>Bab sebelumnya menjelaskan metode tie digunakan untuk isolasi,

pemurnian, dan budaya (f terisolasi protoplas, dan menawarkan beberapa wawasan ke dalam
tihe cara di mana seluruh tanaman dapat diregenerasi dari tunggal terisolasi protoplas. minat
lihe dalam teknik fusi protoplas adalah terkait
untuk prospek yang melintasi lebar dari sekarang mungkin dengan sexua cara dapat dicapai
dengan protoplas fusio (n. Misalnya Ior, beberapa tanaman yang menunjukkan
ketidakcocokan fisik atau kimia di crorses seksual yang normal dapat dihasilkan oleh fusi
'protoplas yang diperoleh dari dua budaya dari 'spesies yang berbeda. Perlu ditekankan,
bagaimanapun, bahwa seluruh hybrid
tanaman telah diregenerasi dalam jumlah yang relatif kecil "tetms fusi sistemik, dan thcre ada
contoh dari keberhasilan penggunaan bridization hidrokarbon somatik dalam program
tanaman-brueding. dasi pekerjaan penelitian awal, toplasts pro dapat diisolasi dari sejumlah
kecil tanaman, jumlah isolasi protoplas sukses meningkat perbaikan tercukupi dalam teknik
diragukan mengikat sejumlah eksperimen fusi sukses akan.
meningkat pesat setelah iq teknologi kami telah disempurnakan.
Trhe fusi protoplas tanaman ada ita fenomena terutama baru; Kfister pada tahun 1909
menggambarkan proses fusi acak di protoplas mekanis terisolasi. Ketika dua atau lebih
protoplas terisolasi yang menyatu
bersama-sama, selalu ada perpaduan dari cytoplasrms dari berbagai
protoplas (Gambar. 13. I). Inti protoplas menyatu mungkin sekering bersama, atau mereka
mungkin rellain terpisah. Sel co) ntaiining nonidentical
inti disebut hcterokaryons atau lieterokaryocytes (Mastran- gelo, 1979). Fusi inti dalam hasil
heterokarion berinti dua dalam pembentukan sebuah protoplas hybrid benar atau
synkaryocyte (Constabel, 1978). Fusi dua protol.lasts fron hasil kultur dasi slUnIC di
homokaryon a. Sering informasi genetik yang hilang dari salah satu inti. Jika "satu nukleus
sepenuhnya menghilang, yang sitoplasma dari dua protoplas orangtua masih hibridisasi
(Gambar 13.,, dan fusi-produk SLT dikenal sebagai.?" Cybrid "(hybrid sitoplasma;
heteroplast)
>Faktor genetik tertentu dilakukan dalam sistem warisan sitoplasma bukan
dari dalam gen nuklir (misalnya, kemandulan laki-laki dalam beberapa tanaman). Foirmation
yang
dari cybrids, oleh karena itu, memiliki aplikasi dalam program tanaman-breeding.
Fusi spontan protoplas dapat terjadi, atau mereka nay diinduksi
untuk sekering dengan adanya "agen fusigenic." Selama pencernaan enzimatik
dari dinding sel, protoplas sel yang bersebelahan mungkin sekering bersama
melalui plasnmodesmata sebelah mereka. Pembubaran dinding memungkinkan
helai plasmodesmatal interkoneksi sel untuk memperbesar; ubin
sitoplasma dan organel dari dua atau lebih sel kemudian mengalir bersama-sama.
Ini fusi spontan selalu intraspesifik (yaitu, berasal dari
jaringan tanaman yang sama). Thi. pIhenomenon jarang terjadi karena negatif
biaya pada permukaan protoplas menyebabkan mereka untuk mengusir setiap
lainnya (Grout dan (Coutts, 197,1;. Nagata dan Melchers, 1978) Meskipun
agen genteng fusigeiiic menurunkan biaya surfitce, yang memungkinkan protoplas yang
membran untuk datang ke dekat, adhesi dari protoFig.
13. I.Soume ilsii n produk resuthing budaya protoplas froin. The
fousion dari * pro) toplasts A dan l1resulis di abinceate heterokarion contaiing
mengikat contems sitoplasma dari tle dua protoplas asli. Fusi
dari dua inti hasil inatetraploid sel hybrid atau synkaryocyte. Jika
satu o) f suatu cybrid atau heter) Plast diproduksi.
>plasts tidak cukup untuk membawa 'lusinl tanpa alterartionns niolcular dalam struktur
bilayer ofr e plits asriial MML ubra s (Alikoig ut al., 1975t).
Beberapa comnponds memiliki beenl, showl memiliki iaf'usigeric Ctct pada
protoplas. Dalam I97 () Power dan co-, vorkers, U niversity of1 "Nottingham, slo,., L Thiar a
* ddllirz (d natrium itrilei ke le Budaya nlmeliumn ilduced
I'usion dari 'mrItpr roplasrs f ont oal M / c Wfirunl L.) dan jagung
(Zca mao L ..). Fusion adalah llso proIlel d oleh i (omlbiniliotin tinggi pl-I (10,5), sebuah
LcOIR.etriltlrio tinggi * Ca "IIInl 1l1s5 (9 () M (AC1. 211,0), dan
tenpcraure tinggi ((V) (VCZ.lhIr MeClICILrs gersang, Michers I7 c; dan
Labib, 197, i). Pada dasi prese mrinlnr 4polyUthylenie glyol (PIL (;) adalah (lie ost
banyak ,, digunakan agen fusiiiiC ((: Orist b anid Kia, I97, k Kim dan Michayluk,
1 () 7, i). Th ,, m uular weiglir arnd climitrtloll, dari, PG, yang
density ni "pro (oplaists, ban i1clibalrion renipe.-rattre, kehadiran bantuan thue dari
divalet (AIMS kemarahan semua Iators yang berperan dalam proses tIhrtfsion (Willfin,
(; lirnelius, aind F'rikssor, 197, i). l olyethylene glyo l telah digunakan (l tO) intluce ru fusin
oflanin, 1te.lls ('ontr.rorvo, 11), 5); hrltore, itu
kerusuhan stirlrisirig rtbar hiere sebuah '(., aryom vas prodltcd berwer'ie ail imirial sel
membantu seorang et al., 1975). 'LHE sel lIir (LAhkong terakhir lieterokaryon terlibat
fusi OFI sebuah lietn Crytlnocyre gersang i kamu, 'ir protroplast. LHE f'usion dari '
clls amfibi berbudaya dengan proroplasts dari tanaman yang lebih tinggi telah menjadi Juga
dilaporkan () avey erIill., 19-78).
Experirrierir yang ouliried sakit c ini + halpter inVoIvs arrelrt pesawat ke intduce
ftusio ii bctW n isoflitetl pro (il) berlangsung frotir dua (sumber tanaman yang berbeda.
berbohong iIhcrive., irrlmii) M, yang invholves rendah slped cetrifugarior oflthe
campuran culrur 'iinthe kehadiran o (l polietilen glikol (I1uG), akan menghasilkan
sakit berbagai, pron tistuom (lus. The proi Plast populaton akan Corsist dari
prril unluisdICd (rri0 clls 'mengikat dua jaringan, lhimokaryois, icrerokaryonrs,
dan muIltil flusion lpro1duc: ts. Jika rhis niixtnre, adalah p) late_, d pada budaya
Iletlium, somie of1 ban Berbagai IypCs kirim akan membagi dan de (.velopt + kalus.
Berikutnya ft masalah) r Itehinwvestigiato) r adalah rucignirioi kalus I'ried
oleh), hibrida somatik dan cybrid c.lls. The seleCtioin rIucedtrus umumnya
dari dua jenis: visual dan blochumical merinl.Is seleksi.
Temukan Visual telah resrrio.tel untuk fusi o "promplasts berwarna
protoplas witl coinainini, chlorplasts. lrotop1isrs yang demn- onstraite karakteristik struktur
yang dihasilkan conmpletly iitegLirted dari 'kedua jenis sewa-pasien yang literoktaryons aind
sel berpotensi hybrid (Kio ct al, 197,4;. Power dan Cocking, 19,77;. Patnaik et al, 1982). Ali
contoh
ban fusi "potoplasts tanaman ditunjukkan pada Gambar.
>3.2 . Ini adalah po ) ssible ke
melampirkan ban label ton neon rtcr nenr'branies o ) f dua poipulattions toplast orangtua pro
dan kemudian tine slparate ' produk lusion froim yang paFig . 13.2 . Fusi protoplas berwarna
dan kloroplas yang mengandung .
( Courtesy Profesor G. Melchers . )
>Gambar . 13.3 . Metode skrining untuk mendeteksi hibrida somatik yang auksin - autotropic
nutrisi . Protoplas terisolasi dari kedua Nicotianaglauca
dan N. Lanpg.doffii tidak dapat tumbuh tanpa adanya
auksin eksogen . Hasil fusi dari dua jenis orangtua adalah auxinautotropic
dan tumbuh pada media auksin bebas .
>sewa campuran dengan metode sel neon menyortir (Redenbaugh et al., 1982). Hibrida
somatik dapat dipilih dengan menggunakan media untuk mendorong se- giowth kolektif ini.
Sebuah metode dikembangkan untuk pemilihan hibrida yang dihasilkan dari fusi protoplas
dari Nicotianaglauca dan N. Langs- dorffii (Carlson, Smith, dan Dearing, 1972; Gambar
13.3.). Baik dari protoplas parentl adalah ofgrowth mampu pada media dirampas auksin.
Produk fusi dari dua spesies autotropic auksin, dan mereka mampu pembentukan kalus pada
media auksin bebas. Cal.us yang kemudian dapat disubkultur dan diinduksi untuk
menumbuhkan tanaman hibrida. Alasan untuk prosedur ini kemudian dikonfirmasi oleh
Smith, Kao, dan Combatti (1976). Metode lain melibatkan penggunaan mutan biokimia dan
pembacaan se hibrida somatik oleh bentuk komplementasi. Antibiotik aktinomisin D akal
digunakan dalam deteksi produk fusi dua spesies Petunia (Power et al., 1976). Kultur sel P.
hybrida tidak dapat tumbuh di hadapan actinomyciii D, sedangkan sel-sel dari P.parod / iiare
mampu pertumbuhan di hadapan antibiotik ini. Sel-sel dari spesies terakhir, bagaimanapun,
tidak dapat beregenerasi Petuniaplants dari kultur kalus. Satu-satunya sel yang mampu
tumbuh di hadapan aktinomisin D dan mampu regenerasi seluruh tanaman adalah produk fusi
dari dua baris protoplas orangtua. Dua strain mutan dari Nicotiana tabacum, yang memiliki
karakteristik sensitivitas cahaya dan klorofil deft- efisiensi, yang digunakan dalam prosedur
seleksi komplementasi oleh Melchers dan Labib (1974). Teknik yang ada di bab ini mungkin
salah satu yang paling sulit bahwa siswa akan menghadapi dalam buku ini. Fusi exper- iment
hendaknya tidak dilakukan sampai protoplas telah berhasil diisolasi dan berbudaya (lihat bab.
12). Percobaan ini melibatkan induksi fusi dua protoplas membawa penanda visual yang
berbeda dalam bentuk pigmen warna. Produk fusi dapat diidentifikasi dengan pemeriksaan
mikroskopik dari sel-sel. Setelah teknik ini dikuasai, siswa dapat maju ke hibridisasi yang
lebih kompleks dan seleksi metode

>DAFTAR BAHAN
Sterilizationmode : C , kimia ; 0 , oven ; A, autoclave
protoplas terisolasi dari dua jenis di media kultur (bab . 12 ) . Menggunakan metode bab
sebelumnya , protoplas yang diisolasi dari
salah satu tanaman berikut :
( a) daun dan umbi Beta tulgaris (b ) daun dan akar tunggang dari Daucus carota ( c ) daun
dan kelopak Nicotiana tabacum ( d ) daun dan kelopak Petunia hybrida O 9 - cm Petri piring (
10 ) O forsep Tabung O centrifuge , 6 " < 16 mm ( ditutup dengan aluminium foil ) Sebuah
250 - CM4 Erlenmeyer dengan 200 cm ' MS - manitol ( 13 % b / v ) ditambah agar ( 2 % b / v
) , 40'C (lihat prosedur di Bab . 12 ) Sebuah solusi polietilen glikol ( 20 % w / v ; berat
molekul 3000 ) Sebuah pipet Pasteur , bore lebar Fuchs - Rosenthal hemositometer , 0,2 mm
secara mendalam etanol ( 80 % v / v ) dip etanol ( 70 % v / v ) dalam botol pencet plastik
lampu metanol bangku - top centrifuge , jenis berayun - ember Evans biru pewarna reagen
diasetat fluorescein mikroskop fluoresensi
>PROSEDUR 1. Setelah pemilihan tanaman yang tepat , mengisolasi dua set protoplas
dengan menggunakan teknik yang diuraikan dalam bab sebelumnya . Prosedur ini harus
menghasilkan satu tabung berisi protoplas hijau bahan daun matang dan tabung kedua
protoplas merah dari kelopak , umbi , atau jaringan akar tunggang . Dengan kata lain,
penanda untuk fusi yang kloroplas dan vakuola mengandung pigmen arithocyanin . 2. Prinsip
dasar dari fusi ditunjukkan pada Gambar . 13.1 . nomor yang sama protoplas ( A ) anti ( B )
dicampur dalam tabung centrifuge mengandung PEG ( 20 % w / v ) sebagai agen fusigenic .
Tabung disentrifugasi pada 75- 100 x g selama 10 menit . Tekanan yang relatif sedikit ini
memaksa protoplas ke dalam kontak dekat dan memungkinkan fusi berlangsung . 3. pelet
leburan dan disatukan protoplas hati-hati disuspensi dan diuji untuk kelangsungan hidup dan
kepadatan , dan campuran berlapis sebagai dijelaskan pada Bab 12 .
>HASIL
Setelah campuran protoplas telah berlapis dan agar-agar telah dipadatkan ,
piring dapat dilihat secara mikroskopis untuk identifikasi
produk fusi . Heterokarion dapat diidentifikasi oleh kehadiran ferent kombinasi produk fusi ,
dan siswa harus berusaha untuk mengindentifikasi , sebanyak mungkin. Jika salah satu
produk fusi memulai kalus , regenerasi tanaman dapat dicoba seperti yang dijelaskan
sebelumnya di
Bab 6 .
PERTANYAAN UNTUK DISKUSI I. Apa chcmical CoML ) Ounds telah cmpl ) YCD
sebagai agen fUsigenic ? 2. Apa keuntungan dari fusi iprotoplast atas metode tradisional
hibridisasi seksual ? 3. Apa jenis prosedur dapat digunakan untuk pemilihan * sel hybrid ? 4.
Apa cybrid isa ? l ) w tidak Iphenomenon ini terjadi , dan apakah hal itu memiliki signifikansi
dalam pemuliaan tanaman ? 5. Daftar beberapa fusi protoplas menarik yang mungkin
mengakibatkan hibrida yang tidak biasa ( misalnya , kentang dan tolmato ) .