihasilkan
dari metobelisme sel. Enzim katalase bertanggung jawab untuk mempercepat
pemecahan hidrogen peroksida menjadi air (H 2O) dan oksigen (O2). Reaksi kimia yang
ditunjukkan dalam persamaan berikut.

2 H2O2 2 H2O + O2
katalase

Saat ini beberapa metode penentuan aktivitas katalase baik kualitatif maupun
kuantitatif sudah banyak dilakukan. Salah satu metode kualitatif yang paling sederhana
dalam menentukan keberadaan katalase pada kultur bakteri adalah dengan
menggunakan H2O2. Senyawa ini akan dipecah menjadi gelembung O 2 oleh katalase.
Identifikasi adanya enzim katalase didasarkan pada terbentuknya gelembung oksigen
pada waktu reaksi terjadi.

16
C. Alat dan bahan
Alat
Tabung reaksi Kaki tiga + kasa
Rak tabung reaksi Pembakar spiritus
Gelas ukur 10 mL Pipet Tetes
Gelas beker 50 mL Pipet volume 1 mL
Gelas beker 250 mL Hole punch
Bola hisap Stopwatch
Kaca lengkung Pipa karet

Bahan
Ekstrak hati Ekstrak kunyit
Ekstrak jantung Ekstrak daun pepaya
Kultur bakteri/jamur Kertas saring
H2O2 3% Es batu
Akuades NaOH 1 M
HCl 1 M

D. Cara Kerja
1. Uji aktivitas katalase dengan kertas saring
Kertas saring direndam dalam kultur bakteri selama 2 menit. Kemudian, kertas
saring diambil dan ditempatkan pada bagian dasar gelas beker yang berisi 25 mL larutan
H2O2 3%. Amati dan hitung waktu ketika kertas saring mulai naik ke permukaan larutan.
Ulangi perlakuan diatas sebanyak 3 kali. Ulangi langkah diatas pada sampel A, B , dan C.
Keterangan: Larutan A (1:4) = campuran 5 mL larutan H2O2 3% dan 20 mL air
Larutan B (1:9) = campuran 2,5 mL larutan H2O2 3% dan 22.5 mL air
Larutan C (1:49) = campuran 0,5 mL larutan H2O2 3% dan 24.5 mL air

Tabel 1. Aktivitas katalase dengan kertas saring


Sampel Waktu yang diperlukan kertas saring naik ke permukaan gelas (s)

17
1 2 3 Rata-rata
H2O2 3% (kontrol)
A (1:4)
B (1:9)
C (1:49)
Buat grafik antara konsentrasi pada sumbu x dan waktu pada sumbu y.

2. Uji aktivitas katalase terhadap berbagai kondisi


Siapkan dua buah tabung reaksi dan dimasukkan masing-masing 10 mL akuades.
Pada tabung 1 ditambahkan 1 mL akuades. Tabung ini akan digunakan sebagai kontrol.
Pada tabung 2 ditambahkan 1 mL ekstrak hati. Setelah itu, rangkai alat seperti pada
gambar berikut.

Larutan H2O2 3% sebanyak 2 mL ditambahkan ke dalam kedua tabung reaksi dan


sesegera mungkin ditutup. Biarkan selama 3 menit sambil dihitung jumlah gelembung
yang terbentuk. Ulangi perlakuan diatas sebanyak 2 kali.

Ulangi langkah diatas pada sampel lain dengan berbagai kondisi berbeda.
Pada kondisi asam : sampel + 3 tetes HCl 1 M
Pada kondisi basa: sampel + 3 tetes NaOH 1 M
18
Pada kondisi suhu rendah: sampel direndam dalam air es
Pada kondisi suhu tinggi: sampel direndam dalam air mendidih

Jumlah gelembung
No. Jenis Ekstrak + H2O2 Kondisi Kondisi Kondisi suhu Kondisi
pH netral
asam basa rendah suhu tinggi
1. Ekstrak Hati
2. Ekstrak Jantung
3. Ekstrak Daun Pepaya
4. Ekstrak Kunyit
Tabel 2. Uji aktivitas katalase terhadap berbagai kondisi

Daftar Pustaka
Alfonso-Prieto, M., Biarnes, X., Vidossich, P., dan Rovira, C. (2009): The Molecular
Mechanism of the Catalase Reaction, J. Am. Chem. Soc., 131(33), 11751-11761.

Anonim (2016): Investigating the effects of temperature on enzyme activity,


http://www.mayfieldschools.org. Diakses tanggal 16 Februari 2016.

Iwase, T., Tajima, A., Sugimoto, S., Okuda, K., Hironaka, I., Kamata, Y., Takada, K dan
Mizunoe, Y. (2013): A Simple Assay for Measuring Catalase Activity: A Visual Approach,
Scientific Reports, 3, 3081-3084.

Scibior, D., dan Czeczot, H. (2006): Catalase: Structure, Properties, Functions, Postepy
Hig Med Dosw, 60, 170-180.

St. Rosemary Educational Institution. "Factors Affecting the Activity of Catalase and
Amylase Lab Answers." http://schoolworkhelper.net/. St. Rosemary Educational
Institution, Last Update: 2016. Web. Diakses pada: Rabu 16 Februari 2016.
http://schoolworkhelper.net/factors-affecting-the-activity-of-catalase-and-amylase-lab-
answers/.

19
PERCOBAAN V
ELEKTROFORESIS SDS PAGE
A. Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui karakterisasi protein dari kecambah
menggunakan SDS PAGE (Sodium Dedocyl Sulphate Polyacrilamide Gel
Electrophoresis)

B. Dasar Teori
Elektroforesis adalah teknik untuk memisahkan molekul yang memiliki muatan
listrik pada sebuah matriks (misalnya gel) menggunakan medan listrik
sebagai tenaga penggerak molekulnya. Untuk elektroforesis protein, ada beberapa teknik
yang digunakan, yaitu proteinnya yang dibuat terdenaturasi (SDS PAGE) atau tidak
(NATIVE PAGE).
Pada teknik SDS-PAGE, proteinnya dibuat terdenaturasi (dengan menambahkan
larutan SDS) sehingga bermuatan negatif, protein tersebut bergerak dari negatif ke positif
dan kecepatan pergerakannya hanya dipengaruhi oleh ukuran molekul. Protein yang
terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan
berat molekul protein tersebut (Dunn,1989). Denaturasi protein dilakukan dengan
merebus sampel dalam buffer yang mengandung -merkaptoetanol (berfungsi untuk
mereduksi ikatan disulfide), gliserol dan SDS (Wilson dan Walker,2000). Muatan
asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion yang teikat sehingga
kompleks protein-SDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang konstan.
(Hames, 1987).
Sampel-sampel enzim yang diinjeksikan ke dalam sumur gel diberi warna
dengan bromphenol biru yang dapat terionisasi. Fungsi pewarna adalah untuk
membantu memonitor jalannya elektroforesis. Berat molekul protein dapat diketahui

20
dengan membandingkan Rf protein dengan protein standar yang berat molekulnya
telah diketahui (Wilson dan Walker,2000).
Pada teknik yang native, pergerakan molekul protein selain dipengaruhi oleh faktor
ukuran, juga oleh besarnya muatan molekul. NATIVE PAGE digunakan untuk
mempelajari konformasi, self-asosiasi atau agregasi, dan pengikatan protein oleh
senyawa lain.

C. Alat dan bahan


Alat
Seperangkat alat elektroforesis vertikal
Mikropipet
Penangas air
Gelas beker 250 mL
Pipet ukur 10 mL
Pipet ukur 5 mL
Sentrifuge
Vortex
Blender

Bahan
Kecambah UGB
Metanol p.a. TEMED
Kloroform APS 10%
Etanol 95% RSB
Aquabidest Running buffer
T-akrilamid 30% Marker
LGB Larutan staining
Kertas saring Larutan destaining

D. Cara Kerja
3. Isolasi Protein dari Kecambah
21
Kecambah ditimbang sebanyak 10 gram dan ditambahkan dengan 100 mL
aquabidest kemudian diblender. Hasilnya diambil 7 mL kemudian di sentrifuge dan
diambil bagian supernatan sebanyak 5 mL. Supernatan tersebut ditambahkan 4 mL
etanol, 2 mL kloroform, dan 3 mL aquabidest kemudian divortex. Setelah itu disentrifuge
dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Dari hasil sentrifugasi tersebut, lapisan
atas dibuang sedangkan lapisan bawah ditambah dengan 3 mL methanol kemudian di
vortex kembali. Larutan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit.
Hasilnya, supernatan dibuang dan endapan ditambahkan dengan etanol 3 mL dan siap
untuk diuji.

4. Uji Kualitatif Protein Hasil Isolasi dengan SDS PAGE


1. Disiapkan dan dijepitkan 2 plate kaca elektroforesis pada penjepit elektroforesis
2. Dicek kebocoran plate dengan cara mengaliri air perlahan-lahan pada plate
3. Dibuat larutan separating gel 12% dengan ketentuan :
a. Dipipet dan dimasukkan 1700 L dH2O
b. Dipipet dan dimasukkan 2000 L T-acrylamid 30%
c. Dipipet dan dimasukkan 1300 L LGB
d. Divortex ketiga komposisi diatas 5 menit
e. Dipipet dan dimasukkan 70 L APS (dibuat dalam keadaan fresh),
(APS 10% dibuat dengan cara 10 mg APS dilarutkan dalam 100 L ddH 2O)
f. Divortex keempat komposisi diatas 5 menit
g. Dipipet dan dimasukkan 7 L TEMED
h. Divortex kelima komposisi diatas 5 menit
i. Dimasukkan separating gel dalam plate dan ditunggu hingga mengeras
4. Dibuat larutan stacking gel 3% dengan ketentuan :
a. Dipipet dan dimasukkan 812 L dH2O
b. Dipipet dan dimasukkan 220 L T-acrylamid 30%
c. Dipipet dan dimasukkan 344 L UGB
d. Divortex ketiga komposisi diatas 5 menit
e. Dipipet dan dimasukkan 8,25 L APS (dibuat dalam keadaan fresh),
(APS 10% dibuat dengan cara 10 mg APS dilarutkan dalam 100 L ddH 2O)
f. Divortex keempat komposisi diatas 5 menit
g. Dipipet dan dimasukkan 5,5 L TEMED

22
h. Divortex kelima komposisi diatas 5 menit
i. Dimasukkan separating gel dalam plate dan ditunggu hingga mengeras
5. Dimasukkan stacking gel 3% dalam plate, 1500 L
6. Dimasukkan sisir, ditunggu hingga mengeras
7. Dipindahkan dan dimasukkan plate dalam bak elektroforesis berisi running
buffer
8. Dipanaskan sampel+RSB (1:1) dalam oven 95 oC, selama 3 menit (kapasitas
setiap well maksimal 15 L), begitu pula dengan marker. Jika sampel
berbentuk padatan, maka sampel ditambahkan aquabidest (ddH 2O). Komposisi
RSB adalah sebagai berikut (BIO-RAD) :
a. B-mercaptoethanol 25 L
b. Stock Sampel Buffer 475 L
Sedangkan komposisi stock sampel buffer adalah sebagai berikut (BIO-RAD) :
a. Distilled Water 4,8 mL
b. 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 1,2 mL
c. Glycerol 1,0 mL
d. 10% (w/v) SDS 2,0 mL
e. 0,1% (w/v) Bromophenol Blue 0,5 mL
9. Didinginkan sampel + RSB hasil pada langkah 8.
10. Dimasukkan sampel + RSB ke dalam setiap well (maksimal 15 L/well), kecuali
marker protein, yakni 5 L/well
11. Dirunning dengan tegangan konstan 100 volt, selama 80 menit.
12. Diambil dan diwarnai gel selama 1 jam dengan larutan staining (dilakukan pada
mesin penggoyang atau shaker)
13. Dilakukan destaining selama 24 jam, destaining dihentikan ketika larutan
destaining jernih
14. Gel dibungkus dengan mika dan diamati profil protein yang terdapat pada gel
dengan cara discan.

Komposisi Larutan Staining :


a. Comasie brilliant blue = 0,25 g
b. Metanol absolut = 45,4 mL
c. Asam Asetat Glasial = 9,2 mL
d. ddH2O = 100 mL

23
Komposisi Larutan Destaining
a. Metanol absolut = 70 mL
b. Asam Asetat Glasial = 70 mL
c. ddH2O =1 L

PERCOBAAN VI
UJI ENZIM AMILASE DALAM AIR LIUR

A. Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari kondisi daya cerna enzim amilase dalam air
liur.

B. Dasar Teori
Amilase merupakan enzim yang berfungsi memecah pati dan glikogen. Enzim ini
banyak terdapat dalam hasil tanaman dan hewan. Disamping itu amilase juga dapat
diisolasi dari mikroorganisme, misalnya Aspergillus oryzae dan Bacillus subtilis. Enzim
amilase dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan yaitu: -amilase, -amilase dan
glukoaminase. Kerja enzim sangat khusus dan spesifik. Artinya, suatu enzim hanya
menjalankan satu fungsi saja. Misalnya adalah enzim -amilase yang bekerja spesifik di
dalam mulut, enzim ini terdapat bersama dengan air liur (saliva), enzim -amilase
berperan dalam melakukan hidrolisis awal makanan terutama yang mengandung pati.
Disamping kerjanya sangat spesifik, kerja enzim juga sangat dipengaruhi oleh faktor-
faktor lain. Diantaranya adalah konsentrasi substrat pH, suhu, kofaktor. Karena organism
di alam, termasuk manusia dapat mencerna pati, maka enzim -amilase secara alamiah
banyak ditemukan, seperti dalam air liur manusia dan system sekresi pankreas.

24
C. Alat dan Bahan
Alat
Gelas ukur Termometer
Tabung reaksi Penangas air
Penjepit tabung Kertas saring
Glass wool Pipet tetes

Bahan
Air liur (saliva) Air es
Asam asetat encer HCl
Aquadest Na Karbonat 0,1%
Larutan kanji 1% Kertas pH universal
Reagen iodine Reagen biuret
Reagen benedict Reagen Molisch

D. Cara Kerja
1. Persiapan Air Liur
Rongga mulut dibersihkan dengan cara berkumur berkali-kali. Air liur dikumpulkan
sekitar 30 mL, disaring dengan glass wool. Sifat dan susunan air liur diuji dengan
mengukur pH dan mereaksikan dengan dengan berbagai pereaksi yaitu biuret dan
molish.

2. Uji Biuret dan Molisch


Disiapkan 2 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 10 tetes air liur. Tabung 1
ditambahkan 15 tetes reagen biuret dan tabung 2 ditambahkan 5 tetes reagen molish.

3. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Amilase Air Liur


Disiapkan 4 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 2 mL air liur dan 2 mL
akuades kemudian dikocok. Tabung 1 diletakkan pada air es, tabung 2 pada suhu ruang,
tabung 3 pada suhu 37oC dan tabung 4 pada suhu 85oC selama 15 menit. Setelah itu
setiap tabung diisi dengan 2 mL larutan kanji, dikocok dan direaksikan pada masing-
25
masing kondisi suhu selama 10 menit. Isi tabung dipindahkan menjadi 2 bagian, satu
bagian diuji dengan reagen iodium dan satu bagian dengan reagen benedict.

4. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Amilase Air Liur


Disiapkan 4 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 2 mL HCl, 2 mL asam
asetat, 2 mL akuades dan 2 mL Na-karbonat dan diukur pH nya. Setiap tabung
ditambahkan 2 mL larutan kanji dan 2 mL air liur, dikocok dan diletakkan di penangas air
37oC selama 15 menit. Isi tabung dipindahkan menjadi 2 bagian, satu bagian diuji dengan
reagen iodium dan satu bagian dengan reagen benedict.

26
PERCOBAAN VI
PEMERIKSAAN GLUKOSA DAN PROTEIN PADA URINE

A. Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan adanya glukosa dan protein pada urine
secara kualitatif.

B. Dasar Teori
Urine atau air kencing merupakan cairan sisa yang diekskresikan oleh ginjal
kemudian dikeluarkan dari dalam tubuh melalui proses urinasi. Eksreksi urine diperlukan
untuk membuang molekul-molekul sisa dalam darah yang disaring oleh ginjal dan untuk
menjaga homeostasis cairan tubuh. Urine disaring di dalam ginjal, dibawa melalui ureter
menuju kandung kemih, dan akhirnya dibuang keluar tubuh melalui uretra. Urine normal
biasanya berwarna kuning, berbau khas jika didiamkan berbau ammoniak, pH berkisar
4,8 7,5 dan biasanya 6 atau 7. Berat jenis urine berkisar antara 1,002 1,035. Volume
normal perhari 900 1400 mL.
Warna urine biasanya dipengaruhi oleh jenis makanan yang dimakan, jenis
kegiatan atau dapat pula disebabkan oleh penyakit. Namun biasanya warna urine normal
berkisar dari warna bening sampai warna kuning pucat. Urine mengandung berbagai zat
yaitu air sebanyak 95 %, urea, asam ureat, ammonia, zat warna empedu (Bilirubin dan
Biliverdin), dan garam mineral, terutama NaCl. Selain itu, urine juga mengandung zat-zat
bersifat racun seperti sisa obat dan hormon.

27
C. Alat dan Bahan
Alat
Tabung reaksi Lampu spiritus
Rak tabung reaksi Pipet tetes
Centrifuge dan tabungnya Gelas ukur
Penjepit

Bahan
Urine Glucotest strip
CuSO4.5H2O Akuades
Natrium sitrat Asam asetat 10%
Na2CO3 anhidrat Natrium asetat
Sitrat karbornat Asam asetat glasial

D. Cara Kerja
1. Pembuatan Reagen Benedict
CuSO4.5H2O sebanyak 1,73 g dilarutkan dengan 10 mL akuades. Larutan tersebut
ditambahkan 17,3 g natrium sitrat dan 10 g Na 2CO3 anhidrat dalam 60 mL akuades
dengan pemanasan, kemudian disaring. Perlahan-lahan dengan adukan yang konstan
tambahkan larutan sitrat karbonat. Bersihkan seluruh CuSO 4 dengan akuades dan
tambahkan aquadest hingga mencapai volume 100 mL.

2. Uji Glukosa dalam Urine


Reagen benedict dimasukkan 2,5 mL kedalam tabung reaksi dan ditambahkan
0,25 mL (4 tetes) urine dan campurkan. Campuran tersebut diletakkan dalam air
mendidih selama 2-3 menit. Angkat tabung reaksi dan amati perubahan yang terjadi.

Warna yang terjadi adalah simbol jumlah glukosa yang terkandung dalam urine.
28
a. Biru tidak ada endapan (-) 0,0 0,1 g/dL
b. Hijau dengan endapan kuning (+) 0,5 1,0 g/dL
c. Kuning (++) 1,0 1,5 g/dL
d. Orange (+++) 1,5 2,5 g/dL
e. Merah (++++) 2,5 4,0 g/dL

3. Uji Glukosa dengan Glucotest Strip


Celupkan strip ke dalam urine selama 30 detik. Baca hasil tersebut dengan
membandingkan warna yang didapat dengan warna standard.

4. Uji Protein dalam Urine


Tabung reaksi diisi urin sebanyak nya dan dididdihkan selama 1-2 menit.
Kemudian tambahkan 3 tetes asam asetat 10% secara perlahan dalam keadaan
mendidih. Amati dan catat perubahan yang terjadi.
Kekeruhan yang dihasilkan menandakan banyak sedikitnya protein dalam urine.
a. Tidak ada kekeruhan (-)
b. Kekeruhan sedikit sekali ()
c. Kekeruhan sedikit (+) 10-50 mg %
d. Kekeruhan jelas (++) 50-200 mg %
e. Kekeruhan hebat (+++) 200-500 mg %
f. Kekeruhan menggumpal (++++) >500 mg %

5. Uji Protein dengan Metode Bang

29
Reagen bang dibuat dengan melarutkan natrium asetat 2,36 g dan 5 mL asam
asetat glasial. Campuran tersebut ditambahkan akuades sampai volumenya 20 mL. Lima
milliliter urine dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah 0,5 mL reagen Bang.
Setelah itu, dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. Amati perubahan yang
terjadi. Terbentuknya kekeruhan pada sampel menunjukkan adanya protein dalam urine.

6. Uji Protein dengan Metode Hellers


HNO3 2 M sebanyak 2 mL dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian,
ditambahkan 2 mL urine secara perlahan. Terbentuknya gumpalan berwarna putih
menunjukkan adanya protein dalam urine.

Daftar Pustaka
BCM 101 Biochemistry Week 9 Pratical Urine Analysis. Diakses tanggal 18 Februari
2016 dari http://www.pua.edu.eg/Version2/Courses2/Dentistry%20Courses/Freshmen
/Spring/BCM101/Practical/Week%209%20Practical%20_Urine%20analysis_.pdf

30
LAMPIRAN
Lampiran 1. Format Laporan

SAMPUL LAPORAN

BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
1.2 Tujuan

BAB II TINJAUAN PUSTAKA


2.1 Dasar Teori (teori-teori baku yang menunjang pembahasan)
2.2 Tinjauan Bahan (MSDS bahan yang digunakan)

BAB III METODE PERCOBAAN


3.1 Alat
3.2 Bahan
3.3 Cara kerja (ditulis dalam bentuk paragraf)

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN


4.1 Data Hasil Pengamatan
4.2 Analisis prosedur dan analisa hasil

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

DAFTAR PUSTAKA
min. 5 referensi, 2 atau lebih diantaranya dari artikel penelitian.

LAMPIRAN
Lampiran berisi diagram alir, data-data mentah, tabel pengamatan, dan perhitungan.

31
Lampiran 2. Contoh Cover Laporan Praktikum

ISOLASI ASAM NUKLEAT


(...............judul percobaan.............)

Disusun Oleh:

Nama : Moh. Taufiq


NIM : 03530014
Jurusan : Kimia
Asisten : Taufiq Hidayat
Kelompok : VI

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG
2016

32
Lampiran 3. Limbah Praktikum Biokimia II

Percobaa Jenis Limbah Kategori Wadah


n
I Larutan iodine + bakteri + Organik halogen Kuning
enzim amilase
Reagen DNS + bakteri Asam basa Putih
Reagen DNS + Glukosa Asam basa Putih
II Enzim papain + susu skim Asam basa Putih
+ pp + NaOH
III Dedak padi /kacang Organik Hijau
tanah+ petroleum eter +
buffer
Susu + Enzim lipase + pp Asam basa Putih
+ NaOH
IV Kertas saring + kultur Asam basa Putih
bakteri + H2O2
Aquadest + H2O2 + HCl Asam basa Putih
Aquadest + H2O2 + NaOH Asam basa Putih
Aquadest + H2O2 Asam basa Putih
V Gel akrilamid + protein Organik Hijau
VI Air liur + biuret/molisch Organik Hijau
Air liur + aquadest + Organik Hijau
iodium
Air liur + aquadest + Organik halogen Kuning
benedict
Air liur + HCl / NaOH/ Asam basa Putih
asam asetat + iodium
Air liur + HCl / NaOH/ Asam basa Putih
asam asetat + iodium
VII Benedict + urine Logam Merah
Asam asetat + urine Asam basa Putih
Reagen Bang + urine Asam basa Putih
HNO3 + urine Asam basa Putih

33