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LABORATORIO INGENIERIA

DE BIOPROCESOS

INGENIERA DEL CULTIVO CELULAR POR


INTEGRANTES:
LOTES EMPLEANDO Pichia stipitis NRRL Y- ANASTACIO JUAREZ JORGE
BARCO JARA MELISSA
7124, UTILIZANDO GLUCOSA Y XILOSA FERNANDEZ SOLORZANO CELESTE
COMO FUENTE DE CARBONO GAMBINI ARROYO RICARDO
HUAMAN LIAN LUCY

GRUPO C-3
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE AGROINDUSTRIA
ESCUELA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

NDICE

I.OBJETIVOS:.................................................................................................... 3

II.METODOLOGA EXPERIMENTAL: ............................................................... 4

III.MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS ...................................... 27

IV.CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS .................................... 43

V.REFERENCIAS BIBILIOGRFICAS ........................................................... 43

VI. ANEXOS, CLCULOS: .............................................................................. 45

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TTULO: INGENIERA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES


EMPLEANDO Pichia stipitis NRRL Y-7124, UTILIZANDO GLUCOSA Y XILOSA
COMO FUENTE DE CARBONO
I. OBJETIVOS:

1.1. OBJETIVOS GENERALES:

Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por


lotes en matraces, empleando una cepa de Pichia stipitis
NRRL Y-7124, evalundose el efecto de la fuente de
carbono de la mezcla de xilosa y glucosa y la velocidad de
agitacin en la cintica de crecimiento y la produccin de
etanol.

1.2. OBJETIVOS ESPECFICOS:

- Disear y preparar el medio liquido de cultivo.


- Lograr la activacin celular y desarrollo del inoculo.
- Determinar la cintica de crecimiento de la biomasa.
- Determinar la cintica de consumo de la fuente de carbono.
- Determinar la cintica de generacin de etanol.
- Determinacin del , y los rendimientos del nutriente
limitante en clulas y en etanol, adems de las respectivas
productividades en clulas y etanol.
- Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cintica.

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II. METODOLOGA EXPERIMENTAL:

2.1. DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO:


El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la
eleccin de los componentes necesarios para lograr el crecimiento
y la formacin de productos correspondientes al proceso a
desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos
aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los
sustratos a ser empleados como son los requerimientos
nutricionales del microorganismo y algunos especficos del
proceso.

Para la formulacin del diseo de cultivo se tiene en cuenta los


siguientes requerimientos nutricionales para el cultivo Pichia stipitis
NRRL Y-7124.

Para el Diseo del medio de cultivo:


Macronutrientes: C, N, Mg, K y P
Micronutrientes: Zn,Ca,Fe,Cu,Co y Mn
PH: 4,5
Estado: Medio Liquido
Temperatura: 30C
Velocidad de agitacin(Shaker): 240 rpm
Volumen del medio: 30%-40% del volumen del
fermentador

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Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio


de cultivo mnimo.

Fuente de carbono y energa


xilosa y glucosa
Fuente de N
Sulfato de amonio
Fuente de Mg y S
Sulfato de magnesio heptahidratado
Fuente de K
Fosfato dicido de Potasio
Fuente de P
Fosfato dicido de Fosforo


= 2

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COMPOSICIN DE MEDIOS DE MANTENCIN, ACTIVACIN Y


FERMENTACIN PARA Pichia stipitis NRRL Y 7124 PARA LA
PRODUCCIN DE ETANOL
2.1.1. Medio Slido De Mantencin (Pgy- Agar)
Tabla 01: Concentracin de Nutrientes para el medio de
mantencin (50mL)

Nutriente Concentracin Peso (g)


(g/L)
Extracto de levadura 3 0.15
Peptona de casena 5 0.25
Agar 20 1
Extracto de malta 3 0.15

2.1.2. Medio Activacin:


Tabla 02: Concentracin de Nutrientes para el medio de
activacin (15 mL)

Nutriente Concentracin Peso


(g/l) (g)
Xilosa 10 0.15
Extracto de 3 0.045
levadura
Extracto de 5 0.075
malta
Solucin de 5 ml/L 0.075 ml
sales

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2.1.3. Medio De Fermentacin


Para un volumen de medio: 30% - 40% del volumen del matraz.
Para una concentracin final: 2 g/l.
Tabla 03: Concentracin de Nutrientes para el medio de
fermentacin (200 ml)

Nutriente Concentracin Peso (g)


(g/L)
Glucosa 5 1
Xilosa 4.66 0.932
Extracto de 3 0.6
Levadura
(NH4)2SO4 0.87 0.174
KH2PO4 0.17 0.034
MgSO4.7H2O 0.06 0.012
Solucin de 5 mL 1mL
sales
100mL 20mL
Tampn Citrato
Ajustar pH 4.5
T 30C, N 240 RPM

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2.1.4. Tabla 04: Nutrientes Para El Medio De Fermentacin

Elemento Compuesto Nutriente P.M. % en % en Yx/s So S'o


Clula Nutriente (g/g) (g/l) (g/l)
C Xilosa C5H10O5 150 46.57 40 0.429 4.66 4.66
C Glucosa C6H12O6 180 46.57 40 0.429 5 5
N Sulfato de amonio (NH4)2SO4 132 9.24 21.21 2.30 0.87 1.305
S Sulfato de amonio (NH4)2SO4 132 0.13 24.24 186.46 0.01 0.015
K Fosfato dicido de potasio KH2PO4 136 2.5 28.68 11.47 0.17 0.255
P Fosfato dicido de potasio KH2PO4 136 1.7 22.79 13.41 0.15 0.225
Mg Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 246 0.3 9.76 32.53 0.06 0.09
S Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 246 0.13 13.01 100.08 0.02 0.03
Nutriente Limitante: Glucosa
NOTA: El nutriente limitante es la glucosa, debido a que tiene menor afinidad y concentracin con el
microorganismo pichia stipitis NRRL Y-7124, por ello trabajaremos con la xilosa para poder hallar los datos
orrespondientes, ya que tiene mayor afinidad y concentracin con el microorganismo.

=8.25(teorico)
Tiempo de fermentacin: 12 horas
2.1.5. Tabla 05: Sales Para El Medio De Fermentacin

Elemento Compuesto Nutriente P.M. % en % en Yx/s So S'o


(g/mol) Clula Nutriente (g/g) (g/L) (g/L)
Ca Cloruro de calcio dihidratado CaCl2H2O 146 0.20 27.40 137 0.014 0.021

Zn xido de Zinc ZnO 81 0.01 80.25 8025 0.003 0.005

Fe Sulfato ferroso heptahidratado Fe2SO4.7H2O 278 0.255 21.70 85.01 0.024 0.036

Cu Sulfato de cobre pentahidratado Cu2SO4.5H2O 249 0.01 25.30 2530 0.008 0.012

Co Cloruro de Cobalto hexahidratado CoCl2.6H2O 237 0.01 24.89 2489 0.008 0.012

B cido brico H3BO3 62 0.01 17.74 1774 0.001 0.002

H cido clorhdrico HCl 36 0.01 97.22 9722 0.002 0.003


2.2. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO:
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de
fermentacin es una etapa fundamental para asegurar la
productividad de los mismos.
Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de
naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos
ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de
formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis
de metabolitos y para el mantenimiento celular.

2.2.1. Condiciones de Asepsia: Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la


tcnica asptica se utiliza para prevenir la introduccin de organismos
adicionales al cultivo.
Se inicia rotulando los matraces que se van a utilizar,
colocando el nombre de la cepa, fecha y el nombre del
grupo
Luego se enciende el mechero bunsen previamente
desinfectado el rea de trabajo con alcohol de 96
Despus sostener los matraces, si estos tienen un
tampn de algodn, debemos aflojarlos un poco de
manera que no est muy apretado
Se flamea la boca de ambos matraces para matar
cualquier microorganismo presente en el rea y que
pueda contaminar en la prctica
Continuamente debemos retirar, tapando con el
meique.
Seguidamente debemos flamear la boca de ambos
matraces
Despus debemos mantener una posicin inclinada
para que el riesgo de contaminacin sea mnimo
Sembrar el inoculo en el matraz estril.
Luego se flamea la boca de los matraces y se tapan de
nuevo.
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Se mezcla el inoculo en los matraces de caldo


sembrado.
Flamear los tapones antes que los coloques en los
matraces.
Esquema 01
ROTULAR Matraz
-Nombre de cepa.
-Fecha.
Mechero bunsen Nombre del grupo.
ENCENDER

SOSTENER
Los Matraces

FLAMEAR

RETIRAR

FLAMEAR

Posicin inclinada (riesgo de


MANTENER contaminacin sea mnimo)

SEMBRAR Matraz estril

FLAMEAR

MEZCLAR

FLAMEAR
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2.2.2. Preparacin del medio de mantencin, segn la TABLA 01 para el


cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124:

Para la preparacin del medio de mantencin, primero se pes las cantidades que nos indica
la tabla 01 en una balanza analtica. Luego, en un vaso precipitado se ech agua destilada
para diluir de esa manera los compuestos agregadis en el matraz, se agreg agua hasta llegar
a 50 ml. Se encendi el mechero bunsen, y se calent la mezcla diluida agitando
constantemente con una varilla por un minuto (aparicin de la primera burbuja). Se prepar
6 tubos de ensayos (con sus tapas respectivas) y con ayuda de una pipeta de 10ml, se agreg
7 ml de la mezcla en cada tubo de ensayo, finalmente taparlos. Se coloc los tubos de ensayo
en un vaso precipitado y se llev a una olla presin ( autoclave), as tambin aflojar las tapas
dentro de la olla de presin para que nos permita el intercambio de gases. Se calent hasta
que la temperatura alcance 121C, y se control 15 a 20 minutos. Finalmente se dej reposar
a Temperatura ambiente.

2.2.3. Preparacin del medio de activacin, segn la TABLA 02 para el cultivo


de Pichia stipitis NRRL Y-7124.

Pesamos las cantidades exactas de los componentes para


el medio.
Luego se esterilizar por separado: Extracto de levadura en
un matraz, xilosa en un matraz de 125 ml, las sales en un
tubo de ensayo, luego disolvemos por separado los
componentes, alistamos el volumen de las sales minerales,
despus agregamos en un matraz que contiene el extracto
de levadura con la ayuda de a micro pipeta ya que son
pequeas cantidades, se ajusta el PH a 7 de la solucin que
contiene glucosa y xilosa. Se esteriliza a una temperatura
de 121 C en un tiempo de15 min. Luego se coloca los
dems componentes en un ambiente asptico para as
poder evitar la contaminacin.

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Esquema 03

Componentes para el medio


PESAR
de la tabla N02

ESTERELIZAR

DISOLVER

ALISTAR

Sales minerales
AGREGAR

EL pH a 7
AJUSTAR

ESTERELIZAR 121C 15 min.


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MEZCLAR

2.2.4. Preparacin del medio de fermentacin, segn la TABLA 03 para el


cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124.

Procedimiento

a. Pesar los componentes descritos en la Tabla 3


b. Disolver completamente cada compuesto con agua destilada
de la siguiente manera:
Xilosa en un matraz de 0.5 L con 80 ml de agua destilada
(NH4)2SO4 en un matraz con 50 ml. de agua destilada
Solucin de sales, KH2PO4, (MgSO4).7H2O en un matraz
con 50 ml de agua destilada
c. Regular el pH de la solucin de xilosa 4.5
d. Esterilizar las diluciones por separado
e. Terminada la esterilizacin dejar enfriar y guardar en
refrigeracin hasta su posterior uso

Esquema 04

Componentes para el medio PESAR


de la tabla N03 14

DISOLVER
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Esquema 4: Proceso de preparacin del medio de cultivo


2.3. CULTIVO DEL M.O, MONTAJE
para DEL EQUIPO
fermentacin

EXPERIMENTAL, ETC.
2.3.1. Resiembra celular (Solido - slido)

a. Materiales y equipos:
Aza bacteriolgica
Tubo de ensayo con medio slido donde se encuentra el M.O.
Mechero Bunsen, trpode y rejilla.

b. Procedimiento:

1) Para la resiembra se seguirn las tcnicas de asepsia


utilizando un mechero que mantenga el ambiente de trabajo
estril.
2) El asa bacteriolgica se someter al fuego del mechero hasta
alcanzar el rojo vivo.
3) Se debe dejar enfriar por unos segundos; del tubo de ensayo
que contena las clulas desarrolladas en medio slido, se
extrae una azada, se flamea el tubo para cerrarlo.

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4) El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos


preparados con medio slido (con agar).
5) La azada se coloca en el tubo desde adentro hacia fuera.
6) Se llevan a la incubadora a 30 C durante 48 horas

Esquema 05

ESTERILIZAR

COLOCAR

SOMETER

ENFRIAR

EXTRAER

RESEMBRAR

REALIZAR

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LLEVAR A la Incubadora a 30C
durante 24 a 48 horas.
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Esquema 5: Proceso de resiembra en medio Solido


Liquido

2.3.2. Activacin celular y desarrollo del inculo

a. Materiales y equipos:
Matraz de 125 ml.
Algodn
Gasa
Agua destilada
Aza bacteriolgica
Shaker
Mechero Bunsen, trpode y rejilla
b. Procedimiento:

Tomar una azada de la cepa incubada en medio slido


Pichia stipitis NRRL Y-7124
Inocular en el Matraz con los 30ml del medio de activacin
Luego tapamos el matraz con un tapn de gasa y algodn
Llevamos al Shaker a 240rpm, T = 30 C.. Hasta alcanzar un
desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento
en la turbidez del medio

Esquema 06
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TOMAR

INOCULAR

TAPAR

Al Shaker a
LLEVAR 240rpm, T = 30 C

2.3.3. Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa


(ESPECTOFOTOMETRO)
a. Materiales y equipos
Matraz de 500mL conteniendo el medio de fermentacin
Espectrofotmetro
Algodn
Papel aluminio
Mechero Bunsen
Asa bacteriolgica
Pipetas esterilizadas
Pipetas entre 100-1000L
Papel film
Tijera
Centrifuga
Tubos de ensayo
Capachos de papel aluminio
b. Procedimiento:

Primero incubamos 30ml de caldo (medio rico + biomasa) a un matraz


de 1L contenido 270ml de medio definido.

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A partir de este momento se determinar la cintica de crecimiento


de la biomasa.
Extraemos una muestra de 5 ml de caldo.
Se mide X0 y S0 con D.O

Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido


del mechero.
La toma de muestras se inicia desde la dilucin del medio de
activacin en el medio de fermentacin.
Estas se realizarn cada hora y media para la primera muestra y
posteriormente cada hora de la siguiente manera:
- Extraemos 5 ml del medio de cultivo, luego separamos 3 ml
para el tubo de espectrofotmetro y el resto se le agreg al
tubo de centrifugado.
- Medimos la absorbancia a 640 nm y PH.
- Completamos 5ml en el tubo de centrifugado, se devuelve.
- Centrifugamos a la mxima velocidad por 20 minutos.
- Verter y guardar el sobrenadante en viales y ponerlos en
refrigerador con el fin de despus de determinar el consumo
del sustrato.

Esquema 07

INOCULAR

EXTRAER

MEDIR

EXTRAER

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SEPARAR
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2.3.4. Determinacin de la concentracin celular por D.O

a. Materiales y equipos:
Espectrofotmetro.
Centrfuga.
Estufa.

b. Reactivos:
Muestra del medio.
Agua destilada.

c. Procedimiento:

Tomar una muestra de volumen conocido


Centrifugar a 5000 rpm durante 20 minutos.

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Eliminar el sobrenadante y se re-suspende el centrifugado con


agua destilada.
Volver a centrigugar nuestra muestra con las mismas
condiciones para eliminar restos del sustrato que puediera
alterar la determinacin.
Eliminar el sobrenadante, se re-disuelve el precipitado y se deja
secar en la estufa a 80C hasta peso constante.

Esquema 07

TOMAR MUESTRA

5000 rpm ; Tiempo: 20


CENTRIFUGAR

RESUSPENSER

ELIMINAR

5000 rpm ; Tiempo: 20


a fin de eliminar restos de
CENTRIFUGAR
sustrato que pudieran alterar la
NUEVAMENTE determinacin.

ELIMINAR 21
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REDISOLVER

SECAR Estufa: 80 C
hasta peso constante

2.3.5. Determinacin de azcares reductores: mtodo del DNS (cido


dinitrosaliclico)

a. Materiales y equipos:
Espectrofotmetro.
Agitador magntico.
Mechero bunsen.
Balanza analtica
Esptula.
Papel aluminio capachitos.
2 Vasos de precipitado de 1 litro
Matraz de aforo de 1 litro.
Pipeta.
Gradilla.
b. Reactivos:

10 g /L de cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)

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200 mL / L de NaOH 2N
300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Sacarosa Estndar

c. Procedimiento:
Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en
aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se
disuelve el cido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un
matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolucin
de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un
litro.
Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la
muestra.

1. Preparar 7 tubos con tapa y adicionar la sol.Std+ el agua

destilada.

2. Colocar agua en una ollita y ponerla a hervir

3. Adicionar 500 del reactivo DNS

4. Colocar los 7 tubos (todos a la vez) en el agua en ebullicin

durante 5 minutos, controlado con cronometro.

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5. Sacar los 7 tubos (todos a la vez) en agua con hielo durante

3 minutos.

6. Adicionar 5 ml de agua destilada en cada tubo (con pipeta)

7. Dejar reposar durante 15 minutos.

8. Al minuto 13, agitar en el agitador de tubos.

9. Luego leer en el espectrofotmetro a 540nM.

La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de

muestras de concentracin conocida y analizadas segn

este procedimiento.

Esquema 08

PREPARAR

AADIR

CALENTAR

ENFRIAR

AADIR

24
REPOSAR
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III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

3.1. PREPARACIN DE MEDIO SLIDO DE MANTENCIN


a. Materiales y Equipos:

Balanza analtica: Las balanzas analticas


modernas, que pueden ofrecer valores de
precisin de lectura de 0,1 micras a 0,1 mg,
estn bastante desarrolladas de manera que
no es necesaria la utilizacin de cuartos
especiales para la medida del peso.

Lo utilizaremos: En este caso pesaremos todos


los compuestos para el medio as que tiene que
Matraz Erlenmeyer: Es ms seguro que un ser con mucho cuidado.
vaso de precipitado, ya que la estructura del
matraz evita perdidas de la sustancia o
solucin contenida (agitacin o
evaporacin). Es ideal para agitar
soluciones. Se puede tapar fcilmente
utilizando algodn o tapa.
25
Lo utilizaremos: Este se llena primeramente con
agua para diluir todos los componentes
pesados.
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Mechero Bunsen: Se utiliza para calentar, fundir o


evaporar sustancias. La llama del mechero que arde
correctamente es transparente y tiene un matiz
azulado.

Lo utilizamos: Aqu se calienta la mezcla del matraz


agitando con la varilla de vidrio y hasta la aparicin de
la primera burbuja.
Lo utilizaremos: Este se llena primeramente con
agua para diluir todos los componentes pesados.

Esptula, pipeta: Objetos de


ayuda al pesar y medir volmenes
respectivamente.

Tubo de ensayo: Es un pequeo tubo de vidrio con una


abertura en la zona superior, y en la zona inferior es
cerrado y cncavo. Esta hecho de un vidrio especial
que resiste las temperaturas muy altas, sin embargo,
los cambios de temperatura muy radicales pueden
provocar el rompimiento de tubo (Pyrex)
Lo utilizaremos: A estos tubos se le adiciona 6-7 ml de
la mezcla e inmediatamente se tapa.

Varilla de vidrio: Son unas varillas de unos


20 cm de longitud que se utilizan para agitar
las disoluciones ayudando a que los slidos
se disuelvan en los disolventes ms
rpidamente.
Lo utilizaremos: nos ayuda al calentar la
mezcla en el mechero.

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Glucosa Agua destilada

Olla a presin: Se introducen los Algodn, gasa y capachitos de


tubos y se afloja las tapas para el aluminio
intercambio ydenutrientes:
b. Reactivos gases

Cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124: es una


levadura fermentadora de hexosas y pentosas
que presenta un rendimiento de etanol de 0.4
gg-1, sin produccin de xilitol. Este cultivo a
trabajar nos da referencia para el medio
cultivo.

Extracto de levadura:
Es un excelente estimulador del crecimiento de
bacterias, es utilizado en la preparacin de medios de
cultivo microbiolgicos. Extracto de Levadura es la
parte soluble en agua de autolisis levadura que es
cuidadosamente controlada para preservar la forma
natural de la referencia para el medio cultivo.

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Peptona Extracto de malta

3.2. PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:


a. Materiales y Equipos:

2 matraces
Balanza analtica

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Una probeta de 100


Mechero Bunsen ml

Varilla de vidrio, pipeta y esptula


Estufa: La estufa de secado es un equipo
que se utiliza para secar y esterilizar
recipientes de vidrio y metal en el
laboratorio. Se identifica tambin con el
nombre Horno de secado.

PH metro: es un sensor utilizado en el mtodo


electroqumico para medir el pH de una Agitador orbital- Shaker: Un agitador, a veces
disolucin. La determinacin de pH consiste en llamado mezclador, es un dispositivo que se
medir el potencial que se desarrolla a travs de utiliza en los laboratorios de qumica y
una fina membrana de vidrio que separa biologa para mezclar lquidos o
dos soluciones con diferente concentracin preparar disoluciones y suspensiones
de protones.

b. Reactivos y nutrientes:

Glucosa: es un azcar Extracto de levadura:


que est presente de29 Es un
manera natural en excelente estimulador
elementos tales como del crecimiento de
las frutas o la miel. Las bacterias,
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Solucin de sales

Extracto de malta: Debido a su especial sabor,


color y agradable aroma, el extracto de malta se
usa ampliamente en la industria alimentaria con
el fin de mejorar las propiedades organolpticas,
valor nutricional, textura y vida til de los
productos.

Alcohol Agua destilada

3.3. PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN:


a. Materiales y Equipos:

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2 matraces de 125 ml Matraz 1L.

Balanza analtica Varilla de vidrio

Gasa, capachitos y algodn.


pH metro

b. Reactivos y nutrientes:

Sacarosa: es el trmino apropiado para describir el


azcar comn. Dos azcares simples, glucosa y
fructosa, se combinan para formar el hidrato de
carbono complejo conocido como sacarosa. La
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sacarosa es fina, incolora, inodora y tiene un sabor
dulce. La sacarosa da un impulso de energa rpida
para el cuerpo. Es fermentable y absorbe humedad.
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Extracto de levadura Agua destilada

(NH4)2SO4 = sulfato de amonio: En bioqumica, la


precipitacin del sulfato de amonio es un mtodo
comn para purificar las protenas al lado de
precipitacin selectiva; El sulfato de amonio es
extremadamente soluble en agua y as que puede
hacer las soluciones muy concentradas que
pueden salar hacia fuera las protenas, causando
su precipitacin en las concentraciones
particulares.

KH2PO4 = fosfato de potasio: Alcohol

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Solucin de sales

c. Equipos

EQUIPO DESCRIPCIN
BALANZA ANALTICA
Marca: Adventurer

Una balanza analtica es una clase de balanza de


laboratorio diseada para medir pequeas masas,
en un principio de un rango menor del miligramo
(y que hoy da, las digitales, llegan hasta la
diezmilsima de gramo: 0,00001 g o 0,01 mg).

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CENTRFUGA
Marca: P-Selecta

Una centrifugadora es una mquina que pone


en rotacin una muestra para (por fuerza
centrfuga) acelerar la decantacin o
la sedimentacin de sus componentes o fases
(generalmente una slida y una lquida), segn
su densidad. Es muy usada en laboratorios de
control de calidad y en fbricas que
elaboran zumos a base de ctricos, para controlar
el nivel de pulpa fina, mediante separacin del
zumo exprimido.

ESPECTROFOTMETRO
Marca: Sigma
Modelo: 2-16PK
Un espectrofotmetro es un instrumento usado
en el anlisis qumico que sirve para medir, en
funcin de la longitud de onda, la relacin entre
valores de una misma magnitud fotomtrica
relativos a dos haces de radiaciones y
la concentracin o reacciones qumicas que se
miden en una muestra. Tambin es utilizado en los
laboratorios de qumica para
la cuantificacin de sustancias y microorganismos
.

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PHMETRO
Marca: Inolab

El pH-metro es un sensor utilizado en el mtodo


electroqumico para medir el pH de
una disolucin. La determinacin de pH consiste
en medir el potencial que se desarrolla a travs de
una fina membrana de vidrio que separa
dos soluciones con diferente concentracin
de protones. En consecuencia se conoce muy bien
la sensibilidad y la selectividad de las membranas
de vidrio delante el pH. Una celda para la medida
de pH consiste en un par de electrodos, uno de
calomel ( mercurio, cloruro de mercurio) y otro de
vidrio, sumergidos en la disolucin de la que
queremos medir el pH.

AGITADOR MAGNTICO
Marca: Thermolyne
Modelo: Maxi-mix II

Un agitador magntico consiste de una pequea


barra magntica (llamada barra de agitacin) la
cual est normalmente cubierta por una capa de
plstico (usualmente Tefln) y una placa debajo
de la cual se tiene una magneto rotatoria o una
serie de electromagnetos dispuestos en forma
circular a fin de crear un campo magntico
rotatorio. Es muy frecuente que tal placa tenga un
arreglo de resistencias elctricas con la finalidad
de dotarle de calor necesario para calentar
algunas soluciones qumicas.

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Fermentador:
Marca: Sartoriustedin
Capacidad: 2 litros
Partes: software, CPU, reactor.

Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente biolgicamente


activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un
proceso qumico que involucra organismos o sustancias bioqumicamente activas
derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aerbico o anaerbio. Estos
biorreactores son comnmente cilndricos, variando en tamao desde algunos mililitros
hasta metros cbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. Un biorreactor
puede ser tambin un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer clulas o tejidos
en operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo para su
uso en ingeniera de tejidos.

Shaker: El agitador orbital modelo SAROTIUS STEDIM est diseado para usos generales
en laboratorios de anlisis clnicos, industriales, de fsica, qumica y en todo tipo de
ensayos que requieran agitar, mezclar, disolver casi todo tipo de lquidos y soluciones
con distinto grado de viscosidad. Estn diseados ergonmicamente para ser
funcionales y confiables ahora y en el futuro. Su sistema microprocesado, permite un
control exacto de la velocidad de giro, independiente de la carga, puesto que supervisa
constantemente la velocidad corrigiendo automticamente cualquier variacin de la
misma. Posee adems un timer que permite controlar con precisin en el tiempo de la
experiencia a realizar. El dispositivo mecnico de agitacin est formado por una base
amplia, metlica, con fuertes nervaduras, y una plataforma mvil.

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OLLA A PRESIN (AUTOCLAVE)


La olla a presin es un recipiente hermtico para cocinar que no
permite la salida de aire o lquido por debajo de una presin
establecida. Debido a que el punto de ebullicin del agua aumenta
cuando se incrementa la presin, la presin dentro de la olla permite
subir la temperatura de ebullicin por encima de 100 C . La
temperatura ms alta hace que los alimentos se cocinen ms
rpidamente llegando a dividirse los tiempos de coccin
tradicionales por tres o cuatro. Por ejemplo, un repollo se cocina en
un minuto, los porotos verdes en cinco, las papas pequeas y
medianas (hasta 200g) pueden tardar unos cinco minutos y un pollo
completo no ms de veinticinco. Generalmente, se utiliza para
conseguir en un corto periodo de tiempo los mismos efectos de la
coccin a fuego lento.

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AUTOCLAVE
Una autoclave es un recipiente de presin metlico de paredes
gruesas con un cierre hermtico que permite trabajar a alta
presin para realizar una reaccin industrial, una coccin o una
esterilizacin con vapor de agua. Su construccin debe ser tal
que resista la presin y temperatura desarrollada en su interior.
La presin elevada permite que el agua alcance temperaturas
superiores a los 100 C. La accin conjunta de la temperatura y
el vapor produce la coagulacin de las protenas de los
microorganismos, entre ellas las esenciales para la vida y la
reproduccin de stos, hecho que lleva a su destruccin.

MENU DE LLAVE DE
MANOMETRO
CONTROL SEGURIDAD

REFRIGERADORA DOMESTICA
MARCA: PHILLIPS

DESCRIPCION: La funcin de una mquina de refrigeracin es


tomar el calor de un ambiente a baja temperatura (en este
caso un armario cerrado y aislado trmicamente) y cederlo
en el ambiente exterior (para el refrigerador domstico sera
la cocina), empleando una fuente de energa externa para
mantener el proceso. Un refrigerador es una bomba de calor
(como las de agua, bombea calor de un lugar a bajo nivel
trmico a otro de mayor nivel), impulsada generalmente por
un motor elctrico. Es asimismo posible emplear sales
eutcticas o absorcin.

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ESTUFA ELECTRICA:
MARCA: P-SELECTA

MODELO: 209

DESCRIPCION: Equipo de 75 litros de capacidad, con una


cavidad de 500 x 400 x 400 mm, que permite el secado
de muestras en un rango de temperatura til
comprendido entre 0 y 200 C.

La estufa de secado se emplea para esterilizar o secar el


material de vidrio y metal utilizado en los exmenes o
pruebas, que realiza el laboratorio y que proviene de la
seccin de lavado, donde se enva luego de ser usado en
algn procedimiento. La esterilizacin que se efecta en la
estufa se denomina de calor seco y se realiza a 180 C durante 2 horas; la cristalera, al ser
calentada por aire a alta temperatura, absorbe la humedad y elimina la posibilidad de que se
mantenga cualquier actividad biolgica debido a las elevadas temperaturas y a los tiempos
utilizados.

INCUBADORA ELECTRICA
MARCA: P-SELECTA

MODELO: 206

DESCRIPCION: una incubadora es un dispositivo que sirve para


mantener y hacer crecer cultivos microbiolgicos o cultivos
celulares. La incubadora mantiene la temperatura, la humedad y
otras condiciones en grado ptimo, tales como el contenido de
dixido de carbono (CO2) y de oxgeno en su atmsfera interior.
Las incubadoras son esenciales para una gran cantidad de trabajos
experimentales en biologa celular, la microbiologa y en biologa
molecular y se utilizan para cultivos celulares, tanto bacterianos
como de clulas eucariotas.

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CUADRO DE RESUMEN: MATERIALES A UTILIZAR

Instrumentos MANTENCION ACTIVACION FERMENTACION


Asa bacteriolgica x
Matraces x x x
Tubos de ensayo x x
Mechero x x
Rejilla de asbesto x
Trpode x x
Pipeta x
Shaker x x
Refrigeradora
Estufa elctrica x
Incubadora x
elctrica
Olla a presin x x
(autoclave)
Algodn x
Gasa x x
Balanza analtica x x
pH-metro x x
Papel aluminio x

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CUADRO DE RESUMEN: REACTIVOS QUE UTILIZAREMOS

MEDIO NUTRIENTE
Extracto de levadura
Peptona
Solido de mantencin
Agar
(PGY- Agar)
Extracto de malta

Xilosa
Extracto de levadura
Activacin
Extracto de malta
Solucin de sales
Glucosa
Xilosa
(NH4)2SO4
Fermentacin KH2PO4
MgSO4.7H2O
Solucin de sales
Tampn citrato

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IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS


V. REFERENCIAS BIBILIOGRFICAS

- Barbosa Marcela, Espinosa Hernndez Armando, Malagn Romero Dionisio,


Moreno Sarmiento Nubia. (2005). Produccin de poli--hidroxibutirato (phb)
Por Ralstonia eutropha ATCC 17697. Revista de la Facultad de Ciencias
Pontificia Universidad Javeriana 10: 45-54.
- Becerra Jimnez Monica. (2013). Produccin De Un Polmero Tipo
Polihidroxialcanoato (Pha) Empleando Residuos De La Produccin De
Biodiesel. Tesis revisada de la Universidad Nacional de Colombia.
- Cramm, R. (2009). Genomic View of Energy Metabolism in Ralstonia eutropha
H16. J Mol Microbiol Biotechnol 16 (12): pp. 3852.
- Duarte. A. (1995). Introduccin a la ingeniera bioqumica. Facultad de
ingeniera de la Universidad Nacional de Colombia, Bogota.
- Jacquel, N.; et al. (2008). Isolation and purification of bacterial poly(3-
hydroxyalkanoates). Biochem. Eng. J. 39 (1): pp. 1527.
- Jess Antonio Crdova Lpez. (2013). Sntesis y biodegradacin de
polihidroxialcanoatos: plsticos de origen microbiano. Rev. Int. Contam.
Ambie. 29 (1) 77-11.
- Jin Seol Kim, Bong Hee Lee, Beom Soo Kim. (2005). Production of poly(3-
hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) by Ralstonia eutropha.
Biochemical Engineering Journal 23 169174.
- Jorge Quillaguamn; Osvaldo Delgado; Bo Mattiasson; Rajni Hatti-Kaul.
(2006). Poli (-hidroxibutirato) por una halfila moderada, Halomonas
boliviensis LC1. Enzyme and Microbial Technology 38: 148154.
- Lee, S. (1996). Plastic bacteria. Progress and prospects for polyhydroxy-
alkanoates production in bacteria. Trends in Biotechnology. 14: 431-438.

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- Mariana Cardona Betancur; Lina Mara Agudelo Escobar MsC. (2012).


Produccin de bioplsticos a partir de bacterias empleando sustratos no
convencionales.
Universidad de Antioquia. Grupo de Biotransformacin Escuela de
Microbiologa
- Pohlmann, A., Fricke, W., Reinecke, F., Kusian, B., Liesegang, H., Cramm, R.,
Eitinger, T., Ewering, C., Potter, M., Schwartz, E., Strittmatter, A., Vob, I.,
Gottschalk, G., Steinbuchel, A., Friedrich, B. and Bowien, B. (2006). Genome
sequence of the bioplastic-producing Knallgas bacterium Ralstonia eutropha
H16. Nature Biotechnology 24 (10): pp. 12571262
- Ramrez N, Sandoval AH, Serrano JA. (2004). Las bacterias halfilas y sus
aplicaciones biotecnolgicas. Rev. Soc. Ven. Microbiol. v.24 n.1-2
- Repaske, R. (1981). Nutritional Requirements for Hydrogenomonas
eutropha. J Bacteriol. 83 (2): pp. 418422
- S.O. Kulkarnia, P. Kanekara, S. Nilegaonkara, S. Sarnaika, J.P. Jogb. (2010).
Production and characterization of a biodegradable poly (hydroxybutyrate-
co-hydroxyvalerate) (PHB-co-PHV) copolymer by moderately
haloalkalitolerant Halomonas campisalis MCM B-1027 isolated from Lonar
Lake, India. Bioresource Technology 110: 97659771
- Shilpi Khanna , Ashok K. Srivastava. (2005). Statistical media optimization
studies for growth and PHB production by Ralstonia eutropha. Process
Biochemistry 40: 2173 2182
- Yolanda Gonzlez Garca, Juan Carlos Meza Contreras, Orfil Gonzlez
Reynoso

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VI. ANEXOS:

Hallamos el porcentaje del elemento en clula:


CH1.79 O0.6 N0.17

Elemento Peso Cantidad Peso


atmico molecular(g/mol)
C 12 1 12
H 1 1.79 1.79
O 16 0.6 9.6
N 14 0.17 2.38
Total(g/mol) 25.77

% de Carbono en clula

25.77 100%
12

12 100
=
25.77

= . %

% de Nitrgeno en clula

25.77 100%
2.38

2.38 100
=
25.77

= . %

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Ahora hallamos los siguientes porcentajes de los dems elementos


en clula con la siguiente tabla:
Tabla 04. Composiciones de clulas microbianas

ELEMENTO % EN PESO BASE SECA


BACTERIAS LEVADURAS MOHOS
CARBONO 46-53 46-51 45-55
HIDRGENO 6.5-7.5 6-8 8-12
OXGENO 18-32 28-35 18-24
NITRGENO 10-14 6-10 3-7
MAGNESIO 0.1-0.5 0.1-0.5 0.1-0.3
FSFORO 2.0-3.0 0.8-2.6 0.4-4.5
AZUFRE 0.1-1.0 0.01-0.24 0.1.-0.5
CALCIO 0.01-1.1 0.1-0.3 0.1-1.4
POTASIO 1.0-4.5 1.0-4.0 0.2-2.5
HIERRO 0.02-0.2 0.01-0.5 0.1-0.2

0.1+0.5
% de Magnesio en clula: = 0.30%
2

0.01+0.24
% de Azufre en clula: = 0.13%
2

1.0+4.0
% de Potasio en clula: = 2.50%
2

0.8+2.6
% de Fsforo en clula: = 1.70%
2

Este elemento se encuentra dentro de la composicin de uno de los compuestos que se


encuentran en la solucin de sales:
0.1+0.3
% de Calcio en clula: = 0.20%
2

0.01+0.5
% de Hierro en clula: = 0.255%
2

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Para los dems elementos, los cuales son: Cl, Zn, Cu, Co, B; se consider porcentaje del
elemento en clula de 0.01%.

Hallamos el porcentaje del elemento en compuesto:


Xilosa:
Frmula:
Peso molecular:
C: 12 5 = 60
H: 1 10 = 10
O: 16 5 = 80
/
150

% de carbono

150 100%
60

= %

Glucosa:
Frmula:
Peso molecular:
C: 12 6 = 72
H: 1 12 = 12
O: 16 6 = 96
/
180

% de carbono

180 100%
72

= %

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Sulfato de amonio

Frmula: (4 )2 4

Peso molecular:
C: 14 2 = 28
H: 1 8=8
S: 32 = 32
O: 16 4 = 64

132 /

% de nitrgeno

132 100%
28

= . %

% de azufre

132 100%
32

= . %

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Fosfato dicido de potasio

Frmula: 2 4

Peso molecular:

K: 39 = 39 +
H: 1 2 = 2
P: 31 = 31
O: 16 4 = 64

136 /

% de potasio

136 100%
39

= . %

% de fsforo

136 100%
31

= . %

Sulfato de magnesio heptahidratado:

Frmula: 4 . 72

Peso molecular:
Mg: 24 = 24
S: 32 = 32
O: 16 11 = 176
H: 1 14 = 14

246 /

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% de magnesio

246 100%
24

= . %

% de azufre

246 100%
32

= . %

Sales:

Cloruro de calcio dihidratado:

Formula: CaCl2.2H2O

Peso molecular:

Mg: 40 1 = 40
Cl: 35 2 = 70
O: 16 2 = 32
H: 1 4=4

146 /

% de calcio

146 100%
40

= . %

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xido de zinc:

Formula: ZnO

Peso molecular:

Zn: 65 1 = 65
O: 16 1 = 16

81/

% de calcio

81 100%
65

= . %

Sulfato ferroso heptahidratado:

Formula: FeSO4.7H2O

Peso molecular:

Fe: 56 1 = 56
S: 32 1 = 32
O: 16 11 = 176
H: 1 14 = 14

278 /

% de hierro

278 100%
56

= . %

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Sulfato de cobre pentahidratado:

Formula: CuSO4.5H2O

Peso molecular:

Cu: 63 1 = 63
S: 32 1 = 32
O: 16 9 = 144
H: 1 10 = 10

249 /

% de cobre

249 100%
63

= . %

Cloruro de cobalto hexahidratado:


Formula: CoCl2.6H2O
Peso molecular:

Co: 59 1 = 59
Cl: 35 2 = 70
O: 16 6 = 96
H: 1 12 = 12

237 /

% de cobalto

237 100%
59

= . %

51
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cido brico:

Formula:H3BO3

Peso molecular:

B: 11 1 = 11
O: 16 3 = 48
H: 1 3=3

62 /

% de boro

62 100%
11

= . %

cido clorhdrico:

Formula: HCl

Peso molecular:

O: 35 1 = 35
H: 1 1=1

36 /

% de cloro

36 100%
35

= . %

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Hallamos los rendimientos de cada elemento


%
/ =
%
Ahora:

%
/ =
%

Solo para la fuente de carbono y energa:


f: metabolismo aerobio (0.5-0.6)
metabolismo anaerobio (aprox. 0.1)

Carbono: Xilosa

40
/ = 0.6 = .
46.57

Carbono: Glucosa

40
/ = 0.6 = .
46.57

Nitrgeno:

21.21
/ = = .
9.24

Azufre:

24.24
/ = = .
0.13

Potasio:

28.68
/ = = .
2.5

Fsforo:

22.79
/ = = .
1.7

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Magnesio:

9.76
/ = = .
0.3

Azufre:

13.01
/ = = .
0.13

Sales:

Calcio:

27.4
= =
0.2

Zinc:
80.25
= =
0.01

Hierro:
21.7
= = .
0.255

Cobre:
25.3
= =
0.01

Cobalto:
24.89
= =
0.01

Boro:
17.74
= =
0.01

Cloro:
97.22
= =
0.01

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Hallamos la concentracin de sustrato inicial de cada compuesto:


( )
0 = +
/
Donde:

0 y 0 0 ; = 2 /

Carbono: Xilosa

(2 0)
0 = 0 +
0.52

= .

Carbono: Glucosa

(2 0)
0 = 0 +
0.52

= .

Nitrgeno:

(2 0)
0 = 0 +
2.30

= .

Azufre:

(2 0)
0 = 0 +
186.46

= .

Potasio:

(2 0)
0 = 0 +
11.47

= .

Fsforo:

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(2 0)
0 = 0 +
13.41

= .

Magnesio:

(2 0)
0 = 0 +
32.53

= .

Azufre:

(2 0)
0 = 0 +
100.08

= .

Ahora, hallamos el nuevo sustrato, dependiendo de un factor de correccin si es que un


compuesto es sustrato no limitante.

0 = 0

Donde:

= 1, cuando el nutriente es limitante

= 1.5 2, cuando el nutriente no es limitante

Carbono: Xilosa

0 = 3.85 1 = . /

Carbono: Glucosa

0 = 3.85 1 = . /

Nitrgeno:

0 = 0.87 1.5 = . /

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Azufre:

0 = 0.01 1.5 = . /

Potasio:

0 = 0.17 1.5 = . /

Fsforo:

0 = 0.15 1.5 = . /

Magnesio:

0 = 0.07 1.5 = . /

Azufre:

0 = 0.02 1.5 = . /

SALES:

Calcio:
(2 0)
0 = 0 +
137

= .

0 = 1.46 1.5 = . /

Zinc:

(2 0)
0 = 0 +
8025

= .

0 = 0.025 1.5 = . /

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Hierro:

(2 0)
0 = 0 +
85.01

= .

0 = 2.325 1.5 = . /

Cobre:

(2 0)
0 = 0 +
2530

= .

0 = 0.079 1.5 = . /

Cobalto:

(2 0)
0 = 0 +
2489

= .

0 = 0.08 1.5 = . /

Boro:

(2 0)
0 = 0 +
1774

= .

0 = 0.113 1.5 = . /

Cloro:

(2 0)
0 = 0 +
9722

= .

0 = 0.02 1.5 = . /

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Hallamos la concentracin celular inicial mediante formula, la cual es


la siguiente:

X0= 10%(Xf)

X0=10%(2)

X0=0.2

Hallamos el valor de mximo con la siguiente tabla de tiempos de


duplicacin de diferentes tipos de clula:

Tabla 05: Tiempo de duplicacin caractersticos

Tipo de clula td(h)


Bacterias 0.3-2.5
Levaduras 1.0-4.0
Hongos filamentosos 1.5-7.0
Microalgas 18-35
Clulas animales in vitro 20-40

De la tabla N 05, obtenemos el promedio del td de las levaduras que es de 2.5 h.


Ln(2)
td =

Ln(2)
=

Ln(2)
=
2.5
= 0.28 h-1

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Hallamos el tiempo de fermentacin con el valor de mx:


Ln ( ) = Max t

2
Ln ( ) = 0.28 t
0.2
= .

60