UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

CARRERA DE QUMICA FARMACUTICA

TTULO DE LA INVESTIGACIN
MICROARRAYS Y WESTERN BLOT

La tcnica de hibridacin con microarrays ha esclarecido la relacin existente entre el perfil de

expresin gnica y la presencia de diversas patologas. Esta tcnica es adems de gran inters en el
ensayo de frmacos.

Qu es un microarray?

Es un formato experimental, basado en la sntesis o fijacin de sondas, que representan los genes
(o protenas, o metabolitos), sobre un sustrato slido (cristal, plstico, slice,...), y expuestos a las
molculas diana (la muestra).

Cmo funciona un microarray?

El ADN de las clulas de un organismo contiene la informacin gentica necesaria para la

construccin de sus protenas. La molcula de ARNm (ARN mensajero) es una copia de esta
informacin mediante un proceso conocido como transcripcin. La informacin codificada en la
molcula de ARNm es interpretada en un proceso denominado traduccin que tiene como fin la
construccin de la protena. Por tanto, la concentracin de una protena depender de la cantidad
y estabilidad de molculas de ARNm producidas a partir de su gen.
Existen microarrays (realizados sobre soportes slidos de vidrio o plstico o membranas) que
contienen secuencias correspondientes a los diferentes genes del ADN de un organismo (oligos) y
que hibridan de forma especfica con ADNc de cada gen. Para estimar el nivel de expresin de cada
uno de estos genes se puede aislar el ARN que en un momento determinado estn produciendo las
clulas del organismo. Como el ARNm es una molcula que es degradada fcilmente por enzimas
habitualmente presentes, conviene transformarlo en una molcula ms estable ADNc, ADN
complementario, que contiene la misma informacin que el ARNm. Esto se realiza mediante la
accin de una protena conocida como transcriptasa inversa. El ADNc es marcado mediante
radioactividad o fluorescencia y se hibrida con el microarray. Cada secuencia de ADNc hibridar con
el oligo correspondiente a la secuencia de su gen nicamente en el pocillo o posicin en el que se
encuentre este oligo especfico.
El revelado posterior mostrar qu grado de hibridacin presenta cada gen. La seal recibida estar
en funcin de la cantidad de cada ADNc que a su vez depende de la cantidad que hubiera en la
muestra aislada del ARNm concreto que lo gener. Las posiciones en el array de genes en los que el
nivel de transcripcin fuera alto y/o la degradacin del ARNm fuera menor sern las ms destacadas.
Por el contrario, la seal ser menor en aquellos genes de los que la concentracin de ADNc, y por
tanto del ARNm, fuera menor en el momento de tomar la muestra.

Qu tipos de microarrays existen?

De Protenas
De Tejidos
De DNA
Arrays de CGH
SNPs
 De Expresin
De cDNA
De oligonucletidos

Aplicaciones de los microarrays

En medicina, la tcnica de hibridacin con microarrays puede emplearse para muchos fines:
Para la clasificacin de una enfermedad en funcin de su perfil de expresin especfico.
Para determinar qu genes, y por tanto, qu protenas, estn implicadas en la aparicin y desarrollo
de una enfermedad mediante la comparacin del perfil de individuos sanos e individuos enfermos.
Para investigar qu protenas, correspondientes a genes concretos cuya expresin se modifique,
pueden ser dianas teraputicas adecuadas. Para determinar qu cambios provoca en el perfil de
expresin gnica asociado a una enfermedad un cambio en la dosis de un frmaco.
Los microarrays se han aplicado al estudio de casi cualquier tipo de problema biolgico. El nmero
de publicaciones anuales con la palabra microarray en el ttulo es muy alto y continua creciendo:

Estudio de genes que se expresan diferencialmente entre varias condiciones:

Sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados.
Clasificacin molecular en enfermedades complejas.
Identificacin de genes caractersticos de una patologa (firma o signature).
Prediccin de respuesta a un tratamiento
Deteccin de mutaciones y polimorfismos de un nico gen (SNP)

Nomenclatura y Clasificacin

Dado el auge que han tenido recientemente estas tecnologas se ha producido una gran
diversificacin tecnolgica que ha derivado en la necesidad de establecer una nomenclatura y
clasificacin para estos dispositivos.

Los criterios de clasificacin son muy variados y abarcan varios conceptos los cuales se encuentran
en la siguiente tabla:

Tabla N1: Criterios de clasificacin en Biochips

Diseo de Microarrays

Operaciones y tecnologas necesarias para la elaboracin de microarrays y biochips de ADN

Tabla N2: Operaciones y tecnologas necesarias para la elaboracin de microarrays y biochips de ADN

Operaciones a realizar:

Tipo de Sonda

El diseo de las sondas y su produccin son elementos clave a la hora de hacer posible la
hibridacin en el biochip. Sin la riqueza de conocimiento y datos de secuencias disponibles
en diversas bases de datos y proyectos genmicos, la generacin de estas sondas sera
imposible. Fsicamente, las sondas tienen tres formas diferentes: clones de cDNA, productos
de PCR, y oligonucletidos.

Las sondas basadas en clones se depositan en la superficie del array en forma de fragmentos
o genes completos generalmente procedentes de libreras gnicas

El tamao de estas sondas puede ser de varios cientos de pares de bases hasta varias
kilobases. Los productos de PCR consisten en fracciones de genes generados por PCR
procedentes de clones de cDNA, libreras genmicas, o RNA.

La longitud de estos fragmentos suele ser de 200 a 500 pares de bases. Las sondas
consistentes en oligonucletidos difieren de las anteriores en que el nmero de pares de
bases es ms limitado, 20-25 para anlisis de expresin diferencial y hasta 100 para anlisis
de expresin gnica.

Marcaje de Sondas

La deteccin de la hibridacin entre las sondas de ADN inmovilizadas en el soporte y los

fragmentos de material gentico de la muestra, requiere un marcaje previo para su
posterior deteccin. Este marcaje puede ser directo o indirecto:
 Tabla N3: Mtodos de marcaje de ADN en microarray para deteccin directa

Tabla N4: Mtodos de marcaje de ADN en microarrays para deteccin indirecta

Material de Soporte

Tradicionalmente los sustratos slidos de los biochips se dividen en porosos y no porosos:

Chips porosos
Son chips en los que las interacciones entre el material a inmovilizar y el soporte slido de
inmovilizacin no tienen por lo general carcter covalente.
Los soportes ms comnmente empleados son pequeas porciones de geles, o membranas
porosas de nylon o nitrocelulosa presentes sobre portaobjetos de cristal.

El uso de superficies porosas como soporte para inmovilizar cidos nucleicos supone una gran
ventaja al ofrecer mayor superficie de unin que los soportes lisos.
Chips lisos o no porosos
Son aquellos en los que el material se encuentra por lo general inmovilizado covalentemente a la
superficie slida que le sirve de soporte y que puede ser cristal o cualquier otra superficie como
silicio, plstico u oro.

Aunque las membranas de nylon y nitrocelulosa siguen utilizndose en la actualidad, han sido
sustituidas en la mayora de los casos por alternativas que permiten mayor resolucin de los
puntos, adems del uso de la fluorescencia como mtodo de deteccin y el uso de dos
fluorocromos simultneamente.

Sin embargo, algunos biochips utilizan membranas o sustancias porosas que recubren la
superficie de un cristal, mejorando la resolucin de los puntos. El uso de micropartculas (slice
o agarosa) en la mayora de los casos es complementario al de membranas. Existe un buen
nmero de alternativas a estos soportes que estn todava en desarrollo, como la inmovilizacin
del ADN sobre geles de acrilamida ha desarrollado un tipo de soporte totalmente diferente a las
plataformas que utilizan membranas o cristal como soporte.

Estos biochips consisten en un conjunto de electrodos cubiertos por una fina capa de agarosa.
Los microelectrodos generan un campo elctrico que controla la deposicin de las sondas y la
hibridacin con las secuencias diana.

Caractersticas de los soportes

Tabla N5: Tipos de soportes utilizados en microarrays y biochips de ADN

..
Conclusiones y perspectivas

Los experimentos con microarrays han revolucionado el estudio de la genmica funcional,

mejorando el conocimiento de la funcin de los genes a partir de la similitud de patrones de
expresin, mejorando el conocimiento de las familias de genes:

Permiten incluir nuevos genes en las familias.

Descubren patrones de expresin coordinados.
Aumenta el nmero de familias conocidas de genes.

Como toda tecnologa tiene sus limitaciones: Algunas como la baja reproducibilidad o la calidad del
genoma se solucionaran con el tiempo, otras como el uso adecuado de sus posibilidades dependen
del buen (o mal) uso que se haga de ellas