Anda di halaman 1dari 16

TEKNIK DEPROTEINASI KULIT RAJUNGAN (Portunus pelagious)

SECARA ENZIMATIK DENGAN MENGGUNAKAN BAKTERI


Pseudomonas aeruginosa UNTUK PEMBUTAN POLIMER KITIN DAN
DEASETILASINYA

Pendahuluan
Indonesia merupakan negara maritim kaya akan bahan baku kitin yang banyak
terdapat dalam kulit udang, kulit kepiting, dan cumi-cumi akan menjadi sangat
potensial dalam produksi kitin dan kitosan. Salah satunya propinsi Lampung
memiliki potensi yang cukup besar dalam menghasilkan kepiting setiap tahunnya,
dari dua perusahaan besar yaitu, PT Panji Saburai Putra dan PT Philip Amanjaya.
Pemanfaatan kepiting umumnya baru terbatas untuk keperluan makanan, biasanya
hanya dagingnya saja yang diambil sedangkan cangkangnya dibuang, padahal
cangkang kepiting mengandung senyawa kitin yang cukup tinggi yaitu, sekitar 20-
30 % berat kulit keringnya. Sedangkan kulit kepiting sendiri merupakan limbah
pengalengan kepiting yang belum diolah secara maksimal. Penggunaan kitin
dibatasi oleh sifat-sifat yang tidak larut dan sulit dipisahkan dengan bahan lain
yang terikat terutama protein, sehingga untuk pemanfaatannya kitin perlu diubah
terlebih dahulu menjadi kitosan. Kitin merupakan salah satu polisakarida yang
melimpah dialam selain selulosa dan pati.
Kitin adalah polimer dari N asetilglukosamin yang terikat secara 1,4 dengan
tingkat terasetilasi yang lebih tinggi. Sedangkan turunannya yang memiliki tingkat
terasetilasi lebih rendah disebut kitosan. Setiap tahunnya diproduksi sekitar 106-
107 ton kitin dari organisme laut (Yu dkk, 1991 dalam Peter, 1995). Kitin dan
kitosan dinegara maju telah diproduksi secara komersial mengingat manfaatnya
diberbagai industri, seperti bidang farmasi, biokimia, bioteknologi, kosmetika,
biomedika, industri kertas, industri pangan, industri tekstil, dan lain-lain.
Pemanfaatan tersebut didasarkan atas sifat-sifatnya yang dapat digunakan sebagai
pengemulsi, koagulasi, pengkelat, dan penebal emulsi (Muzarelli, 1984). Isolasi
kitin dari kulit kepiting dilakukan dengan dua metode, yaitu metode kimia dan
metode enzimatik. Pada metode kimia dilakukan tiga tahap yang meliputi tahap
pemisahan protein dengan menggunakan larutan NaOH encer, pemisahan mineral
dengan larutan asam klorida encer, dan tahap pemutihan hasil dengan aseton.
Ketiga tahap ini merupakan faktor yang menentukan kualitas kitin. Produksi kitin
secara kimia ini dapat menimbulkan masalah pembuangan limbah yang sangat
berpengaruh pada lingkungan hidup dan menyebabkan kitin terdepolimerisasi
sehingga rantainya menjadi lebih pendek. Wang (1997) melaporkan bahwa
pembuatan kitin secara enzimatik dapat dilakukan dengan menggunakan bakteri
Pseudomonas aeruginosa K-187 yang merupakan penghasil enzim kitinase atau
lisozim. Dengan proses fermentasi, telah ditemukan bahwa bakteri ini juga
memiliki aktivitas protease. Pada penelitian ini dilakukan deproteinasi kitin dari
kulit kepiting secara enzimatik menggunakan isolat Pseudomonas aeruginosa
dalam medium cair nutrient broth (NB) pada suhu ruang dengan konsentrasi
substrat 5%, variasi waktu panen, dan pH diperoleh waktu optimum 2 hari serta
pH optimum 8. Untuk proses demineralisasi menghasilkan rendemen sebesar
20,08% dan depigmentasi sebesar19,52%. Sedangkan untuk pembuatan kitosan
dilakukan deasetilasi kitin secara kimia menggunakan larutan NaOH pekat 50%
(1:15, w/v) pada suhu 100C selama 6 jam (Muzarelli, 1977). Kitin dan kitosan
yang diperoleh diuji kelarutannya dan dianalisis menggunakan spektrofotometer
infra merah dengan kitin dan kitosan standar sebagai pembanding.

Metodolgi Penelitian
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: alat-alat gelas, 1 set alat
ekstraksi soklet, oven merk Heraeus, magnetik stirer merk Nuova, kondensor
refluks, jarum ose, cawan penguap, ayakan 40 mesh, pH meter merk Orion, tanur,
atoklaf model S-90N merk Tommy Seiko, desikator, shaker merk Gerhardt
Schuttelmaschine RO 10, inkubator merk Selecta, neraca merk Ainsworth AA-
160, laminary air flow merk Crumair, ultrasonic merk Branson, penangas air merk
Selecta, dan Spektrophotometer Infra Merah (IR). Bahan yang digunakan pada
penelitian ini adalah kulit kepiting rajungan (Portunus pelagious), isolat bakteri
Pseudomonas aeruginosa, bacto agar, nutrient broth (NB), kapas, akuades, dan
laktosa . Sedangkan bahan kimia yang digunakan adalah NaOH, H2SO4 pekat,
HCl pekat, NH4NO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, NaH2PO4,
K2SO4, Na2S2O3, H3BO3, HgO, (NH4)2C2O4, LiCl, NaOCl, CH3COOH,
TCA, methylen blue, methylen red, follin cialcateu, dan N,N-dimetilasetamida.

Prosedur Penelitian
Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan adalah kulit kepiting rajungan (Portunus pelagious) yang
diambil dari PT. Philip Amanjaya. Kulit kepiting yang telah direbus, dibersihkan,
dan dikeringkan dengan sinar matahari. Setelah kering digiling dengan mortar dan
diayak dengan ayakan ukuran 40 mesh.

Isolasi Kitin Secara Enzimatik


Isolasi kitin dilakukan dengan empat tahap yang meliputi tahap pembuatan media
substrat, penyiapan medium fermentasi, pembuatan starter dan penentuan kondisi
optimum fermentasi.

Pembuatan Media Substrat


a. Demineralisasi
150 g bubuk kulit kepiting dimasukkan ke dalam gelas beker 2 L dan
ditambahkan 1200 ml HCl 2N sedikit demi sedikit sambil diaduk lalu disimpan
pada suhu 25oC selama 2 hari. Pemisahan residu dan filtrat dilakukan dengan
penyaringan dimana filtrat diuji dengan amonium oksalat. Sedangkan residu di
cuci dengan aquades sampai pH netral, lalu dikeringkan pada suhu 60C selama 4
jam.
b. Depigmentasi
Kitin kasar hasil demineralisasi diekstraksi dengan aseton dengan perbandingan
1:10 selama 7 jam secara sokletasi. Residunya diputihkan dengan NaOCl 0,315%
selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian residunya dicuci dengan akuades
sampai pH netral dan dikeringkan dengan oven pada suhu 600C selama 4 jam.
Penyiapan Medium Fermentasi
NH4NO3 0,5 g, K2HPO4 0,1 g, FeSO4. 7H2O 0,5 g, MgSO4. 7H2O 0,5 g,
laktosa 1 g dan 5 g media kulit kepiting dimasukkan ke dalam erlenmeyer lalu
ditambahkan akuades 100 ml. Campuran dikocok dalam shaker sampai homogen.
Erlenmeyer kemudian diberi sumbat kapas, disterilisasi pada suhu 121C, tekanan
15 psi selama 20 menit.
Pembuatan Starter
Starter adalah inokulum yang siap digunakan untuk fermentasi. Starter dibuat
dengan cara biakan Pseudomonas aeruginosa yang telah diinkubasi selam 3 hari
dalam media nutrient broth agar (NBA) lalu dimasukkan ke media cair NB secara
steril, kemudian dilakukan pengocokan pada suhu kamar selama 24 jam dengan
kecepatan 100 rpm. Selanjutnya starter siap dimasukkan ke dalam media
fermentasi.
Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi
a. Penentuan waktu panen optimum
4 buah erlenmeyer yang berisi 45 ml media fermentasi, masing-masing
dimasukkan 5,0 ml starter kemudian diinkubasi dalam shaker dengan variasi
waktu 1, 2, 3, dan 4 hari. Hasil fermentasinya diuji kelarutannya dalam campuran
N,N-dimetilasetamida dan LiCl 10%.
b. Penentuan pH optimum
4 buah erlenmeyer yang berisi 45 ml media fermentasi diatur pH-nya sebagai
berikut 7, 7,5, 8, dan 8,5. Kedalam media dimasukkan starter sebanyak 5 ml,
dikocok dengan kecepatan 100 rpm sampai waktu panen optimumnya. Hasil
fermentasi diuji kelarutannya dalam campuran N,Ndimetilasetamida dan LiCl
10%.
Pembuatan Kitosan Secara Kimia
1 g kitin dicampur dengan 15 ml NaOH 50% dalam bejana tahan asam basa yang
dilengkapi dengan pengaduk, termometer, dan penangas air bertermostat. Tahap
ini dilakukan selama 6 jam pada suhu 100C. Residu yang diperoleh dicuci
dengan akuades sampai pH netral dan dikeringkan selama 4 jam pada suhu 60C
lalu diuji kelarutannya dalam asam asetat 5%.
Karakterisasi Kitin dan Kitosan
Analisis kadar air secara gravimetri
Dilakukan penimbangan terhadap cawan penguap yang hendak dipakai, kemudian
dimasukkan sampel dengan berat tertentu. Dikeringkan dalam oven pada suhu 100
o
C sampai beratnya konstan ( selama 3 jam), didinginkan dalam desikator,
kemudian ditimbang.
Analisis kadar abu secara gravimetri
Cawan penguap disiapkan untuk pengabuan. Cawan penguap ditimbang,
kemudian dibakar dalam tanur, didinginkan dalam desikator dan ditimbang
kembali. Sampel yang telah ditimbang dimasukkan dalam cawan penguap,
kemudian dibakar diatas pembakar gas sampai asapnya habis, selanjutnya
diletakkan dalam tanur pengabuan dibakar sampai didapat abu berwarna putih.
Pengabuan ini dilakukan pada suhu 6000C-7000C selama 6 jam.
Pengukuran spektroskopi IR
Kitin dan kitosan yang diperoleh diukur dengan spektoskopi IR. Sampel dibuat
pelet dengan KBr dan dilakukan scanning pada daerah panjang gelombang 4000 -
400 cm1. Hasil pengukuran yang diperoleh dibandingkan dengan pengukuran
kitin dan kitosan standar
Derajat Deasetilasi
Derajat deasetilasi ditentukan dari spektrum serapan spektroskopi IR dengan
metode garis dasar. Puncak tertinggi dicatat dan diukur dari garis dasar yang
dipilih. Perbandingan antara absorbansi pada V = 1655 cm-1 ( serapan pita amida)
dengan absorbansi V= 3450 cm-1 (serapan pita hidroksi) dihitung untuk N-
deasetilasi kitin yang sempurna (100%) diperoleh A1655= 1,33. (Bastaman, 1989
dalam Haryanto, 1995).
Penentuan Kadar Nitrogen
1g kitin dimasukkan kedalam labu kjehdal ditambah dengan 5 mg raksa oksida,
0,2 g kalium sulfat, dan 10 ml asam sulfat pekat, lalu didestruksi sampai cairan
berwarna jernih dan didinginkan. Setelah itu ditambah akuades 25 ml dan 10 ml
larutan NaOH dengan natrium tiosulfat lalu didestilasi. Gas amoniak yang terjadi
ditampung dalam erlenmeyer yang berisi 50 ml asam klorida yang telah diberi 4
tetes indikator metil merah. Ujung tabung kondensor harus lebih rendah dibawah
larutan asam klorida, selanjutnya destilat dititrasi dengan natrium hidroksida 0,01
N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu
Hasil dan Pembahasan
Proses Pembuatan Polimer Kitin
Pada penelitian ini dilakukan proses pembuatan kitin dari kulit kepiting rajungan
(Portunus pelagious) dengan menggunakan metode kombinasi No (1989) dan
Wang (1998) yang meliputi tahap demineralisasi, depigmentasi, dan deproteinasi
secara enzimatik. Untuk mengetahui adanya kitin dalam kulit kepiting rajungan
(Portunus pelagious) dilakukan uji kualitatif. Sampel ditambahkan dengan I2
dalam KI menimbulkan warna coklat, kemudian bila ditambahkan dengan H2SO4
pekat akan menimbulkan perubahan warna dari coklat menjadi violet. Hal ini
menunjukkan bahwa dalam kulit kepiting rajungan (Portunus pelagious)
mengandung senyawa kitin.
a. Demineralisasi
Proses pemisahan ini bertujuan untuk menghilangkan senyawa anorganik yang
terdapat pada kulit kepiting. Kandungan mineral yang terbanyak dalam kulit
kepiting adalah CaCO3, dan dalam jumlah yang sedikit terdapat Ca3(PO4)2.
Menurut Knorr (1984) mineral CaCO3 lebih mudah dipisahkan dibandingkan
protein karena garam anorganik ini dapat dihilangkan dari senyawa kitin dengan
menggunakan HCl. Asam klorida efektif untuk melarutkan kalsium sebagai
kalsium klorida, namun asam klorida juga dapat menyebabkan kitin mengalami
depolimerisasi (Austin, 1981 dan Shimara, 1988).
Reaksi garam anorganik dengan HCl adalah sbb :
CaCO3 (s) + 2 HCl (l) CaCl2 (s) + H2O (l) + CO2 (g)
Ca3(PO4)2 (s) + 4 HCl (l) 2 CaCl2 (s) + Ca(H2PO4)2 (l)
Menurut Turikun (1989) bahwa hasil reaksi tersebut akan larut dan mudah
dihilangkan pada tahap pemisahan mineral ini, sampel dilarutkan dalam HCl 2N
selama 48 jam pada suhu ruang dengan perbandingan berat sampel dan volume
pengekstrak 1 : 8 (w/v) yang hasilnya menunjukkan keefektifan dalam
menurunkan kadar abu. Kadar abu yang dihasilkan adalah 1,12%. Terjadinya
proses pemisahan mineral ditunjukkan dengan terbentuknya gas CO2 yang berupa
gelembung-gelembung udara pada saat larutan HCl ditambahkan ke dalam
sampel. Setelah proses demineralisasi, dilanjutkan dengan tahap netralisasi. Hasil
ekstraksi dicuci dengan aquades sampai pH netral, sebagai indikator digunakan
pH universal. Filtrat diuji dengan (NH4)2C2O4 untuk membuktikan adanya
mineral kalsium yang dapat dipisahkan selama proses demineralisasi. Ion oksalat
akan membentuk endapan putih dengan kalsium. Pencucian ini dimaksudkan
untuk mencegah terjadinya degradasi produk selama proses pengeringan. Karena
kitin juga mengandung beberapa gugus amino bebas baik disebabkan adanya
sedikit deasetilasi selama proses pengeringan atau akibat pembentukan asetilasi
yang tidak sempurna (Johnson dan Peniston, 1982). Rendemen yang dihasilkan
dari proses demineralisasi adalah 30,13 g dari berat sampel awal 150 g (20,08 %).
Hal ini menunjukkan bahwa mineral yang dapat dipisahkan dari sampel adalah
79,91 %.
b. Depigmentasi
Depigmentasi merupakan proses penghilangan warna yang ada pada kitin. Pada
penelitian ini kitin hasil demineralisasi menghasilkan warna kuning kemerahan
yang warnanya dapat dihilangkan dengan aseton dan sokletasi selama 7 jam
dengan perbandingan berat sampel dan volume pelarut 1 : 10 (w/v). Proses
sokletasi selama 7 jam menghasilkan 29 siklus yang setiap siklusnya selama 10
menit. Aseton yang berwarna jernih mengalami perubahan menjadi kuning
kemerahan. Hal ini membuktikan bahwa zat warna dari kitin dapat dipisahkan
dengan aseton. Pada penelitian ini didapat warna kuning kemerahan pada aseton
dimana menunjukkan adanya reduksi astaksantin dari kitin. Purwatiningsih (1992)
melaporkan bahwa aseton dapat mereduksi astaksantin dari kitin limbah udang
windu. Setelah itu dilakukan pemutihan dengan menggunakan larutan NaOCl
0,315% selama 10 menit. Dari 150 g sampel awal diperoleh kitin seberat 29,20 g
(19,52%).
c. Deproteinasi secara enzimatik
Deproteinasi merupakan proses penghilangan protein dari kitin. Proses ini
dilakukan secara enzimatik dengan menggunakan isolat bakteri Pseudomonas
aeruginosa dalam medium cair NB pada suhu ruang dan konsentrasi substrat 5%.
Dengan proses fermentasi bakteri Pseudomonas aeruginosa akan menghasilkan
enzim protease. Enzim protease ini mempunyai kemampuan untuk memutuskan
ikatan peptida dari residu asam amino dalam molekul protein (Amrizal, 1988).
Pada tahap deproteinasi dilakukan variasi waktu panen dan pH untuk
mendapatkan waktu panen optimum dan pH optimum. Pada tahap ini mula-mula
dilakukan pembuatan medium fermentasi untuk variasi waktu panen 1, 2, 3, dan 4
hari. Media fermentasi yang telah dimasukkan starter kemudian diukur pHnya
dengan menggunakan larutan buffer phosfat, larutan buffer ini berfungsi untuk
menjaga agar pH tidak berubah. Setelah dilakukan pengukuran pH, media
fermentasi diinkubasi dalam shaker dengan kecepatan 100 rpm. Setiap variasi
waktu panen pada media fermentasi yang telah diinkubasi, ditambahkan larutan
TCA (asam trikhloro asetat) yang berfungsi untuk menginaktifkan enzim protease.
Untuk mendapatkan produk dilakukan penyaringan, setiap filtrat yang diperoleh
dilakukan pengukuran pH. Setelah produk didapatkan lalu dicuci dengan aquades
sampai pH netral dan dilakukan uji kelarutan serta uji protein untuk filtrat. Uji
kelarutan menggunakan campuran N,N-dimetilasetamida dan LiCl 10%,
sedangkan uji protein dengan menggunakan follin cialcateu.
Kondisi Optimum Fermentasi Kitin
a. Waktu panen optimum fermentasi kitin
Dari hasil penelitian diperoleh waktu panen optimum 2 hari yang akan
menentukan pH optimum produk selanjutnya. Hasil ini didapatkan berdasarkan uji
kelarutan dengan menggunakan campuran N,N-dimetilasetamida dan LiCl 10%
yang merupakan pelarut efektif untuk melarutkan kitin (Kenzo dkk, 1988). Produk
yang diperoleh dilarutkan dalam campuran N,Ndimetilasetamida dan LiCl 10%
lalu diaduk dengan menggunakan alat shaker selama 3 hari untuk
menghomogenkan larutan dan diultrasonik 15 menit dengan tujuan untuk
memecahkan dinding sel dengan menggunakan gelombang frekuensi tinggi.
Gelombang ini dapat menyebabkan dinding sel pecah. Kemudian hasilnya
ditimbang untuk mendapatkan berat produk yang terbanyak. Selain uji kelarutan,
dilakukan juga uji protein pada filtrat dengan menggunakan follin cialcateu yang
memberikan warna kuning kehijauan, hal ini menunjukkan bahwa dalam filtrat
sudah tidak ada protein. Hal ini juga sesuai dengan media fermentasi yang
ditambahkan dengan follin cialcateu memberikan warna yang sama, yaitu kuning
kehijauan. Hal ini dapat dilihat pada kurva dibawah ini (Gambar 1.) menunjukkan
hubungan waktu fermentasi kitin dengan berat produk yang larut dalam campuran
N,N-dimetilasetamida dan LiCl 10%, dimana waktu fementasi kitin optimum
mampu menghasilkan berat produk terbesar pada hari ke-2.
b. pH optimum fermentasi kitin
Mempertahankan nilai pH tertentu sepanjang pertumbuhan, mempunyai arti
penting bagi mikroorganisme yang meskipun memproduksi asam, tetapi tidak
tahan terhadap asam, misalnya pada bakteri Pseudomonas aeruginosa (Schlegel
dan Schmidt, 1994). Pada umumnya bakteri dapat tumbuh pada pH sekitar 7
meskipun kisaran pHnya adalah 5-8. Banyak bakteri menghasilkan asam; asam ini
akan menghambat pertumbuhan bakteri (Lay, 1992). Pada penelitian ini
didapatkan pH optimum produk 8 berdasarkan dari waktu optimum fermentasi
produk 2 hari. Pada kondisi ini, produk dilarutkan dalam campuran N,N-
dimetilasetamida dan LiCl 10% dan filtrat diuji dengan follin cialcateu yang
memberikan hasil positif bahwa produk pada pH 8 tidak mengandung protein
dengan memberikan warna kuning kehijauan. Hal ini dapat dilihat pada kurva
dibawah (Gambar 2.) yang menunjukkan hubungan pH fermentasi kitin dengan
berat produk yang larut dalam campuran N,N-dimetilasetamida dan LiCl 10%.
Berat produk terbesar pada pH 8.
Deasetilasi Polimer Kitin Secara Kimia
Deasetilasi adalah proses penghilangan gugus asetil (COCH3) dari kitin dengan
larutan alkali (Whistler, 1973; Johnson dan Peniston, 1982). Menurut Muzzarelli
(1979) dalam Johnson dan Peniston (1982) kitin mempunyai struktur kristalin
yang panjang dengan ikatan kuat antara atom nitrogen dan gugus karboksil. Oleh
karena itu pada proses deasetilasi digunakan larutan NaOH dengan konsentrasi
tinggi (40-50)% dan suhu tinggi (100- 150)0C untuk mendapatkan kitosan dari
kitin. Pada penelitian ini menggunakan larutan basa NaOH pekat 50% dengan
perbandingan berat sampel dan volume pengekstrak 1 : 15 (w/v) pada suhu 1000C
selama 6 jam (Muzarelli 1977). Kitosan yang diperoleh diuji kelarutan dengan
asam asetat 5%, diaduk dengan menggunakan alat shaker selama 3 hari, dan
diultrasonik selama 15 menit, hasil yang diperoleh kitosan larut dan mengental
membentuk gel. Hal ini sesuai perlakuannya dengan menggunakan kitosan
standar. Asam asetat digunakan sebagai pelarut karena kitosan dapat larut dengan
baik dan akan membentuk larutan yang lebih kental pada konsentrasi kitosan yang
lebih tinggi (Hayes dkk, 1976). Larutan NaOH berfungsi memutuskan ikatan
antara gugus asetil dengan atom nitrogen sehingga berubah menjadi gugus amino
(NH2). Dari 1 g kitin diperoleh kitosan seberat 0,72 g kitosan (72%).

Karakterisasi Kitin Dan Kitosan


Kadar air secara gravimetri
Kadar air adalah salah satu parameter kualitas penting dari kitin, karena akan
mempengaruhi daya simpannya. Adanya kandungan air pada bahan dapat
mempengaruhi daya tahan suatu bahan terhadap serangan mikroba yang
dinyatakan dengan Aw (aktivitas water) yaitu jumlah air bebas yang dapat
digunakan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhan. Dengan kadar air kitin yang
berkisar (2-3)%, berarti kitin yang diperoleh mempunyai kestabilan kadar air kitin
2,84%. Pada penentuan kadar air kemungkinan adanya bahan lain yang mudah
menguap dan ikut menguap bersama-sama dengan air sewaktu dipanaskan. Untuk
menghilangkan air yang terikat secara fisik diperlukan panas rendah untuk
menguapkannya pada suhu 100-1050C. Semakin halus butiran-butiran padatan,
semakin banyak air yang teradsorpsi karena luas permukaan persatuan berat
bertambah (Harjadi, 1993).
Kadar abu secara gravimetri
Abu adalah sisa yang tertinggal setelah bahan dibakar sampai bebas karbon.
Sebenarnya sisa tertinggal ini merupakan unsur-unsur mineral yang terdapat
dalam suatu bahan. Pada proses pengabuan unsur-unsur itu membentuk oksidanya
atau bergabung dengan radikal seperti phosfat, sulfat, nitrat atau klorida.
Sedangkan bahan-bahan organik yang lain pada proses ini akan terus terbakar
(Bastaman, 1989). Proses yang berperan penting dalam penentuan kadar abu
adalah proses demineralisasi dan netralisasinya. Kadar abu pada kitin terutama
disebabkan oleh garam-garam anorganik Ca(PO4)2 dan CaCO3. Dari hasil
penelitian menunjukkan kadar abu kitin 1,12 % kitin yang dihasilkan digunakan
untuk diubah menjadi kitosan, karena aktivitas proses pembentukan kitosan ini
dipengaruhi oleh adanya mineral yang dapat menganggu proses deasetilasi.
Pengukuran Spektroskopi IR
a. Penafsiran Spektrum IR Hasil Fermentasi Kitin
Dari spektrum IR hasil fermentasi kitin diperoleh pita serapan pada 3388,7 cm-1
menunjukkan vibrasi ulur O-H yang melebar dan vibrasi ulur N-H amida
sekunder, pita serapan 3103,3 cm-1 menunjukkan vibrasi ulur N-H amida
sekunder, pita serapan 1627,8-16625,5 cm-1 menunjukkan vibrasi ulur C=O dan
vibrasi tekuk N-H pita amida I, pita serapan 1417,6 cm-1 menunjukkan vibrasi
ulur C-N amina alifatik, pita serapan 1261,3-1315,3 cm-1 menunjukkan vibrasi
tekuk O-H dan vibrasi ulur C-N, pita serapan 1028,0-1234,3 cm-1 menunjukkan
vibrasi ulur C-O dan vibrasi tekuk C-H dalam bidang dan pita serapan 559,3 cm-1
dirujuk sebagai vibrasi tekuk O-H keluar bidang. Spektrum IR dari hasil
penelitian ini (Gambar 3.) sesuai dengan spektrum IR kitin standar produksi Wako
Jepang (Gambar 4.), sehingga dapat disimpulkan bahwa senyawa tersebut adalah
kitin.
Gambar 3. Spektrum IR Hasil Fermentasi Kitin

Gambar 4. Spektrum IR Kitin Standar Produksi Wako Jepang


b. Penafsiran Spektrum IR Kitosan
Dari spektrum IR kitosan diperoleh pita serapan 3697,3 cm-1 menunjukkan
vibrasi ulur O-H yang tajam, pita serapan 3423,4 cm-1 menunjukkan vibrasi ulur
O-H yang melebar, pita serapan 3273,0 cm-1 menunjukkan vibrasi ulur N-H
amida sekunder, pita serapan 2987,5 cm-1 menunjukkan vibrasi ulur C-H alifatik,
pita serapan 1598,9 cm-1 menunjukkan vibrasi tekuk N-H amida sekunder, pita
serapan 1421,4 cm-1 menunjukkan vibrasi C-N amina alifatik, pita serapan
1321,1 cm-1 menunjukkan vibrasi tekuk O-H dan vibrasi ulur C-N, pita serapan
1091,6-1259,4 cm-1 menunjukkan vibrasi ulur C-O dan vibrasi tekuk C-H dalam
bidang, pita serapan 896,8 cm-1 menunjukkan vibrasi tekuk C-H keluar bidang
dan pita serapan 420,4-576,6 cm-1 menunjukkan vibrasi tekuk O-H keluar bidang.
Spektrum IR hasil penelitian ini (Gambar 5.) sesuai dengan spektrum IR kitosan
standar produksi Wako Jepang (Gambar 6.), sehingga dapat disimpulkan bahwa
senyawa tersebut adalah kitosan.

Gambar 5. Spektrum IR Kitosan


Gambar 6. Spektrum IR Kitosan Standar Produksi Wako Jepang

Derajat Deasetilasi
Menurut Bastaman (1989), kitin adalah suatu polimer N-asetil glukosamin yang
terdeasetilasi sedikit (lebih besar dari 25% dan lebih kecil dari 70%). Sedangkan
kitosan adalah kitin yang terdeasetilasi sebanyak mungkin (lebih besar dari 70%).
Derajat deasetilasi adalah persentase gugus asetil yang berhasil dihilangkan
selama proses deproteinasi kitin, dimana kitin diberi perlakuan dengan
menggunakan larutan NaOH 50% pada suhu 1000C yang menyebabkan
terhidrolisisnya gugus asetil dari gugus asetamida pada kitin. Dari hasil penelitian
diperoleh derajat deasetilasi kitin sebesar 38,8% dan derajat deasetilasi kitosan
sebesar 62,8%. Deproteinasi dengan menggunakan bakteri Pseudomonas
aeruginosa tidak menyebabkan kitin terdeasetilasi lebih lanjut sehingga
menghasilkan derajat deasetilasi kitosan yang kurang dari 70%. Deasetilasi kitin
menjadi kitosan menggunakan larutan basa NaOH 50% dengan perbandingan
berat sampel dan volume pengekstrak 1:15 (w/v) pada suhu 1000C selama 6 jam
menghasilkan derajat deasetilasi kitosan yang rendah. Hal ini disebabkan kurang
lamanya proses pemanasan dan suhu yang kurang tinggi, sehingga pemutusan
gugus asetil kurang sempurna. Besarnya derajat deasetilasi ditentukan dengan
metode garis dasar.
Penentuan Kadar Nitrogen
Banyaknya protein yang terdapat dalam kitin dapat dilihat dari persen nitrogen.
Metode yang umum digunakan untuk penentuan kadar nitrogen adalah metode
Kjeldahl. Metode ini dilakukan melalui 2 tahap yaitu destruksi dan destilasi. Pada
tahap destruksi sampel dioksidasi dengan panas dan pelarut H2SO4 pekat, karbon
dan hidrogen diubah menjadi CO2 dan H2O. Nitrogen pada amida dan amina
diubah menjadi ion amonium. Proses ini berlangsung lambat sehingga perlu
ditambahkan K2SO4 yang berfungsi untuk menaikkan titik didih. H2SO4 dan
katalis HgO untuk mempercepat reaksi. Tahap destruksi ini berlangsung selama
12 jam. Selanjutnya tahap destilasi, dimana campuran hasil destruksi didinginkan,
lalu ditambahkan dengan aquades yang disertai dengan pengocokan, kemudian
didinginkan kembali lalu ditambahkan NaOH 50% dan Na2S2O3 yang bertujuan
untuk menghasilkan amonia. Pada saat penambahan tersebut dilakukan secara
perlahan hingga terbentuk dua lapisan, kemudian diputar perlahan agar tercampur
dan didinginkan kembali. Pada saat destilasi berlangsung amonia yang dibebaskan
ditampung dalam labu penerima yang berisi HCl 0,02 N. Proses destilasi
dihentikan setelah dalam labu destilat berisi lebih dari setengah cairan. Ketika
destilasi selesai, labu penerima segera diambil untuk mencegah agar larutan tidak
terhisap balik ke dalam labu kjehdal. Lalu kondensor dibilas dengan aquades dan
ditampung pada labu penerima. Dilanjutkan dengan titrasi menggunakan NaOH
0,01 N dan sebagai indikator digunakan metil merah (AOAC Official Method
976.05 Protein (crude) in Animal Feed, 1995).
Kesimpulan
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa :
1. Kombinasi antara metode No (1989) dan Wang (1998) dapat digunakan untuk
deproteinasi polimer kitin dari kulit rajungan (Portunus pelagious) dengan
menggunakan bakteri Pseudomonas aeruginosa.
2. N,N-dimetilasetamida dan LiCl 10% merupakan pelarut efektif untuk
melarutkan kitin, hal ini terbukti dengan diperolehnya waktu panen optimum 2
hari dan pH optimum 8 yang menghasilkan produk terbanyak.
3. Deproteinasi kitin dari kulit rajungan (Portunus pelagious) menghasilkan
rendemen sebesar 93,33% dengan persen protein yang hilang 6,67%, derajat
deasetilasi 38,8%, kadar air 2,84%, kadar abu 1,12%, dan kadar nitrogen 1,17%.
4. Deasetilasi kitin menjadi kitosan menggunakan NaOH 50% memberikan
rendemen sebesar 72% dari berat awal 1 g dengan derajat deasetilasi 62,8%.