Enzim PDF
Enzim PDF
II.1 Enzim
Enzim merupakan biokatalisator, terdapat dalam semua sistem hidup. Enzim dapat
mengaktifkan, mengkatalisis dan mengendalikan reaksi kimia yang penting untuk
mempertahankan keberadaan organisme itu sendiri. Berbeda dengan katalisator kimia
biasa, enzim mempunyai karakteristik yang sangat spesifik. Pada reaksi yang tidak
dikatalisis enzim dapat terjadi macam-macam produk samping. Sedangkan pada reaksi
yang dikatalisis enzim, hanya menghasilkan produk yang spesifik dari substrat yang
spesifik pula (Voet & Voet, 2006).
Substrat akan terikat dengan enzim pada bagian yang sangat spesifik, yang disebut sisi
aktif atau sisi katalitik enzim. Sisi aktif enzim tersebut hanya merupakan bagian yang
relatif kecil dibandingkan dengan molekul enzim (Matthews, 2000).
Dalam reaksi enzimatik, bila konsentrasi substrat tetap maka kenaikan laju reaksi
berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Sedangkan bila konsentrasi enzim yang
5
tetap, maka kenaikan laju reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi substrat. Tetapi
pada konsentrasi substrat yang tinggi, laju reaksi tidak meningkat lagi dengan
bertambahnya konsentrasi substrat. Pada keadaan ini laju reaksi mencapai batas
maksimum dan enzim seolah-olah sudah jenuh dengan substrat.
Secara sederhana, hipotesis Michaelis-Menten dapat dituliskan sebagai berikut :
k1
k 3 P + E
E +S ES
k2
Dengan : E = enzim bebas
S = substrat
ES = kompleks enzim substrat
P = produk / hasil reaksi
k1 = tetapan kesetimbangan reaksi pembentukan ES
k2 = tetapan kesetimbangan reaksi penguraian ES
k3 = tetapan kesetimbangan reaksi pembentukan produk.
Laju reaksi awal suatu reaksi enzimatis dapat dituliskan sebagai V = k3 [ES], karena baik
[ES] maupun k3 tidak dapat diukur langsung, maka untuk menghitung v harus dicari dulu
besaran-besaran lain yang dapat diukur langsung. Pada keadaan tunak (steady state)
berlaku [E] = [E]0 - [ES] dengan [E]0= konsentrasi enzim mula-mula.
Maka : Laju pembentukan ES = k1 [E] [S] = k1 {[E]0 [ES]} x [S]
Laju penguraian ES = k2 [ES] + k3 [ES]
Untuk reaksi berkesetimbangan (reversibel) laju pembentukan ES sama dengan laju
penguraian ES sehingga : k1 {[E]0[ES]} x [S] = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2+k3)[ES]
[E]0[S]
sehingga diperoleh persamaan : [ES] =
K M + [S]
[E]0[S]
V = k3 [ES] = k3
K M + [S]
6
Jika [S] >> sehingga E semuanya menjadi ES, maka [ES][E]o akibatnya k3 [E]o = Vmaks
Vmaks menyatakan banyaknya molekul yang terbentuk atau substrat yang diolah secara
[S]
maksimum, sehingga diperoleh persamaan Michaelis-Menten : V = V maks
K M +[S]
Penentuan nilai Vmaks dan KM langsung dari grafik persamaan Michaelis-Menten tidaklah
selalu memuaskan karena grafiknya membentuk kurva sehingga menyulitkan untuk
melakukan ekstrapolasi dengan akurat. Lineaweaver-Burk (1934) menyelesaikan masalah
diatas dengan menata ulang persamaan Michaelis-Menten ke dalam bentuk persamaan
1 KM 1 1
linear: = +
V V maks [S] V maks
Nilai Vmaks dan KM ditentukan dengan plot Lineaweaver-Burk seperti gambar II-1
dibawah ini
Kemiringan = KM/Vmaks
Perpotongan = 1/Vmaks
Bila nilai KM semakin besar berarti ikatan kompleks ES semakin lemah atau afinitas
enzim terhadap substrat kecil. Sebaliknya jika nilai KM kecil berarti ikatan kompleks ES
semakin kuat atau afinitas enzim terhadap substrat besar. Nilai KM bersifat spesifik untuk
7
setiap enzim terhadap substrat tertentu yang dipengaruhi oleh waktu inkubasi dan tingkat
kemurnian enzim (Fersht, 1999)
Sumber enzim katalase cukup banyak, murah dan mudah didapat. Typical Katalase,
bagian jenis yang paling besar, ditemukan di dalam hampir semua organisma, kedua-
duanya prokarya maupun eukarya (Delpech, 2007).
Struktur detail dari katalase berbeda dari satu makhluk hidup dengan yang lain, tetapi
struktur kuartener analog dengan Hb dimana katalase mempunyai beberapa unit dan
masing-masing mengandung 500-residu sub unit Fe pada pusat cincin prophyrin seperti
dilihat pada gambar II-2 berikut :
Gambar II-2 Struktur heme Katalase dan Haemoglobin dengan K lambang untuk protein
katalase dan G lambang untuk protein globin.
8
Enzim katalase (EC 1.11.1.6) adalah bagian terbesar bodyguard makhluk hidup dalam
melindungi tubuh dari bahaya radikal bebas anion superoksida, suatu hasil samping dari
metabolisme lemak dan karbohidrat (Walsh, 1979).
.
O2 B e rb a h a ya
su p e ro k sid a d ism u ta se
.
H 2O 2 OH B e rb a h a ya
k a ta la se
g lu ta tio n p e ro k sid a se H 2O + O 2
H 2O
Gambar II-3 memperlihatkan bahwa enzim superoksida dismutase (SOD) adalah garis
pertama yang melawan radikal bebas anion superoksida yang diubah menjadi hidrogen
peroksida. Hidrogen peroksida masih bersifat racun untuk sel. Katalase adalah jawaban
untuk mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen yang sama sekali tidak
berbahaya bagi tubuh, dimana pada reaksi ini hidrogen peroksida direduksi dan
dioksidasi (Luck, 1974).
Mekanisme reaksi katalisasi dari katalase dianggap sebagai proses dua langkah, yaitu :
1. Satu molekul hidrogen peroksida direduksi menjadi air dan katalase dioksidasi
menjadi kompleks I.
2. Satu molekul hidrogen peroksida dioksidasi menjadi oksigen dan kompleks I
direduksi menjadi katalase.
Reaksi penguraian ini mengikuti reaksi orde pertama sekurang-kurangnya reaksi dengan
waktu pendek (kurang dari 3 menit) pada konsentrasi enzim yang relatif tinggi
(Murshudov, 1992).
Umbi tanaman kentang yang biasa dimakan, dinamakan kentang juga dan sudah
termasuk salah satu makanan pokok penduduk Indonesia. Granola dan atlantik
merupakan dua varietas kentang yang sudah cukup lama dibudidayakan di Indonesia.
Granola mempunyai kekhasan sebagai kentang sayur, sedangkan atlantik merupakan
bahan baku industri kripik kentang (Wales, 2001).
Pada tahun 1990 kentang yang dijual dipasaran lokal Perancis berhasil diisolasi,
dimurnikan dan ditentukan sifat enzim katalasenya. Isolasi dilakukan dengan sonikasi
dan sentrifugasi, sedangkan pemurnian dilakukan dengan fraksinasi amonium sulfat,
kromatografi filtrasi gel dan kromatografi affinitas. Enzim katalase murni yang
10
dihasilkan sebanyak 35% dengan aktivitas spesifik 3000 unit/mg protein. Beberapa sifat
yang ditentukan dari enzim murni yang dihasilkan diantaranya adalah massa molekul
sub-unitnya 56 2 kDa, massa molekul proteinnya 224 8 kDa, konsentrasi substrat
optimum 30mM, pH optimum antara 6,2 sampai 7,5 (Beaumont et al, 1990).
II.4.1 Sentrifugasi
Sentrifugasi memiliki berbagai kegunaan, tapi kegunaan utamanya adalah untuk preparasi
sampel biologis dan pengukuran analitik sifat-sifat hidrodinamik makromolekul yang
telah dimurnikan atau organel sel. Pada sentrifugasi suatu sampel biologis diberi suatu
gaya yang besar dengan memutar sampel tersebut pada kecepatan yang sangat tinggi.
Pada keadaan seperti ini, menyebabkan terjadinya sedimentasi partikel, organel sel atau
makromolekul pada suatu kecepatan yang tergantung pada massa, ukuran dan kecepatan
(Boyer, 1993).
11
Suatu partikel, baik itu berupa makromolekul atau organel sel, jika diberi suatu gaya
sentrifugal ketika diputar dengan kecepatan yang tinggi, maka akan timbul gaya
sentrifugal. Gaya sentrifugal (F) dinyatakan dengan persamaan (Boyer, 1993):
F = mr
dengan : F = Kekuatan gaya sentrifugal
m = massa efektif partikel yang diendapkan
= kecepatan sudut perputaran (rad/detik)
r = jarak perpindahan partikel dari pusat sumbu perputaran
Gaya yang menyebabkan partikel-partikel bersedimentasi bertambah dengan
bertambahnya kecepatan perputaran dan jarak partikel dari sumbu rotasi. Suatu ukuran
yang umum untuk F, sebagai pengganti kekuatan gravitasi bumi (g), adalah relatife
centrifugal force (RCF), yang dinyatakan dengan rumus (Boyer, 1993):
RCF = (1,119X10-5)(rpm)(r)
dengan : rpm = revolution per minute
r = jarak partikel terhadap sentrifugasi (cm)
Tujuan utama sentrifugasi dalam pemurnian enzim adalah untuk memperoleh endapan
yang padat dan supernatan yang jernih (Scopes, 1994).
potensial zeta menjadi nol dan akibatnya protein akan terendapkan. Proses ini dikenal
sebagai salting out. Efek ini terjadi karena adanya perubahan molekul-molekul air oleh
konsentrasi garam yang tinggi (Holme & Peck, 1993).
Garam-garam yang efektif untuk digunakan pada proses pengendapan protein adalah
garam multianionik, seperti sulfat, fosfat dan sitrat. Jenis kation tidak terlalu penting,
namun harus tidak membentuk kompleks karena kation-kation kompleks akan
berinteraksi dengan protein. Suatu keuntungan fraksionasi dengan garam ammonium
sulfat adalah terjadinya suatu stabilisasi protein. Suatu suspensi potensi atau kristal hasil
pengendapan ammonium sulfat stabil untuk beberapa tahun. Selain itu, konsentrasi garam
yang tinggi juga mencegah terjadinya proteolisis dan aktivitas bakteri (Scopes, 1994).
II.4.3 Dialisis
Teknik dialisis ini digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang memiliki berat
molekul yang kecil dengan molekul-molekul yang memiliki berat molekul yang besar,
sehingga dapat digunakan untuk proses desalting. Selain itu proses dialisis ini dapat
digunakan untuk menyetimbangkan suatu larutan sampel dengan kondisi awal yang akan
digunakan pada proses pemisahan selanjutnya.
Proses dialisis dilakukan dengan memasukan suatu larutan sampel yang mengandung
makromolekul dan molekul yang kecil ke dalam suatu membran yang berpori. Membran
yang sudah berisi larutan sampel ditempatkan pada suatu wadah yang berisi larutan
penyangga dengan kekuatan ion yang rendah. Pori-pori membran terlalu kecil untuk
dapat terjadi difusi makromolekul yang besar. Sedangkan molekul-molekul yang kecil
dapat dengan bebas berdifusi. Lewatnya molekul-molekul yang kecil melalui membran
terus berlangsung sampai konsentrasi di dalam dan di luar membran sama (Boyer, 1993).
pH dan komposisi larutan. Karena perubahan komposisi larutan dapat mengubah muatan
yang diemban oleh suatu molekul, maka hal ini dijadikan suatu dasar pemisahan pada
kromatografi pertukaran ion (Holme & Peck, 1993).
Kromatografi pertukaran ion merupakan salah satu jenis kromatografi adsorpsi yang zat
terlarutnya bersifat ionik berinteraksi secara elektrostatik dapat balik dengan fasa diam
yang bermuatan (Boyer, 1993). Penukar ion memanfaatkan muatan total protein yang
berbeda pada pH tertentu, dan matrikss penukar ion berinteraksi dengan protein
berdasarkan pada gaya tarik elektrostatik (Scopes, 1994).
Penukar ion terdiri atas matriks yang tidak larut dalam air yang mengikat gugus-gugus
bermuatan secara kovalen. Gugus bermuatan tersebut dapat bergabung dengan counter
ion seperti, ion logam, ion klorida, dan ion-ion dari buffer. Ion-ion tersebut dapat diganti
oleh ion-ion lain tanpa mengubah matriks (Boyer, 1993).
Ada dua golongan penukar ion, yaitu penukar anion (matriks bermuatan positif) dan
penukar kation (matriks bermuatan negatif). Dari dua macam penukar ion ini, ada
berbagai jenis matriks yang berbeda dalam hal substituen kimianya, derajat substitusi dan
jenis keterikatan substituen (Scopes, 1994).
Penukar anion yang paling umum digunakan adalah dietilaminoetil- (DEAE-), dan
aminoetil kuartener (TEAE-, QAE-). Setiap adsorben ini memiliki satu muatan positif
pada atom nitrogen. Pada substituen kuartener muatan positif ini tidak dapat berdisosiasi.
Namun pada adsorben DEAE, proton pada atom nitrogen berdisosiasi pada pH yang
tinggi membentuk suatu matriks yang tidak bermuatan di atas pH 9,5. Selain itu,
adsorben DEAE tidak bemuatan sebagian pada pH netral, dan bahkan tidak sepenuhnya
terprotonisasi pada pH 6. Meskipun ini berarti pada kondisi operasi (pH 7 sampai 8),
adsorben ini hanya sebagian terprotonisasi, matriks ini dapat bertindak sebagai
penyangga kuat, dan ini merupakan suatu hal yang mendukung pemisahan yang tidak
dapat terjadi pada sustituen kuartener (Scopes, 1994).
14
Penukar kation dibagi menjadi tiga kategori kimia, yaitu penukar kation lemah, misalnya
substituen karboksimetil, penukar kation kuat, misalnya gugus sulfonat (S- dan SP-) dan
fosfat. Adsorben karboksimetil- paling luas penggunaannya, dan bermuatan penuh diatas
ph 4,5. Tetapi penggunaan pada pH di bawah 4, digunakan jenis sulfo yang lebih kuat,
karena gugus karboksimetil menjadi terprotonasi dan menjadi tidak bermuatan pada pH
di bawah 4,5. Gugus sulfonat terikat pada matriks melalui rantai propil dan hidroksipropil
(Scopes, 1994).
Pada proses pemisahan dengan kromatografi penukar ion dapat terjadi dua tahap. Tahap
pertama jika protein yang dipisahkan bermuatan sama dengan muatan gugus pada
matriks, maka protein tersebut akan terelusi dengan mudah oleh buffer awal sehingga
keluar terlebih dahulu dari kolom. Tahap kedua, jika muatan pada protein berlawanan
dengan muatan pada gugus matriks, maka protein akan terikat pada matriks oleh gaya
elektrostatik yang berbeda. Untuk melepaskan protein tersebut diperlukan eluen dengan
kekuatan ion yang berbeda pula. Semakin kuat protein terikat pada matriks, maka
diperlukan eluen dengan kekuatan ion yang semakin besar (Scopes, 1994).
Metode penentuan kandungan protein dalam pemurnian enzim yang paling banyak
digunakan adalah Metode Bradford menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai
protein standar. Hal ini disebabkan karena pereaksi Bradford dapat bereaksi sempurna
dalam waktu singkat 2 menit; mudah digunakan; sensitif; tidak terkontaminasi dengan
kation seperti K+, Na+, dan Mg2+; tidak berinterferensi dengan amonium sulfat, polifenol,
karbohidrat; dan dapat mengukur protein dengan bobot molekul 40.000 daltons.
Pereaksi Bradford ada yang sudah tersedia dalam bentuk kit (Bio Rad) atau dibuat sendiri
secara manual (Stoscheck, 1990)
muatan dan ukuran molekul akan identik untuk semua protein dan pemisahan terjadi
hanya karena adanya perbedaan berat molekul, sehingga terpisah karena proses
penyaringan molekul melalui pori-pori gel (Scopes, 1994).
Ada dua keuntungan utama menggunakan SDS-PAGE dibandingkan dengan
elektroforesis biasa, yaitu (Scopes, 1994):
1. Agregat dan partikel-partikel yang tidak larut seringkali menyebabkan hasil yang
tidak baik jika dilakukan pemisahan dengan elektroforensis biasa, karena adanya
pori-pori yang terhalang. Ketika didenaturasi, agregat-agregat ini akan menjadi larut
dan berubah menjadi polipeptida tunggal.
2. Mobilitas suatu protein ditentukan oleh ukuran polipeptidanya, sehingga dapat
langsung menentukan berat molekul dari tiap komponen yang ada pada sampel.
Dalam mata pelajaran Biologi semester 1 kelas XII terdapat standar kompetensi 2, yaitu
Siswa mampu menganalisis proses metabolisme dan implikasinya pada sains,
lingkungan, teknologi, dan masyarakat (salingtemas) yang memuat materi pokok tentang
enzim sebagai biokatalisator (Depdikbud, 2007). Pada Materi pokok Enzim dijelaskan
tentang konsep susunan enzim, ciri-ciri enzim, penamaan enzim, cara kerja enzim dan
inhibitor (Syamsuri dkk, 2007). Pengalaman belajar siswa yang diharapkan diantaranya
melakukan praktik uji enzim katalase dengan berbagai perlakuan untuk mendeskripsikan
fungsi dan kerja enzim (Dikdasmen Depdiknas, 2007). Jadi secara kualitatif percobaan
tentang enzim katalase sudah ada dalam mata pelajaran biologi tetapi belum menyangkut
sisi kinetikanya.
Dalam mata pelajaran Kimia semester 1 kelas XI terdapat standar kompetensi 3. Siswa
mampu memahami kinetika reaksi, kesetimbangan kimia, dan faktor-faktor yang
17
Selain konsep-konsep dalam kedua mata pelajaran tersebut ada satu konsep yang
diperbantukan yaitu konsep tentang persamaan regresi linear dalam mata pelajaran
matematika untuk mengolah data yang dihasilkan. Jadi untuk dapat memahami konsep
kinetika enzim maka guru / siswa harus mampu menggabungkan ketiga konsep tersebut.