UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERA

ESCUELA ACADMICA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

TTULO:

INGENIERA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES EMPLEANDO UNA

CEPA DE Pichia stipitis NRRL Y-7124, USANDO XILOSA COMO FUENTE DE

CARBONO

ALUMNOS:
Arroyo Lozano Junior Yorkei

Huincho Aquio Sonia Marisol

Luera Dominguez Royder Santos

Urrutia Vega Nataly

Vsquez Villacorta Nelly Sofa

CURSO:
Laboratorio de Ingeniera de Bioprocesos

DOCENTE:

Ing. Augusto Castillo Caldern

NUEVO CHIMBOTE PER

2017
 NDICE

I. OBJETIVOS ............................................................................................................ 2

II. METODOLOGA EXPERIMENTAL .............................................................. 3

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS ................................... 23

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS .................................. 26

V. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................ 28

VI. ANEXOS ............................................................................................................ 29

1
 PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO

TTULO: INGENIERA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES

EMPLEANDO UNA CEPA DE Pichia stipitis NRRL Y-7124, USANDO XILOSA

COMO FUENTE DE CARBONO

I. OBJETIVOS

1.1 Generales:

Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces,

empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y 7124, evalundose el

efecto de la fuente de carbono y la velocidad de agitacin en la cintica de

crecimiento y la produccin de etanol.

Determinar los parmetros cinticos de la cepa Pichia stipitis NRRL Y -

7124.

1.2 Especficos:

Disear el medio lquido de cultivo.

Activacin celular y desarrollo del inculo.

Determinar la cintica de crecimiento de la biomasa.

Determinar la cintica de consumo de la fuente de carbono.

Determinar la cintica de produccin de Etanol.

Determinar el , y los rendimientos del nutriente limitante en clulas

y en etanol, adems de las respectivas productividades en clulas y en

etanol.

Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cintica de crecimiento.

2
II. METODOLOGA EXPERIMENTAL

Antes de iniciar con el desarrollo experimental del cultivo del microorganismo,

es importante recalcar, cul ser la metodologa experimental a utilizar, a fin de

evitar problemas y/o errores experimentales, los mismos que podran darse en: las

tcnicas aspticas, en la obtencin de cultivos puros, en la preparacin de los

medios de cultivo, en las tomas de muestra, en el crecimiento del microorganismo,

entre otros factores.

Es necesario recordar que, cualquier medio de cultivo de levadura debe

proporcionar los requerimientos nutritivos bsicos, que incluyen: una fuente de

carbono, agua, una fuente de nitrgeno, fsforo, azufre, y varios minerales, como

el hierro, magnesio, cloro, entre otros. A este tipo de medio de cultivo se llama

definido o sinttico, porque se conoce exactamente su composicin qumica. Sin

embargo, en el trabajo de laboratorio rutinario, a menudo se emplean tambin

medios complejos. Por ejemplo, el extracto de levaduras y las peptonas (protenas

hidrolizadas). Estos materiales proporcionan una gran variedad de fuentes de

carbono, nitrgeno, fsforo y azufre en forma de pptidos y aminocidos; y una

mezcla de cofactores, como por ejemplo las vitaminas. Un caldo de cultivo es un

medio lquido en el que los componentes se disuelven simplemente en agua

destilada. La adicin de agar (un carbohidrato complejo extrado de algas marinas

da lugar a un medio slido). El agar es un agente solidificante ideal para los

medios microbiolgicos por sus propiedades reolgicas y porque no posee ningn

valor nutritivo para la inmensa mayora de bacterias y hongos. El agar slido

funde entre 90 100C, y se solidifica a unos 42C.

3
2.1. DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO

A la hora de disear un medio de cultivo no solo hay que tener en cuenta los

nutrientes sino tambin las condiciones fsicas que permitan el crecimiento de los

microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea producir.

Para la formulacin del diseo de cultivo se tiene en cuenta los siguientes

requerimientos nutricionales de la Pichia stipitis NRRL Y 7124.

Macronutrientes : C, N, Mg, S, K y P
Micronutrientes : Ca, Cl, Zn, Fe, Cu Co, B
pH : 4.5

2.1.1. Estado: Medio lquido

2.1.2. Volumen del medio: 30 40 % del volumen del fermentador
2.1.3. Temperatura: 30C
2.1.4. Velocidad de Agitacin: 240 rpm en shaker.
2.1.5. pH: 4.5
2.1.6. Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio de
cultivo definido.

Fuente de carbono
Xilosa
y energa
Fuente de N Sulfato de amonio (4 )2 4

Fuente de Mg y S Sulfato de magnesio heptahidratado 4 . 72

Fuente de K, P Fosfato dicido de potasio 2 4

4
 2.1.7. Solucin de sales concentradas

Fuente de Ca Cloruro de calcio dihidratado .

Fuente de Zn xido de zinc

Fuente de Fe Sulfato ferroso heptahidratado 4 . 72

Fuente de Cu Sulfato de cobre pentahidratado 4 . 52

Fuente de Co Cloruro de cobalto hexahidratado 2 . 62

Fuente de B cido brico 3 3

Fuente de Cl cido clorhdrico

COMPOSICIN DE MEDIOS DE MANTENCIN, ACTIVACIN Y

FERMENTACIN PARA Pichia stipitis NRRL Y 7124 PARA LA
PRODUCCIN DE ETANOL

Medio de Mantencin:
Tabla 1
Concentracin de Nutrientes para el medio de mantencin (50 mL)
PESO (g)
NUTRIENTE CONCENTRACIN (g/L) PARA 0.05L

Extracto de Levadura 3 0.15

Peptona 5 0.25

Extracto de Malta 3 0.15

Agar 20 1

5
 Medio de Activacin:
Tabla 2
Concentracin de Nutrientes para un medio de activacin (20 mL)
NUTRIENTE CONCENTRACIN (g/L) PESO (g)
PARA 0.02L
Xilosa 10 0.20
Extracto de 3 0.06
levadura
Extracto de malta 5 0.10
Solucin de sales 5(mL/L)

Medio de Fermentacin:
Tabla 3
Concentracin de Nutrientes para un medio de fermentacin (200mL)
(Para un volumen de medio = 40% del volumen del matraz)
(Volumen del matraz=500 mL)
(Para una concentracin celular final = 2 g/L)
NUTRIENTE CONCENTRACIN PESO (g)
(g/L) PARA 0.200 L
Xilosa 14 2.80
Extracto de levadura 3 0.60
( ) 3 0.60
2 0.40

. 1.1 0.22

Solucin de sales 5ml/L

Tampn citrato

Ph 4.5

6
Tabla 4
Composicin del medio mnimo de cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124 para un crecimiento en biomasa de 2.0g/L

ELEMENTO Compuesto Frmula % en clula % en compuesto YX/S (g/g) S0 (g/L) S0 (g/L)

C Xilosa C5H10O5 46.57 40 0.52 3.85 3.85

N Sulfato de amonio (NH4)2SO4 9.24 21.21 2.30 0.87 1.305

Mg Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4.7H2O 0.30 9.76 32.53 0.07 0.105

S Sulfato de amonio (NH4)2SO4 0.13 24.24 186.46 0.01 0.015

K Fosfato dicido de potasio KH2PO4 2.50 28.68 11.47 0.17 0.255

P Fosfato dicido de potasio KH2PO4 1.70 22.79 13.41 0.15 0.225

Solucin de sales concentradas

Tampn citrato; pH=4.5

Nota. El procedimiento de obtencin de los datos de la presente tabla se encuentra en los anexos.

7
Tabla 5
Solucin de sales concentradas (100 veces) para cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124 en base a su crecimiento de 2.0g/l

S0 S0
ELEMENTO Compuesto Frmula % en clulas % en compuesto ( )
(g/L) (g/L)
Ca Cloruro de calcio dihidratado CaCl2.2H2O 0.20 27.40 137 1.460 2.190

Cl cido clorhdrico HCl 0.01 97.22 9722 0.020 0.031

Zn xido de zinc ZnO 0.01 80.25 8025 0.025 0.037

Fe Sulfato ferroso heptahidratado FeSO4.7H2O 0.255 21.70 85.01 2.325 3.529

Cu Sulfato de cobre pentahidratado CuSO4.5H2O 0.01 25.30 2530 0.079 0.119

Co Cloruro de cobalto hexahidratado CoCl2.6H2O 0.01 24.89 2489 0.080 0.120

B cido brico H3BO3 0.01 17.74 1774 0.113 0.169

Nota. El procedimiento de obtencin de los datos de la presente tabla se encuentra en los anexos.

8
2.2. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

2.2.1. Preparacin del Medio de Mantencin, segn la Tabla 1, para el

cultivo de Pichia stipitis NRRL Y 7124, para la produccin de etanol.

Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composicin del medio de

mantencin para Pichia stipitis NRRL Y 7124.

Luego, de acuerdo a la Tabla 1 anterior se pesan las cantidades requeridas

de cada compuesto, con mucho cuidado, en la balanza analtica.

Medir en un vaso de precipitados primeramente con agua destilada para

diluir todos los compuestos pesados anteriormente.

Continuar agregando agua destilada hasta llegar a los 50 ml que se

requiere.

Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando

constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparicin de

la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos.

Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 7ml de la

mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, e inmediatamente

taparlos.

Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a presin,

previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de gases.

Calentar hasta que la temperatura alcance los 121C y a partir de ello

controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilizacin.

Ajustar las tapas de los tubos estando estos an dentro de la olla, luego

colocarlos en posicin inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

9
 Figura 1. Diagrama de flujo de la preparacin del Medio de Mantencin

Siembra en Medio de Mantencin:

- Materiales y equipos a utilizar:
Asa bacteriolgica
Tubo de ensayo con medio slido donde se encuentra el M. O.
Mechero Bunsen, trpode y rejilla.
- Procedimiento:
- Esterilizar los materiales y equipos a utilizar.
- Colocar el asa bacteriolgica en el mechero hasta que se torne roja,
luego enfriar.
- Flamear la boca del tubo de ensayo con el agar preparado previamente
y con el asa extraer la cepa.
- Sembrar en la superficie realizando la mayor cantidad de estras en la
superficie.
- Tapar el tubo de ensayo y repetir el mismo procedimiento con los dems
tubos.
- Incubar a 28C por 24 48 horas.

10
2.2.2. Preparacin del Medio de Activacin, segn la Tabla 2, para el cultivo
de Pichia stipitis NRRL Y 7124, para la produccin de etanol.
Pesar los componentes descritos en la Tabla 2.
Se esterilizan por separado el extracto de levadura y extracto de mal en un
tubo de ensayo (hasta 4 ml con agua destilada), la xilosa en un matraz de
125 ml (con 17ml. de agua destilada); esto para evitar la reaccin entre
estos dos componentes; y por ltimo las sales en otro tubo de ensayo (hasta
2.925 ml)
Disolver por separado los componentes. Tener listo el volumen de sales.
Con la ayuda de una micropipeta, agregar las sales minerales al matraz que
contiene el extracto de levadura.
Esterilizar a 121C por 15 minutos; mezclar con los dems componentes
en un ambiente asptico, para evitar la contaminacin.
Previamente a la esterilizacin ajustar el pH a 4.5.

11
Figura 2. Diagrama de flujo de la preparacin del Medio de Activacin
Activacin de la Cepa:
- Materiales y equipos:
Matraz de 125 ml
Algodn
Gasa
Agua destilada
Asa bacteriolgica
Shaker
Mechero Bunsen, trpode y rejilla

- Procedimiento:
- Esterilizar el asa bacteriolgica y el matraz con la flama del mechero.
- Enfriar el asa.
- Extraer con el asa la cepa de los tubos de resiembra preparados.
- Inocular los 30 ml de medio de mantencin preparados.
- Tapar con un tampn de algodn y gasa.
- Llevar al shaker a 28C y 220rpm por 24 horas.
- Notar el desarrollo y crecimiento en biomasa por la turbidez del medio.

2.2.3. Preparacin del Medio de Fermentacin, segn la Tabla 3, para el

cultivo de Pichia stipitis NRRL Y 7124, para la produccin de etanol.

Pesar los componentes descritos en la Tabla 3

Disolver completamente cada compuesto con agua destilada de la
siguiente manera:
Xilosa en un matraz de 0.5 L con 80 ml de agua destilada
(NH4)2SO4 en un matraz con 50 ml. de agua destilada
Solucin de sales, KH2PO4, (MgSO4).7H2O en un matraz con 50 ml de
agua destilada
Regular el pH de la solucin de xilosa 4.5
Esterilizar las diluciones por separado
Terminada la esterilizacin dejar enfriar y guardar en refrigeracin hasta
su posterior uso

12
Figura 3. Diagrama de flujo de la preparacin del Medio de Fermentacin

Preparacin de la Solucin de Sales: Segn Tabla 5

Figura 4. Diagrama de flujo de la preparacin de la Solucin de Sales

13
 Fermentacin de la Cepa:

Materiales y equipos
Matraz de 0.5 L conteniendo el medio de fermentacin
pH-metro
Gasa y algodn
Tubos de ensayo

Procedimiento:

- Esterilizar los materiales a utilizar.

- En un matraz de 0.5L, que contiene 180 ml de medio definido,

aadir los 20 ml de caldo (medio+biomasa) preparados
previamente.

- Mezclar y tomar 5 ml para el anlisis del biomasa y sustrato inicial.

- Tapar con un tapn de gasa y algodn.

- Llevar al shaker a 30C y 240rpm.

- Recoger y analizar muestras de 5 ml cada hora por 24 horas.

2.3. RESIEMBRA CELULAR (SOLIDO - SLIDO)

Para la resiembra se seguirn las tcnicas de asepsia utilizando un mechero

que mantenga el ambiente de trabajo estril.
El asa bacteriolgica se someter al fuego del mechero hasta alcanzar el rojo
vivo.
Se debe dejar enfriar por unos segundos; del tubo de ensayo que contena las
clulas desarrolladas en medio slido, se extrae una azada, se flamea el tubo
para cerrarlo.
El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos preparados con
medio slido (con agar).
La azada se coloca en el tubo desde adentro hacia fuera.
Se llevan a la incubadora a 30 C durante 48 horas.

14
2.4. CULTIVO DEL MICROORGANISMO
Despus de la inoculacin de una porcin de medio con unas pocas clulas,
transcurre un perodo de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una
velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una
intensa actividad metablica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de
poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanz una velocidad constante de
crecimiento se dice que est en la fase exponencial debido a que el nmero de
clulas se puede expresar como funcin de 2n, donde n es el nmero de ciclos de
duplicacin experimentado por la poblacin.

2.5. ACTIVACIN CELULAR Y DESARROLLO DEL INCULO

Se llevar a cabo la activacin del microorganismo, bajo estrictas normas de
asepsia, siguiendo el protocolo establecido por el laboratorio:

- Para la inoculacin partimos con la cepa incubada en medio slido Pichia

stipitis NRRL Y 7124.

- Se toma una azada y se inocula en el matraz con los 20 ml del medio de

activacin

- Se tapa el tubo con un tapn de gasa y algodn.

- Se lleva al Shaker a 240 rpm, T = 30 C y un t = 12min hasta alcanzar un

desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del
medio.

- El procedimiento de inoculacin se har por duplicado es decir 2 azadas.

2.6. INOCULACIN AL MEDIO DE FERMENTACIN

Inocular los 20 ml de caldo (medio rico + biomasa) a un matraz de 0.5L
conteniendo 180 ml de medio definido. A partir de este paso se determinar la
cintica de crecimiento de la biomasa.
Inmediatamente despus, se extrae una muestra de 5 ml del caldo y medir X0
y S0 con D.O.
Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido del
mechero.

15
 La toma de muestras se inicia desde la dilucin del medio de activacin en el
medio de fermentacin.
Estas se realizarn cada hora y media para la primera muestra y posteriormente
cada hora de la siguiente manera:
Se extrae 5 mL del medio de cultivo, 3 mL se le agrega al tubo del

espectrofotmetro y el resto se le agrego al tubo de centrifugado.

Se mide su absorbancia a 640 nm y pH; luego se devuelve al tubo de

centrifugado para completar los 5 ml y se centrifuga a la mxima velocidad

por 20 minutos; el sobrenadante se vierte a los viales y se guarda en el

refrigerador con el fin de despus determinar el consumo de sustrato.

2.7. MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL

2.7.1. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES: MTODO

DEL DNS (CIDO DINITROSALICLICO)

La preparacin del reactivo DNS requiere de lo siguiente:

10 g/l de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS)

200 ml/l de NaOH 2N

300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en

aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el cido

DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se

agita hasta la completa disolucin de todos los componentes, para

posteriormente aforar hasta un litro.

16
 Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra:

1.- Se aade un volumen del reactivo DNS a un volumen de

muestra a analizar.

2.- Se mantiene la mezcla en un bao de agua a ebullicin durante

5 minutos para luego dejar enfriar.

3.- Se aaden 10 volmenes de agua destilada.

4.- Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.

5.- La concentracin se obtiene interceptando la medida de

absorbancia en la curva de calibrado.

La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de

muestras de concentracin conocida y analizadas segn este

procedimiento.

2.7.2. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN CELULAR POR

DENSIDAD PTICA (D. O.)

El mtodo se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse

la concentracin de microorganismos, esto puede ser detectado fcilmente

por espectrofotometra a 640 nm. Para esta determinacin es necesario que

previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las

concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por

peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:

17
 1. Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a

5000 rpm durante 20 minutos.

2. Se elimina el sobrenadante y se re-suspende el centrifugado con

agua destilada.

3. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de

eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la

determinacin.

4. Se elimina el sobrenadante, se re-disuelve el precipitado y se seca

en la estufa a 80C hasta peso constante.

2.7.3. DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CRECIMIENTO DE LA

BIOMASA.

Materiales y equipos
Matraz de 0.5 L conteniendo el medio de fermentacin
Espectrofotmetro
pHmetro
Gasa y algodn
Centrifuga
Tubos de ensayo
Capachos de papel aluminio

Procedimiento: Al inicio y cada hora por 10 horas se realizar lo

siguiente

EXTRAER 5ml del medio de cultivo

SEPARAR 3ml para el tubo de espectrofotmetro y el

resto se le agreg al tubo de centrifugado.

MEDIR Absorbancia a 640nm y pH

18
 COMPLETAR 5ml en el tubo de centrifugado, se devuelve.

CENTRIFUGAR A la mxima velocidad por 20 minutos

El sobrenadante en viales y ponerlos en

VERTER Y GUARDAR refrigerador

Utilizando la ecuacin ln(X/ X0) = t, se determinan distintos valores de

.
Tabular Si vs. i
Con la ecuacin 1/ = 1/m + (KS/ m) 1/S, se grafica. La intercepcin
con el eje y ser el valor de 1/m siendo su inversa el valor de m, adems
la pendiente m= KS/ m conocido anteriormente m determinamos KS.
dX / dt = m X .()
X = X0 e mt

2.7.4. DETERMINACIN DE ETANOL POR CROMATOGRAFA DE

GASES:

a) Reactivos y soluciones
etanol
propanol

b) Procedimiento:

Preparacin de 50 ml de solucin patrn de etanol a 6 g/l

Concentracin de solucin patrn de etanol = 6 g/l

Volumen solucin patrn etanol a 6 g/l =50 ml

Volumen solucin etanol 99.7%=0.3809

19
 Preparacin de 50 ml de solucin patrn de propanol a 4 g/l

Concentracin de solucin patrn propanol = 4 g/l.

Volumen solucin patrn etanol a 4 g/l =50 ml

Volumen solucin etanol 99.5% = 0.2487 ml

Estndar interno

Anlisis cromatogrfico

a. Instalar una columna capilar RTx-20 utilizando frulas de grafico para

asegurar conexiones hermticas.
b. Encender el cromatgrafo de gases, abrir la vlvula de gas portador
(helio) y regular cuidadosamente su flujo.
c. Ajustar las condiciones cromatogrficas.

Concentracin Vol. Vol. Vol.

(g/l) Etanol Propanol H2 O
(ml) (ml) (ml)
3 5 5 0
2.1 3.5 5 1.5
1.2 2 5 3
0.6 1 5 4
0 0 5 5

d. Abrir las vlvulas de otros gases, primero el aire luego el hidrogeno.

e. Con una solucin de jabn o detergente. Verificar fugas de gases en
todas las conexiones.
f. Encender el detector y obtener una lnea de base estable.

Condiciones cromatogrficas
T inicial del horno 55 C
T final del horno 120 C
Tiempo inicial 3 min
Tiempo final 2 min

20
 Velocidad de calentamiento 10 C/min (RATE= rampa)
T inyector 200 C
Volumen de inyeccin 1l
Modo de inyeccin Split
Radio Split 300
Velocidad inicial 32.9 cm/seg
Luego de establecidas las condiciones cromatogrficas, se procede a la
determinacin de los parmetros de estudio

2.7.5. DETERMINACIN DE PARMETROS CINTICOS:

Preparar 8 tubos de ensayo con diferentes concentraciones de xilosa; para

ello, diluir y utilizar la curva de calibracin para azcares reductores,

determinando as la concentracin en cada matraz.

Inocular los matraces con 1ml e incubar.

Utilizando la curva de calibracin determinar a cabo de tiempos

determinados la concentracin final de las clulas.

Utilizando el modelo de Michaelis-Menten.

( ) =

Determinamos los valores de

Tabular S vs .

Ks
1 1 ( )
m
Con la ecuacin: = + graficar y con la pendiente determinar
m s

Conocido el M se determina Ks.

2.8. PROGRAMA DE MUESTREOS

21
 CRECIMIENTO CELULAR:

CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

Plan de Muestreos y Registro de Datos

Grupo: __________________________________ Da: ___ /___ / ___

Da de la experiencia: __________________________________

Microorganismo: _______________ Fuente Carbono: _______________

PH0: _______ TC _______ N rpm _______

Nombre del
N HORA TIEMPO Absorbancia alumno Observaciones
(Horas) (640 nm)
01 0 Todos

22
III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

Material Biolgico: Cepa liofilizada de Pichia stipitis NRRL Y-7124

PREPARACIN DE SLIDO DE MANTENCIN:

Materiales y Equipos:
Balanza analtica
Matraz Erlenmeyer de 250 ml
Mechero Bunsen
Gradilla
6 Tubos de ensayo con tapas
Pipeta de 10 ml
Vaso de precipitado
Cocina a gas
Olla a presin
Varilla de vidrio
Guantes
Esptula

Reactivos y nutrientes:
Agua destilada
Extracto de levadura
Peptona
Extracto de malta
Agar

PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:

Materiales y Equipos:
Balanza analtica
2 Matraces de 125 ml
Una probeta de 100ml
Micropipeta

23
 Estufa
Algodn
Gasa
Varilla de vidrio
Esptula

Reactivos y nutrientes:
Xilosa
Extracto de levadura
Solucin de sales
Agua destilada
Alcohol

PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN:

Materiales y Equipos:
Matraz de 500 ml
2 Matraces de 125 ml
Varilla de vidrio
Balanza analtica
Gasa y algodn
Olla a presin

Reactivos y nutrientes:
Xilosa
(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4.7H2O
Solucin de sales
Extracto de Levadura
Agua destilada
Alcohol

24
 INOCULACIN AL MEDIO DE ACTIVACIN:
Materiales y equipos
Matraz de 125 ml
Algodn
Gasa
Agua destilada
Asa bacteriolgica
Shaker
Mechero Bunsen
Trpode
Rejilla

DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES: MTODO

DEL DNS (CIDO DINITROSALICLICO)
Materiales y equipos
Espectrofotmetro
Agitador magntico
Mechero Bunsen
Balanza analtica
Esptula
Papel aluminio - capachitos
2 vasos de precipitados de 1 litro
Matraz aforado de 1 litro
Pipeta
Gradilla

Materiales y equipos
10 g/l de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS)
200 ml/l de NaOH 2N
300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Sacarosa estndar

25
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS

DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE

Pichia stipitis NRRL Y-7124
FECHA ACTIVIDAD
02/05/17 Presentacin del pre-informe.
05/05/17 Tcnicas de asepsia, de esterilizacin de
medios, materiales de vidrio y equipos.
Mantenimiento de cepas microbianas.
12/05/17 Preparacin de reactivos y medios de
mantencin.
Resembrado de clulas.
Obtencin de curvas de calibrado de los
mtodos analticos.
19/05/17 Preparacin de medios para el inculo.
Cultivo de medio rico.
Preparacin de medios para la cintica celular
microbiana.
26/05/17 Seguimiento de la cintica de cultivo celular
por lotes.
30/05/17 Presentacin y sustentacin del informe final.

26
PROGRAMACIN DE CINTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES:
HORARIO
ACTIVIDAD
INICIO TRMINO
- Preparacin de materiales de
trabajo para la inoculacin en 7:30 a.m. 8:00 a.m.
el medio de activacin y medio
de cultivo rico para la cintica
de fermentacin.
- Inoculacin de la levadura 8:00 a.m. 8:10 a.m.
Pichia stipitis NRRL Y-7124
desde la cepa en agar al medio
de activacin.
- Tiempo de referencia para que 8:10 a.m. 11:10 a.m.
se lleve a cabo la activacin del
inoculo en el medio de
activacin.
- Inoculacin de medios para 11:10 a.m. 11:30 a.m.
cintica de fermentacin.
- Seguimiento de la cintica de 11:40 a.m. 7:40 p.m.
fermentacin a cada hora
(registro de datos)

27
V. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap (2009) Biologa de los

microorganismos (2009), Duodcima Edicin, Editorial Pearson.

Joao Paulo A. Silva, Solange I. Mussatto, Ines c. Roberto, Jos a. Teixeira, (2011)

Fermentation mdium and oxygen transfer conditions that maximize the

xylose conversin to etanol by Pichia stipitis.

Castillo, A. (2016) Cintica de procesos fermentativos, mdulo de clase UNS.

Castillo, A. (2016) Balance de materia, diseos de medios y evaluacin en

bioprocesos, mdulo de clase UNS.

28
VI. ANEXOS

CLCULOS PARA EL DISEO DEL MEDIO DE FERMENTACIN

% del elemento en clula

Frmula del microorganismo: CH1.79 O0.60 N0.17

Peso molecular:
C: 12 = 12 +
H: 1 1.79 = 1.79
O: 16 0.60 = 9.60
N: 14 0.17 = 2.38

25.77
Peso molecular: 25.77 g/mol

% de Carbono en clula % de Nitrgeno en clula

25.77 100% 25.77 100%

12 2.38

12 100 2.38 100

= =
25.77 25.77

= . % = . %

El valor del resto de elementos se sac de la siguiente tabla:

Tabla 6
Composicin qumica de las clulas microbianas
% EN PESO, BASE SECA
ELEMENTO
BACTERIAS LEVADURAS MOHOS
Carbono 46 - 53 46-51 45 - 55
Hidrgeno 6.5 - 7.5 6-8 8 - 12
Oxgeno 18 - 32 28-35 18 - 24
Nitrgeno 10 - 14 6-10 3-7
Magnesio 0.1 - 0.5 0.1-0.5 0.1 - 0.3
Fsforo 2.0 - 3.0 0.8-2.6 0.4 - 4.5
Azufre 0.1 - 1.0 0.01-0.24 0.1 - 0.5
Calcio 0.01 - 1.1 0.1-0.3 0.1 - 1.4
Potasio 1.0 - 4.5 1.0-4.0 0.2 - 2.5
Hierro 0.02 0.2 0.01-0.5 0.1 - 0.2

29
 COMPUESTO
Protenas 45-60 35-45 25 - 40
Carbohidratos 6-15 30-45 40 - 55
Lpidos 5-10 5-10 5 - 10
cidos nucleicos 15-25 5-15 2 - 10
Cenizas 4-10 4-10 4 - 10

Nota. Recuperado de Balance de materia, diseo de medios y evaluacin de cultivos en

Bioprocesos. (Castillo, A., 2016)

0.1+0.5
% de Magnesio en clula: = 0.30%
2

0.01+0.24
% de Azufre en clula: = 0.13%
2

1.0+4.0
% de Potasio en clula: = 2.50%
2

0.8+2.6
% de Fsforo en clula: = 1.70%
2

0.1+0.3
% de Calcio en clula: = 0.20%
2

0.01+0.5
% de Hierro en clula: = 0.255%
2

Para el resto de elementos, tales como: Cl, Zn, Cu, Co, B; se consider un
porcentaje del elemento en clula de 0.01%.

30
% del elemento en compuesto:

Xilosa % de carbono

Frmula: C5 H10 O5 150 100%

60
Peso molecular:
C: 12 5 60 100
=
= 60 + 150
H: 1 10 = 10
= %
O: 16 5 = 80

150 /

Sulfato de amonio

Frmula: (4 )2 4 % de nitrgeno

Peso molecular: 132 100%

C: 14 2 = 28 + 28
H: 1 8=8
28 100
S: 32 = 32 =
132
O: 16 4 = 64
= . %

132 /

Sulfato de magnesio
heptahidratado
% de magnesio
Frmula: 4 . 72
246 100%
Peso molecular: 24
Mg: 24 = 24 +
24 100
S: 32 = 32 =
246
O: 16 11 = 176
= . %
H: 1 14 = 14

246 /

31
 O: 16 4 = 64

132 /

Sulfato de amonio
% de azufre
Frmula: (4 )2 4
132 100%
Peso molecular:
32
C: 142
= 28 + 32 100
=
H: 1 8=8 132
S: 32 = 32
= . %

Fosfato dicido de potasio

Frmula: 2 4 % de potasio

Peso molecular: 136 100%

39
K: 39 = 39 +
H: 1 2 = 2 39 100
=
P: 31 = 31 136
O: 16 4 = 64 = . %

136 /

Fosfato dicido de potasio

Frmula: 2 4 % de potasio

Peso molecular: 136 100%

31
K: 39 = 39 +
H: 1 2 = 2 31 100
=
P: 31 = 31 136
O: 16 4 = 64
= . %

136 /

32
Sales:

1) Ca: cloruro de calcio dihidratado CaCl2.2H2O

CaCl2.2H2O = 146

%COMPUESTO:
146 100%
40
= . %

2) Zn: xido de zinc ZnO

ZnO = 81

%COMPUESTO:
81 100%
65
= . %

3) Fe: sulfato ferroso heptahidratado FeSO4.7H2O

FeSO4.7H2O = 278

%COMPUESTO:
278 100%
56
= . %

4) Cu: sulfato de cobre pentahidratado CuSO4.5H2O

CuSO4.5H2O = 249

%COMPUESTO:
249 100%
63
= . %

5) Co: cloruro de cobalto hexahidratado CoCl2.6H2O

CoCl2.6H2O = 237

%COMPUESTO:
237 100%
59
= . %

33
 6) B: cido brico H3BO3

H3BO3 = 62

%COMPUESTO:
62 100%
11
= . %

7) Cl: cido clorhdrico HCl

HCl = 36

%COMPUESTO:
36 100%
35
= . %

Clculo de los rendimientos:

% %
/ = / =
% %

Solo para la fuente de carbono y energa:

f: metabolismo aerobio (0.5-0.6)
metabolismo anaerobio (aprox. 0.1)

Carbono: 28.68
/ = = .
2.5
40
/ = 0.6 = . Nitrgeno:
46.57

21.21
/ = = .
9.24
Magnesio:

9.76
/ = = . Azufre:
0.3

24.24
/ = = .
0.13
Potasio:

34
Fsforo: 22.79
/ = = .
1.7
Sales:

1) Ca: cloruro de calcio dihidratado CaCl2.2H2O

27.4
= =
0.2

2) Zn: xido de zinc ZnO

80.25
= =
0.01

3) Fe: sulfato ferroso heptahidratado FeSO4.7H2O

21.7
= = .
0.255

4) Cu: sulfato de cobre pentahidratado CuSO4.5H2O

25.3
= =
0.01

5) Co: cloruro de cobalto hexahidratado CoCl2.6H2O

24.89
= =
0.01

6) B: cido brico H3BO3

17.74
= =
0.01

7) Cl: cido clorhdrico HCl

97.22
= =
0.01

35
Clculo de la concentracin de sustrato inicial:

( )
0 = +
/

Donde:

0 y 0 0 ; = 2 /

Carbono:

(2 0) Nitrgeno:
0 = 0 +
0.52
(2 0)
= . 0 = 0 +
2.30

= .

Magnesio:

(2 0) Azufre:
0 = 0 +
32.53
(2 0)
0 = 0 +
= . 186.46

= .

Potasio:

(2 0) Fsforo:
0 = 0 +
11.47
(2 0)
= . 0 = 0 +
13.41

= .

36
Nutriente limitante:

0 = 0

Donde:

= 1, cuando el nutriente es limitante

= 1.5 2, cuando el nutriente no es limitante

Carbono:

0 = 3.85 1 = . /

Nitrgeno:

0 = 0.87 1.5 = . /

Magnesio:

0 = 0.07 1.5 = . /

Azufre:

0 = 0.01 1.5 = . /

Potasio:

0 = 0.17 1.5 = . /

Fsforo:

0 = 0.15 1.5 = . /

37
Determinacin de la concentracin de sustrato inicial " " de las sales:

=
/
= / ; = / = /

1. Ca
2
0 = 1.5100 = . /
137

2. Cl
2
0 = 1.5100 = . /
9722

3. Zn
2
0 = 1.5100 = . /
8025

4. Fe
2
0 = 1.5100 = . /
85.01

5. Cu
2
0 = 1.5100 = . /
2530

6. Co
2
0 = 1.5100 = . /
2489

7. B
2
0 = 1.5100 = . /
1774

38