MTODOS CROMATOGRFICOS
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
(Texto para fins didticos)
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
ter de petrleo
Mistura de
pigmentos
CaCO3 clorofilas
Xantofila
caroteno
Devido a isso, houve um perodo de dormncia que terminou em 1931, quando o grupo
de Richard Kuhn, em Heidelberg, demostrou a superioridade da cromatografia em relao a
outros mtodos utilizados at ento.
Nesse intervalo de 25 anos (entre as duas mais importantes publicaes de Tswett e o
incio dos trabalhos em Heidelberg), somente uns poucos cientistas reconheceram a
importncia da cromatografia como uma tcnica de separao e a utilizaram em suas
pesquisas. Entre esses, Charles Dhre, na Sua e Leroy Sheddon Palmer, nos Estados
Unidos.
Charles Dhre nasceu em Paris (05/03/1876) e estudou medicina, recebendo seu grau
de Doutor em 1898 e a tese teve como tema as investigaes relacionadas ao sistema
nervoso central. Dhre nunca exerceu a profisso de mdico. Atuou como professor assistente
no Departamento de Cincias Naturais da Universidade de Sorbone e em 1900 foi trabalhar
tambm como professor associado (colaborador) de fisiologia, qumica biolgica e
microbiologia na Universidade de Friburgo na Sua. Em 1908 tornou-se professor efetivo e em
1909 recebeu o grau de Doutor em Cincias pela Universidade de Sorbone, com uma tese
sobre a investigao de albuminas, protenas e seus derivados usando espectroscopia
ultravioleta. O interesse maior de Dhr foi a investigao de substncias biologicamente
importantes, particularmente por espectroscopia ultravioleta e de fluorescncia.
Naturalmente, o pr-requisito de qualquer investigao espectroscpica dispor de
substncias puras. Devido a isso, Dhr tornou-se interessando desde o incio de sua carreira
profissional em tcnicas fundamentais de laboratrio que pudessem ser usadas para esse
propsito. Uma delas foi a eletrodilise e Dhr contribuiu significantemente para o
desenvolvimento dessa tcnica. Seu interesse em mtodos permitiu a separao de
substncias biolgicamente importantes e a preparao dessas em forma pura, tambm o
conduziu cromatografia.
Dhr comeou a usar a cromatografia em torno de 1911 e o primeiro trabalho em que
isto documentado a tese de doutorado de Wladyslaw de Rogowski, um estudante de
Warsaw. Poucos anos depois, a tcnica cromatogrfica foi melhorada no trabalho de um outro
estudante de graduao, Guglielmo Vegezzi.
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O TRABALHO DE ROGOWSKI
A alumina pode ser preparada com diferentes graus de atividade. A alumina atividade grau I
o
a mais ativa preparada pelo aquecimento a 400 C por 4 horas ou at no ocorrer mais dessoro
de gua); Alumina atividade grau II tem 2-3% de gua (adicionada a de grau I); Alumina atividade
grau III tem 5-7% de gua; Alumina atividade grau IV 9-11% de gua; Alumina atividade grau V
15% de gua (menos ativa).
ESCOLHA DO ELUENTE
PREPARO DA COLUNA
O preenchimento da coluna pode ser feito com o suporte (adsorvente) seco, ou,
umedecido no solvente apropriado. Para evitar o escoamento do adsorvente fora da coluna,
deve-se colocar um pequeno pedao de algodo; algumas colunas so dotadas de um disco
de vidro sinterizado. Se o preenchimento da coluna feito com o adsorvente umedecido,
necessrio manter a coluna com uma certa quantidade de solvente e o adsorvente umedecido
adicionado gradativamente. Aps adicionar o adsorvente coluna, deve-se passar o eluente
(ou o solvente puro) at empacotamento adequado. A amostra pode ser aplicada coluna sob
a forma de soluo ou de pastilha. A pastilha preparada pela dissoluo da amostra no
solvente adequado e a soluo misturada com uma pequena quantidade do adsorvente.
Aps evaporao total do solvente, a mistura slida aplicada no topo da coluna.
Dependendo do tamanho da amostra ( em conseqncia o tamanho da coluna) define-se
tambm o volume de cada frao a ser coletado. A eluio em geral monitorada pela
cromatografia em camada delgada.
eluente
adsorvente
vcuo
disponvel no laboratrio. Por essa razo, a cromatografia flash bastante usada nos
laboratrios de pesquisa para a separao de substncias.
Com o advento das colunas pr-empacotadas em 1971, teve incio uma importante fase
no desenvolvimento de metodologias de cromatografia lquida preparativa. A limitao das
colunas LOBAR a separao de amostras maiores que 5,0 gramas. Para acomodar amostras
dessa ordem de grandeza, ou maiores, foi introduzida a CROMATOGRAFIA LQUIDA DE
MDIA PRESSO. Esse tipo de cromatografia envolve o uso de colunas mais longas com
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grandes dimetros internos (as quais podem ser facilmente preenchidas) e requer presses
mais altas que a cromatografia lquida de baixa presso para favorecer alta velocidade de fluxo
do eluente. A tcnica de MPLC considerada uma complementao ao mtodo de
Cromatografia lquida de coluna aberta (convencional) e a cromatografia flash com melhor
resoluo e tempo de separao mais curto.
As colunas podem ser preenchidas com suporte seco ou umedecido no solvente
apropriado. O mtodo de preenchimento seco d uma densidade de empacotamento 20% mais
alta que a tcnica de suporte mido e conduzida manualmente. Aps enchimento da coluna
e a pr-coluna (10% da coluna), o conjunto conectado a um cilindro de nitrognio. Nitrognio
passado na coluna com presso de 10 bar .
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:
ABBOTT D., & ANDREWS, R.S. - Introduccin a la cromatografia, 3ed. Editorial Alhambra S., 1973.
MEYER, V.R., & ETTRE, L.S. Early evolution of chromatography : the activities of Charles Dhre. J.
Chromatogr. 600 : 3-15, 1992.
a
COLLINS, C.H., BRAGA, G.L., BONATO, P.S. Introduo a mtodos cromatogrficos. 7 ed. Editora
Unicamp, 1997.