PRACTICA No 1

Juan Anchante
ESPECTROFOTOMETRIA

Luis Enrique Enciso Bernaola | Bioqumica y nutricin | 2017

Objetivos

Aprender el funcionamiento de un espectrofotmetro

Conocer los espectros de luz de las longitudes de onda
Conocer la Ley de Lambert-Beer

PGINA 1
Marco Terico

El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere la utilizacin de tcnicas

analticas que permitan su determinacin cualitativa y cuantitativa, as como su
caracterizacin fsico-qumica y biolgica. Uno de los mtodos ms sencillos, accesibles,
tiles y utilizados es la espectroscopa, en general, y la espectroscopa ultravioleta-visible,
en particular. Se pueden identificar y cuantificar biomolculas en solucin y en muestras
biolgicas, con el empleo de reactivos especficos que reaccionan con el compuesto a
analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.

El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las molculas para absorber

radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de
onda de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se
absorben dependen de la estructura atmica y de las condiciones del medio (pH,
temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un
valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas. Las molculas
pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa interna. Esto permite
poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosntesis en plantas y bacterias. Cuando
la luz (considerada como energa) es absorbida por una molcula se origina un salto desde
un estado energtico basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energa (estado
excitado), E2. Y slo se absorber la energa que permita el salto al estado excitado. Cada
molcula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de
molculas. Como consecuencia, la absorcin que a distintas longitudes de onda presenta
una molcula -esto es, su espectro de absorcin constituye una sea de identidad de la
misma. Por ltimo, la molcula en forma excitada libera la energa absorbida hasta el estado
energtico fundamental.

Figura 1. Diagrama de niveles de energa en

una molcula. La absorcin de energa
luminosa hace que la molcula pase desde un
estado fundamental (E1) a otro excitado (E2).
Posteriormente la molcula relaja su energa
mediante distintos mecanismos (vibracin,
rotacin, etc.)

La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la

concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las
radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma
lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro,
en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y
medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

PGINA 2
La regin UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400
nm. Es una regin de energa muy alta. Provoca dao al ojo humano as
como quemadura comn. Los compuestos con dobles enlaces aislados,
triples enlaces, enlaces peptdicos, sistemas aromticos, grupos carbonilos
y otros heterotomos tienen su mxima absorbancia en la regin UV, por
lo que sta es muy importante para la determinacin cualitativa y
cuantitativa de compuestos orgnicos. Diversos factores -como pH,
concentracin de sal y el disolvente- que alteran la carga de las molculas, provocan
desplazamientos de los espectros UV. La fuente de radiacin ultravioleta es una lmpara de
deuterio. En la regin visible apreciamos el color visible de una solucin y que corresponde
a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorcin
es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solucin coloreada. La
fuente de radiacin visible suele ser una lmpara de tungsteno y no proporciona suficiente
energa por debajo de 320 nm.

Transmitancia y Absorbancia Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda

de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una disolucin de un compuesto qumico
que absorbe luz o cromforo, el compuesto absorber una parte de la radiacin incidente
(Ia) y dejar pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It

La transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz

transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de
luz que incidi sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io
x 100

La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y

transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la concentracin no es lineal,
pero asume una relacin logartmica inversa.

La absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica
la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en
consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y transmitida
son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una
determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0.

La cantidad de luz absorbida depender de la distancia que atraviesa la luz a travs de la

solucin del cromforo y de la concentracin de ste.

PGINA 3
Desarrollo Experimental

Se llen en 5 tubos de ensayo con probeta de 5 ml Bicromato de potasio y agua

destilada, las medidas estn en la siguiente tabla

Luego se procedi a observar el funcionamiento del espectrofotmetro

El espectrmetro estaba calibrado en 350 nm de longitud de onda

Se tena que calibrar a 0 antes de colocar la solucin en la celda
Se coloca la solucin del primer tubo en la celda hasta la flecha que indicaba
Se Limpia la celda y se coloca en el espectrofotmetro
Se cierra la tapa y se espera el resultado de la absorbancia
Este proceso se hace con cada tubo
Una vez obtenido los resultados
Construir la grfica de absorbancia

PGINA 4
Cuestionario

1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotmetro.

Consiste bsicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que
refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo ms usual es que
los datos se recojan en 31 intrvalos de longitudes de onda (los cortes van de 400 nm, 410
nm, 420 nm 700 nm). Esto se consigue haciendo pasar la luz a travs de un dispositivo
monocromtico que fracciona la luz en distintos intrvalos de longitudes de onda. El
instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento
de longitudes de onda se conoce en comparacin con una superficie de reflexin difusa
perfecta.

2.- Qu diferencias existen entre un fotocolormetro y un espectrofotmetro?

La diferencia fundamental entre un espectrofotmetro y un fotmetro o fotocolormetro,
consiste en que el fotocolormetro trabaja nicamente en el espectro de luz visible y selecciona
una longitud de onda determinada mediante filtros fijos.

En cambio, un Espectrofotmetro es capaz de trabajar, no solo con la luz visible sino que en
otras regiones del espectro electromagntico (ultravioleta e infrarroja). Adems posee un
monocromador para seleccionar la longitud de onda deseada.

3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus
respectivas longitudes de ondas.

4.- Qu relacin matemtica existe entre Absorbancia y Transmitancia?

PGINA 5
5.- Construya una curva de calibracin con los siguientes valores:

Con la curva obtenida hallar la concentracin de las siguientes muestras, sabiendo que sus
absorbancia fueron:

Muestra A........................0.015
Muestra B........................0.125
Muestra C........................0.350

PGINA 6
Bibliografa

Pginas web

http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/quimbiotec/FQpractica4.pdf
http://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?it=1027

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