Kultur Protoplasma

Istilah protoplasma pertama kali diperkenalkan oleh Hanstein pada tahun 1880,
yang dimaksud dengan istilah tersebut adalah sel tumbuhan yang telah dikupas bagian
diding selnya atau sel tumbuhan telanjang tanpa dibungkus oleh dinding sel. Isolasi
protoplasma dapat dilakukan dengan dua cara:
1. Metode mekanikal.
Isolasi protoplasma menggunakan metode ini dikenalkan pertama kali oleh
Klercker pada tahun 1892. Isolasi protoplasma dilakukan dengan cara mengupas
dinding sel menggunakan alat bedah mikro. Metode ini telah berhasil mengisolasi
protoplasma dari daun Saintpaulia ionantha dan dikulturkan hingga tumbuh kalus.
Kelebihan dari metode ini adalah bila sel yang digunakan mempunyai vakuola sel
yang relatif besar sedangkan kelemahannya adalah: 1) Keberhasilannya rendah; 2)
Pekerjaan yang membutuhkan tenaga banyak dan membosankan; 3) Viabilitas
protoplasma rendah, karena seng terjadi kerusakan protoplasma selama proses
pengupasan dinding sel.
2. Metode enzimatik
Isolasi protoplasma menggunakan bantuan enzim. Orang pertama yang
melakukan metode ini adalah Cocking pada tahun 1960, ia mengisolasi protoplasma
menggunakan enzim selulase. Enzim selulase diisolasi dari jamur Myrothecium
verrucaria. Namun orang pertama yang menggunakan enzim komersial untuk
mengisolasi protoplasma dan berhasil meregenerasikan adalah Takabe dan kawan-
kawan pada tahun 1968.
Organ sebagai sumber protoplas
 Protoplasma yang telah berhasil diisilasi berasal dari organ-organ seperti:
daun, tangkai daun, pucuk, akar, buah, koleoptil, embrio dan mikrospora. Diantara
organ tersebut sel yang paling mudah dan bagus untuk diisolasi protoplasmanya
adalah berasal dari jaringan mesofil daun, karena:
1. Bentuk selnya relatif seragam.
2. Tdak perlu membunuh tanamannya.
3. Dinding sel mudah terkelupas oleh enzim.
Sumber protoplasma selain diperoleh dari organ tersebut di atas tetapi juga
berasal dari kalus dan sel suspensi. Untuk sumber yang berasal kalus, paling baik
berasal dari kalus yang remah (friable) dengan kandungan karbohidrat rendah
sedangkan yang berasal sel suspensi, paling baik diambil pada fase pertumbuhan
exponensial.

Salah satu teknik kultur jaringan yang dewasa ini berkembang pesat adalah teknik
kultur protoplasma. Bagian-bagaian sel tumbuhan, termasuk protoplasma, secara umum
dijelaskan pada Gambar 49. Protoplasma ini dapat diisolasi dari sel dan kemudian
dikulturkan secara in-vitro. .
Kultur protoplasma dapat digunakan untuk berbagai macam tujuan seperti
perbanyakan dan untuk memperoleh
varietas baru. Teknik yang
digunakan untuk memperoleh
hibrida ini antara lain perlakuan
protoplasma dengan mutagen dan
manipulasi genetik ditingkat sel
melalui fusi (penggabungan) dua
protoplasma dari varietas atau
spesies yang berbeda serta
penggunaan protoplasma dalam
rekayasa genetika ditingkat
molekuler dengan teknik
elektroporasi, mikro injeksi atau partikel bombardment.
 Jaringan tanaman yang digunakan sebagai eksplan untuk kultur protoplasma ini
bermacam-macam termasuk jaringan yang masih memiliki sel-sel parenchyma
(dindingnya belum berlignin).
Biasanya jaringan tanaman diiris halus lalu diplasmolisis (sedikit) dalam larutan
manitol untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) sitoplasma dg dinding selnya.
Setelah dimodifikasi, di dalam kultur protoplasma akan membentuk dinding sel
kemudian membelah membentuk koloni sel seperti kalus (callus-like cells). Protoplasma
memerlukan media tanam yang lebih kompleks untuk dapat bertahan hidup dan
beregenerasi. Biasanya ditambahkan suatu osmotikum (misalnya sorbitol, manitol) ke
dalam media awal sebelum dinding selnya terbentuk untuk mencegah plasmolisis.
Gambar 49. Sel mesofil daun.

Prosedur Kultur Protoplasma

Kultur ptotoplasma dilakukan melalui secara bertahap mulai dari persiapan

eksplan dan isolasi protoplasma diikuti dengan penanaman. Mutasi protoplasma dapat
dilakukan dengan menambahkan senaywa mutagen ke dalam media tanam atau dengan
memperlakukan protoplasma dengan senyawa mutagen tersebut. Silangan somatik
dilakukan dengan cara penggabungan dua buah protoplama segera setelah isolasi
kemudian ditumbuhkan. Prosedur kultur protoplasma secaraa umum adalah sebagai
berikut:

1. Persipan eksplan.
Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini beragam,
umumnya jaringan yang lebih muda dan berasal dari tanaman yang mempunyai umur
fisiologis muda, seperti pucuk muda (seperti dari kecambah, bibit, plantlet), pucuk
adventif hasil pangkasan. Protoplasma dari sel jaringan tersebut lebih mudah diisolasi
protoplasmanya karena dinding selnya masih sederhana dan hanya terdiri dari dinding
 sel primer saja dan jaringannya masih memiliki sel-sel parenchyma (dindingnya
belum berlignin). Selain itu, ada juga yang menggunakan jaringan yang telah dewasa,
namun media untuk isolasi protoplasma dari jaringan ini lebih kompleks karena
dinding selnya telah berlignin, telah memiliki dinding sel primer dan dinding sel
sekunder.

2. Sterilsasi eksplan.
Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu dicuci
kemudian disterilakan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 – 2 % selama 10
– 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan tersebut selanjutnya
dicuci dengan air steril (3 – 4 kali) untuk mencuci sisa sodium hipoklorit pada
eksplan.

3. Isolasi Protoplasma.
Isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzym yang dapat
mengahancurkan dinding sel. Enzym yang digunakan bervariasi jenis dan konsentrasinya
tergantung kondisi fisologis eksplan, terutama umur jaringan yang erat kaitannya dengan
komposisi dinding selnya. Berikut dikemukanan perbandingan antara dinding sel primer
dan sekunder pada sel tumbuhan.

Tabel 13. Perbandingan komposisi dinding sel primer dan sekunder

Komponen Dinding sel primer Dinding sel sekunder

Polisakarida 90 % 60 - 85 %
cellulose 30 % 50 - 80 %
hemicellulose 30 % 5 - 30 %
pectin 30 % -
Protein 10 % -
Lignin - 15 - 35 %
______________________________________________________
 Enzym yang digunakan untuk mengancurkan dinding sel tumbuhan
umumnya ada 3 yaitu:
a. Cellulase untuk menghancurkan sellulose
b. Hemicellulase untuk menghancurkan hemisellulose
c. Pectinase untuk menghancurkan pektin.

Alat-alat yang digunakan untuk isolasi dan kultur ptotoplasma adalah

sebagai berikut:
• Laminar air flow cabinet
• Centrifuge
• Inverted microscope
• Gyratory shaker
• Magnetic stirrer + hot plate
• pH meter
• Saringan stainless stell (lubang 60 - 70 µ m)
• Bacterial filter
• Nalgene filter unit 0,22 µ m
• Millex filter unit 0,45 µ m
• Spet dan jarum
• Piset dg ujung runcing + pisau kultur
• Pipet 5 ml berujung lebar
• Pipet pastur 2 ml
• Petri dish
• Gelas beker
• Parafilm/plastic wrapp

Bahan- bahan yang digunakan untuk isolasi protoplasma adalah sebagai

berikut:
• Eksplan dapat berupa: jaringan mesophyll daun, callus atau sell suspensi,
akar, tuber, bintil akar, petal, pollen, endosperm, aleurone, coleoptil, radicula
 • Ethanol 70 %
• Larutan isolasi protoplasma

4. Tahapan pengerjaan isolasi protoplasma (lihat Gambar 51, 52 dan

53)
1. Jaringan tanaman seperti daun tembakau disterilkan terlebih dahulu dengan
cara merendamnya dalam alkohol 70% selama 30 detikm selanjutnya di
rendam kedalam larutan pemutih (misalnya bayklin) 20% yang ditambah
beberapa tetes Tween selama 15 menit. Selanjutnya daun tembakau tersebut
dibilas menggunakan aquadest steril sebanyak tiga kali.
2. Jaringan tanaman steril, diiris halus dan dikupas eidermis serta dihilangkan
urat daunnya dengan menggunakan mata skalpel runcing steril, untuk lebih
memudahkan isolasi protoplasmanya.
Contoh campuran dan konsentrasi enzym yang digunakan untuk isolasi
protoplasma beragam dan tergantung dari jenis jaringan yang digunakan sebagai
eksplan, seperti:
1. Medium enzim untuk jaringan Akar
o 2 % rhozyme
o 2 % meicellase
o 0,03 % macerozyme R10
2. Medium enzim untuk daun Serealia
o 2 % cellulysin
o 0,2 % macerozyme R10
o 0,5 % hemicellullase
o 11 % mannitol
3. Medium enzim untuk Daun Tembakau:
o 0,5 % Onozuka R10 cellulase
o 0,1 % Onozuka R10 macerozyme R10
o 13,0 Mannitol
o pH 5,8
3. Untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) antara sitoplasma dengan
dinding selnya, Larutan enzim biasanya ditamhkan senyawa osmoticum.
Senyawa osmoticum yang dapat digunakan antara lain:
• Mannitol
• Sorbitol
• Glukosa
• Fruktosa
• Galaktosa
• Sukrosa
4. Setelah dinding sel lepas, selanjutnya eksplan direndam ke dalam 20 ml
larutan media preplasmolisis selama 1-8 jam. Medium preplasmolisis untuk
setiap jenis eksplan berbeda, untuk tembakau medium preplasmolisis tersusun
atas medium isolasi protoplasma ditambah 13% mannitol.
Komponen Medium Isolasi Protoplasma (MIP) adalah sebagai berikut:
o CaCl2.H2O 1480,0 mg/l
o KH2PO4 27,2 mgl
o KNO3 101,0 mg/l
o MgSO4.7H2O 246,0 mg/l
o CuSO4.5H2O 0,025 mg/l
o KI 0,16 mg/l
o pH 5,8
5. Eksplan dipindah larutam medium enzim (komposisi media ini juga berbeda-
beda untuk setiap jenis eksplan yang digunakan) untuk daun tembakau
komponennya dapat dilihat di atas. Eksplan dipindah ke tabung steril dan
dituangi medium enzim sebanyak 10 ml, lalu tabung ditutup dengan
aluminium foil steril dan diisolasi menggunakan parafilm atau plastik wrap.
Tabung berisi eksplan tersebut digoyang pada shaker dengan kecepatan 40
rpm selama semalam atau 4-16 jam.
5. Pemurnian protoplasma
1. Protoplasma dalam poin 5 disaring dengang filter steril, mess 63 µm,
masukkan ke dalam gelas piala volume 250 ml menggunakan pipet pastuer.
2. Medium pencuci (MIP ditambah + 10 %) sebanyak 3 ml ditambahkan ke
dalam cawan petri yang berisi debris dari daun, digoyang perlahan dan
kombinasikandengan protoplas/ campuran enzim dalam gelas piala vol. 250
ml.
3. Protoplas yang diperoleh dicuci dengan medium pencuci dan saring. Protoplas
yang masih tercampur dengan larutan enzim disentrifuge dengan kecepatan
50 x g selama 10 menit.
4. Pelet diresuspensi dalam medium pengapung (medium flotasi) 10 ml
ditambah medium pencuci 1 ml selanjutnya disentrifuge, protoplasma akan
melayang-layang diantara medium flotasi (MIP + 20%) dan medium pencuci.
5. Protoplasma yang melayang-layang dipindahkan ke dalam tabung ditambah
10 ml medium pencuci, selanjutnya disentrifuge maka protoplasma akan
mengendap sebagai pelet.
6. Supernatan dibuang dan pelet ditambah 10 ml medium pencuci dan diputar
lagi.
7. Supernatan dibuang sisakan suspensi protoplasma sebanyak 1 ml.
8. Kerapatan suspensi protoplasma yang dikulturkan untuk setiap spesies
tanaman berbeda-beda seperti tembakau suspensi protoplas kerapatannya
50.000 sel/ ml dan 25000 sel/ ml untuk protoplasma petunia, protoplasma
tersebut dikulturkan dalam cawan petri steril..

6. Perhitungan konsentrasi dan test viabilitas protoplasma.

Uuntuk menghitung kerapatan dapat dihitung dengan bantuan haemocitometer:
jumlah sel / grid x 10.000. Tes viabilitas protoplasma dilakukan dengan
menggunakan senyawa flourescent seperti fluresein diacetate (FDA). Medium kultur
diambil 25 tetes selanjutnya ditambah 1 tetes larutan pewarna FDA dan 1 tetes
protoplasma suspensi tersebut agar protoplas tercat dengan baik, selanjutnya dilihat di
 bawah mikroskop. Protoplasma yang mati berwarna merah dan yang viable tercat
hijau.

7. Kultur protoplasma
Protoplasma yang hidup diambil dalam jumlah memadai (frekuensi protoplas
viable 100 – 200 sel) selanjutnya ditanam pada media yang telah disediakan dan
dikulturkan dan disimpan tempat gelap pada temperatur 28 oC selama semalam.
Kultur proplasma dipindahkan pada cahaya rendah (10 – 20 µmol.detik-1m-2) dengan
cahaya lampu putih yang dingin dan fotoperiode 16 jam, selama 2 hari. Kultur
dipindahkan pada intensitas cahaya yang lebih tinggi (50 – 75 µmol.detik-1m-2).
Media yang digunakan untuk kultur protoplasma dapat berupa media media cair
yang diletakkan dalam cawan petri kecil atau media padat media padat (dengan
pemadat agarose). Media yang digunakan untuk kultur protoplasma jauh lebih
kompleks dibandingkan dengan media untuk teknik kultur lainnya, karena
protoplasma belum memiliki dinding sel sehingga perlu ditanam pada media awal
yang diperkaya dengan osmotikum (misalnya sorbitol atau mannitol) untuk:
menghindari plasmolisis. Salah satu contoh media kultur protoplasma tembakau
(tabel 14).
Tabel 14. Formula media kultur protoplasma tembakau
Formula mg/l Formula mg/l Formula
Ca(H2PO4).H2) 100,000 H2BO3 3,00 Mannitol 1
CCl2.2H2O 50,000 KI 0,75 Inositol
KNO3 500,000 MnSO4.4H2O 13,20 Nicotinic acid
MgSO4.7H2O 50,000 Na2MoO4.2H2O 0,25 Pyridoxine-HCl
NaH2PO4.2H2O 170,000 ZnSO4.7H2O 2,00 Thiamine-HCl
(NH4)SO4 134,000 Sequestrene 330 28,00 2,4-D
CoCl2.6H2O 0,025 sucrose 10.000,00 NAA
CuSO4.5H2O 0,025 Glukose 18.000,00 BA
Catatan: pH: 5,8

Penanaman protoplama ke dalam media dilakukan dengan cara mencampur

protoplama dengan larutan agarose. Campuran disedot dengan pipet pasteur steril
kemudian diteteskan pada cawan petri steril (5 – 10 tetes per petri). Cawan petri
ditutup dengan parafilm selanjutnya kultur diletakkan pada ruang kultur dengan suhu
 25°C dan diberikan 16 jam penyinaran. Setiap 2 minggu ditambahkan media baru ke
bagian tetesan protoplasma tersebut.

8. Teknik Kultur Protoplasma

Protoplasma yang telah dimurnikan biasanya dikulturkan dengan dalam medium
agar semisolid dan liquid. Protoplasma sering dikulturkan dalam media liquid untuk
meregenerasi dinding sel terlebih dahulu, sebelum dikulturkan ke media agar. Media
semisolid agar, agar yang digunakan untuk kultur protoplasma adalah khusus: yaitu gel
agar lunak, salah satunya agarose
Teknik media liquid biasanya digunakan pada fase awal kultur, karenas:
• Mudah larut dan diserap.
• Beberapa spesies, protoplasmanya tidak dapat membelah
dalam media agar.
• Tekanan osmotik media direduksi secara efektif.
• Kerapatan sel-sel dapat direduksi setelah beberapa hari
dikulturkan.
Kelemahan dari teknik ini tidak boleh diisolasi dari turunan koloni tunggal
yang berasal dari sel induk satu. Teknik media liquid dapat dibedakan menjadi dua
metode
1. Metode liquid tetes
Dengan menggunakan pipet ukuran 100-200 µl, suspensi protoplasma dalam
media diteteskan pada cawan petri ukuran 60mx15m sebanyak 5-7 tetes. Cawan
petri ditutup dan direkatkan dengan parafilm atau plastik wrap selanjutnya
diinkubasikan. Setiap 5-7 hari tambahkan medium segar baru dengan cara
meneteskan langsung pada tetesan suspensi protoplasma yang telah mengalami
pertumbuhan. Metode ini biasanya baik untuk keperluan pengamatan dengan
mikroskop. Kelemahan dari metode ini adalah tetesan-tetesan suspensi menyatu
menjadi satu tetesan di pusat.
2. Metode tetes menggantung
Dengan menggunakan pipiet volume 40-100 µl, suspensi protoplasma
diteteskan di dalam tutup cawan petri, selanjutnya cawan petri, ditutupdengan
 menggunakan tutup yang telah ditetesi suspensi protoplasma, sehingga tetesan
suspensi tersebut akan menggantung di dalam tutup cawan petri tersebut.

9. Pembentukan Dinding Sel

Perkembangan protoplama diawali dengan regenerasi atau terbentuknya dinding
sel diikuti terbentuknya koloni sel menyerupai kalus. Pada beberapa spesies,
protoplasma membentuk kalus dan beregenerasi melalui organogenesis atau
embryogenesis.

10. Regenerasi Protoplama

Regenerasi protoplasma membentuk koloni sel kemudian tanaman lebih sulit
dibandingkan sengan teknik kultur jaringan jaringan lain. Salah satu teknik yang
digunakan untuk merangsang regenerasinya adalah menggunakan sel-sel lain (sebagai
perawat) sehingga tekniknya disebut dengan teknik “Nurse Culture”. Untuk kultur
satu protoplasma, “nurse cells” diletakkan berdekatan dengan kultur protoplasmanya
untuk mendukung pertumbuhan dan perkembangan protoplasma. Teknik ini pertama
kali diperkenalkan oleh Muir dkk.
Tanaman yg dihasilkan dari kultur protoplasma bisa seragam atau bervariasi,
disebut “protoclonal variation”. Apabila dalam penanaman protoplasma ditambahkan
mutagen ke dalam media, maka hasil regenerasi akan berupa generasi baru.
Produksi tunas dapat dilakukan pada media cair, umumnya ke dalam media
ditambahkan hormon pertumbuhan sitokinin (misalnya 0,5 µ M BAP). Setelah tunas
terbentuk cukup besar, tunas selanjutnya dalat diakarkan. Salah satu contoh media
pengakatran protoplasma adalah 1/2 MS + 3-aminopyridine (untuk tembakau) atau
picloran (untuk tebu). Plantlet yang cukup besar selanjutnya diaklimatisai kemudian
ditanam di lapangan.

Silangan Somatik
 Secara alamiah persilangan terjadi hanya persilangan sexual antar kerabat dekat
dalam satu jenis (species). Persilangan sexual telah dipergunakan bertahun-tahun untuk
perbaikan tanaman budidaya. Sayangnya persilangan sexual hanya terbatas pada kultivar-
kultivar dalam satu spesies atau yang terbaik pada beberapa spesies liar yang mempunyai
hubungan kekerabatan terdekat dengan tanaman budidaya. Adanya pembatas antar
spesies tanaman maka persilangan seksual kurang berfungsi.
Peleburan sel (fusi sel) somatik dapat mengarah ke pembentukan sel hibrid viable
yang dapat digunakan sebagai cara/ metode untuk menghilankan pembatas antar spesies
yang terjadi pada persilangan seksual. Protoplasma tanaman merupakan ladang dari
genetik sel somatik untuk perbaikan tanaman. Teknik produksi hibrid melalui fusi
protoplasma yang telah diisolasi dari sel somatik (tubuh) secara in vitro dan berkembang
menjadi heterokarion yang menjadi satu persilangan tanaman, dikenal sebagai
Hybridisasi somatik. Prosedur ini termasik mengabaikan unsur sel dalam hibridisasi.
Dalam persilangan somatik, inti dan sitoplasma dari kedua induk menyatu dalam sel
silangan. Kadang-kadang genom inti dari berasal hanyadari satu induk yang melebur,
tetapi kadang juga terjadi gen sitoplasmik (plastome) berasal dari kedua induk yang ada
dalam proses peleburan, hal ini dikenal dengan cybrid (cytoplasmic hybrid).
Jadi teknik peleburan protoplasma dapat digunakan untuk menghilangkan
pembatas dari incompatibilitas dan sebagai manipulasi genetik dari sel tanaman.
Persilangan somatik bermanfaat untuk persilangan antar spesies yang berbeda takson dari
tingkat marga sampai tingkat divisi, untuk menciptakan sel-sel dengan genetik baru, inti
yang sebagus pada sitoplasmik yang tidak mungkin didapatkan dengan metode
persilangan seksual..
Kegiatan persilangan somatik meliputi:
• Peleburan protoplasma (fusi protoplasma)
• Seleksi sel silangan
• Identifikasi tanaman silangan.

Fusi Protoplasma (lihat gambar 52 dan 53)

 Peleburan protoplasma dari 2 genom yang berbeda dapat diperoleh baik secara
spontan ataupun dengan teknik pemacuan peleburan.
Metode peleburan spontan
Peleburan protoplasma secara spontan biasanya terjadi karena membran protoplas
yang sangat tipis dan lunak sehingga mudah sobek atau pecah yang dapat mengakibatkan
peleburan protoplasma. Biasanya terjadi pada protoplasma yang diisolasi dari kalus.
Perleburan protoplasma dengan teknik ini biasanya terjadi pada protoplasma yang
mempunyai asal tanaman yang sama sehingga tidak bernilai untuk perbaikan tanaman.

Metode pemacuan peleburan

Untuk mencapai peleburan protoplasma diperlukan adanya agensia untuk memacu
terjadinya peleburan protoplasma (dikenal sebagai fusagen) yang berbeda jenis
tanamannya. Larutan fusagen contohnya:
Perlakuan dengan sodium nitrat: 5,5% sodium nitrat dalam larutan 10% sukrose
dan kultur diinkubasikan dalam water bath bersuhu 35o C selama 5 menit selanjutnya
disentrifuge dengan kecepatan 200 g selama 5 menit. Subernatan dibuang dan pelet
disimpan dalam water bath bersuhu 35o C selama 30 menit. Pada beberapa saat
protoplasma akan terjadi peleburan. Agregat ditiangkan secara hati-hati pada medium
kultur yang telah ditambah 0,1% NaNO3. Teknik ini akan dihasilkan dengan frekuensi
rendah bila asal protoplasmanya dari mesofil daun (Power dkk. (1970 dalam Chawla
2002).
Perlakuan ion calsium padas pH tinggi . Teknik ini telah digunakan pada
protoplasma tembakau. Caranya protoplasma yang telah diisolasi ditambahkan larutan
fusagen berupa 0,5 M mannitol yang berisi 0,05 M CaCl2.2H2O pada pH 10,5 selanjutnya
disentrifuge dengan kecepatan 50 g selama 3 menit. Selanjutnya tabung sentrifuge
disimpan dalam water bath bersuhu 37o C selama 40-50 menit hingga protoplasma
melebur (Keller dan Melchers (1973 dalam Chawla 2002).
Perlakuan polyethelene glycol (PEG). Dari sekian banyak metode peleburan
protoplasma, metode ini yang yang berhasil dengan baik untuk melebur protoplasma.
Suspensi protoplasma dilarutkan dalam larutan PEG: 1 ml suspensi protoplasmadalam
medium kultur dicampur dengan 1 ml 28-56% PEG (1500-6000 MW). Tabung digoyang
selama 5 detik dan biarkan berhenti 10 menit. Selanjutnya suspensi protoplasma tersebut
dipindahkan dari larutan PEG dengan cara mencucinya menggunakan medium kultur
sebanyak 2 kali. Hasil peleburan protoplasma ini berupa pembentukan heterokarion
dengan frekuensi yang tinggi, sedangkan kebanyakan tipe sel sitoplasmik dengan
pembentukan hetekarion binukleat rendah (Kao dan Michayluk (1974 dalam Chawla
2002).
Perlakuan peleburan elektro (elektrofusion). Protoplasma diletakkan di dalam sel
kultur yang kecil dan berisi elektrode yang berbeda potensialnya, protoplasma diletakkan
diantara barisan elektrode-elektrode. Selanjutnya protoplasma diberi shok gelombang
pendek elektrik yang akan mengiduksi terjadinya peleburan protoplasma. Dalam metode
ini ada dua tahapan prosedur yang dimulai dengan penggunaan AC dari intensitas rendah
untuk suspensi protoplasma. Kolektor dielektroforetik diatur 1,5 V dan 1 MHz dan
konduktivitas elektirk dari medium suspensi kurang dari 10-5 detik/cm efek sebuah
elektroforesis dijalankan akan membuat masing-masing sel berbenturan sepanjang alur
barisan elektrode (lihat gambar 5). Tahap kedua injeksi aliran listrik DC dengan
intensitas tinggi (750-1000V/cm) dengan waktu yang sangat singkat yaitu 20-50 µdetik
menyebabkan membran protoplasma robek dan akan menghasilkan peleburan yang
selanjutnya membran akan mengalami reorganisasi. Teknik fusielektro sangat sederhana,
cepat dan efisien. Sel-sel yang telah di fusikan secara eletronik tidak menunjukkan respon
yang sitotoxit. Namun metode ini jarang digunakan.
Contoh-contoh hasil peleburan protoplasma dapat dilihat pada tabel di bawah ini.

Tabel 15. Jumlah kromosom dalam beberapa persilangan interspesifik dan intergenerik
yang diproduksi melalui peleburan protoplasma.
No Jenis tanaman dengan Jumlah kromosom
jumlah kromosomnya hasil persilangan
INTERSPESIFIK
1 Brassica oleracea (2n = 18) Variasi luas
+ B. campestris (2n = 18)
2 Nicotiana tabacum (2n = 50-58
48) + N.
glutinosa (2n = 24)
 3 Nicotiana tabacum (2n = 96
48) + N.
nesophila (2n = 48)
4 Lycopersicon esculentum 72
(2n = 24) + L.
peruviarum (2n = 24)
5 Solanum tuberosum (2n = 60
24, 48) + S.
chacoense (2n = 14)
INTERGENERIK
No Jenis tanaman dengan Marga (Genus)
jumlah kromosomnya baru
6 Raphanus sativus (2n = 18) Raphanobrassica
+ B. oleracea (2n = 18)
7 Solanum tuberosum (2n = Solanopersicon
24) + L.
esculentum (2n = 24)
Nicotiana tabacum (2n = Nicotiopersicon
24) + L.
esculentum (2n = 24)

Tabel 16. Pemindahan sifat genetik melalui peleburan protoplasma.

No Persilangan somatik Sifat (resistan)
1 Nicotiana + N. Tobacco mosaic
tabacum nesophila virus
2 Solanum + S. Potato leaf roll
tuberosum brevidens virus
3 Brassica + B. napus Black rot
oleracea (Xanthomonas
campestris
4 Citrullus + Cucumis Club rot resistance
lanatus melo
5 Hordeum + Daucus Toleran terhadap
vulgare carota pembekuan dan
garam
 Meningkatkan kualitas Sifat
6 N. rustica + N. tabacum Kandungan nikotin
tinggi
7 B. napus + Eruca Erucic acid rendah
sativa
Sifat Agronomik (dipindah melalui pembentukan
cybrid)
8 N. tabacum + N. Resisten terhadap
sylvestris Streptomycin
9 B. nigra + B. napus Resisten terhadap
Hygromycim
10 S. nigrum + S. Resisten terhadap
tuberosum Triazine

1. Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press Limited.
England. 236 p.
2. Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland University of
Technology Printing Unit Garden's Point Campus. Queensland. 80p.
3. Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture general
principles and commercial applications. Queensland Department of Primary
Industries. Brisbane. 31 p.
4. Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor.
Bogor. 304 h.
5. Han, H. (ed.), 1981. Plant tissue culture. Proceedings of syposium on plant tissue
culture. Pitman Publishing Pty Ltd., Melbourne. 531 p.
6. Sharp, R.R., D.A. Evans, P.V. Ammirato & Y. Yamada, 1985. Handbook of plant
cell culture. Vol. 2. Crop species. Collier Macmillan Publisher. London.
7. Street, H.E., 1974. Tissue culture and plant science. Academic Press. London.
502 p.
8. Trigiano, R.N. & D.J. Gray, 2000. Plant Tissue culture concepts and laboratory
exercises. 2nd Adt. CRC Press. New York
9. Vasil, K., 1984. Cell culture and somatic cell genetics of plant. Vol. I. Laboratory
procedures and their aplication. Academic Press. Inc. London.
10. Winkelmann, T., 1993. Use of a Protoplast Regeneration System for African Violet
Improvement African Violet Vol. 46(6), Pp. 50-52 (1993). Diakses dari http://aggie-
horticulture.tamu.edu/tisscult/proto/wink/wink.html, 5-2-2007.

KEMBALI DAFTAR ISI LANJUT