DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE GERMENI AEROBI DIN PRODUSELE

ALIMENTARE
Metod orizontal pentru enumerarea microorganismelor. Tehnic de numrare a
coloniilor la 30C
Standardul stabilete o metod orizontal pentru enumerarea microorganismelor prin
numrarea coloniilor crescute pe unh mediu solid dup incubarea aerob la 30 C. Microorganism
- este o bacterie, drojdie sau colonie numrabil formatoare de mucegai.
Produse alimentare care se examineaz n vederea detectrii NTG: lapte crud; lapte pentru
consum, Lapte UHT; lapte praf, produse lactate praf pentru copii; smntn dulce pentru fric i
fric btut, nghetat; unt, brnz topit; carne zvntat, refrigerat, congelat i organe de
pasre, mncruri gtite congelate i mncruri gtite, servite calde; preparate din carne, mixte sau
simple, gata pregtite, care se consum reci; pete proaspt, decapitat i eviscerat; prjituri cu
crem , deserturi , creme; maionez; prafuri de budinci i creme deshidratate, nlocuitori de fric;
buturi rcoritoare i sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile; pulberi pentru
sucuri; finuri alimentare altele dect finuri pentru panificaie (fin de orez, orezin, fosfarin);
specialiti din ciocolat umplute cu crem gras sau de tip fondant; specialiti din ciocolat
umplute cu crem gras sau de tip fondant;concentrate alimentare (supe, cuburi de carne); ceai
(plant); melanj din ou praf; produse din gru germinat; fructe de mare refrigerate; sandviciuri,
mncruri tip fast-food; etc.
Principiul metodei
Prepararea a dou plci turnate prin folosirea unui mediu de cultur specific i a unei cantiti
specificate de prob, dac produsul iniial este lichid sau a unei cantiti specificate de suspensie
niial n cazul altor produse. Prepararea n aceleai condiii, a altei perechi de plci turnate,
folosind diluiile decimale ale probei sau ale suspensiei iniiale. Incubarea plcilor Petri n
condiii de aerobioz timp de 72 de ore la temperatura de 30oC. Calcularea numrului de
microorganisme pe ml sau pe g de prob din numrul de colonii obinute pe plcile selectate.
Medii de cultur i diluani Medii de cultur.Compoziie - Agar pentru numrare - PCA.
Acesta conine: digest enzimatic pentru cazein 5,0g, extract de drojdie 2,5g, glucoz
anhidr (C6H12O6) 1,0g, agar 9 - 18g i ap 100 ml. La examinarea produselor lactate se adaug
1,0g lapte praf degresat pe un litru de mediu de cultur. Laptele praf degresat trebuie s nu conin
substane inhibitoare;

Preparare - pentru preparare n caz c se utilizeaz mediu complet deshidratat disponibil

comercial se respect instruciunile productorului. Dup preparare se necesar s se regleze pH-ul
dac este necesar, n aa fel nct dup sterilizare s fie 7,00 la 25oC;
Distribuie - se repartizeaz mediul n eprubete, n cantiti de 12 - 15 ml/ eprubet, sau n
flacoane sau sticle cu capacitatea de pn la 500 ml;
Sterilizare - se sterilizeaz la autoclav la 121oC timp de 15 minute;
Pstrare - dac mediul se folosete imediat, se rcete nainte de folosire pe o baie de ap
(apt de a opera de la 44 - 47 oC). n caz contrar se pstreaz la ntuneric la temperatura de 32 oC
pentru maxim 3 luni, n condiii care s nu provoace nici o modificare a compoziiei sau
proprietilor.

nainte de nceperea examenului microbiologic, pentru a evita orice ntrziere la turnarea

mediului, nainte de folosire, se topete complet mediul, apoi se rcete pe o baie de ap ntre 44 -
47 oC.

Pentru a verifica temperatura mediului se recomand s se pun un termometru ntr-o

poriune de soluie de control ce conine 15g/l agar, ntr-un container separat, identic cu cel folosit
pentru mediu. Soluia de control trebuie s fie supus la celeai operaii de nclzire i rcire ca i
mediul.

Aparatur i sticlrie

Aparat pentru sterilizare uscat (etuv) sau umed (autoclav);

Incubator apt de a opera la 30o1oC;
Cutii Petri din sticl sau plastic, cu diametrul de 90 - 100 mm;
Pipete cu capacitate nominal de 1 ml;
Baie de ap, apt de a opera de la 44 - 47 oC;
Echipament de numrare a coloniilor, costnd dintr-o baz luminat pe un fond
ntunecat, prevzut cu lentile de mrire cu putere corespunztoare de circa 1,5x i
un dispozitiv de numrare mecanic sau electronic digital;
pH- metru, avnd o acuratee a etalonrii de 0,1 uniti de pH la 25oC;
Eprubete, flacoane sau sticle de capacitate corespunztoare nu mai mare de 500 ml.

Eantionare

Este important ca laboratorul s primeasc un eantion care este cu adevrat reprezentativ

i care s nu fi fost deteriorat sau modificat n timpul transportului sau depozitrii.
Pregtirea probei Exemple:
Lapte i produse lactate se agit energic eantionul de analizat pentru a asigura o
repartizare uniform a microorganismelor rsturnnd rapid de 25 de ori recipientul cu eantion.
Trebuie evitat formarea spumei iar cea format trebuie dispersat. Intervalul dintre omogenizarea
eantionului i prelevarea probei necesare analizei nu trebuie s depeasc 3 minute.
Lapte praf, zer dulce se amestec direct coninutul recipientului nchis, prin agitri i
rsturnri repetate..Se cntresc 10 g eantion ntr-un vas de sticl i se rstoarn praful n sticl
cu soluia de diluare (90 ml de soluie adecvat la 45+-1oC n baie de ap). Se menin flacoanele n
baia de ap timp de 5 minute agitnd din cnd n cnd. Se obine astfel o diluie de 10-1.
Pregtirea eantionului pentru analiz i a diluiei iniiale
 Cu o pipet steril se introduce 1 ml din soluia iniial ntr-o eprubet care conine 9 ml
de soluie diluare steril. Pipeta se schimb pentru fiecare diluie.
Inoculare i incubare

Se iau dou cutii Petri sterile. Se transfer n fiecare cutie cu ajutorul unei pipete
sterile 1 ml prob, dac este lichid sau 1 ml suspensie niial n cazul altor
produse (dfiluia 10-1);
Se iau alte 2 cutii Petri sterile. Se transfer n fiecare cutie cu ajutorul altei pipete
sterile 1 ml din diluia10-1 (produse lichie) sau 1 ml din diluia10-1 (alte produse).
Dac este necesar se repet procedura cu diluiile urmtoare, folosind o nou pipet
steril pentru fiecare diluie decimal. Se selecteaz numai etapele diluiilor critice
(cel puin dou diluii decimale consecutive) pentru inocularea plcilor Petri care
vor da ntre 15 i 300 colonii pe plac
Se toarn de la 12 - 15 ml agar pentru placa de numrare la 44 - 47 oC n fiecare
plac Petri. Timpul scurs ntre sfritul preparrii suspensiei iniiale (sau a diluiei
10-1 dac produsul este lichid) i momentul cnd mediul este turnat n plci nu
trebuie s depeasc 45 min;
Se amestec atent inoculul cu mediul prin rotirea plcii Petri i se las amestecul
s se solidifice prin lsarea plcilor Petri pe o suprafa orizontal rece;
Dup solidificare complet i numai n cazul n care se suspecteaz c produsul
examinat conine microorganisme ale cror colonii pot suprapopula suprafaa
mediului, se toarn circa 4 ml mediu de acoperire la 44 - 47 oC pe suprafaa
mediului de inoculare. Se las s se solidifice pe o suprafa orizontal rece;
Se ntorc plcile pregtite cu faa n jos i se pun la incubator la 30 o1oC pentru
72h3h. Nu se suprapun mai mult de ase plci pe coloan.
Coloanele cu plci trebuie s fie separate unele de altele i de pereii i partea
superioara a incubatrului
Numrarea coloniilor

Dup perioada de incubare (72h3h), se numr coloniile de pe plci, folosind dac este
necesar echipamentul pentru numrarea coloniilor. Se examineaz plcile n lumin difuz. Este
necesar ca coloniile mici s fie ncluse n numrare, dar este esenial ca operatorul s evite
confundarea particulelor neltoare de material nedizolvat sau precipitat din plci cu colonii mici.
Se examineaz atent obiectele neltoare, folosind o mrire mai mare dac este necesar, pentru a
distinge coloniile de materiale strine.

Coloniile extinse se vor considera o singur colonie. Dac mai puin de un sfert din plac
este acoperit de extinderi, se numr coloniile de pe partea neafectat a plcii i se calculeaz
numrul corespunztor pentru toat placa. Dac mai mult de un sfert este acoperit cu colonii
extinse nu se ia n considerare numrtoarea.
Exprimarea rezultatelor
Metoda de calcul
Pentru numrtoare se utilizeaz cutiile ce conin cel mult 300 de colonii i cel puin 15
colonii.Numrul de microorganisme pe ml sau gram de produs, N, se calculeaz, ca medie
ponderat cu urmtoarea formul:

N = ------------------------

(n1 + 0,1 n2) x d

unde; C suma coloniilor numrate n toate cutiile reinute

n1 numrul cutiilor reinute la prima diluie

n2 - numrul cutiilor reinute la a doua diluie

d factorul de diluie corespunztor primei diluii
Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative. Ca rezultat se ia numrul de
microorganisme pe ml sau pe gram de eantion exprimat printr-un numr cuprins ntre 1,0 i 9,9 x
10x unde x este puterea atribuit lui 10.
Exemplu:
O numrtoare de microorganisme obinute la 30C a dat urmtoarele rezultate. la
prima diluie reinut 10-2: 168 i 215 colonii;

la a doua diluie reinut 10-3: 14 i 25 de colonii.

C 168 + 215 + 14+ 25 422

N = --------------------------------
-- = _________________ =________=19.182

(n1 + 0,1 n2 ) x d [2+(0,1x2)]x10-2 0,022

Se rotunjete la dou cifre semnificative adic 19.000

Estimarea numerelor mici

Dac cele dou cutii la nivelul eantionului de analizat (produse lichide) sau al diluiei
iniiale (alte produse) conin mai puin de 15 colonii se face media aritmetic, m a coloniilor
numrate n cele dou cutii. Rezultatul se d sub forma:

numr de microorganisme estimat pe ml

NE = m(produse lichide)
numr de microorganisme estimat pe gram:
NE = m x d-1 (alte produse), n care d este factorul de diluie al diluieiniiale.
Dac cele dou cutii corespunztoare eantionului de analizat (produse lichide) sau diluiei
iniiale (alte produse) nu conin nici o colonie rezultatul se d sub forma:

mai puin de 1 microorganism pe ml (produse lichide);

mai puin de 1 x d-1microorganisme pe gram (alte produse) n care d este factorul de diluie al
diluiei iniiale
Buletinul de analiz

Buletinele de analiz sunt ntocmite de responsabilii de ncercare i verificate de

responsabilii de compartiment n trei sau patru exemplare ( n funcie de situaie) dintre care unul
se pstreaz n laborator iar celelalte sunt preluate de la Biroul recepie probe de ctre medicul
veterinar care a ntocmit procesul verbal de recoltare, procesator ( n cazul probelor recoltate n
cadrul programului de autocontrol) iar un exemplar se dirijeaz ctre serviciul de igien i sntate
public din cadrul D.S.V.

Buletinul de analiz trebuie s cuprind; toate informaiile necesare pentru identificarea

complet a probei; metoda de eantionare folosit (dac se cunoate); metoda de analiz folosit,
cu referire la standardul internaional; toate condiiile de operare nespecificate n standard, sau
privite ca opionale, mpreun cu detalii ale cror incidente pot influena rezultatul; rezultatele
obinute n analiz.