BAB I

INTRODUCTION

Tauopathies adalah masalah kesehatan neurodegeneratif utama di seluruh

dunia. Ini termasuk penyakit Alzheimer, demensia frontotemporal dengan

Parkinsonisme terkait dengan kromosom (FTPD, penyakit Pick's, kelumpuhan

supranuklear progresif dan degenerasi kortikobas. Fitur umum yang dimiliki oleh

penyakit ini adalah kelimpahan tau-positive neurofibrillary Kusut (NFTs) yang

mendefinisikan neuropatologi. Sementara tau terlibat dalam perakitan mikrotubulus

(MT) dan stabilisasi dalam kondisi fisiologis, tau disfungsional telah dikaitkan

dengan NFL terkait tauopati yang diakibatkan oleh akumulasi agregat toksik yang

tidak larut. Rekombinan tau sangat meniru sifat penting protein alami yang terjadi.

Untuk tujuan ini, rekombinan tau telah digunakan secara ekstensif untuk mempelajari

aspek molekuler, biokimia dan seluler dari toksisitas protein, termasuk (i) mengikat

MTs dalam kondisi fisiologis dan patologis (ii) interaksi tau-tau yang mengarah ke

agregasi mereka. Menjadi filamen heliks berikatan berpasangan (PHF) yang serupa

dengan yang diisolasi dari otak Pasien penyakit Alzheimer, dan (iii) penyebaran

transkellular toksisitas ini pada yang terkena organisme. Pengikatan tau ke MTs

terganggu pada penyakit dan juga oleh kehadiran

Mutasi FTPD-17 spesifik yang beberapa di antaranya dapat meningkatkan agregasi

protein ke dalam PHF. Selanjutnya, konstruksi tau terpotong seperti domain ulangi

Rawan agregasi dan menunjukkan kinetika agregasi yang lebih baik dibandingkan

dengan keseluruhan- Panjang isoform. The tau four-repeat domain (K18), misalnya,

cukup untuk polimerisasi protein menjadi PHFs.

Bila ditambahkan secara eksogen, fragmen tau ini bisa jadi Diinternalisasi oleh sel,

melibatkan protein endogen untuk membentuk agregat beracun yang menyebar

Transmisi sel-ke-sel prion seperti. Ekspresi imbas tinggi tau murni sangat penting

untuk studi tauopati in vitro. Namun, Ekspresi dan pemurnian protein diperumit oleh

kecenderungan agregasi dan pemotongannya yang tinggi, dan metodologi yang

memakan waktu dan mahal. Di sini, kami berusaha Identifikasi parameter yang akan

memastikan ekspresi optimal tau K18 dan FTPD-17 nya

Varian V337M dan N279K. Kondisi ekspresi berikut diselidiki:

Pilihan strain inang E. coli, suhu induksi, durasi induksi, dan adanya glukosa dalam

media kultur. Selanjutnya, kondisi yang baru terbentuk digunakan untuk ekspresi

protein dan pemurnian berskala besar. Protein yang dimurnikan itu

Ditandai melalui analisis dichroism melingkar struktur sekunder dan perakitan

FPS mirip Alzheimer.

BAB II

BAHAN DAN METODE

Kloning K18 menjadi plasmid pProEx Plasmid pProEx-HTa-Myc-K18 dibangun

untuk ekspresi rekombinan K18. Tau dan dua varian FTPD-Dalam setiap kasus,

urutan K18 didahului oleh Tembakau Etch Virus (TEV) urutan pengenal protease

ENLYFQG menyatu pada ujung N ke label poli-histidin dan tag c-Myc (Gambar 1).

Pengaturan ini memungkinkan protein berskala besar Pemurnian menggunakan

IMAC dan pembelahan protease TEV berikutnya.

Urutan pengkodean K18 dihasilkan oleh reaksi berantai polimerase menggunakan

pCMV-FLAG-tau sebagai template dan Kloning antara situs EheI dan EcoRI plasmid

pProEx-HTa (Invitrogen) yang mengandung Resistansi ampisilin dan gen encoding

lacI. Ekspresi dikontrol oleh promotor trc, dan dimulai dengan penambahan isopropil

-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG).

Urutan plasmid dikonfirmasi dengan sekuensing DNA (GATC Biotech AG,

Konstanz, Jerman). Mutagenesis yang diarahkan ke situs (SDM) Perangkat Q5

SDM (New England Biolabs) digunakan untuk menciptakan N279K dan V337M

Mutasi patogen pada tipe liar K18 (WT) tau, menurut pabrikan

Instruksi, menggunakan primer. Plasmid ditransformasikan menjadi Sel NEB-5 E.

coli yang kompeten (turunan DH5) dan tumbuh semalam di Luria-Bertani (LB)

yang mengandung 100 g / ml ampisilin dalam inkubator gemetar dengan agitasi

(180 rpm) Di 37 0C DNA plasmid diisolasi dengan menggunakan kit QIAprep Spin

Miniprep (QIAGEN GmbH,Hilden, Jerman) sesuai instruksi pabrik pembuatnya.

Kehadiran mutasiDikonfirmasi oleh sekuensing DNA seperti yang dijelaskan di atas,

dengan menggunakan primer yang tercantum dalam Tabel 2, Setelah itu DNA

plasmid diubah menjadi BL21 (DE3)

Primer yang digunakan pada mutagenesis yang diarahkan pada situs tipe K18 liar

membangun untuk menciptakan mutasi patogen FTPD-17 N279K dan V337M.

Kodon bermutasi digaris bawahi.. DNA sequencing primer. Transformasi sel yang

kompeten Lima nanaogram DNA plasmid ditambahkan ke 50 l sel BL21 (DE3) *

pRosetta yang kompeten dan diinkubasi pada es selama 30 menit. Sel ternganga pada

suhu 42 oC selama 30 detik, diikuti oleh 2 Min inkubasi di atas es. 950 l kaldu LB

ditambahkan dan campuran diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam. 40 l dilapisi

pada larutan LB yang dilengkapi dengan ampisilin (100 g / ml) dan kloramfenikol

(35 g / ml) dan diinkubasi semalam pada suhu 37oC. Ekspresi konstruksi K18 tau

Koloni tunggal diinokulasi ke dalam 10 ml kaldu LB selektif dan ditanam semalam

pada suhu 37oC. Keesokan paginya, 1 ml kultur semalam diinokulasi ke dalam LB

selektif 50 ml Kaldu dan tumbuh pada suhu 37 oC dengan agitasi 180 rpm. Budaya

tumbuh sampai mencapai OD600 = 0,6 - 0,7, diinduksi dengan 0,5 mM IPTG dan

kemudian ditanam selama 3 jam lagi. 1,5 ml aliquot

Disentrifugasi pada ~ 11.000 xg selama 1 menit, pelet disuspensikan kembali dalam

100 l fosfat Buffered saline (PBS) dan disonikasi selama 5 detik pada kekuatan 10%

dan disentrifugasi kembali pada ~ 11.000 xgSelama 5 menit Semua sonication

dilakukan pada Sonicator Bandelin Sonopuls 2070. Yang larut (Supernatan) fraksi

dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf untuk elektroforesis gel. Pelet

Disuspensikan kembali dalam 500 l PBS, disonikasi (10% daya, 5 s) dan

disentrifugasi (~ 11.000 xg untuk 5 menit). Pelet yang dihasilkan disuspensikan

kembali dalam 150 l PBS, menghasilkan fraksi yang tidak larut. Ekspresi Tau dalam

fraksi larut dan tidak larut dianalisis dengan sodium dodecyl

Elektroforesis gel poliakrilamida sulfat (SDS-PAGE) dan Western blotting (WB).

 SDS-PAGE dan WB Sampel protein dengan konsentrasi yang sama

dipisahkan pada standar 15% Tris-glycine SDS- Gel PAGE dengan (gel pengurang)

atau tanpa (gel yang tidak mereduksi) -merkaptoetanol dan 5 menit Pemanasan pada

suhu 95 oC. Sampel dianalisis terhadap protein tangga (P7712 atau P7712S dari New

England BioLabs, kisaran ukuran = 11 - 245 kDa) selama 35 menit pada 200 V di

Biorad Mini

Sistem Tetra PROTEAN (BioRad Laboratories, California, AS) dan diwarnai dengan

InstantBiru (Coomassie berbasis noda dari Expedeon, Cambridge, Inggris) selama 1

jam pada suhu kamar (RT) tanpa langkah mencuci yang diperlukan dan dicitrakan

menggunakan sistem pencitraan GG Box SynGene. Untuk mengetahui band tau-

positif, WB dilakukan sebelum deteksi antibodi.

Gel dipindahkan semalam pada suhu 4 oC atau 2 jam di RT ke Amersham Hybond

Elektrokimiawi membran nitroselulosa (GE Healthcare, Buckinghamshire, Inggris)

Dan diblokir selama 15 menit sebelum 2 jam inkubasi dengan antibodi primer (1:

5000 pengenceran,Kelinci poliklonal anti-manusia tau A0024, Dako, Ely, Inggris).

Antibodi yang tidak terikat telah dilepas Dengan 5 x 5 menit mencuci dengan 10%

TBS-Tween dalam air suling sebelum inkubasi 2 jam di RT Dengan antibodi sekunder

(kambing anti kelinci IgG 31460, Thermo Ilmiah, Inggris, 1: 5000

Pengenceran) dan membran dicuci seperti sebelumnya. Bagi WB untuk

mengkonfirmasi pembelahan dari-Nya Tag, antibodi anti-Nya (27-4710-01 dari GE

Healthcare, dilatasi 1: 2500) dan obat kelinci anti-Tikus IgG (31450 dari

Thermofisher, 1: 5000 pengenceran) digunakan sebagai primer dan

Antibodi sekunder masing-masing. Deteksi antibodi dilakukan dengan menggunakan

Amersham Pereaksi deteksi elektrokimiawi sesuai dengan instruksi pabrik

pembuatnya Band yang divisualisasikan dengan paparan film sinar-X (Fuji Medical

X-ray Film Super RX) dan dikembangkan dalam prosesor AGFA Curix 60 (Agfa

Healthcare, Greenville, SC, USA).

Analisis Densitometri pita protein dilakukan dengan menggunakan ImageJ, dan

perbedaannya Dibandingkan dengan menggunakan uji Mann-Whitney di Prism 6

(GraphPad Inc., CA, USA) sebesar 5% Tingkat signifikansi. Ekspresi bangunan tau

skala besar Kultur besar dihasilkan dengan menginokulasi 500 ml kaldu LB selektif

dengan 10 ml semalam Budaya menggunakan parameter ekspresi yang dijelaskan di

atas. Kultur kemudian disentrifugasi pada suhu 4 oC selama 10 menit pada 9800 xg.

Pelet yang dihasilkan disuspensikan kembali dalam 50 mM

Na2PO4 pH 7.5 dan beku sampai habis. Sebelum dimurnikan, lisat direbus pada suhu

70oC 10 menit sampai mencair, dan koktail penghambat protease (Roche

Diagnostics, 1 tablet / ~ 50 ml lisat),

DNAse I dan 5 ml pereaksi ekstraksi protein BugBuster 1X (Merck Millipore)

ditambahkan. Campuran dibiarkan berdiri di RT selama 1 jam, disiram dengan

kekuatan 70% selama 1 menit dan Disentrifugasi pada suhu 4 oC selama 30 menit

pada 48.000 xg. Supernatan mengandung fraksi terlarut

(Ekstrak kasar) dituang, disaring melalui filter 0,2 m dan dimurnikan seperti di

bawah ini.

Pemurnian protein dengan kromatografi afinitas logam yang tidak bergerak (IMAC)

Kolom Ni-NTA digunakan. Chelating sepharose resin (GE Healthcare, Inggris) diisi

Dengan 10 mM NiCl2 / CH3COONa pH 4.0 dan diseimbangkan dengan penyangga

A (pH 50 mM Na2PO4 7.0, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol) sebelum penambahan

ekstrak kasar. Kolom itu Dicuci kembali dengan buffer A, diikuti

Indikasi formasi -sheet. Sedangkan fraksi terlarut dalam persiapan PHF

Sampel terdiri dari monomer dan oligomer dengan berat molekul rendah, PHF yang

tidak larut terdiri dari spesies dengan berat molekul lebih tinggi yang tidak terlihat

oleh WB.
 BAB III

Kesimpulan

Protein Tau telah menjadi subjek penelitian intensif karena bersifat fisiologis

dalam menstabilkan MTs, mendukung transportasi aksonal, pertumbuhan neurologis

dan lainnya proses yang terlibat dalam biologi sel neuronal. Selain itu, agregat toksik

WT Tau dan varian FTPD-17-nya adalah ciri utama penyakit Alzheimer dan

tauopathies lainnya.

Produksi rekombinan yang efisien adalah prasyarat untuk in vitro dan

Beberapa pemodelan in vivo dari penyakit ini. Hasil protein target ini tidak

mencukupi beberapa perangkap eksperimental.

Penelitian in telahi meneliti parameter yang dapat mempengaruhi Ekspresi

dan pemurnian WT dan FTPD-17 tau patogen, dalam upaya untuk mengidentifikasi

Cara untuk meningkatkan hasil tau murni untuk aplikasi hilir. Hal itu menunjukkan

bahwa Adanya mutasi patogen V337M dan N279K nampaknya tidak mempengaruhi

ekspresi tau monomer, yang terbesar pada suhu induksi 37 oC dibandingkan dengan

25 oC dan 30 OC.