Tesis Microbiologica Potenci Tilosina

VALIDACIN DE LA TCNICA PARA LA CUANTIFICACIN DE
TILOSINA EN UN PRODUCTO SLIDO
AUTOR
LUZ STELLA MEJIA RANGEL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C.
2008
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por
sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique
nada contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no
contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea
en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.
ii
AUTOR
APROBADO
________________________ ________________________
Viviana Pea Pez Janeth Arias
Microbiloga Industrial Bacteriloga MSc
Director Codirector
________________________ ________________________
Cindy Fernandez Jazmn Castellanos
Microbiloga Industrial Qumica
Jurado Jurado
iii
AUTOR
APROBADO
________________________ ________________________
Ingrid Schuler Ph.D Janeth Arias MSc
Decana Acadmica Director de Carrera de
Microbiologa
iv
A mis padres por su ayuda, confianza y apoyo incondicional y a Dios
por acompaarme en cada uno de mis pasos
v
AGRADECIMIENTOS
A mi familia por estar conmigo, darme nimos y darme todo lo necesario

para lograr mis metas.
La empresa Vicar Farmaceutica S.A. por permitirme realizar mi tesis en

sus instalaciones y la financiacin de esta.
Viviana Pea por su amistad y colaboracin para realizar con xito este
trabajo de grado.
Janeth Arias Docente y Directora de la Carrera de Microbiologa por su

apoyo y colaboracin
A todo el personal de Control de Calidad por su calor humano.
Reinaldo Orejarena por darme nimos constantemente
vi
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCION ......................................................................................... 0
MARCO TEORICO ...................................................................................... 2
2.1 ANTIBITICOS .............................................................................. 2
2.1.1 MODO Y MECANISMO DE ACCIN DE LOS ANTIBIOTICOS 2
2.1.2 MACROLIDOS ............................................................................ 3
2.1.2.1 ORIGEN Y COMPOSICIN QUMICA .................................... 3
2.1.2.2 FORMULACIONES DEL FARMACO ....................................... 4
2.1.2.3 MECANISMO DE ACCIN ...................................................... 4
2.2 TILOSINA ....................................................................................... 5
2.2.1.1 ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA TILOSINA .................... 5
2.2.1.2 DESCUBRIMIENTO ................................................................. 6
2.2.1.3 FORMULA EMPIRICA ............................................................. 6
2.2.1.4 CARACTERISTICAS FISICO QUIMICAS ............................ 6
2.2.2 USOS DE LA TILOSINA ............................................................. 7
2.2.3.1 MECANISMO DE ACCIN ...................................................... 8
2.2.3.2 ABSORCIN, METABOLISMO Y EXCRECIN ..................... 8
2.2.3.3 CONTRAINDICACIONES DE LA TILOSINA ........................... 9
2.2.4 POTENCIA ................................................................................ 10
2.2.4.1 METODOS DE EVALUACIN DE POTENCIA
MICROBIOLOGICA ............................................................................ 10
2.2.4.2 DIFUSIN EN PLACA ........................................................... 10
2.5. MICROORGANISMO .................................................................. 11
2.5.1 Micrococcus luteus .................................................................... 11
2.6 VALIDACIN ................................................................................ 14
2.6.1 PARAMETROS DE CALIFICACION Y VALIDACION .............. 15
2.6.1.1 CALIFICACIN DE INSTALACIN (IQ) ................................ 15
2.6.1.2 CALIFICACIN OPERACIONAL (OQ) .................................. 15
2.6.1.3 CALIFICACIN DE DESEMPEO (PQ) .............................. 15
2.6.2 PARMETROS DE VALIDACIN DE UN MTODO ............... 15
2.6.2.1 ESPECIFICIDAD .................................................................... 15
2.6.2.2 SELECTIVIDAD ..................................................................... 16
2.6.2.3 LINEALIDAD Y ALCANCE ..................................................... 16
2.6.2.4 PRECISIN ............................................................................ 17
2.6.2.4.1 REPETIBILIDAD ................................................................. 17
2.6.2.4.2 REPRODUCIBILIDAD ......................................................... 17
2.6.2.5 EXACTITUD ........................................................................... 18
2.6.2.6 LMITE DE DETECCIN........................................................ 18
2.6.2.7 LMITE DE CUANTIFICACIN .............................................. 18
2.6.2.8 ROBUSTEZ ............................................................................ 19
2.6.2.9 SENSIBILIDAD ....................................................................... 19
2.6.3 TIPOS DE VALIDACION DEL PROCESO ............................... 19
2.6.3.1 VALIDACIN PROSPECTIVA ............................................... 19
2.6.3.2 VALIDACIN CONCURRENTE ............................................ 20
vii
2.6.3.3 VALIDACIN RETROSPECTIVA .......................................... 20
2.6.3.4 REVALIDACIN ..................................................................... 20
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN ....................... 21
4. OBJETIVOS ........................................................................................... 22
4.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................. 22
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ....................................................... 23
5. MATERIALES Y METODOS ................................................................ 23
5.1 MATERIALES ............................................................................... 23
5.2 REACTIVOS ................................................................................. 24
5.3 MEDIO DE CULTIVO ................................................................... 24
5.5 MICROORGANISMO ................................................................... 24
6. METODOLOGA .................................................................................... 25
6.1 PROCEDIMIENTO DE LA VALIDACION..................................... 27
6.1.1 PREPARACIN DEL MICROORGANISMO ............................ 27
6.1.2 PREPARACIN DEL BUFFER ................................................. 27
6.1.3 PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO ............................ 27
6.1.4 INOCULO .................................................................................. 28
6.1.5 PERFORACIN Y LECTURA ................................................... 28
6.1.6 CONTROLES ............................................................................ 28
6.2 MUESTRA DE TRABAJO Y ESTANDAR .................................... 29
6.3 VALIDACIN ................................................................................ 29
7. PARMETROS ...................................................................................... 30
7.2 ESPECIFICIDAD .......................................................................... 30
7.3 SELECTIVIDAD ....................................................................... 31
7.4 LINEALIDAD DEL SISTEMA........................................................ 32
7.5 LINEALIDAD DEL METODO........................................................ 34
7.6 PRECISION DEL MTODO ......................................................... 36
7.7 PRECISIN DEL SISTEMA ......................................................... 36
7.8 EXACTITUD ................................................................................. 37
7.9 LMITE DE DETECCIN .............................................................. 38
7.10LIMITE DE CUANTIFICACIN ................................................... 38
8. RESULTADOS Y DISCUSION .............................................................. 40
8.1 ESPECIFICIDAD ......................................................................... 40
8.2 SELECTIVIDAD............................................................................ 40
8.2.1 SELECTIVIDAD CONDICIN CIDA....................................... 40
8.2.2 SELECTIVIDAD CONDICIN BSICA .................................... 41
8.2.3 SELECTIVIDAD CONDICIN ULTRAVIOLETA ...................... 41
8.2.4 SELECTIVIDAD CONDICIN TRMICA ................................. 41
8.3 LINEALIDAD................................................................................. 42
8.3.1 LINEALIDAD DEL SISTEMA..................................................... 42
8.3.2 LINEALIDAD DEL MTODO..................................................... 43
8.4 PRECISIN .................................................................................. 44
8.4.1 PRECISIN DEL MTODO ...................................................... 44
8.4.1.1 PRECISIN DA 1 ANALISTA 1 ........................................... 44
8.4.1.2 PRECISIN DIA 1 ANALISTA 2 ............................................ 44
8.5 EXACTITUD ................................................................................. 46
viii
8.5.1 EXACTITUD CONCENTRACION 80% .................................... 46
8.5.2 EXACTITUD CONCENTRACION AL 100% ............................ 47
8.5.3 EXACTITUD CONCENTRACION AL 120% ............................ 47
8.6 LIMITES ........................................................................................ 48
8.6.1 LIMITE DE DETECCIN........................................................... 48
8.6.2 LIMITE DE CUANTIFICACIN ................................................. 49
CONCLUSIONES ...................................................................................... 50
BIBLIOFRAFIA .......................................................................................... 51
ANEXOS .................................................................................................... 55
1. RESULTADOS EN EXCEL ............................................................ 55
2 RESULTADOS CON EL PROGRAMA DE VALIDACIN .............. 74
ix
INDICE DE TABLAS
Tabla 1: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la

Especificidad 31
Tabla 2. Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la
selectividad 32
linealidad del sistema 33
Linealidad del mtodo 35
Precisin del mtodo 36
Exactitud 37
Tabla 7: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en el Limite
de deteccin. 38
Tabla 8: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en el Limite
de cuantificacin 39
Tabla 9: Resultado del parmetro de especificidad 40
Tabla 10: Resultado del porcentaje de degradacin en el parmetro
Selectividad en condicin cida 40
Selectividad en condicin bsica 41
Selectividad en condicin ultravioleta 41
Selectividad en condicin trmica 41
Tabla 14: Resultados del parmetro precisin da 1, analista 1 44
Tabla 18: Resultados del parmetro Exactitud al 80% 46
x
Tabla 21: Resultados del parmetro Limite de Deteccin 48
Tabla 22: Resultados del parmetro Limite de cuantificacin 49
xi
TABLAS DE ANEXOS
1.1 ESPECIFICIDAD 55
1.2SELECTIVIDAD 56
1.2.1 SELECTIVIDAD CONDICIN CIDA 56
1.2.2 SELECTIVIDAD CONDICIN BSICA 57
1.2.3 SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA 58
1.2.4 SELECTIVIDAD CONDICIN TRMICA 59
1.3 LINEALIDAD DEL SISTEMA 60
1.4 LINEALIDAD DEL MTODO 62
1.5 PRECISION DEL METODO 64
1.5.1 PRECISION DIA 1 ANALISTA 1 64
1.6 EXACTITUD 68
1.6.1 EXACTITUD AL 80% 68
1.7 LIMITE DE DETECCIN 71
1.8 LIMITE DE CUANTIFICACION 72
2.1 LINEALIDAD SISTEMA 74
2.2LINEALIDAD DEL MTODO 79
2. 3 PRECISIN DEL MTODO 83
2.4 PRECISIN DEL SISTEMA 89
2.5 EXACTITUD 92
2.6 LIMITE DE CUANTIFICACIN 95
xii
RESUMEN
El presente trabajo se llev a cabo para validar la tcnica de

cuantificacin de Tilosina en presentacin en polvo. Previamente se
estandariz la tcnica recomendada por la United States Pharmacopeia
versin 30 ao 2007 con el fin de ajustarse y dar cumplimiento a la
normatividad internacional. La Muestra tiene una composicin del 10% de
Tilosina Fosfato y 90% de Carrier 40-60.
El microorganismo sometido a prueba fue Micrococcus luteus ATCC 9341

y el mtodo empleado fue difusin en agar; los resultados de las pruebas
fueron sometidos a un programa de validacin microbiolgica Validation
Manager .
El mtodo en difusin en agar dio valores acuerdo a lo esperado,

validando as esta tcnica.
xiii
ABSTRACT
The following work was performed to validate a tylosin (in powder

form) quantification technique. Previously, the technique was standardized
according to the United States Pharmacopeia, 30th version, 2007 in order
to keep with international regulations. Our working sample is composed of
10% tylosin phosphate and 90% Carrier 40-60.
Agar diffusion was used to test the micro-organism Micrococcus luteus

ATCC 9341 and all results were validated via the program "Validation
Manager".
Expected results were obtained using agar diffusion, therefore validating

this technique
xiv
INTRODUCCION
El control de calidad es la parte de las prcticas adecuadas de

fabricacin que se refiere al muestreo, especificaciones y ensayo, como
tambin a los procedimientos de organizacin, documentacin y
autorizacin que aseguren que los ensayos necesarios y pertinentes
realmente se efecten y que no se permita la circulacin de los
materiales, ni se autorice la venta o suministro de los productos, hasta
que su calidad haya sido aprobada como satisfactoria. El control de
calidad no se limita a las operaciones de laboratorio, sino que debe estar
presente en todas las decisiones concernientes a la calidad del producto.
Los conceptos de garanta de la calidad, prcticas adecuadas de

fabricacin y control de calidad constituyen aspectos de la administracin
de la calidad que se relacionan entre s.
Dentro del concepto de garanta de la calidad, las prcticas adecuadas de

fabricacin constituyen el factor que asegura que los productos se
fabriquen en forma uniforme y controlada, de acuerdo con las normas de
calidad adecuadas al uso que se pretende dar a los productos y conforme
a las condiciones exigidas para su comercializacin. Las
reglamentaciones que rigen las prcticas adecuadas de fabricacin tienen
por objeto principal disminuir los riesgos inherentes a toda produccin
farmacutica que no pueden prevenirse completamente mediante el
control definitivo de los productos. Esencialmente, tales riesgos son de
dos tipos: contaminacin cruzada (en particular, por contaminantes
imprevistos) y confusin (causada por la colocacin de etiquetas
equivocadas en los envases)
Se debe contar con instalaciones adecuadas, personal capacitado y

procedimientos aprobados, a fin llevar a cabo el muestreo, la inspeccin y
el ensayo de materias primas, materiales de envasado y productos
intermedios, a granel y acabados y en caso que sea apropiado, para
efectuar el control de las condiciones ambientales en relacin con las
prcticas adecuadas de fabricacin.
Los estudios de validacin constituyen una parte esencial de las prcticas

adecuadas de fabricacin y deben efectuarse conforme a protocolos
definidos de antemano. Debe prepararse y archivarse un informe escrito
que resuma los resultados y las conclusiones registrados. Deben
establecerse procesos y procedimientos sobre la base de un estudio de
validacin, los cuales se sometan peridicamente a una revalidacin para
asegurar que con ellos se puedan seguir obteniendo los resultados
deseados.
Validacin es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de
evidencia documentada que un proceso especfico producir de forma
consistente y permanente productos que poseern las caractersticas de
calidad predefinidas (WHO Technical Report Series, No. 823,1992)
Bajo las condiciones adecuadas es importante realizar la validacin de la
tcnica de cuantificacin de productos farmacuticos; debido a su gran
importancia en la industria pecuaria, es necesario obtener antibiticos
idneos y confiables, para esto, se debe realizar una validacin
microbiolgica frente a los principios activos, as asegurando la calidad del
producto y as contribuir a la calidad de la vida animal.
1
MARCO TEORICO
2.1 ANTIBITICOS
Un antibitico es una sustancia qumica derivada o producida por

microorganismos que tienen la capacidad a bajas concentraciones de
inhibir el crecimiento o de matar bacterias y otros microorganismos.
(Groupe, 1990)
2.1.1 MODO Y MECANISMO DE ACCIN DE LOS ANTIBIOTICOS
Al referirse al mecanismo general de los antibiticos se ha hecho constar

que algunas son predominantes bactericidas, muerte de los
microorganismos y que otras predominantemente bacteriostticas,
deteccin del crecimiento de los mismos. La bacteriostasis puede ser
importante para la curacin de proceso infeccioso al intervenir las
defensas del organismo para destruir los microorganismos al inhibir su
multiplicacin. Al emplear antibiticos bactericidas que al destruir las
bacterias hace fcil su eliminacin con la ayuda de las defensas
orgnicas, mientras si se emplea antibiticos bacteriostticos la curacin
depende sobre todo de las defensas del organismo de manera que si
dichas defensas son insuficientes o si se interrumpe la droga se
interrumpe prematuramente, la poblacin bacteriana puede aumentar de
nuevo y producirse una recada.(Groupe, 1990)
Estas sustancias antibacterianas para producir la accin bacteriosttica y
bactericida lo hacen interfiriendo con los mecanismos fisiolgicos
expuestos. Son cuatro mecanismos de accin de los antibiticos.
- Inhibicin de la sntesis de la pared celular, el componente esencial de

dicha pared es mucopptido, el peptidoglucano, cuya sntesis es
impedida por el antibitico por inhibicin de los sistemas enzimticos
2
correspondientes, la droga se fija en la pared celular y cuando se
produce la divisin celular de la bacteria, aparecen defectos en dicha
pared, el microorganismo se hace osmticamente sensible, penetra
lquido en su interior, estalla y se lisa, as actan las penicilinas,
cefalosporinas, bacitracinas, cicloserinas y vancomicina (Groupe,1990)
- Lesin de la membrana celular, en esta forma se afectan importantes

funciones celulares, pues en la membrana existen sistemas
enzimticos vitales, y adems rige la entrada y salida de elementos
nutritivos de manera que el antibitico provoca un escape de protenas
y nucletidos lo que produce dao o muerte celular, la polimixina B,
colistina, nistatina, anfotericina B actan de este modo (Groupe,1990)
- Inhibicin de la sntesis proteica, existen antibiticos que bloquean los

pasos necesarios para dicha sntesis, actuando sobre los ribosomas y
en esta forma la vida de la bacteria queda afectada. As acta el
cloranfenicol, tetraciclinas, aminoglucosidos, rifampicina, eritromicina,
espiramicina, lincomicina y tilosina. (Groupe, 1990)
- Inhibicin de la sntesis de los cidos nucleicos, el cido

desoxirribonucleico o DNA es esencial para la vida celular, los
antibiticos pueden actuar inhibiendo dicha sntesis, la griseofulvina
acta de este modo. (Groupe, 1990)
2.1.2 MACROLIDOS
2.1.2.1 ORIGEN Y COMPOSICIN QUMICA
Los antibiticos macrlidos son un grupo de compuestos similares

estructuralmente, la mayora de los cuales se obtienen de varias especies
de bacterias del gnero Streptomyces procedentes del suelo.
3
Qumicamente todos los antibiticos de este grupo estn clasificados
como lactonas macrocclicas, con miembros que contienen entre 12 y 20
tomos de carbono en el anillo lactona. A este anillo se le une varias
combinaciones de desoxiazcar mediante enlaces glucosdicos.
Desde el descubrimiento de la eritromicina a partir de un microorganismo
del suelo, Streptomyces erythreus, se han aislado o sintetizado a partir de
la molcula base eritromicina numerosos macrlidos, incluyendo la
tilosina, la roxitromicina, eritromicilina, la tilmicosina, la diritromicina, la
azitromicina, la claritromicina, la espiramicina, la fluritromicina. (Adams,
2003)
2.1.2.2 FORMULACIONES DEL FARMACO
Todos los macrlidos son bases dbiles, con valores de pKa que oscilan
entre 6 y 9, el pKa de la tilosina es 7,1 y la eritromicina tiene un pKa de
8,7-8,8. (Adams, 2003)
2.1.2.3 MECANISMO DE ACCIN
Los macrlidos inhiben la traslocacin del RNA de trasferencia desde el

punto aceptor del aminocido, lo que impide la formacin de un nuevo
enlace peptdico, impidiendo as la sntesis de nuevas protenas en la
clula microbiana. En general los macrlidos no se unen a los ribosomas
de las clulas de mamfero, resultando ser un grupo de frmacos
relativamente seguro para uso veterinario.
Aunque la mayora de los autores han clasificado los macrlidos como

bacteriostticos a las concentraciones teraputicas, pueden resultar
bactericidas lentos, especialmente frente a estreptococos. Su accin
bactericida es dependiente del tiempo. (Adams, 2003)
4
2.2 TILOSINA
2.2.1.1 ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA TILOSINA
Figura 1. Estructura de la tilosina, tomada del artculo Angela C. Kolz

2005
Figura 2: Estructura de la Tilosina A, tomada del articulo de E. Cundliffe,

2001
5
2.2.1.2 DESCUBRIMIENTO
La Tilosina fue obtenida primeramente en 1959 por McGuire y

colaboradores de un filtrado de cultima de Streptomyces fradie, el cual se
aisl de una muestra de tierra de Tailandia. Pertenece al grupo de los
antibiticos de los macrlidos y se emplea nicamente en veterinaria (H.
Trolldenier, 1980)
2.2.1.3 FORMULA EMPIRICA
Tilosina base : C45H77NO17

Tartrato de Tilosina: C49H83NO23
(H. Trolldenier, 1980)
2.2.1.4 CARACTERISTICAS FISICO QUIMICAS
La tilosina es de base dbil; en estado seco se cristaliza en pequeas

lminas blanco-amarillentas. La solubilidad de la base en agua tiene
efecto en la proporcin de 5 mg/ml a 25C. La Tilosina se disuelve bien en
la mayora de disolventes orgnicos, como el propilengicol. Forma sales
hidrosolubles, como son los tartratos, los fosfatos, los gluconatos, los
lactatos y el clorhidrato. Contrariamente a la base el tartrato de tilosina es
soluble en agua hasta la proporcin de 600mg/ml. Las soluciones son
estables durante 30 das a temperatura ambiente y a un pH de 4 a 9. Por
hidrlisis cida (pH inferior 4) se descompone en dos fracciones: el azcar
y la desmicosina, un producto microbiologicamente activo que posee
propiedades fsico-qumicas similares. Si prosigue el desdoblamiento, se
liberan los sacridos neutros micarosa y micaminosa. La tilosina conserva
su estabilidad durante dos aos en las condiciones habituales de
condicionamiento. El tartrato se disuelve en agua a 36-38C para usarlos
a los 10-20 minutos con el fin de dar tiempo a su disolucin completa. (H.
Trolldenier, 1980)
6
2.2.2 USOS DE LA TILOSINA
Como antibitico se ha utilizado en el control de la neumona zotica e

infecciones respiratorias. Recientemente la Food and Drug Administration
la aprob como ergotrpico para ganado bovino, cerdos y pollos, Se
administra en el alimento a dosis que varan en 10-1000g/tonelada. En la
actualidad, se reconoce que es especifcamete eficaz para prevenir los
abscesos hepticos en el ganado. (Sumano, 1997)
Este frmaco es sumamente eficaz en el control de la micoplasmosis

aviar, reduce la incidencia de saculitis area. En los productos
comerciales, las dosis que se indican para el pollo de engorda son de 50
a 625 g/toneladas de alimento. Para las gallinas de postura, se indica de
250 a 600g/tonelada de alimento, con efecto teraputico contra
micoplasmas. (Sumano, 1997)
Se ha utilizado teraputicamente la tilosina para tratar el ojo rosa

(Moraxella bovis) en el ganado vacuno, las infecciones del tracto
respiratorio, la disentera del cerdo, la pleuroneumona debida a
Haemophilus parahemolyticus y otras infecciones. (Adams, 2003)
La tilosina se ha utilizado como aditivo de piensos para promover el

crecimiento en animales en abastos como el cerdo, el ternero, pollo entre
otros. (Adams, 2003)
Despus de administrar tilosina al ganado vacuno existe un periodo de

espera de 21 das y de 14 das en el caso del cerdo. La tilosina se
concentra en la leche y persiste durante largo tiempo y no debera
administrarse a animales en lactacin (Adams, 2003)
7
La tilosina es activa contra microorganismos Gram positivos, con especial
accin sobre Mycoplasma gallisepticum S6. Tambin acta sobre algunos
Gram negativos. Por lo general, los microorganismos resistentes a tilosina
tambin lo son a la eritromicina.
Las bacterias sensibles a la tilosina en los cerdos principalmente:

Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Staphylococcus
aureus y Erysipelothrix rhusiopatiae, entre otras. En bovinos, Klebsiella,
Pseudomonas, Streptococcus, Salmonella, Herella, Pasteurella multocida,
Fusobacterium, Corybacterium pyogenes, Streptococcus haemolyticus.
En el perro: Pasteurella, Staphylococcus, Leptospira, Mycoplasma. En

aves: Mycoplasma gallisepticum y meleagridis y Coccidia. Adems acta
sobre Diplococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes , Corybacterium
diphteriae, los gneros de Clostridium, Neisseria, Hemophilus,
Treponema, Rickettsias, virus y Entamoeba histolytica.(Sumano,1997)
2.2.3.1 MECANISMO DE ACCIN
La tilosina llega por difusin pasiva al interior de las bacterias y bloquea la

sntesis de protena bacteriana al unirse a la subunidad ribosomal 30S. En
general son bacteriostticos, pero a dosis elevadas puede ser bactericida.
La resistencia bacteriana ocurre por alteracin del receptor ribosomal o
por mecanismo, que dificultan la entrada del antibitico o la clula
bacteriana, siendo muy comn la resistencia cruzada a otros antibiticos
del grupo como espiramicina y eritromicina (Thomson, 2005)
2.2.3.2 ABSORCIN, METABOLISMO Y EXCRECIN
El tartrato se absorbe con suma facilidad en el aparato digestivo de

gallinas, pavos y cerdos. En las aves, esta sal se puede aplicar por va
subcutnea y tambin puede darse en el agua de bebida.
8
Es posible mezclar la sal fosfato con el alimento del cerdo, aunque su
absorcin es ms limitada. Cuando se administra por va parenteral, se
recomienda la va intramuscular, disolvindola en propilenglicol y agua,
adicionando alcohol benclico al 4% como bactericida. (Sumano,1997)
La tilosina, se une a las protenas plasmticas del bovino en 40% y tiene

alto grado de liposolubilidad, por lo tanto muestra amplio distribucin en
los lquidos corporales y en los tejidos. Su excrecin principal, es a travs
de los riones e hgado. Sin embargo tambin se elimina por la leche en
altas concentraciones.
La dosis letal media (DL50) en el cerdo es de 5g/kg por va oral y de 1 g

por va intramuscular; en la rata y el ratn, es de 600mg/kg por va
intravenosa y por va oral de ms de 500mg/kg. En el perro, por va
intramuscular, es una sola dosis. (Sumano, 1997)
2.2.3.3 CONTRAINDICACIONES DE LA TILOSINA
La tilosina no se debe administrar en gallinas de postura, porque el huevo

puede adquirir concentraciones altas del antibitico, adems de que las
gallinas no se deben inyectar por va intramuscular tres das antes del
sacrificio, ni 24 horas si la sustancia se proporciona va oral. En el caso de
pavos debe ser 5 das de espera para el consumo humano despus de
administrar la tilosina. Las vacas lactantes se deben retirar de la lnea de
ordea durante 96 horas para evitar el consumo de leche por el ser
humano ya que en la leche hay aproximadamente 1mg/ml.
Los cerdos no se deben sacrificar en un lapso de 21 das tras la

administracin de tilosina, si se utiliz la va intramuscular, y de cuatro
das si se emple la va oral. (Sumano, 1997)
9
2.2.4 POTENCIA
Bajo las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibiticos

puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre microorganismos. La
reduccin en la actividad antimicrobiana tambin revela cambios sutiles
no comprables mediante mtodos qumicos. En consecuencia, las
valoraciones microbiolgicas o biolgicas sigue siendo, por lo general, el
estndar para disipar dudas en cuanto a la posible prdida de la actividad.
La cantidad mnima de tilosina que se puede cuantificar o la potencia de

este antibitico es de 900UI/mg (USP 30). Para la Tilosina fosfato mnimo
800 UI/mg en base anhidro, es de color ligeramente amarillo en polvo;
para tilosina Tartrato mnimo 800 UI/mg en base anhidra, es en polvo
ligeramente blanco.
2.2.4.1 METODOS DE EVALUACIN DE POTENCIA

MICROBIOLOGICA
Se emplean dos mtodos generales: la valoracin en cilindro en placa y

valoracin turbidimtrica o en tubo. El primer mtodo se basa en la
difusin del antibitico desde un cilindro vertical a travs de una capa de
agar solidificada en un plato o placa de petri hasta inhibir totalmente el
crecimiento del microorganismo aadido, en un rea circular o zona de
inhibicin en torno del cilindro que contiene una solucin del antibitico. El
mtodo turbidimtrico se basa en la inhibicin del crecimiento de un
cultivo microbiano en una solucin uniforme del antibitico de un medio
lquido que promueva su rpido crecimiento en ausencia del antibitico
(USP 30)
2.2.4.2 DIFUSIN EN PLACA
Se basa en la difusin radial de una solucin de un antibitico desde un

reservorio a travs de una capa de agar que ha sido inoculada con un
microorganismo sensible al antibitico. Se colocan cantidades medidas de
sustancias a ensayar en placas con medio de cultivo slido inoculado con
10
un microorganismo adecuado. Las placas se incuban para permitir el
desarrollo del microorganismo. La zona obtenida es una zona clara (halo)
de inhibicin del crecimiento en torno a los reservorios. La base
cuantitativa del ensayo es la relacin entre el dimetro de las zonas de
inhibicin y la concentracin de antibitico.
Figura 3. Ventajas y desventajas de las metodologas para

determinar potencia en antibiticos
Difusin en placa Turbidimetria
Mayor facilidad de operacin Mayor complejidad de operacin
Mayor tiempo de incubacin Menor tiempo de incubacin

Las placas deben ser idnticas y de Los tubos deben ser de igual
fondo plano dimetro y espesor
Las placas deben prepararse en La medida del volumen del medio
superficie nivelada debe ser muy cuidadoso
El producto se debe difundir El corte de la incubacin debe ser
simultaneo
El producto no debe precipitarse ni El producto debe solubilizarse
evaporarse en el medio de cultivo
La muestra no debe dar turbidez ni
color
No puede usarse microorganismos
que forme aglomerados
La contaminacin del tubo es critica
Error subjetiva de lectura La medicin de la respuesta es
objetiva
2.5. MICROORGANISMO
2.5.1 Micrococcus luteus
Los miembros del gnero Micrococcus son Cocos Grampositivos y se

encuentran en el ambiente y como flora transitoria en la piel del hombre y
varios mamferos (Koneman, 2004). Aunque excepcionalmente pueden
11
causar infecciones como endocarditis o bacteriemia en huspedes
susceptibles.
(http://db.doyma.es/cgi- bin/wdbcgi.exe/doyma/mrevista.pdf?pident=13042871)
Algunas especies producen pigmentos carotenoides y las colonias de

estas especies son de color amarillo o rosa brillantes en los medios
slidos. Ciertos especies de micrococos ha sido utilizadas en la industria
como microorganismos para ensayos biolgicos destinados a la deteccin
de agentes antimicrobianos en comidas para animales, cosmticos y
lquidos corporales. (Koneman, 2004)
A fines de 1995 Stackebrandt. Col. Realizaron anlisis de secuencias del

RNA ribosmico 16S de las nueve especies reconocidas de Micrococcus
y propusieron varios cambios en la taxonomia de estos microorganismos.
Segn estos investigadores, Micrococcus luteus y Micrococcus lylae son
las nicas especies que permanecen en el gnero Micrococcus; M.roseus,
M.varians y M. kristinae pertenece al gnero Kocuria, como K. roseus, K.
varians y K. kristinae, respectivamente M. halobius, M: nishinoiyaensis y
M. sedentarius se ubican ahora en tres gnros separados como
Nesterenkonia halobia, Kytococcus nishinomiyaensis y Dermacoccus
sedentarius, respectivamente M.agilis ha sido reclasificado en el gnero
Arthrobacter como A. agilis. (Koneman, 2004)
Figura4. Cuadro de mtodos para la identificacin de especies de

Micrococcus
12
Mtodo Reaccin Micrococcus
Produccin de cido a partir de glucosa en Negativo

anaerobiosis
Lisostafina Resistente
Produccin de cido a partir de la glucosa en Negativo
anaerobiosis y en presencia de 0.4 g/ml de
eritromicina
Furazolidona Resistente
Prueba de Oxidasa modificada Positivo
Bacitracina (disco Taxo A de 0.0 4 U) Sensible
Cuadro tomado de: (Koneman, 2004)
Micrococcus luteus la disposicin celular se encuentra en pares, ttradas,

cubos, grupos y es catalasa positivo; la pigmentacin es color amarillo,
oxidasa positivo, Motilidad negativo, hidrlisis de gelatina (Koneman,
2004).
Micrococcus, como muchos otros gneros de Actinobacteria, pueden ser
catabolicamente verstiles, con la habilidad de utilizar un extenso rango
de substratos inusuales, tales como piridina, herbicidas, bifenilos
policlorados y petrleo (Doddamani HP. 2201)
Sinnimos de Micrococcus luteus 9341: Kocuria rhizophila (Jane S., 2003)
13
Figura 5. Micrococcus luteus Tomada :
http://www.puc.cl/sw_educ/biologia/bio100/html/portadaMIval11.2.1.1.
1.html
2.6 VALIDACIN
El control analtico de un producto farmacutico o de los ingredientes

especficos del producto, es necesario para asegurar la inocuidad y
eficacia del producto durante todas las fases de su perodo de actividad,
incluyendo el almacenamiento, la distribucin y el uso. Idealmente, dicha
vigilancia debe efectuarse de conformidad con especificaciones
establecidas y comprobadas durante la elaboracin del producto. Con
esto se asegura que las especificaciones de calidad sean aplicables al
material farmacutico usado para establecer las caractersticas biolgicas
de las sustancias activas, como tambin a las formas farmacuticas
comercializadas. Cuando se completa la evaluacin biomdica del
producto, la aceptabilidad de todos los lotes subsiguientes ser juzgada
exclusivamente sobre la base de esas especificaciones. (OMS, 1996)
El objetivo principal de la validacin analtica es el de asegurar que un

procedimiento analtico seleccionado dar resultados reproducibles y
confiables que sean adecuados para el propsito previsto. De ah que sea
necesario definir debidamente tanto las condiciones en que el
procedimiento ha de emplearse como el objetivo previsto para el mismo.
Estos principios se aplican a todos los procedimientos descritos en la
farmacopea y tambin a los procedimientos no incluidos en la farmacopea
pero que se utilizan en una fbrica.
Si bien estas pautas son aplicables a los procedimientos usados para

examinar atributos qumicos y fsico-qumicos, muchas de ellas son
igualmente aplicables a los procedimientos microbiolgicos y biolgicos.
(OMS, 1996)
14
2.6.1 PARAMETROS DE CALIFICACION Y VALIDACION
2.6.1.1 CALIFICACIN DE INSTALACIN (IQ)
Establecer por evidencia objetiva que todos los aspectos claves del
equipo de proceso y la instalacin de sistemas auxiliares cumplen con las
especificaciones aprobadas del fabricante y las recomendaciones del
abastecedor del equipo son consideradas de manera apropiada (FDA,
2004)
2.6.1.2 CALIFICACIN OPERACIONAL (OQ)
Establecer por medio de evidencia objetiva los lmites de control de

proceso y los niveles de accin que resultan en un producto que cumpla
con todos los requerimientos predeterminados. (FDA, 2004)
2.6.1.3 CALIFICACIN DE DESEMPEO (PQ)
Establecer por medio de evidencia objetiva que los procesos, bajo

condiciones anticipadas, producen de manera consistente un producto
que cumple con todos los requerimientos predeterminados (FDA, 2004)
2.6.2 PARMETROS DE VALIDACIN DE UN MTODO
2.6.2.1 ESPECIFICIDAD
La especificidad es la capacidad de evaluar de manera inequvoca el

analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta
previsible, como impurezas, productos de degradacin y componentes de
matriz. La falta de especificidad de un procedimiento analtico individual
15
puede compensarse usando otros procedimientos analticos
complementarios (USP 30)
2.6.2.2 SELECTIVIDAD
La selectividad o especificidad de un procedimiento es la posibilidad de

que ste mida el analito en una forma que est libre de interferencia de
parte de otros componentes de la muestra que se est examinando (por
ejemplo, impurezas provenientes de la fabricacin o de la degradacin, o
bien ingredientes que no sean el analito, sean farmacolgicamente
activos o inertes). La selectividad (o la carencia de la misma) puede
expresarse en relacin con el sesgo de los resultados analticos obtenidos
cuando el procedimiento se aplica al analito en presencia de niveles
previstos de otros componentes, comparado con los resultados obtenidos
con el mismo analito sin sustancias agregadas. Cuando los dems
componentes son todos conocidos y estn disponibles, la selectividad
puede determinarse mediante la comparacin de los resultados analticos
obtenidos con el analito, con o sin la adicin de los materiales que pueden
interferir. Cuando dichos componentes no han sido identificados o no
estn disponibles, a menudo puede medirse la selectividad determinando
la recuperacin de una adicin normal de analito puro a un material que
contenga un nivel constante de los otros componentes. (OMS, 1996)
2.6.2.3 LINEALIDAD Y ALCANCE
La linealidad de un procedimiento analtico es la posibilidad de que ste

produzca resultados que sean directamente proporcionales a la
concentracin de analito en la muestra. El alcance del procedimiento es
una expresin de los niveles ms bajo y ms alto de analito que, segn se
haya demostrado, pueden ser determinables con precisin, exactitud, y
linealidad aceptables. Estas caractersticas son determinadas mediante la
aplicacin del procedimiento a una serie de muestras que tienen
16
concentraciones de analito que cubren el alcance atribuido al
procedimiento. Cuando la relacin entre la respuesta y la concentracin
no es lineal, se puede lograr la normalizacin por medio de una curva de
calibracin. (OMS, 1996)
2.6.2.4 PRECISIN
La precisin del procedimiento es el grado de concordancia entre los

resultados de los anlisis individuales. Se mide por la dispersin de los
resultados individuales de la media y usualmente se expresa como una
desviacin patrn o como el coeficiente de variacin (desviacin patrn
relativa) cuando el procedimiento completo se aplica repetidas veces a
muestras separadas e idnticas, obtenidas del mismo lote de material
homogneo. (OMS, 1996)
2.6.2.4.1 REPETIBILIDAD
Es la precisin del procedimiento cuando es repetido por el mismo

analista bajo el mismo conjunto de condiciones (los mismos reactivos,
equipos, graduaciones, y laboratorio) y dentro de un lapso breve. La
repetibilidad de un procedimiento se evala efectuando determinaciones
completas y separadas, con muestras separadas e idnticas del mismo
lote de material homogneo, y por lo tanto proporciona una medida de la
precisin del procedimiento bajo condiciones normales de operacin.
(OMS, 1996)
2.6.2.4.2 REPRODUCIBILIDAD
Es la precisin del procedimiento cuando se efecta bajo condiciones

diferentes, usualmente en diferentes laboratorios, con muestras
supuestamente idnticas obtenidas del mismo lote de material
homogneo. Tambin se puede obtener informacin valiosa efectuando
comparaciones de los resultados obtenidos por distintos analistas,
mediante el uso de diferentes equipos, o llevando a cabo el anlisis en
diferentes momentos. (OMS, 1996)
17
2.6.2.5 EXACTITUD
La exactitud del procedimiento empleado consiste en la proximidad de los

resultados obtenidos al valor real. La exactitud puede determinarse
aplicando el procedimiento a las muestras del material a examinarse,
cuando han sido preparadas con exactitud cuantitativa. Siempre que sea
posible, esas muestras deben contener todos los componentes del
material, incluyendo el analito. Deben prepararse tambin muestras en las
que el analito haya sido incorporado en cantidades de aproximadamente
10% por encima y por debajo de la gama de valores prevista. Tambin es
posible determinar la exactitud comparando los resultados con los
obtenidos empleando otro procedimiento ya comprobado. (OMS, 1996)
2.6.2.6 LMITE DE DETECCIN
El lmite de deteccin es el nivel ms bajo de analito que pueda

detectarse, pero no necesariamente determinado en forma cuantitativa,
empleando un mtodo especfico bajo las condiciones experimenta les
exigidas. Dicho lmite generalmente se expresa en trminos de la
concentracin de analito (por ejemplo, en microgramos por litro) en la
muestra. Cuando la medicin final se basa en la lectura de un
instrumento, se deber tener en cuenta la respuesta de fondo (la
proporcin entre seal y ruido) (OMS, 1996)
2.6.2.7 LMITE DE CUANTIFICACIN
El lmite de cuantificacin es la concentracin ms baja de analito en la

muestra, que puede ser determinada con precisin y exactitud aceptables
cuando se emplea el procedimiento exigido. Se mide mediante el anlisis
de muestras que contengan cantidades conocidas de analito en
disminucin, y la determinacin del nivel ms bajo al cual pueden
alcanzarse grados aceptables de exactitud y precisin. Cuando la
evaluacin final se basa en la lectura instrumental, tal vez sea necesario
evaluar y tener en cuenta la magnitud de la respuesta de fondo (la
proporcin entre seal y ruido). En muchos casos el lmite de
18
cuantificacin es aproximadamente el doble que el de deteccin. (OMS,
1996)
2.6.2.8 ROBUSTEZ
La robustez de un procedimiento analtico es una medida de su capacidad

para no resultar afectado por variaciones pequeas pero deliberadas en
los parmetros enumerados en la documentacin del procedimiento, y a la
vez, da una idea de su aptitud durante su uso normal. La robustez puede
determinarse durante la etapa de desarrollo del procedimiento analtico
(USP 30)
2.6.2.9 SENSIBILIDAD
La sensibilidad es la capacidad del procedimiento de prueba de registrar
pequeas variaciones de la concentracin. Es la inclinacin de la curva de
calibracin. Se debe evitar usar el trmino en forma ms general, es decir,
abarcando lmite de deteccin y/o lmite de cuantificacin. (OMS,1996)
2.6.3 TIPOS DE VALIDACION DEL PROCESO
2.6.3.1 VALIDACIN PROSPECTIVA
Este tipo de validacin se basa en informacin obtenida antes de

implantar el proceso de validacin. Se realiza durante la etapa de
desarrollo, mediante un anlisis de riesgos del proceso de produccin,
que se divide en pasos individuales, estos se evalan entonces a la luz de
la experiencia para determinar si podran conducir a situaciones crticas;
se investigan posibles causas y se determina la probabilidad de que
suceda y su magnitud, se trazan los planes del ensayo y se fijan las
prioridades; a continuacin se efectan y se evalan los ensayos y se
19
hace una valoracin general; si los resultados son aceptables al final, el
proceso es satisfactorio. Los procesos no satisfactorios se tienen que
modificar y mejorar hasta que una nueva validacin demuestre su carcter
satisfactorio. Este tipo de validacin es importante para limitar el riesgo de
errores que se producen a escala de produccin, por ejemplo, en la
preparacin de productos inyectables. (Comisin Europea, 2001)
2.6.3.2 VALIDACIN CONCURRENTE
La informacin requerida en este tipo de validacin se obtiene durante la

implementacin del mismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en
proceso de la variables crticas que demuestre que el proceso est bajo
control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en estado
productivo. (Comisin Europea, 2001)
2.6.3.3 VALIDACIN RETROSPECTIVA
Este tipo de validacin se lleva a cabo por medio de la revisin y anlisis

de la informacin histrica del proceso. Se deben tomar como mnimo 20
a 30 lotes que cuenten con reportes analticos slidos y confiables,
documentacin que muestre condiciones de los procesos y estudios de
reclamos de los productos, entre otros. Dentro de este tipo de validacin
es necesario tener en cuenta el control de la materia prima, controles
ambientales, controles microbiolgicos, equipos, procedimientos, mtodos
analticos y especificaciones; es aplicada para productos que se
encuentran en el mercado y cuyo proceso de manufactura se considera
estable, adems cuando por las caractersticas del producto,
econmicamente no se justifica hacer una validacin prospectiva. La
validacin retrospectiva tambin puede ser til en el establecimiento de
las prioridades en un programa de validacin (Comisin Europea, 2001)
2.6.3.4 REVALIDACIN
Es la repeticin de un procedimiento de validacin o una parte del mismo.

Esto no significa que el programa original deba ser repetido. Se aplica
20
cuando se presenta cambio de uno de los componentes crticos de la
formulacin, cambio o reemplazo de una pieza crtica en un sistema o
equipo, cambio en instalaciones, cambio en tamao del lote de fabricacin
y por unidades producidas fuera de especificaciones en lotes
consecutivos.
La revalidacin peridica se presenta cuando los procesos experimentan
cambios graduales, incluso si operarios experimentados trabajan
correctamente aplicando los mtodos establecidos. De manera anloga,
el desgaste del equipo puede tambin causar cambios graduales. Por
consiguiente, es aconsejable realizar revalidacin a intervalos
programados, incluso sin introducir cambios deliberados.
La decisin de implantar la revalidacin peridica debe basarse
esencialmente en un examen de datos histricos, es decir, datos
producidos durante las pruebas del proceso de fabricacin y del producto
terminado efectuadas despus de la validacin ms reciente, con el
objetivo de verificar si el proceso est bien controlado. Al examinar esos
datos histricos se debe evaluar cualquier tendencia observada en los
datos compilados. (Comisin Europea, 2001)
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
El Control de Calidad es una estrategia para asegurar el mejoramiento

continuo de la calidad. Programa para asegurar la continua satisfaccin
de los clientes externos e internos mediante el desarrollo permanente de
la calidad del producto y sus servicios.
Para el control de calidad en la elaboracin de medicamentos en la
industria farmacutica veterinaria es importante obtener medicamentos
seguros y reproducibles, para esto se debe realizar la validacin de las
tcnicas.
21
Al examinar los datos de validacin de los mtodos, se espera que los
datos para las pruebas repetitivas sean coherentes y que las diversas
concentraciones de las soluciones de prueba provean resultados lineales.
Tilosina es un principio activo que pertenece al grupo de los Macrlidos,

presentando accin bacteriosttica sobre una amplia gama de patgenos
como Estafilococos, Estreptococos, Clostridios, Leptospiras, Chlamydas,
Diplococos, Bacilos, Mycoplasmas y es de gran inters solo a nivel
veterinario. (Adams, 2003)
Colombia es un pas agropecuario donde la Tilosina es de gran inters en

el sector ganadera y/o pecuaria y se busca ofrecer calidad en los
productos ofrecidos, apoyando el bienestar animal.
El objetivo de este estudio es la validacin microbiolgica de la tcnica

para la cuantificacin de Tilosina, en una empresa que fabrica productos
farmacuticos de uso veterinario.
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Implementar y validar una tcnica para la cuantificacin de Tilosina,

mediante el mtodo de Potencia recomendado segn la United States
Pharmacopeia (USP)
22
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Realizar la tcnica de cuantificacin de tilosina durante el proceso de

validacin concurrente
Validar la tcnica de cuantificacin de tilosina, producto en polvo,

alimento balanceado mediante el mtodo de difusin en placa.
Evaluar los parmetros y la efectividad del ensayo para el anlisis

microbiolgico de productos farmacuticos, especficamente tilosina,
empleando una tcnica de potencia
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 MATERIALES
Cajas de Petri estriles desechables
Balones aforados
Pipetas graduadas y aforadas
Frascos Schott volumen 500 ml
Puntas estriles
Micropipeta 10-100 l
Asa redonda
23
Tubo taparosca 16*100 mm
Beaker 100 mL
5.2 REACTIVOS
Metanol grado reactivo
Fosfato dibsico de potasio
Fosfato monobsico de potasio
Cloruro de sodio NaCl 0.9%
Acido fosforico 18 N
Hidroxido de potasio 10 N
5.3 MEDIO DE CULTIVO

Medio antibitico N 11
5.5 MICROORGANISMO
Micrococcus luteus ATCC 9341
5.6 EQUIPOS
Incubadora 35C +/- 3
Bao termostatado
Cabina Seguridad Biolgica Clase II
Autoclave
Ultrasonido
Calibrador
24
6. METODOLOGA
25
Metodologa
Medio Repique Diluciones

antibitico N 11 M. luteus
ATCC 9341
(da anterior)
Bases (20 ml) Preparacin Preparacin de la
del estndar muestra -> ultrasonido
Inoculo 3 ml * 100ml
Patrn Mac farland 25%
transmitancia
Siembra
Incubacin 16-18 horas
Lectura de halos
26
6.1 PROCEDIMIENTO DE LA VALIDACION
6.1.1 PREPARACIN DEL MICROORGANISMO
A partir de una cepa original en Loop realizar recuperacin en agar

tripiticasa soya para poder realizar repique de la cepa M. luteus ATCC
9341, incubar por 24 horas y observar un crecimiento macroscpico de
color amarillo; no se debe realizar mas de tres pases de la cepa.
6.1.2 PREPARACIN DEL BUFFER

Solucin amortiguadora N 3 pH 8; Disolver 16.73 g de fosfato dibsico de
potasio y 0.523 de fosfato monobsico de potasio en 1000 mL de agua.
Ajustar el pH con cido fosfrico 18N o Hidrxido de potasio 10N a 8.0 +/-
0.1
El diluyente a utilizar con la tilosina es una mezcla de proporcin1:1 con
solucin Buffer N 3 y metanol grado reactivo
6.1.3 PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO

El medio antibitico N 11 contiene peptona, peptona de casena, extracto
de levadura, extracto de carne, dextrosa y agar. El pH final de 8.0 +/- 0.2
Se agrega 30.5 g de medio a 1000mL de agua destilada en frasco schott
y someter a calor hasta ebullicin y luego esterilizar en autoclave a 121C
por 15 minutos
Para preparar las bases se hizo con Medio antibitico N 11 agregando a

cada caja 20 ml de medio con la ayuda de un beaker, y dejar solidificar
por 40 minutos.
27
6.1.4 INOCULO
Se inocul con 6 ml con pipeta; para realizar el inculo se prepar con

solucin salina al 0.9% la suspensin de microorganismo y se enfrento
con el patrn de Mc farland al 25% de transmitancia, luego se adicion 3
ml de esta suspensin por cada 100 ml de Medio antibitico N 11,
homogenizar y se deja solidificar el inculo mnimo por una hora. Sobre la
base previamente servida en la caja
6.1.5 PERFORACIN Y LECTURA
Con ayuda del sacabocado se perforan las cajas, se realizan 6

perforaciones y se saca el residuo de agar con pinzas. Se marcan las
cajas y se realiza la siembra enfrentndolo con la concentracin central de
trabajo, se agreg 100 l en cada pozo. Luego se incubo por 16-18 horas
a 37C, las cajas se incuban hacia arriba y despus de este tiempo se
realiz la lectura de los halos de inhibicin y se registro en el formato VI-
TC36-000F1
6.1.6 CONTROLES
Los controles que se lleva durante los montajes son:

Control positivo: Caja inoculada con microorganismo
Control negativo: Caja sin inoculo
Control del montaje: se lleva con el estndar que esta en pozo intermedio
de cada concentracin de trabajo.
28
6.2 MUESTRA DE TRABAJO Y ESTANDAR
La forma farmacutica de la muestra es en polvo, la concentracin del

activo es 10g/100g, lote TF0H0072P y el porcentaje de aceptacin es de
90-110%
El estndar fue tilosina fosfato lote E067067 fecha de expiracin Junio
08 Potencia: 901.8 UI/mg.
6.3 VALIDACIN
Se realiz una validacin de tipo concurrente debido a que la informacin

requerida se obtuvo durante la implementacin de esta.
En la validacin de la metodologa de la tcnica de cuantificacin de

Tilosina se evaluaron los parmetros y los resultados obtenidos fueron
inicialmente analizados y almacenados en Excel y luego se analizaron
mediante un programa estadstico Validation Manager versin: 2.20 L
serial : 054130077083
29
7. PARMETROS
7.1 GENERALIDADES
Para los montajes de evaluacin de los parmetros para el estndar se

pesa 25mg y se afora con metanol en un baln de 50ml, se toma una
alcuota de 2ml en un baln de 50ml y se afora con metanol y buffer pH 8
relacin 1:1, luego de esta dilucin se toma una alcuota de 4ml en un
baln de 50ml y se afora con metanol y buffer relacin 1:1.
Para el montaje de la muestra se pesa 940mg en un baln de 50ml se

somete a ultrasonido, luego se toma 2ml en un baln de 100ml y de esta
ultima dilucin se toma 1ml en un baln de 25ml, las diluciones de la
muestra se aforan con metanol y buffer pH 8 relacin 1:1.
Aplica para especificidad, selectividad y precisin
7.2 ESPECIFICIDAD
Para comprobar la especificidad del mtodo analtico se prepararon

muestras al 100% con el estndar y se realiz este anlisis por triplicado.
La concentracin seleccionada fue de 1.6UI/ml, siendo esta la
concentracin central de trabajo.
El estndar la primera dilucin se realiza con metanol grado reactivo y
luego las siguientes diluciones se realiza con metanol y Buffer pH 8 en
relacin 1:1. Para la muestra las diluciones de trabajo se realizaron con
metanol y Buffer pH 8 en relacin 1:1, adems de esto, la muestra fue
sometida a ultrasonido por 15 minutos.
30
Especificidad
ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI/mL
2 50 BPH8:MEOH
4 50
MUESTRA 940mg 50 1.6 UI/mL

2 100
1 25
BPH8:MEOH
7.3 SELECTIVIDAD
Para verificar la selectividad del mtodo analtico se prepararon muestras

al 100% y se realizaron los siguientes pasos
Se realiz el montaje de la muestra y adems de este se realizo tambin
el anlisis al excipiente carrier; con el fin de detectar posibles
interferencias, siendo este el placebo.
Se evalu las posibles interferencias de metabolitos de degradacin
sometiendo la molcula a condiciones de Temperatura, pH, fotolisis y
calor.
Para pH cido se prepar una muestra para hidrlisis cida empleando
HCL 1N y se someti la muestra por una hora a temperatura de 60C.
Para pH bsico se prepar una muestra para hidrlisis bsica empleando
NaOH 1N y se someti en el horno la muestra por una hora a
temperatura de 60C.
Para observar la degradacin por accin de la luz se expuso la bajo luz
U.V por una semana a exposicin solar.
Para la determinacin trmica se realiz exponiendo la muestra a 60C
por una hora
31
El estndar, la muestra y el placebo fueron sometidos en la ltima dilucin
a cada una de las condiciones anteriormente mencionadas menos a
condicin ultravioleta que fue la exposicin antes de hacer las diluciones.
Tabla 2. Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la

selectividad
ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL
2 50 BPH8:MEOH
4 50 BPH8:MEOH

2 100
1 25
BPH8:MEOH
7.4 LINEALIDAD DEL SISTEMA
Para la linealidad del sistema se trabajaron 8 concentraciones (0.6, 1.0,

1.2, 1.4, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8 UI/ml) para manejar un rango de trabajo entre
el 80% y 120%; con esta linealidad se calcul pendiente e intercepto y as
se calcularon los dems parmetros de validacin.
Se pesa 25 mg de estndar en un baln de 50ml y se afora con metanol
de esta dilucin se toma una alcuota de 2ml en un baln de 50ml y se
afora con metanol y buffer pH 8 relacin 1:1 de esta ultima dilucin tomo
alcuotas de 3, 4, 5, 6, 7ml en Balones de 50ml y se afora con el
diluyente.
De la primera dilucin del estndar se toma una alcuota de 3ml en un
baln de 50ml y de esta se toma una alcuota de 1ml en un baln de
50ml y se afora con el diluente.
32
Con la inicial dilucin del estndar se toma una alcuota de 1ml en un
baln de 50ml, de esta dilucin se toma alcuotas de 5 y 7ml en balones
de 50ml.

linealidad del sistema
Estndar 25mg 50
2 50
3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
50 50 50 50 50
1,2 1,6 2,0 2,4 2,8
C E F G H
Estndar
25mg 50 25 50
3 50 1,0 50
1,0 5,0 7,0
50 50 50
0,6 1,0 1,4
A B D
33
7.5 LINEALIDAD DEL METODO
En la linealidad del mtodo, se realiz con el estndar ms placebo

diferentes diluciones obteniendo 8 concentraciones (0.6, 1.0, 1.2, 1.4,
1.6, 2.0, 2.4, 2.8 UI/ml) para determinar la concentracin de trabajo. Se le
adicion 1 ml de placebo a cada concentracin antes de aforar la ltima
dilucin de cada concentracin.
La dilucin inicial se diluyo con metanol y las siguientes diluciones se
realizaron con metanol-Buffer pH 8 relacin 1:1
Se pesa 25 mg de estndar en un baln de 50ml y se afora con metanol
de esta dilucin se toma una alcuota de 2ml en un baln de 50ml y se
afora con metanol y buffer pH 8 relacin 1:1 de esta ultima dilucin tomo
alcuotas de 3, 4, 5, 6, 7ml en Balones de 50ml y se le agrega 1ml de
placebo y se afora con el diluyente.
De la primera dilucin del estndar se toma una alcuota de 3ml en un
baln de 50ml y de esta se toma una alcuota de 1ml mas 1ml de placebo
en un baln de 50ml y se afora con el diluente.
Con la inicial dilucin del estndar se toma una alcuota de 1ml en un
baln de 50ml, de esta dilucin se toma alcuotas de 5 y 7ml en balones
de 50ml mas 1ml de placebo.
Para el placebo se pesa 940mg en un baln de 50ml de esta se toma una
alcuota de 2ml en un baln de 100ml y se afora con diluente.
34
Linealidad del mtodo
Estndar 25 50
2 50
3,0 +1ml 4,0 +1ml 5,0 +1ml 6,0 +1ml 7,0 +1ml
placebo placebo placebo placebo placebo
50 50 50 50 50
1,2 1,6 2,0 2,4 2,8
C E F G H
Estndar 50
25 25 50
3 50 1,0 50
1,0 +1ml 5,0+ 1ml 7,0 +1ml

placebo placebo placebo
50 50 50
0,6 1,0 1,4
A B D
35
PLACEBO 940 mg 50
2 100
7.6 PRECISION DEL MTODO
En la precisin del mtodo se realiz por dos analistas en dos das

diferentes con la misma muestra.

Precisin del mtodo
ESTANDAR 25 50 MeOH
2 50 BPH8:MEOH
4 50 BPH8:MEOH
1.6 UI / mL

2 100
1 25
BPH8:MEOH
7.7 PRECISIN DEL SISTEMA
Para la evaluacin del parmetro precisin del sistema, se tom 10 datos

de la concentracin central del parmetro linealidad del sistema y se
someti al tratamiento estadstico Validation Manager.
36
7.8 EXACTITUD
Para la evaluacin del parmetro de exactitud se realiz a diferentes

concentraciones con el estndar al 80, 100 y 120 % adicionando placebo
a la ultima dilucin 1 ml. Para verificar el porcentaje de recuperacin entre
97-103%.

Exactitud
MUESTRA 20 mg 50 MeOH 1.3 UI / mL
Concentracin
Al 80% 2 50 BPH8:MEOH
4 +1ml
placebo 50 BPH8:MEOH
Placebo 752 mg 50
2 100

Concentracin
4 +1ml
Placebo 940 mg 50
2 100

Concentracin
4 +1ml
Placebo 1.128mg 50
2 100
37
7.9 LMITE DE DETECCIN
Para la evaluacin del parmetro del lmite de deteccin se realiz

diluciones desde 0.2 UI/ml hasta obtener la concentracin de 0.6 UI/ml y
se enfrento con el estndar a una concentracin de 1.6 UI / mL. En la
primera dilucin se realiz con metanol y las siguientes con metanol y
buffer pH 8 relacin 1:1.
Tabla 7: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en el

Limite de deteccin.
ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL

2 50 BPH8:MEOH
4 50 BPH8:MEOH
MUESTRA 25 50 MeOH 0.6 UI / mL

3 50 BPH8:MEOH
1 50 BPH8:MEOH
7.10LIMITE DE CUANTIFICACIN
Para la evaluacin de limite de cuantificacin, se realiz el montaje a la

concentracin de 0.8 UI/ml para la muestra enfrentndolo con el estndar
a concentracin de 1.6 UI / mL, para verificar que esta es la concentracin
mas diluida donde se puede cuantificar, en forma confiable el activo de
trabajo.
38
Tabla 8: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en el
Limite de cuantificacin
25 50
ESTANDAR MeOH 1.6 UI / mL
2 50 BPH8:MEOH
4 50 BPH8:MEOH
MUESTRA 25 50 MeOH 0,8 UI / mL

4 50 BPH8:MEOH
1 50 BPH8:MEOH
39
8. RESULTADOS Y DISCUSION
8.1 ESPECIFICIDAD
Tabla 9: Resultado del parmetro de especificidad
RESULTADO
M1 MUESTRA 10.6 g / 100g
M2 PLACEBO NO PRODUCE HALO
M3 DILUENTE NO PRODUCE HALO
Ver anexo N 1.1

A partir de los resultados obtenidos, la tcnica permite encontrar
respuesta en el activo de trabajo. El placebo y el diluente no afecta la
respuesta de la tilosina ya que no produce halo de inhibicin demostrando
as que el halo de inhibicin que se expresa es solo de la Tilosina.
8.2 SELECTIVIDAD
8.2.1 SELECTIVIDAD CONDICIN CIDA

Tabla 10: Resultado del porcentaje de degradacin en el
parmetro Selectividad en condicin cida
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 32,4
M2 MUESTRA 44,2
M3 PLACEBO ----
Ver anexo N 1.2.1
40
8.2.2 SELECTIVIDAD CONDICIN BSICA
parmetro Selectividad en condicin bsica
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 96,1
M2 MUESTRA 95,9
M3 PLACEBO ----
Ver anexo N 1.2.2
8.2.3 SELECTIVIDAD CONDICIN ULTRAVIOLETA

parmetro Selectividad en condicin ultravioleta
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 7,0
M2 MUESTRA 14,5
M3 PLACEBO ----
Ver anexo N 1.2.3
8.2.4 SELECTIVIDAD CONDICIN TRMICA

parmetro Selectividad en condicin trmica
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 38,9
M2 MUESTRA 52,0
M3 PLACEBO ----
Ver anexo N 1.2.4
41
En condicin cida el porcentaje de degradacin del estndar fue del
32.4% y la muestra de 44.2% donde se observa que este que el principio
activo frente a condicin cida se ve afectada.
En condicin bsica el porcentaje de degradacin del estndar fue del
96.1% y de la muestra del 95.9%, se observa que la molcula del principio
activo fue seriamente afectada.
En condicin de calor el estndar tiene un porcentaje de degradacin del
38.9 y la muestra de 52%; en condicin de ultravioleta el estndar tiene
un porcentaje de degradacin del 7% y la muestra del 14.5%.
El placebo frente a las diferentes condiciones no se vio afectado, como
era de esperarse no hubo halo de inhibicin.
Estos resultados indican que el producto debe estar bien almacenado, no
debe estar bajo el sol y que la condicin bsica se va afectado en mayor
porcentaje que en los otro parmetros evaluados.
Tilosina es sensible a condiciones extremas de evaluacin ya que a si sea
en muestra se encuentra una disminucin del activo.
Las soluciones son estables durante 30 das a temperatura ambiente y a
un pH de 4 a 9. Por hidrlisis cida (pH inferior 4) se descompone en dos
fracciones: el azcar y la desmicosina, un producto microbiologicamente
activo que posee propiedades fsico-qumicas similares. Si prosigue el
desdoblamiento, se liberan los sacridos neutros micarosa y micaminosa.
La tilosina conserva su estabilidad durante dos aos en las condiciones
habituales de condicionamiento. (H. Trolldenier, 1980)
8.3 LINEALIDAD
8.3.1 LINEALIDAD DEL SISTEMA

En la linealidad del sistema del principio activo tilosina fosfato, la ecuacin
de la recta es y=0.094x -1.209 con un coeficiente de correlacin o r2 de
0.996.
42
Se encuentra en proporcionalidad entre la concentracin de trabajo y el
dimetro del halo, es decir es directamente proporcional la concentracin
al halo.
La linealidad del sistema es la curva patrn para la evaluacin de los
parmetros de validacin.
Ver anexo N 1.3
8.3.2 LINEALIDAD DEL MTODO

El coeficiente de correlacin obtenido es el ndice estadstico que mide la
relacin lineal entre las dos variables cuantitativas (log de concentracin y
dimetro). Este mide la correlacin entre la variable dependiente xi
(Dimetro halo) y una variable independiente yi (Log de concentracin),
El coeficiente de correlacin obtenido es cercano a 1 existiendo una
correlacin positiva. El ndice indica que existe una dependencia total
entre las dos variables denominada relacin directa: cuando el halo tiene
un mayor dimetro (mm) la concentracin (UI/ml) del principio activo es
mayor, es decir cuando una de las variables aumenta, la otra tambin lo
hace en idntica proporcin. (Reyes Aguero C., 2007).
El parmetro de aceptacin va desde 0.95 el coeficiente de correlacin.
La linealidad del mtodo de tilosina con el estndar la ecuacin de la recta
es y=0.121x-1.581 donde la pendiente es 0.121 y el coeficiente de
correlacin r2 = 0.957 y este esta dentro de la especificacin.
Se encuentra una respuesta lineal ya que hay proporcionalidad entre la
concentracin de trabajo y la respuesta del halo.
Ver anexo N 1.4
43
8.4 PRECISIN
8.4.1 PRECISIN DEL MTODO
8.4.1.1 PRECISIN DA 1 ANALISTA 1
Tabla 14: Resultados del parmetro precisin da 1, analista 1

MUESTRAS
M1 M2 M3
Dimetro 15,00 15,15 14,78
Concentracin (UI/ml) 1,5933 1,6432 1,5192
Log (Concentracin) 0,202 0,216 0,182
Cantidad Muestra (mg) 940,8 940,7 941,4
g tilosina /100 g 10,6 10,9 10,1
Potencia Promedio 10,53
% 105,3
Ver anexo N 1.5.1
8.4.1.2 PRECISIN DIA 1 ANALISTA 2

MUESTRAS
M1 M2 M3
Dimetro 14,79 14,69 14,76
g tilosina /100 g 10,1 9,9 10,0
% 100,1
Ver anexo N 1.5.2
44
MUESTRAS
M1 M2 M3
Dimetro 14,58 14,50 14,66
g tilosina /100 g 9,7 9,5 9,8
% 96,6
Ver anexo N 1.5.3

MUESTRAS
M1 M2 M3
Dimetro 15,08 14,56 14,62
g tilosina /100 g 10,8 9,6 9,7
% 100,4
Ver anexo N 1.5.4
Coeficiente de variacin de repetitibilidad 3.98

Especificacin max.: 5.00
45
Coeficiente de variacin de la precisin intermedia 4.81
Especificacin mx.: 5.00
La precisin del procedimiento es el grado de concordancia entre los

resultados de los anlisis individuales.
Se observ en la precisin del mtodo en el analista 1 en los dos das se

obtiene el 105,3 % y 96,6 % , para el analista 2 se obtuvo 100,1% y
100,4% , proporcionndonos un coeficiente de variacin de repetibilidad
de 3.98 y un coeficiente de variacin de precisin de 4.81 con una
especificacin mxima de 5; indicndonos que el mtodo cumple para
repetibilidad (es la precisin del procedimiento cuando es repetido por el
mismo analista bajo el mismo conjunto de condiciones los mismos
reactivos, equipos, graduaciones, y laboratorio y dentro de un lapso
breve) y reproducibilidad (efectuando comparaciones de los resultados
obtenidos por distintos analistas, llevando a cabo el anlisis en diferentes
momentos) (OMS, 1996)
8.5 EXACTITUD
8.5.1 EXACTITUD CONCENTRACION 80%

Tabla 18: Resultados del parmetro Exactitud al 80%
MUESTRAS
M1 M2 M3
Dimetro 14,30 13,63 13,96
Concentracin (UI/ml) recup 1,3678 1,1838 1,2700
Cantidad Muestra mg 22,7 20,3 21,8
UI reales / mg 1,3 1,2 1,3
Porcentaje Recuperado % 104 101 101
Porcentaje % 102,1
Ver anexo N 1.6.1
46
8.5.2 EXACTITUD CONCENTRACION AL 100%
MUESTRAS
M1 M2 M3
Dimetro 14,62 14,52 14,56
Concentracin (UI/ml)
recuperada 1,4674 1,4356 1,4463
UI reales / mg 1,4 1,5 1,5
Porcentaje % 98,7
Ver anexo N 1.6.2
8.5.3 EXACTITUD CONCENTRACION AL 120%

MUESTRAS
M1 M2 M3
Dimetro 15,28 15,96 15,28
recuperada 1,6918 1,9594 1,6909
UI reales / mg 1,7 1,8 1,7
Porcentaje % 99,2
Ver anexo N 1.6.3
47
La exactitud del procedimiento empleado consiste en la proximidad de los
resultados obtenidos al valor real (OMS,1996)
La especificacin para la exactitud, el porcentaje de recuperacin debe
estar entre los limites 97%-103%
El porcentaje de recuperacin al 80, 100 y 120% fue cercano al 100%,
esta dentro del rango permitido, esto indica que la tcnica es exacta
dando valores reales al momento de trabajar.
8.6 LIMITES
8.6.1 LIMITE DE DETECCIN

Tabla 21: Resultados del parmetro Limite de Deteccin
MUESTRAS CONCENT RESULTADO

No se detecta halo de
M1 ST 0.2 UI / mL inhibicin
No se detecta halo de
M2 ST 0.4 UI / mL inhibicin
M3 ST 0.6 UI / mL Se detecta halo de inhibicin
Ver anexo N1.7

El lmite de deteccin es el nivel ms bajo de analito que pueda
detectarse, pero no necesariamente determinado en forma cuantitativa,
empleando un mtodo especfico bajo las condiciones experimenta les
exigidas (OMS, 1996)
El limite de deteccin se determin a partir de la concentracin de 0.6 UI/
mL esta es la mnima concentracin donde se detecta y se observa halo
de inhibicin.
El lmite de deteccin por no ser un parmetro que pueda ser sometido a
programa debe hacerse en forma experimental para poder establecer en
donde no se puede encontrar halo de inhibicin
48
8.6.2 LIMITE DE CUANTIFICACIN
Tabla 22: Resultados del parmetro Limite de cuantificacin
MUESTRAS
M1 M2 M3
Dimetro 11,90 12,09 12,08
Log (Concentracin) -0,089 -0,072 -0,073
UI reales / mg 0,8 0,8 0,8
Porcentaje Recuperado% 103 106 108
Porcentaje % 105,9
MUESTRAS
M1 M2 M3
Dimetro 12,03 11,97 11,81
Log (Concentracin) -0,078 -0,084 -0,098
UI reales / mg 0,8 0,8 0,8
Porcentaje Recuperado% 105 104 101
Porcentaje % 103,1
El lmite de cuantificacin es la concentracin ms baja de analito en la

muestra, que puede ser determinada con precisin y exactitud aceptables
cuando se emplea el procedimiento exigido. En muchos casos el lmite de
cuantificacin es aproximadamente el doble que el de deteccin (OMS,
1996)
49
El lmite de cuantificacin fue de 0.8 UI/mL Se confirma que la
concentracin es exacta y cuantificable porque arroj resultados
coherentes y confiables.
Ver anexo N 1.8
CONCLUSIONES
50
Se estandariz la tcnica para la cuantificacin del principio activo
tilosina
Se valido la tcnica de cuantificacin de tilosina en un producto en
polvo.
Se evidenci que el principio activo frente a condiciones de calor,
ultravioleta y cidos es susceptible la tilosina y en condicin bsica
supera el 95% de degradacin.
Los parmetros crticos para la validacin microbiolgica de la
tcnica es selectividad y precisin
Se demostr que la tcnica difusin en agar mediante la tcnica de
potencia funciona para la validacin de la tcnica de cuantificacin
de tilosina.
La linealidad por ser parmetro fundamental ya que a partir de este
se calculan los otro parmetro, debe manejarse con valores
aceptables como por ejemplo el r2 superior a 0.95.
Cuando cambie su composicin o fabricacin del Tifomix se
recomienda hacer revalidacin de la tcnica de cuantificacin de
tilosina.
BIBLIOFRAFIA
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CIDIGO PR-IIT-143. Universidad Autnoma de Ciudad Jurez.FO-
DGPDI- 001- 02. Fecha de Aprobacin: 22 de Mayo de 2006. Fecha de
Revisin: 21 Febrero de 2007.
54
ANEXOS
1. RESULTADOS EN EXCEL
1.1 ESPECIFICIDAD
TIFOMIX
ACTIVO Tilosina Fosfato
Concentracin 10 g / 100g Lote TF0H0072P N Anlisis P012
1.6 UI /
ESTANDAR 25 50 MeOH mL MUESTRA 940mg 50 1.6 UI/mL
2 50 BPH8 2 100
4 50 BPH8 1 25
BPH8
Promedio
Muestras Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio correlacin
S3 16,74 15,53 15,72 15,34 16,11 16,06 15,35 16,02 15,03 15,77
MUESTRA 15,59 16,14 15,61 14,90 16,45 14,95 15,19 16,10 15,59 15,61 15,00
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio

S3 16,97 18,83 15,71 15,41 16,28 15,34 14,98 13,96 14,52 15,78
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- ---

S3
DILUENTE --- --- --- --- --- --- --- --- ---
MUESTRAS DATOS ESTANDAR

MUESTRA PLACEBO DILUENTE Peso (mg) 27,7
Dimetro 15,00 Potencia (P) UI/mg 901,8
Concentracin (UI/ml) 1,5933 Fecha de vencimiento Jun-08
Log (Concentracin) 0,202 Lote E0607067
Cantidad Muestra (mg) 940,8 DATOS
g tilosina /100 g 10,6 Pendiente 0,0941
Intercepto -1,2096
Factor de Dilucin (D) 6250
RESULTADO
M1 MUESTRA 10.6 g / 100g
M2 PLACEBO ---
M3 DILUENTE ---
55
1.2SELECTIVIDAD
1.2.1 SELECTIVIDAD CONDICIN CIDA

1.6 UI
ESTANDAR 25 50 MeOH / mL MUESTRA 940mg 50
2 50 BPH8 2 100
4 50 BPH8 1
Muestras Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio

S3 18,10 15,50 17,35 18,24 16,58 16,00 16,70 20,81 16,83 17,11
ESTANDAR 15,47 14,64 16,85 14,51 14,21 15,08 15,89 14,53 15,34 15,17

S3 16,84 16,18 16,90 16,29 16,18 18,00 17,94 13,27 15,28 16,52
MUESTRA 13,69 13,99 13,87 12,94 13,40 12,76 12,16 12,71 15,11 13,40

S3 16,97 18,83 15,71 15,41 16,28 15,34 14,98 13,96 14,52 15,78
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- ---

ESTANDAR MUESTRA PLACEBO Peso (mg) 27,7
Dimetro 13,21 12,05 Potencia (P) UI/mg 901,8
Concentracin (UI/ml) Fecha de
recuperada 1,0806 0,8392 vencimiento Jun-08
Log (Concentracin) 0,034 -0,076 Lote E0607067
Cantidad Muestra mg 27,7 940,0 DATOS
UI reales / mg 1,6 5,6 Pendiente 0,0941
Porcentaje % 68 56 Intercepto -1,2096
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 32,4
M2 MUESTRA 44,2
M3 PLACEBO ----
56
1.2.2 SELECTIVIDAD CONDICIN BSICA
ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 940mg 50 1.6 UI/mL
2 50 BPH8 2 100
4 50 BPH8 1 25
BPH8
Muestras
S3 18,34 16,18 15,96 16,08 17,26 15,18 16,94 17,97 16,31 16,69
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- ---

S3 15,44 15,56 16,81 14,09 16,70 15,58 17,73 16,84 17,38 16,24
MUESTRA --- --- --- --- --- --- --- --- ---

S3 16,91 16,49 14,98 16,39 15,87 16,51 14,08 14,45 14,93 15,62
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- ---

Fecha de
Concentracin (UI/ml) recuperada 0,0617 0,0617 vencimiento Jun-08
Log (Concentracin) -1,210 -1,210 Lote E0607067
UI reales / mg 1,6 0 Pendiente 0,0941
Porcentaje 3,9 4,1 Intercepto -1,2096
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 96,1
M2 MUESTRA 95,9
M3 PLACEBO ----
57
1.2.3 SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA
ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 940mg 50
2 50 BPH8 2 100
4 50 BPH8 1
Muestras
S3 16,12 13,91 14,52 13,56 15,65 14,42 14,59 15,96 14,38 14,78
ESTANDAR 14,57 13,70 15,33 13,83 14,93 13,38 14,25 14,66 14,07 14,30

S3 14,95 13,97 14,37 13,25 15,13 14,82 15,48 14,92 13,63 14,49
MUESTRA 13,99 14,43 13,62 14,09 15,59 14,05 16,13 15,04 15,39 14,70

S3 14,57 13,70 15,33 13,83 14,93 13,38 14,25 14,66 14,07 14,30
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- ---

Concentracin (UI/ml) recuperada 1,4865 1,2859 Fecha de vencimiento Jun-08
Log (Concentracin) 0,172 0,109 Lote E0607067
Cantidad Muestra mg 27,7 940,2 940,1 DATOS
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 7,0
M2 MUESTRA 14,5
M3 PLACEBO ----
58
1.2.4 SELECTIVIDAD CONDICIN TRMICA
1.6 UI /
2 50 BPH8 2 100
4 50 BPH8 1 25
BPH8
Muestras
Promedio
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio correlacin
S3 16,85 16,60 16,93 15,85 17,12 16,65 17,53 16,83 17,53 16,69
ESTANDAR 14,44 12,66 14,99 14,12 13,85 14,31 13,95 14,17 14,40 14,28 12,75

S3 15,86 16,93 16,91 17,02 17,10 17,97 16,15 15,86 16,29 16,91
MUESTRA 12,38 12,27 11,86 13,82 13,74 14,59 13,41 12,79 --- 13,11 11,36

S3 16,88 16,91 15,14 16,65 15,91 14,59 14,98 13,96 14,52 15,50
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- ---

Fecha de
Concentracin (UI/ml) recuperada 0,9769 0,7226 vencimiento Jun-08
Log (Concentracin) -0,010 -0,141 Lote E0607067
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 38,9
M2 MUESTRA 52,0
M3 PLACEBO ----
59
1.3 LINEALIDAD DEL SISTEMA
TIFOMIX
LINEALIDAD SISTEMA TILOSINA
10 g /
Concentracin 100g Lote TF0H0072P N Anlisis P012 Fecha 07 11 07
Curva Estndar
Promedio
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Total Promedio corr.
S3- C 15,37 16,55 14,59 14,99 14,14 14,30 15,75 16,30 14,44 136,43 15,16
S1 - A 10,39 11,51 10,97 10,19 10,60 10,44 10,05 10,16 10,00 94,31 10,48 10,48
S3- C 14,20 16,10 14,44 14,53 14,42 15,21 15,73 15,32 14,43 134,38 14,93
S2 - B 12,55 12,50 11,61 12,28 12,09 12,98 13,66 12,77 13,40 113,84 12,65 12,88
S3- C 15,09 15,57 14,65 15,32 13,84 15,88 13,99 15,86 14,45 134,65 14,96
S4 - D 14,99 13,88 13,10 13,07 12,27 14,78 13,67 14,54 12,09 122,39 13,60 13,80
S3- C 13,71 13,88 15,29 14,48 13,92 15,31 16,42 15,02 16,42 134,45 14,94
S4 - E 12,67 14,50 13,92 13,15 13,49 13,69 14,64 14,92 15,66 126,64 14,07 14,29
S3- C 15,30 15,40 15,66 16,47 17,66 15,11 14,58 15,99 16,20 142,37 15,82
S5- F 16,73 16,84 15,86 17,85 16,15 14,82 16,68 16,77 15,96 147,66 16,41 15,75
S3- C 14,21 16,25 16,11 17,49 15,11 15,73 14,90 15,63 14.97 140,40 15,60
S6 - G 19,69 19,18 16,57 17,11 16,46 18,00 16,06 16,97 17,03 157,07 17,45 17,01
S3- C 16,39 16,41 13,99 14,11 14,77 14,55 14,36 14,51 13,16 132,25 14,69
S7 - H 18,02 18,50 16,51 17,36 16,66 17,62 16,60 17,61 15,36 154,24 17,14 17,60
XS 15,16
CURVA ESTANDAR DATOS ESTANDAR

Log
Puntos Dimetro Concentracin (Conc.) Peso (mg) 27,7
(mg/ml) Potencia (P) UI/mg 901,8
Fecha de
S1 10,48 0,60 -0,2222 vencimiento Jun-08
S2 12,88 1,00 -0,0004 Lote E0607067
S3 13,80 1,20 0,0788
S4 14,29 1,40 0,1458
S5 15,16 1,60 0,2038
S6 15,75 2,00 0,3007
S7 17,01 2,40 0,3799
S8 17,60 2,80 0,4468
60
CURVA CALIBRACION TILOSINA
LINEALIDAD SISTEMA
0,5000
0,4000 y = 0,0941x - 1,2096

R2 = 0,996
0,3000
Log. Concentracin
0,2000
0,1000
0,0000
8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00 16,00 17,00 18,00 19,00
-0,1000
-0,2000
-0,3000
Halo (m m )
61
1.4 LINEALIDAD DEL MTODO
TIFOMIX
LINEALIDAD METODO TILOSINA
10 g / N
Concentracin 100g Lote TF0H0072P Anlisis P012 Fecha 07 09 11
Curva Estndar
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Total Promedio Promedio corr.
S3- C 14,59 14,23 13,93 14,03 13,03 14,31 13,27 13,75 14,09 125,23 13,91
S1 - A 12,91 12,85 12,68 11,25 12,29 13,04 12,25 12,91 11,94 112,12 12,46 12,77
S3- C 12,29 14,14 15,91 13,21 14,03 15,34 15,91 13,89 13,75 128,47 14,27
S2 - B 12,80 14,91 14,63 12,82 14,69 14,65 14,91 13,61 14,53 127,55 14,17 14,12
S3- C 14,43 12,89 14,40 15,08 13,60 15,05 15,45 14,18 16,14 131,22 14,58
S4 - D 13,11 13,18 14,35 14,40 13,42 15,12 14,28 13,92 15,00 126,78 14,09 13,73
S3- C 14,17 14,03 15,61 12,49 14,72 14,70 14,78 15,35 15,26 131,11 14,57
S4 - E 15,31 15,70 16,10 14,70 16,20 14,94 14,23 15,05 16,01 138,24 15,36 15,01
S3- C 13,40 13,88 14,56 13,11 13,91 14,55 15,18 13,52 13,31 125,42 13,94
S5- F 14,82 16,82 15,59 15,00 16,40 14,92 16,11 14,06 16,70 140,42 15,60 15,89
S3- C 14,66 13,12 14,68 15,07 13,00 15,35 13,70 13,26 13,72 126,56 14,06
S6 - G 15,44 16,34 16,98 16,90 15,49 17,01 17,38 16,92 16,74 149,20 16,58 16,74
XS 14,22
CURVA ESTANDAR DATOS ESTANDAR
Puntos Dimetro Concentracin Log (Conc.) Peso (mg) 27,7
(mg/ml) Potencia (P) UI/mg 901,8
S1 12,77 1,0 -0,0004 Fecha de vencimiento Jun-08
S2 14,12 1,2 0,0788 Lote E0607067
S3 13,73 1,4
S4 15,01 1,6 0,2038
S5 14,22 2,0
S6 15,89 2,4 0,3799
S7 16,74 2,8 0,4468
62
CURVA CALIBRACION TILOSINA
LINEALIDAD DEL METODO
0,5
0,4
Log. Concentracin
0,3
0,2 y = 0,121x - 1,5818

R2 = 0,9577
0,1
0
11 12 13 14 15 16 17 18
-0,1
Halo (m m )
63
1.5 PRECISION DEL METODO
1.5.1 PRECISION DIA 1 ANALISTA 1

TIFOMIX
Concentracin 10 g / 100g Lote TF0H0072P N Anlisis P012 Fecha
1.6 UI /
2 50 BPH8 2 100
4 50 BPH8 1 25
BPH8
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 16,74 15,53 15,72 15,34 16,11 16,06 15,35 16,02 15,03 15,77
M1 15,59 16,14 15,61 14,90 16,45 14,95 15,19 16,10 15,59 15,61 15,00

S3 14,57 15,48 16,14 15,96 16,05 15,55 15,89 16,08 16,17 15,77
M2 14,98 16,33 15,66 16,11 15,56 15,16 15,73 16,16 16,10 15,75 15,15

S3 15,87 16,24 15,05 15,89 15,90 15,58 15,69 15,19 16,03 15,72
M3 15,59 15,65 14,84 15,33 15,22 15,13 15,27 15,55 15,50 15,34 14,78

M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7
Dimetro 15,00 15,15 14,78 Potencia (P) UI/mg 901,8
Fecha de
Concentracin (UI/ml) 1,5933 1,6432 1,5192 vencimiento Jun-08
Log (Concentracin) 0,202 0,216 0,182 Lote E0607067
Cantidad Muestra (mg) 940,8 940,7 941,4 DATOS
g tilosina /100 g 10,6 10,9 10,1 Pendiente 0,0941
Potencia Promedio 10,53 Intercepto -1,2096
% 105,3 Factor de Dilucin (D) 6250
64

2 50 BPH8 2 100
4 50 BPH8 1 25
BPH8
Muestras
S3 16,04 16,40 15,23 15,44 16,11 15,98 16,32 15,88 15,23 15,85
M1 16,38 15,41 15,21 15,33 15,48 15,17 15,89 14,59 15,83 15,48 14,79

S3 15,84 15,12 15,56 15,72 15,17 15,62 16,08 15,04 15,37 15,50
M2 15,12 15,38 15,22 14,77 15,01 15,91 14,38 14,68 14,83 15,03 14,69

S3 15,75 15,56 15,15 15,66 16,32 15,56 15,21 15,86 16,12 15,69
M3 15,07 14,74 15,48 16,30 15,74 14,69 15,02 15,83 14,72 15,29 14,76

M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7
Concentracin (UI/ml) 1,5199 1,4880 1,5104 Fecha de vencimiento Jun-08
65

2 50 BPH8 2 100
4 50 BPH8 1 25
BPH8
Muestras
Promedio
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio corr
S3 13,94 14,84 16,42 14,16 15,29 15,42 14,61 16,74 15,12 15,17
M1 13,46 15,57 14,15 13,85 16,57 13,51 14,94 15,44 13,86 14,59 14,58

S3 14,16 14,50 14,12 15,21 15,22 13,13 15,65 15,06 13,67 14,52
M2 14,28 14,29 15,25 13,99 12,69 14,30 14,55 12,12 13,32 13,87 14,50

S3 15,44 14,09 13,88 15,82 16,08 15,37 14,64 13,88 15,96 15,02
M3 14,94 12,08 14,05 15,65 16,19 14,87 13,53 15,63 13,72 14,52 14,66

M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7
Concentracin
(UI/ml) 1,4537 1,4280 1,4780 Fecha de vencimiento Jun-08
66

2 50 BPH8 2 100
4 50 BPH8 1 25
BPH8
Muestras
S3 14,36 14,73 15,24 15,86 14,36 15,58 14,17 15,16 14,46 14,88
M1 13,94 14,26 14,79 14,53 15,27 15,36 15,62 14,99 14,45 14,80 15,08

S3 15,52 13,49 15,92 14,27 13,23 15,76 15,40 14,36 14,19 14,68
M2 14,44 13,56 14,14 13,81 13,78 14,35 14,76 13,22 14,66 14,08 14,56

S3 14,51 14,58 15,61 15,35 13,91 13,76 14,07 14,92 14,71 14,60
M3 13,13 14,22 15,44 14,43 12,96 14,08 14,37 14,74 13,24 14,07 14,62

M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7
Concentracin (UI/ml) 1,6192 1,4456 1,4670 Fecha de vencimiento Jun-08
67
1.6 EXACTITUD
1.6.1 EXACTITUD AL 80%
1.6 UI /
ESTANDAR 25 50 MeOH mL MUESTRA 20 50 MeOH 1.3 UI / mL
2 50 BPH8 2 50 BPH8
4 50 BPH8 4 50 BPH8
Muestras
S3 12,18 12,49 10,70 11,52 11,74 9,98 12,66 11,83 12,05 11,68
M1 11,39 11,11 9,96 10,96 10,32 10,77 11,90 10,21 10,81 10,83 14,30

S3 10,93 11,26 10,91 12,33 11,39 11,87 12,63 11,28 12,22 11,65
M2 9,10 9,32 9,75 11,03 10,00 11,14 9,38 10,25 11,13 10,12 13,63

S3 12,45 10,84 11,67 13,98 10,79 11,04 11,56 13,06 12,00 11,93
M3 9,81 10,40 10,42 11,90 9,79 11,20 10,55 11,60 10,92 10,73 13,96

M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7
Concentracin (UI/ml) recup 1,3678 1,1838 1,2700 Fecha de vencimiento Jun-08
UI reales / mg 1,3 1,2 1,3 Pendiente 0,0941
Porcentaje Recuperado% 104 101 101 Intercepto -1,2096
Porcentaje % 102,1 Factor de Dilucin (D) ---
68

1.6 UI / 1.6 UI /
ESTANDAR 25 50 MeOH mL MUESTRA 25 50 MeOH mL
2 50 BPH8 2 50 BPH8
4 50 BPH8 4 50 BPH8
Muestras
S3 12,01 12,00 11,55 11,03 13,38 12,28 11,15 11,65 10,38 11,71
M1 11,04 11,58 12,60 10,89 12,45 10,03 10,38 11,09 10,57 11,18 14,62

S3 10,85 12,54 11,90 12,05 12,12 13,43 11,21 12,33 12,58 12,11
M2 12,56 12,52 9,19 11,20 11,20 13,09 10,04 12,32 11,18 11,48 14,52

S3 11,99 13,15 13,55 9,84 12,28 12,31 10,74 13,11 10,74 11,97
M3 11,96 12,52 11,66 9,64 12,57 10,85 11,53 11,41 10,17 11,37 14,56

M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7
recuperada 1,4674 1,4356 1,4463 Fecha de vencimiento Jun-08
69
1.6 UI / 1.9 UI /
2 50 BPH8 2 50 BPH8
4 50 BPH8 4 50 BPH8
Muestras
S3 12,17 11,71 11,38 10,00 12,43 12,25 12,43 11,20 11,22 11,64
M1 12,35 11,22 11,47 10,66 13,13 10,86 12,60 11,37 12,24 11,77 15,28

S3 11,11 12,25 11,97 11,12 12,11 10,75 11,38 12,02 12,53 11,69
M2 13,09 12,81 13,27 12,53 11,83 12,71 11,64 12,83 11,74 12,49 15,96

S3 10,18 12,42 11,35 10,90 12,06 9,91 11,46 13,55 12,85 11,63
M3 12,10 13,24 10,73 12,94 10,03 11,12 10,43 12,86 12,32 11,75 15,28

M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7
Concentracin (UI/ml) recuperada 1,6918 1,9594 1,6909 Fecha de vencimiento Jun-08
70
1.7 LIMITE DE DETECCIN
1.6 UI / 0.6 UI /
2 50 BPH8 3 50 BPH8
4 50 BPH8 1 50 BPH8
Muestras
S3 13,35 13,99 13,65 16,02 15,86 14,34 14,37 13,96 14,68 14,28
0,2 UI / mL --- --- --- --- --- --- --- --- ---

S3 13,07 14,48 13,60 14,11 14,24 14,37 13,79 13,44 14,18 13,92
0,4 UI / mL --- --- --- --- --- --- --- --- ---

S3 13,98 13,93 13,51 13,55 13,85 13,24 13,09 13,78 13,44 13,60
0,6 UI / mL 8,88 8,81 8,96 8,86 9,01 9,13 8,94 8,87 8,98 8,94 10,50

0,2 0,4 0,6 Peso (mg) 27,7
Dimetro 10,50 Potencia (P) UI/mg 901,8
Concentracin (UI/ml) recup 0,6002 Fecha de vencimiento Jun-08
Log (Concentracin) -0,222 Lote E0607067
Cantidad Muestra mg 27,7 DATOS
UI reales / mg 0,6 Pendiente 0,0941
Intercepto -1,2096
Factor de Dilucin (D) ---
71
1.8 LIMITE DE CUANTIFICACION
1.6 UI / 0,8 UI /
2 50 BPH8 4 50 BPH8
4 50 BPH8 1 50 BPH8
Muestras
S3 15,50 15,23 16,08 16,24 14,84 15,60 16,13 15,53 15,90 15,67
M1 11,89 12,47 12,58 13,08 11,30 13,15 12,60 12,71 11,99 12,42 11,90

S3 15,23 15,82 15,32 14,86 14,97 14,65 15,02 14,85 14,62 15,04
M2 12,01 11,72 12,00 12,00 12,12 11,74 11,55 12,41 12,14 11,97 12,09

S3 15,89 15,63 16,41 15,67 15,50 15,79 14,38 15,94 14,47 15,52
M3 13,02 12,73 12,50 11,67 12,95 12,48 11,99 12,92 11,73 12,44 12,08

M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7
Concentracin (UI/ml) recup 0,8139 0,8465 0,8457 Fecha de vencimiento Jun-08
Log (Concentracin) -0,089 -0,072 -0,073 Lote E0607067
72
LIMITE DE CUANTIFICACION
0,8 UI /
ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 25 50 MeOH mL
2 50 BPH8 4 50 BPH8
4 50 BPH8 1 50 BPH8
Muestras
S3 15,02 15,26 12,77 15,08 15,33 16,87 15,68 14,77 16,30 15,23
M1 12,63 12,16 12,19 11,33 12,80 12,31 10,52 11,98 12,98 12,10 12,03

S3 15,60 15,26 15,68 15,52 15,80 14,60 15,32 14,70 15,64 15,35
M2 12,57 11,02 12,28 12,21 12,73 11,15 12,72 12,18 12,53 12,15 11,97

S3 15,39 16,63 15,35 15,16 16,28 15,22 16,04 15,20 15,69 15,66
M3 13,78 12,15 12,29 12,06 12,76 10,90 12,76 12,11 12,03 12,32 11,81

M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7
Fecha de
Concentracin (UI/ml) recup 0,8358 0,8248 0,7976 vencimiento Jun-08
Log (Concentracin) -0,078 -0,084 -0,098 Lote E0607067
73
2 RESULTADOS CON EL PROGRAMA DE VALIDACIN
2.1 LINEALIDAD SISTEMA

Data.
The model used is : Log(Y ) = a + bX

The linearity of the method is tested with the following data :
Variables transformation
Number of repetitions 3
Unit
Linearity
# HALO CONCEN
1 10.96 0.60
2 10.41 0.60
3 10.07 0.60
4 12.22 1.00
5 12.45 1.00
6 13.28 1.00
7 13.99 1.20
8 13.37 1.20
9 13.43 1.20
10 15.50 1.60
11 14.48 1.60
12 15.50 1.60
13 16.48 2.00
14 16.27 2.00
15 16.47 2.00
16 17.19 2.40
17 16.69 2.40
18 17.21 2.80
19 17.68 2.80
74
Results

The test of linearity of the method gives the following results :
Number of values 19
Unit
Linearity
# HALO Log CONCEN Residuals
1 10.96 -0.22 -0.06
2 10.41 -0.22 -0.01
3 10.07 -0.22 0.02
4 12.22 0.00 0.05
5 12.45 0.00 0.03
6 13.28 0.00 -0.04
7 13.99 0.08 -0.03
8 13.37 0.08 0.03
9 13.43 0.08 0.02
10 15.50 0.20 -0.04
11 14.48 0.20 0.05
12 15.50 0.20 -0.04
13 16.48 0.30 -0.03
14 16.27 0.30 -0.01
15 16.47 0.30 -0.03
16 17.19 0.38 -0.01
17 16.69 0.38 0.03
18 17.21 0.45 0.05
19 17.68 0.45 0.01
75
Calibration curve
Confidence level for calibration curve : 95.00
Plot of the residuals
76
Confidence level for the residuals : 95.00
Analysis of the variance of linearity
Confidence level 95
Student t 1.74
Y intercept -1.14094e+000
- Variance 2.72761e-003
- Confidence interval 9.08742e-002
Slope 8.92383e-002
- Variance 1.28089e-005
Correlation coefficient r 0.986602
Determination coefficient r 0.973384
Variance due to the regression SI 8.33768e-001
Residual variance SR 1.34108e-003
Residual sum of squares 2.27984e-002
77
Test for the existence of a significant slope (F1)
Confidence level 95.00

Degrees of freedom (1,2) 1 , 17
F table 4.450
F calculated 621.713
The Fisher F test is satisfactory.
Conclusion
The characteristic " Linearity " of the analytical method is validated.
Conclusions
Linearity
SUMMARY

Y intercept : -1.14094e+000
Slope : 8.92383e-002
Determination coefficient r : 0.973384
Not
Satisfactory Satisfactory
Test for the existence of a significant slope
(F1)
The analytical method is for this characteristic
Not Validated Validated

78
2.2LINEALIDAD DEL MTODO
Data.
The linearity of the method is tested with the following data :
Unit
Linearity
# HALO CONCEN
1 12.81 1.00
2 12.19 1.00
3 12.37 1.00
4 13.55 1.40
5 14.31 1.40
6 14.40 1.40
7 15.70 2.00
8 15.28 2.00
9 15.10 2.00
10 15.74 2.40
11 15.44 2.40
12 15.62 2.40
13 16.25 2.80
14 16.47 2.80
15 17.01 2.80
Results

The test of linearity of the method gives the following results :
Number of values 15
Unit
Linearity
79
# HALO Log CONCEN Residuals
1 12.81 0.00 -0.04
2 12.19 0.00 0.03
3 12.37 0.00 0.01
4 13.55 0.15 0.03
5 14.31 0.15 -0.05
6 14.40 0.15 -0.06
7 15.70 0.30 -0.05
8 15.28 0.30 -0.00
9 15.10 0.30 0.02
10 15.74 0.38 0.02
11 15.44 0.38 0.06
12 15.62 0.38 0.04
13 16.25 0.45 0.04
14 16.47 0.45 0.01
15 17.01 0.45 -0.05
Calibration curve
Confidence level for calibration curve : 95.00
80
Plot of the residuals
Confidence level for the residuals : 95.00
Confidence level 95
Student t 1.771
Y intercept -1.35693e+000
- Variance 1.18478e-002
Slope 1.08790e-001
81
- Variance 5.34612e-005
Correlation coefficient r 0.971872
Determination coefficient r 0.944535
Variance due to the regression SI 3.72901e-001
Residual variance SR 1.68442e-003
Residual sum of squares 2.18975e-002
Test for the existence of a significant slope (F1)
Confidence level 95.00

Degrees of freedom (1,2) 1 , 13
F table 4.670
F calculated 221.382
The Fisher F test is satisfactory.
Conclusion
The characteristic " Linearity " of the analytical method is validated.

Conclusions
Linearity
SUMMARY

Y intercept : -1.35693e+000
Slope : 1.08790e-001
Determination coefficient r : 0.944535
Not
Satisfactory Satisfactory
Test for the existence of a significant slope
(F1)
82

2. 3 PRECISIN DEL MTODO
Data
The study of the characteristic "Intermediate Precision" is done on the following

data:
Data from group: Group 1
Author : VM administrator
Unit
Intermediate precision
# Concentration Area
1 10.0 10.6
2 10.0 10.9
3 10.0 10.1
Unit
1 10.0 9.7
2 10.0 9.5
3 10.0 9.8
83
Unit
1 10.0 10.1
2 10.0 9.9
3 10.0 10.0
Unit
1 10.0 10.8
2 10.0 9.6
3 10.0 9.7
Results
The study of the characteristic " Intermediate Precision" gives the following
results:
Results for the group: Group 1
84
# Area STAT Test # Q calc. Q (99%) Q (95%)
Concentratio
n
1 10.0 10.6
2 10.0 10.9
3 10.0 10.1 1 0.625 0.988 0.941
(*) suspicious value, (**) aberrant value
Number of values 3
Number of values used for calculation 3 Variance test
Confidence level 95.00 Test #
Mean of values 10.5 C calc.
Confidence interval 0.7 C (99%)
Variance for this group 1.63333e-001 C (95%)
Coefficient of variation 3.84 % STAT
For the calculation of the variances, this group will be:
Accepted
Concentratio
n
1 10.0 9.7
2 10.0 9.5 1 0.667 0.988 0.941
3 10.0 9.8
Number of values 3
85
Accepted
Concentratio
n
1 10.0 10.1
2 10.0 9.9 1 0.500 0.988 0.941
3 10.0 10.0
Number of values 3
Accepted
Concentratio
n
86
1 10.0 10.8 1 0.917 0.988 0.941
2 10.0 9.6
3 10.0 9.7
Number of values 3
Confidence level 95.00 Test # 1
Mean of values 10.0 C calc. 0.693
Confidence interval 1.1 C (99%) 0.864
Variance for this group 4.43333e-001 C (95%) 0.768
Accepted
Calculation of the variance of repeatability and of intermediate precision
Total number of values used for calculation 12

Confidence level (1-/2) 95.00
Degrees of freedom 11
t (table) 1.796
Mean value 10.1
Variation interval 0.3
Variation interval (%) 2.50
Number of groups 4
Variance of repeatability Sr 1.60000e-001

Inter-group variance Sg 7.43519e-002
Variance de intermediate precision SR 2.34352e-001
Coefficient of variation of repeatability 3.98

Specification max.: 5.00
Coefficient of variation of intermediate precision 4.81
Results are within assay specifications.
87
Conclusion
The characteristic "Intermediate Precision " of the analytical method is

validated.
Conclusions
Intermediate Precision
SUMMARY
Analysis of variance
Inter-group variance Sg 7.43519e-002
Variance of intermediate 2.34352e-001
precision SR
Coefficients of variation of:

- repeatability 3.98
- intermediate precision 4.81
The analytical method is for this

characteristic

88
2.4 PRECISIN DEL SISTEMA
Data
The study of the characteristic "Intermediate Precision" is done on the following

data:
Author : VM administrator
Unit
1 1.6 14.20
2 1.6 14.44
3 1.6 14.53
4 1.6 14.42
5 1.6 14.43
6 1.6 14.78
7 1.6 14.54
8 1.6 14.58
9 1.6 14.97
10 1.6 14.21
Results
The study of the characteristic " Intermediate Precision" gives the following
results:
89
Concentratio
n
1 1.6 14.20
2 1.6 14.44
3 1.6 14.53
4 1.6 14.42
5 1.6 14.43
6 1.6 14.78
7 1.6 14.54
8 1.6 14.58
9 1.6 14.97 1 0.247 0.527 0.412
10 1.6 14.21
Number of values 10
Accepted
Calculation of the variance of repeatability
Total number of values used for calculation 10

Mean value 14.51
Variation interval 0.14
Variation interval (%) 0.94
90
Conclusion
The characteristic "Intermediate Precision " of the analytical method is

validated.
Conclusions
Intermediate Precision
SUMMARY
Analysis of variance
Coefficient of variation of 1.62

repeatability

91
2.5 EXACTITUD
Data
The accuracy of the method is tested with the following data:
Number of values 9
Unit
At the target level

1 100.0 104.0
2 100.0 101.0
3 100.0 101.0
4 100.0 101.0
5 100.0 97.0
6 100.0 98.0
7 100.0 98.0
8 100.0 103.0
9 100.0 97.0
Results
Study of accuracy gives the following results:
Number of values 9
Number of values used for calculation 9
Mean of concentrations 100.0
Concentration unit
92
At the target level
# Concentration Area STAT Recovery
1 100.0 104.0 104.00
2 100.0 101.0 101.00
3 100.0 101.0 101.00
4 100.0 101.0 101.00
5 100.0 97.0 97.00
6 100.0 98.0 98.00
7 100.0 98.0 98.00
8 100.0 103.0 103.00
9 100.0 97.0 97.00
Area
Confidence level (1- /2) 95.00
Variance 6.75000e+000
Mean 100.0
Confidence interval 1.6
Coefficient of variation of repeatability 2.60 %
Recovery
t table 1.860
Mean recovery 100.00
Interval (+-) 1.61
Specification min.: 95.00
Mean recovery is centered on 100%.
Conclusion
93
The characteristic "Accuracy - At the target level " of the analytical method is
validated.
Conclusions
Accuracy
At the target level
SUMMARY
Mean recovery
Mean recovery(%) 100.00
Interval (+-) 1.61

94
2.6 LIMITE DE CUANTIFICACIN
Accuracy
Accuracy - At the target level . Calculations
Data
The accuracy of the method is tested with the following data:
Number of values 6
Unit
At the target level

1 100.0 99.0
2 100.0 103.0
3 100.0 105.0
4 100.0 102.0
5 100.0 101.0
6 100.0 99.0
Results
Study of accuracy gives the following results:
Number of values 6
Number of values used for calculation 6
Mean of concentrations 100.0
Concentration unit
At the target level

# Area STA Recover Test Q calc. Q Q
Concentratio T y # (99%) (95%)
n
1 100.0 99.0 99.00
2 100.0 103.0 103.00
3 100.0 105.0 105.00 1 0.333 0.698 0.560
4 100.0 102.0 102.00
5 100.0 101.0 101.00
6 100.0 99.0 99.00
95
Area
Mean 101.5
Confidence interval 1.9
Coefficient of variation of repeatability 2.31 %
Recovery
t table 2.015
Mean recovery 101.50
Interval (+-) 1.93
Mean recovery is centered on 100%.
Conclusion
The characteristic "Accuracy - At the target level " of the analytical method is
validated.
96
Conclusions
Accuracy
At the target level
SUMMARY
Mean recovery
Mean recovery(%) 101.50
Interval (+-) 1.93

Tesis Microbiologica Potenci Tilosina

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VALIDACIN DE LA TCNICA PARA LA CUANTIFICACIN DE

TILOSINA EN UN PRODUCTO SLIDO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

TILOSINA EN UN PRODUCTO SLIDO

TILOSINA EN UN PRODUCTO SLIDO

A mi familia por estar conmigo, darme nimos y darme todo lo necesario

La empresa Vicar Farmaceutica S.A. por permitirme realizar mi tesis en

Janeth Arias Docente y Directora de la Carrera de Microbiologa por su

A todo el personal de Control de Calidad por su calor humano.

Reinaldo Orejarena por darme nimos constantemente

Tabla 1: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la

El presente trabajo se llev a cabo para validar la tcnica de

El microorganismo sometido a prueba fue Micrococcus luteus ATCC 9341

El mtodo en difusin en agar dio valores acuerdo a lo esperado,

The following work was performed to validate a tylosin (in powder

Agar diffusion was used to test the micro-organism Micrococcus luteus

Expected results were obtained using agar diffusion, therefore validating

El control de calidad es la parte de las prcticas adecuadas de

Los conceptos de garanta de la calidad, prcticas adecuadas de

Dentro del concepto de garanta de la calidad, las prcticas adecuadas de

Se debe contar con instalaciones adecuadas, personal capacitado y

Los estudios de validacin constituyen una parte esencial de las prcticas

Un antibitico es una sustancia qumica derivada o producida por

2.1.1 MODO Y MECANISMO DE ACCIN DE LOS ANTIBIOTICOS

Al referirse al mecanismo general de los antibiticos se ha hecho constar

- Inhibicin de la sntesis de la pared celular, el componente esencial de

- Lesin de la membrana celular, en esta forma se afectan importantes

- Inhibicin de la sntesis proteica, existen antibiticos que bloquean los

- Inhibicin de la sntesis de los cidos nucleicos, el cido

2.1.2.1 ORIGEN Y COMPOSICIN QUMICA

Los antibiticos macrlidos son un grupo de compuestos similares

2.1.2.2 FORMULACIONES DEL FARMACO

2.1.2.3 MECANISMO DE ACCIN

Los macrlidos inhiben la traslocacin del RNA de trasferencia desde el

Aunque la mayora de los autores han clasificado los macrlidos como

2.2.1.1 ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA TILOSINA

Figura 1. Estructura de la tilosina, tomada del artculo Angela C. Kolz

Figura 2: Estructura de la Tilosina A, tomada del articulo de E. Cundliffe,

La Tilosina fue obtenida primeramente en 1959 por McGuire y

2.2.1.3 FORMULA EMPIRICA

Tilosina base : C45H77NO17

2.2.1.4 CARACTERISTICAS FISICO QUIMICAS

La tilosina es de base dbil; en estado seco se cristaliza en pequeas

Como antibitico se ha utilizado en el control de la neumona zotica e

Este frmaco es sumamente eficaz en el control de la micoplasmosis

Se ha utilizado teraputicamente la tilosina para tratar el ojo rosa

La tilosina se ha utilizado como aditivo de piensos para promover el

Despus de administrar tilosina al ganado vacuno existe un periodo de

Las bacterias sensibles a la tilosina en los cerdos principalmente:

En el perro: Pasteurella, Staphylococcus, Leptospira, Mycoplasma. En

2.2.3.1 MECANISMO DE ACCIN

La tilosina llega por difusin pasiva al interior de las bacterias y bloquea la

2.2.3.2 ABSORCIN, METABOLISMO Y EXCRECIN

El tartrato se absorbe con suma facilidad en el aparato digestivo de

La tilosina, se une a las protenas plasmticas del bovino en 40% y tiene

La dosis letal media (DL50) en el cerdo es de 5g/kg por va oral y de 1 g

2.2.3.3 CONTRAINDICACIONES DE LA TILOSINA

La tilosina no se debe administrar en gallinas de postura, porque el huevo

Los cerdos no se deben sacrificar en un lapso de 21 das tras la

Bajo las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibiticos

La cantidad mnima de tilosina que se puede cuantificar o la potencia de

2.2.4.1 METODOS DE EVALUACIN DE POTENCIA

Se emplean dos mtodos generales: la valoracin en cilindro en placa y