SECUENCIACIN DEL ADN

Secuenciar una molcula de ADN consiste en determinar en qu orden se disponen los

cuatro nucletidos (A, T, C y G) que componen la molcula.

El primer mtodo diseado para secuenciar el ADN fue desarrollado por Allan Maxam
y Walter Gilbert en 1977. Es un mtodo qumico que somete la molcula de DNA a
distintos mtodos de ruptura. Cada mtodo escinde la molcula all donde haya un
nucletido especfico. Este mtodo es bastante laborioso y, hoy en da, ha sido
sustituido por mtodos enzimticos que, adems, se pueden llevar a cabo de forma
automatizada.

El mtodo de Sanger fue diseado por Fred Sanger en 1977. Tambin se conoce como
mtodo didesoxi o secuenciacin por terminacin de la cadena. Es un mtodo
enzimtico que permite determinar la secuencia del molde a medida que se sintetiza su
hebra complementaria. Se necesitan los siguientes componentes:

un ADN de cadena sencilla que acta como molde

un cebador para iniciar la sntesis de ADN
los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP)
la enzima ADN-polimerasa
los cuatro didesoxirribonucletidos trifosfato (ddATP, ddGTP, ddCTP y
ddTTP) que son utilizados por la ADN polimerasa para construir la nueva hebra
pero, una vez incorporados, impiden la adicin de nuevos nucletidos.

La secuenciacin se lleva a cabo en cuatro tubos. Cada tubo contiene el molde, el

cebador, los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato (dNTP), la polimerasa y un
didesoxirribonucletido trifosfato (ddNTP) distinto en cada caso.

En cada tubo, cuando la ADN polimerasa incorpora aleatoriamente un ddNTP la

reaccin se detiene, de manera que se generan fragmentos de distinta longitud, todos
ellos con el mismo ddNTP terminal. Los diversos fragmentos se separan en funcin de
su tamao mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, una tcnica que permite
separar fragmentos de ADN cuya longitud difiere en un slo nucletido. A partir del gel
se puede reconstruir la secuencia que se ha sintetizado, que es complementaria a la
secuencia del molde. Mediante esta tecnologa, se puede determinar la secuencia de
molculas de ADN de hasta 800 nucletidos de longitud.
MEJORAS EN EL MTODO DE SANGER

Introduciendo ligeras variaciones en el mtodo original de Sanger se ha conseguido

automatizar el proceso. Esta es la principal razn de que se siga utilizando este mtodo
hoy en da, a diferencia del mtodo de Maxam y Gilbert, que ya apenas se utiliza.

Las mejoras introducidas son las siguientes:

1.- Los ddNTP terminadores de cadena estn marcados fluorescentemente. Cada

ddNTP se marca con un fluorforo distinto, que no interfiere en la reaccin de la
polimerasa y que emite luz con una longitud de onda caracterstica. De este modo, la
reaccin se lleva a cabo en un slo tubo, no en cuatro.

2.- Se sustituye la ADN polimerasa por la Taq-polimerasa. De este modo es posible

automatizar el proceso como si se tratara de una PCR. En cada ciclo aumenta de forma
exponencial el nmero de fragmentos generados, cada uno marcado con una molcula
fluorescente que emite luz de distinto color, en funcin del ddNTP terminal. Por eso, a
este mtodo tambin se le conoce como secuenciacin cclica.

3.- La separacin de los fragmentos se realiza mediante electroforesis capilar, que es

ms rpida que la electroforesis en gel. Los fragmentos de distintos tamaos llegan al
final del capilar, donde son excitados con un lser y se detecta la fluorescencia
emitida por el ddNTP terminal. El color de esta fluorescencia determina de qu
nucletido se trata. El grfico resultante se denomina electroferograma, en el que se
observan picos de diversos colores. Cada color indica qu nucletido ocupa cada
posicin en la molcula de ADN o, lo que es lo mismo, su secuencia.
PIROSECUENCIACIN

La pirosecuenciacin es otro mtodo enzimtico que permite determinar la secuencia

de una molcula de ADN. Se necesitan los siguientes componentes:

un ADN de cadena sencilla que acta como molde

un cebador para iniciar la sntesis de ADN
tres desoxirribonucletidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) ms
desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATPS, un derivado del dATP que puede
ser utilizado normalmente por la ADN-polimerasa pero que no es reconocido
por la luciferasa).
cuatro enzimas: ADN polimerasa (que cada vez que aade un nuevo
desoxirribonucletido trifosfato a la cadena naciente genera una molcula de
PPi), ATP sulfurilasa (que convierte el PPi en ATP en presencia de APS),
luciferasa (que, en presencia de ATP, convierte la luciferina en oxiluciferina y
genera un fotn de luz visible) y apirasa (que degrada los nucletidos que no se
han incorporado a la cadena naciente y el ATP generado por la sulfurilasa).
adenosina 5'-fosfosulfato (APS)
luciferina

La pirosecuenciacin es un mtodo de sntesis, porque la secuencia del molde se

determina a medida que se sintetiza su hebra complementaria. Para determinar cul es la
base que se aade durante la sntesis se lleva a cabo, en riguroso orden, una serie de
reacciones enzimticas:

1.- El cebador hibrida con el molde y se incuba en presencia de las cuatro

enzimas (ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa) y de los
sustratos APS y luciferina.

2.- Se aade uno de los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato (por ejemplo,

dCTP) a la mezcla de reaccin anterior. Si resulta ser el complementario a la
hebra molde, se incorporar a la nueva cadena de ADN y se producir una
molcula de PPi por cada desoxirribonucletido incorporado (ya que puede
haber varias bases iguales seguidas en la secuencia del molde). Si no es el
complementario al molde, se aade otro desoxirribonucletido trifosfato (por
ejemplo, dGTP). Si es el correcto, se formar PPi y si no, se aade un tercero
(por ejemplo, dTTP). Si es el correcto, se formar PPi y si no, se aade dATPS
que, ahora s, ser incorporado a la nueva cadena de ADN.

3.- En presencia de APS, la ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP. Este ATP
provoca la conversin de luciferina en oxiluciferina mediante la enzima
luciferasa. Esta reaccin genera una cantidad de luz visible proporcional a la
cantidad de ATP consumido. Esta luz es captada por un fotodetector, dando
lugar a un pico en el pirograma. La altura del pico es proporcional al nmero de
nucletidos que se han incorporado.

4. La apirasa degrada todos los desoxirribonucletidos trifosfato (y el dATPS)

que no se han incorporado, as como el exceso de ATP producido por la reaccin
de la ATP sulfurilasa. Durante la pirosecuenciacin, no se aade un nuevo
 desoxirribonucletido trifosfato (etapa 2) hasta que la apirasa haya degradado
por completo todos los nucletidos no incorporados y el ATP.

Secuenciacin masiva en paralelo

Los mtodos de la primera generacin son capaces de secuenciar hasta 100 kbases al
da, con lo que se necesitan varios aos para secuenciar el genoma humano. Durante
esta ltima dcada se han desarrollado los denominados "mtodos de segunda
generacin" que son capaces de llevar a cabo el proceso de secuenciacin de forma
muchsimo ms rpida. Estos mtodos se caracterizan porque secuencian de forma
masiva y simultnea (en parealelo) la genoteca completa y permiten secuenciar la
totalidad del genoma humano en cuestin de das.

454-pirosecuenciacin

La primera fase de este mtodo consiste en la preparacin de una genoteca. Se

fragmenta el ADN genmico por mtodos suaves como, por ejemplo, la nebulizacin,
que genera fragmentos de entre 300 y 800 pares de bases. Se marcan los extremos de
los fragmentos con dos tipos de adaptadores, que denominaremos A y B (uno
permitir que el fragmento se una a las esferas de agarosa y el otro es complementario al
oligonucletido que actuar como cebador en las fases de amplificacin y
secuenciacin). Se seleccionan los fragmentos marcados en uno de sus extremos con el
adaptador A y en el otro con el adaptador B.
En la segunda fase se hace una PCR en emulsin, es decir, en una mezcla de aceite y
agua. Para ello, primero se mezclan los fragmentos de la genoteca con esferas de
agarosa recubiertas con un oligo complementario a uno de los adaptadores. Se hace la
mezcla de forma que cada esfera slo se una a un fragmento de la genoteca. Despus
se aade una emulsin que contiene, en su fase acuosa, todos los reactivos necesarios
para la PCR. Cada esfera queda aislada en una gota acuosa rodeada de aceite y
separada de las dems esferas. Cada gota se convierte en un microrreactor en el que se
lleva a cabo la PCR. En cada gota aumenta exponencialmente el nmero de
fragmentos de ADN (todos ellos idnticos) que, a su vez, se unen a los
oligonucletidos que recubren la esfera. Al final del proceso, cada esfera est recubierta
de aproximadamente dos millones de fragmentos de ADN.

A continuacin, se deshace la emulsin y se depositan las esferas recubiertas de ADN

en una placa que contiene cientos de miles de pocillos con un dimetro medio de 44
m, de manera que en cada pocillo slo cabe una esfera. Algunos pocillos pueden
quedar vacos. A continuacin se aaden otras esferas ms pequeas sobre las que se
han inmobilizado dos de las enzimas que intervienen en el proceso de pirosecuenciacin
(la sulfurilasa, que convierte el PPi en ATP, y luciferasa, que convierte la luciferina en
oxiluciferina y genera un fotn de luz).
En la tercera fase se lleva a cabo la pirosecuenciacin. El sistema de flujo hace pasar
de manera secuencial cada uno de los cuatro nucletidos a travs de la placa que
contiene los pocillos. Se aaden siempre en el mismo orden (TACG) con lo que se
consigue una secuenciacin masiva en paralelo (cientos de miles de pocillos, cada uno
con dos millones de fragmentos de ADN). Cada vez que en uno de los pocillos se
incorpora un nucletido se genera una seal quimioluminiscente que es recogida por
una cmara digital. Esta seal es proporcional al nmero de nucletidos que se
incorporan en cada pocillo. La adicin secuencial de los cuatro nucletidos se repite 42
veces.

En la cuarta fase se hace un anlisis de las imgenes obtenidas en cada pocillo y se

determina la secuencia de cada fragmento. A partir de esta coleccin de secuencias se
reconstruye la secuencia genmica original por mtodos computacionales.