Electroforesis -1

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ELECTROFORESIS DE PROTEINAS DE SUERO EN ACETATO DE CELULOSA

1.- FUNDAMENTO TERICO

La electroforesis es una tcnica basada en los movimientos de molculas cargadas en un campo

elctrico, cada molcula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (ctodo y nodo), este
movimiento denominado electroforesis da nombre a la tcnica. En el transporte electrofortico, a la
fuerza del campo elctrico se opone la resistencia viscosa del medio, producindose, cuando se igualan
una velocidad constante de desplazamiento de las partculas.

En resumen, puede decirse que cuando una molcula cargada se coloca en un campo elctrico
se mover hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga elctrica, 2) su tamao, 3) la
intensidad del campo elctrico y 4) la temperatura del medio.

La electroforesis se aplica en el campo de la Bioqumica a la separacin de compuestos que

poseen grupos ionizables (aminocidos, pptidos, protenas, cidos nucleicos) teniendo en cuenta que
la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren. Si la molcula tiene
carga positiva migrar hacia el ctodo y si tiene carga negativa, hacia el nodo. La fuerza inica de la
solucin tampn tiene una importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja,
permite velocidades de migracin de los solutos ms rpidas y con menor desprendimiento de calor.

Las protenas estn compuestas de aminocidos que poseen grupos ionizables (principalmente -
COO y -NH3+) pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer
-

elctricamente neutras segn la proporcin de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. En
su punto isoelctrico (pI pHI), la protena tiene carga neta cero. Por debajo de pI las protenas
estarn cargadas positivamente y por encima del pI negativamente.
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ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA

Se usa para la separacin y caracterizacin de protenas y otras molculas. El soporte consiste

en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de adsorcin mnimas, por lo que se evita
la formacin de colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Otras ventajas son:
1) La separacin es muy rpida
2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeas
3) Las tiras pueden hacerse transparentes
4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados
5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos

Entre sus desventajas figuran que captan poca agua y son ms susceptibles a la evaporacin
que el papel. Son tambin ms susceptibles al flujo electro-endosmtico.

Las protenas de suero se pueden separar mediante esta tcnica. Sus puntos isoelctricos
estn entre 4,9 (Albmina) y 7,4 (Gamma-globulinas). Al realizar la electroforesis con un tampn de
pH = 8,6, todas las protenas del suero tendrn carga negativa. La albmina, al tener el punto
isoelctrico ms alejado del pH, tiene ms carga negativa y avanza ms rpido, quedando ms cerca
del polo positivo que las gamma-globulinas, que migran muy poco por ser el pH prximo a su pI. Las
restantes protenas sricas quedan situadas entre estas dos.

En suero humano la composicin normal es:

Albmina ........... 54 - 62%
-globulinas ....... 9 - 15%
-globulinas ....... 8 - 13%
-globulinas ....... 14 - 19%

En el plasma de rata la distribucin de bandas es diferente, separndose slo las -globulinas y

-globulinas, la albmina y una banda proteica de mayor movilidad electrofortica que la albmina,
denominada prealbmina.

2.- MATERIAL Y REACTIVOS

Material

- Tiras de acetato de celulosa (Cellogel) - Pinzas

- Papel de filtro para secar las tiras de acetato - Rodillo
- Cubeta de electroforesis - Aplicador
- Fuente de electroforesis - Vidrio de reloj

Reactivos

- Tampn Tris 0.025 M, glicina 0.192 M pH=8,6

- Solucin de tincin: 0.5% (p/v) negro amido en metanol 45% (v/v) + cido actico10% (v/v)
- Solucin de destincin: metanol 45% (v/v) + cido actico 10% (v/v)
- Plasma de rata
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3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

3.1.- Electroforesis:
- Humedecer en tampn las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su uso, para su
equilibrado.
- Eliminar el exceso de tampn poniendo las tiras entre dos hojas de papel de filtro, con cuidado
de que no lleguen a secarse por completo.
- Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie penetrable quede
hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve cuando la tira se coloca en vertical delante
de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha
- Depositar con ayuda del aplicador dos muestras de suero en cada tira, en el extremo prximo
al ctodo.
- Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 200 voltios durante 60 minutos.

3.2.- Revelado:
- Finalizada la separacin, depositar las tiras en una cubeta con solucin de tincin, de modo
que queden cubiertas por el lquido, durante 10 minutos.
- Lavar las tiras en solucin de destincin hasta que se observen bien las bandas de protena
(azules) sobre un fondo blanco.

3.3.- Clculo del porcentaje de las protenas:

- Limpiar las tiras en agua del grifo durante unos segundos.
- Colocar las tiras entre 2 lminas de transparentes, eliminando las burbujas con un rodillo.
- Escanear las bandas obtenidas por electroforesis.
- Realizar el clculo del porcentaje de las protenas del plasma el programa informtico scion
image.

4.- TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS

4.1.- Dibujar el patrn de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de protenas sricas,
indicando la posicin de nodo y ctodo as como el punto de aplicacin de la muestra. Identificar las
protenas que corresponden a cada banda y justificar el orden.

4.2.- Calcular los porcentajes relativos de las protenas contenidas en suero, a partir del escaneado.