Anda di halaman 1dari 5

STUDI PREFORMULASI: VALIDASI METODE SPEKTROFOTOMETRI OFLOKSASIN DALAM LARUTAN DAPAR

FOSFAT

(Ofloxacin Spectrophotometric Method Validation in Phosphat Buffer Solution: a Preformulation Study)

Budipratiwi Wisudyaningsih
Bagian Farmasetika Fakultas Farmasi Universitas Jember

ABSTRACT

A simple, accurate, precise, and economic UV-spectrophotometric method was developed for the
estimation of ofloxacin in phosphate buffer at pH 3,0; 7,4; and 12,0. Ofloxacin solubility is dependent on pH of the
solvent due to its amphoteric properties. Ofloxacin has absorbance maxima at 295 nm in pH 3,0; 288 nm in pH 7,4;
and 290 nm in pH 12,0. Linearity was obtained in the concentration range of 4-10 g/mL for each pH. Ofloxacin
detection limit at pH 3,0 was 150 g/L, at pH 7,4 and pH 12,0 were 10 g/L, respectively. Recovery values at three pH
conditions were in the range 89,93-104,25%. The results of analysis have been validated statistically and by recovery
studies.

Keywords : ofloxacin, validation, spectrophotometry

Korespondensi (Correspondence): Budipratiwi Wisudyaningsih. Bagian Farmasetika Fakultas Farmasi Universitas


Jember. Jl Kalimantan 37 Jember.

Analisis kadar senyawa aktif adalah penetapan kadar ofloksasin dalam


merupakan salah satu jenis pengawasan sediaan obat secara spektrofotometri
mutu yang dilakukan untuk menjamin kualitas berdasarkan reaksi redoks dengan
dan keamanan suatu bahan obat. Dalam penambahan cerium (IV) sulfat dalam
proses preformulasi, seorang peneliti harus suasana asam5. Penelitian lain juga telah
menentukan metode analisis yang paling mendapatkan metode analisis ofloksasin
sesuai dengan karakeristik bahan aktif, dalam sediaan obat dan dalam sampel urin
sehingga dapat ditentukan kadar senyawa secara spektrofotometri, yaitu dengan tiga
aktif dengan ketelitian dan ketepatan yang metode antara lain dengan penambahan
baik, serta memenuhi kriteria lain seperti batas HCl, NaOH, dan dengan membentuk
deteksi, batas kuantitasi, linearitas, spesifisitas, kompleks dengan Fe(III) dalam suasana
dan ketangguhan. Validasi metode analisis asam6. Selain kedua penelitian tersebut,
merupakan suatu tindakan penilaian penetapan kadar ofloksasin dalam campuran
terhadap parameter tertentu, berdasarkan dengan bahan aktif lain dengan beberapa
percobaan laboratorium, untuk membuktikan metode juga telah dilakukan, dan berhasil
bahwa parameter tersebut memenuhi mendapatkan kriteria yang diharapkan7,8,9.
persyaratan untuk penggunaannya. Tujuan Studi pustaka yang telah dilakukan
validasi metode analisis adalah untuk menunjukkan bahwa belum pernah dilakukan
membuktikan bahwa semua cara atau penelitian untuk mendapatkan metode
prosedur pengujian yang digunakan analisis spektrofotometri ofloksasin yang valid
senantiasa mencapai hasil yang diinginkan dalam larutan dapar fosfat pada berbagai
secara konsisten atau terus menerus1. variasi pH.
Ofloksasin merupakan antibiotik Dalam validasi metode analisis,
golongan fluoroquinolon generasi kedua terdapat beberapa parameter analisis yang
yang termasuk dalam kelas 2 pada harus dipertimbangkan antara lain meliputi
penggolongan Biopharmaceutics ketepatan (akurasi), ketelitian (presisi),
Classification System (BCS)2. Kelarutan spesifitas, linearitas, batas deteksi, batas
ofloksasin bergantung pada kondisi pH kuantisasi, ketangguhan dan rentang10. Proses
pelarut atau lingkungannya. Hal ini ini bukan suatu proses tunggal, namun
disebabkan karena ofloksasin akan bersifat merupakan salah satu bagian dari prosedur
kationik pada kondisi pH di bawah pKa1, analisis yang tidak dapat dipisahkan11.
anionik di atas pKa2, dan zwitter ion pada Parameter yang akan ditentukan dalam
kondisi pH antara pKa1 dan pKa23,4. Dengan penelitian ini hanya meliputi linearitas, limit
karakteristik yang demikian, maka perlu deteksi (LOD), limit kuantitasi (LOQ), ketelitian,
dilakukan validasi untuk mendapatkan suatu dan ketepatan. Penelitian ini bertujuan untuk
metode analisis ofloksasin dalam larutan memperoleh metode analisis ofloksasin
dapar fosfat pada berbagai pH. secara spektrofotometri yang memenuhi
Saat ini telah banyak dilakukan kriteria proses validasi dengan menggunakan
penelitian untuk mendapatkan metode larutan dapar fosfat pada berbagai pH.
analisis ofloksasin secara spektrofotometri
yang valid. Penelitian yang telah dilakukan


Stomatognatic (J.K.G. Unej) Vol. 9 No. 2 2012: 77-81

BAHAN DAN METODE fosfat sehingga diperoleh konsentrasi 10x10-3,


6x10-3 dan 4x10-3 g/L. Masing-masing diukur
Bahan dan Alat Penelitian absorbansinya pada panjang gelombang
Bahan yang digunakan: Ofloksasin maksimum dengan spektrofotometer UV.
(Xinchang Guobang Chemicals Co. LTD Prosedur tersebut dilakukan pada ketiga
China) diperoleh dari PT. Dexa Medica variasi pH. Ketelitian ditentukan sebagai
Cikarang-Bekasi Indonesia. Bahan-bahan lain: simpangan baku (SD) atau koefisien variasi
H3PO4, NaH2PO4, Na2HPO4, Na3PO4, aquadest, (KV). Ketelitian untuk keperluan analisis
NaOH 1 M, dan NaCl. Alat yang digunakan: dikatakan cukup baik jika KV 2%11.
timbangan analitik (Sartorius) pH meter 3) Ketepatan (Accuracy)
(Hanna), membran filter 0,45 m, Uji ketepatan dilakukan dengan
spektrofotometer Ultraviolet-Visible (Genesys), menggunakan metode akurasi baku dan
kuvet kwarsa, micropipette, dan seperangkat diekspresikan dengan menghitung persentase
alat gelas laboratorium recovery. Pengujian dilakukan dengan
membuat suatu seri baku ofloksasin dalam
Prosedur Penelitian dapar fosfat dengan lima konsentrasi.
a. Pembuatanlarutan dapar fosfat Pengujian dilanjutkan dengan melakukan
Larutan dapar fosfat pH 3,0; 7,4 dan penimbangan ofloksasin sejumlah tertentu
pH 12,0 dibuat dengan konsentrasi 0,05 M. sehingga diperoleh konsentrasi 10x10-3; 6x10-3;
Larutan dapar fosfat pH 3,0 diperoleh dan 4x10-3 g/L. Ketiga sampel tersebut
mencampur asam fosfat dan natrium dianalisis dengan menggunakan
dihidrogen fosfat. Larutan dapar fosfat pH 7,4 spektrofotometer UV pada panjang
diperoleh dengan mencampur natrium gelombang maksimum.
dihidrogen fosfat dan dinatrium hidrogen Hasil pengukuran dibandingkan
fosfat, sedangkan larutan dapar fosfat pH dengan kurva baku yang telah dibuat dan
12,0 diperoleh dengan mencampur dinatrium digunakan untuk menghitung persentase
hidrogen fosfat dan trinatrium fosfat. Ketiga recovery. Pengujian akurasi dilakukan dengan
larutan dapar tersebut dibuat dengan 3 kali pengulangan pada masing-masing
konsentrasi 0,05 M. konsentrasi. Recovery dihitung dengan
b. Penentuan panjang gelombang menggunakan rumus:
maksimum ofloksasin !"#"$ !"#$%$#
= 100% (1)
Penentuan panjang gelombang !"#"$ !"#"$%&$'%
maksimum dilakukan dalam larutan dapar Hasil persentase recovery untuk
fosfat pada tiga variasi pH. Ofloksasin keperluan analisis dikatakan memenuhi syarat
ditimbang sebanyak 1,0 mg kemudian jika menunjukkan persentase antara 80-
dilarutkan dengan larutan dapar fosfat 110%11.
hingga diperoleh konsentrasi 10x10-3 g/L. 4) Batas deteksi dan batas kuantitasi (LOD
Larutan tersebut ditentukan panjang dan LOQ)
gelombang maksimumnya secara Batas deteksi dan batas kuantitasi
spektrofotometri UV dengan scanning antara penetapan kadar ofloksasin dengan
panjang gelombang 200 400 nm. menggunakan metode spektrofotometri UV
c. Validasi metode analisis dilakukan dengan membuat lima konsentrasi
Validasi metode analisis ofloksasin di bawah konsentrasi terkecil pada uji
dengan spektrofotometer UV dilakukan linearitas. Nilai pengukuran dapat juga
dengan parameter-parameter sebagai diperoleh dari nilai b (slope) pada persamaan
berikut: garis linear y = a + bx, sedangkan simpangan
1) Linearitas (Linearity) blanko sama dengan simpangan baku residu
Penentuan linearitas dilakukan (Sy/x). Batas deteksi dapat ditentukan
dengan mengukur absorbansi suatu seri dengan persamaan:
! !"/!
konsentrasi larutan baku ofloksasin dalam Q = (2)
!"
pelarut dapar fosfat yaitu: 10x10-3; 8x10-3; 6x10- Batas kuantitasi dapat ditentukan dengan
3; 5x10-3; 4x10-3 g/L pada panjang persamaan:
gelombang maksimum. Hasil absorbansi yang !" !"/!
Q = (3)
diperoleh kemudian dianalisis dengan !"

membuat suatu persamaan garis regresi linear Dengan Q = batas deteksi / kuantitasi suatu
dan ditentukan koefisien korelasinya. Dari hasil sampel; Sl = arah garis linear (kepekaan arah)
analisis tersebut dapat ditentukan dari kurva antara respon terhadap konsentrasi
linearitasnya, dengan membandingkan nilai r = slope (b pada persamaan garis y = a + bx);
hitung hasil regresi dengan r tabel pada taraf dan Sy/x = simpangan blanko / simpangan
kepercayaan 95%. Jika r hitung > r tabel, baku residual1.
maka linearitasnya baik dan dapat
digunakan untuk perhitungan akurasi dan HASIL DAN PEMBAHASAN
presisi12. Hasil scanning panjang gelombang
2) Ketelitian (Precision) maksimum yang diperoleh pada pH 3,0; 7,4;
Pengujian presisi yang dilakukan dan pH 12,0 disajikan pada tabel 1.
adalah kategori keterulangan (repeatability).
Pengujian dilakukan dengan menimbang
ofloksasin dan dilarutkan dalam larutan dapar


Studi Preformulasi: Validasi Metode Spektrofotometri (Buipratiwi W)

Tabel 1. Panjang gelombang maksimum mempengaruhi gugus kromofor pada posisi


ofloksasin pada pH 3,0; 7,4; dan 12,0 N1 menuju ke gugus karboksil dari ofloksasin.

Molar Validasi metode analisis


1%
pH maksimum A1cm Absorbtivity a. Hasil uji linearitas (Linearity)
(nm) (L.mol-1 cm-1) Hubungan linier antara konsentrasi
295 610,00 2,2045 x104 ofloksasin dengan absorbansi ditentukan
3,0 227 352,11 1,2725 x104 dengan membuat suatu seri pengenceran
327 229,47 8,2929 x103 ofloksasin dengan 5 konsentrasi, kemudian
288 677,14 2,4471 x 104 diukur absorbansinya dengan
227 403,57 1,4585 x 104 spektrofotometer UV pada panjang
7,4 204 392,14 1,4172 x 104 gelombang maksimum. Hasil yang diperoleh
257 382,14 1,3810 x 104 pada uji linearitas berupa hubungan antara
332 304,29 1,0997 x 103 konsentrasi dengan absorbansi dari larutan
290 674,45 2,4374 x104 ofloksasin dalam dapar fosfat pH 3,0; 7,4; dan
12,0 231 421,11 1,5218 x104 12,0. Hasilnya dapat dilihat pada tabel 2, 3
333 309,45 1,1183 x104 dan 4.
Hasil persamaan regresi kurva baku
Tabel 2. Hasil uji linearitas ofloksasin dalam ofloksasin yang diperoleh pada pH 3,0; 7,4
pelarut dapar fosfat pH 3,0 dan 12,0 dengan masing-masing 3 replikasi
menunjukkan korelasi yang baik dilihat dari
Replikasi Persamaan regresi kurva baku nilai r-nya. Nilai r pada semua persamaan
I y = 0,05965x + 0,00228; r = 0,9998 regresi memberikan nilai r hitung yang lebih
II y = 0,06287x + 0,00385; r = 0,9998 besar dari r tabel (p = 0,05; d.b = n-2) yaitu
III y = 0,06288x + 0,01039; r = 0,9995 sebesar r = 0,87815.

Tabel 3. Hasil uji linearitas ofloksasin dalam b. Hasil uji ketelitian (Precision)
pelarut dapar fosfat pH 7,4 Penentuan nilai presisi yang
dilakukan merupakan kategori keterulangan,
Replikasi Persamaan regresi kurva baku yaitu dengan mengamati absorbansi larutan
I y = 0,06747x + 0,00033; r = 0,9999 ofloksasin dalam dapar fosfat pH 3,0; 7,4; dan
II y = 0,06811x + 0,00706; r = 0,9999 12,0 pada tiga konsentrasi yang berbeda,
III y = 0,07039x + 0,00244; r = 0,9999 dilakukan tiga kali replikasi. Hasil uji dapat
dilihat pada tabel 5.
Tabel 4. Hasil uji linearitas ofloksasin dalam Ketelitian (presisi) ditentukan
pelarut dapar fosfat pH 12,0 berdasarkan nilai simpangan baku (SD) atau
koefisien variasi (KV). Berdasarkan hasil uji,
Replikasi Persamaan regresi kurva baku
dapat diketahui bahwa metode
I y = 0,06779x + 0,00696; r = 0,9999
spektrofotometri UV yang digunakan untuk
II y = 0,06846x + 0,00833; r = 0,9999
penetapan kadar ofloksasin dalam dapar
III y = 0,07073x + 0,00116; r = 0,9999
fosfat pH 3,0; 7,4; dan 12,0 memiliki presisi
yang baik dengan KV 2%11, pada
konsentrasi tinggi, sedang, dan rendah.
Pergeseran panjang gelombang
maksimum ofloksasin disebabkan adanya tiga
Tabel 5. Hasil uji ketelitian (precision) ofloksasin
bentuk ofloksasin dalam pH dapar yang
dalam pelarut dapar fosfat pH 3,0; 7,4; dan
berbeda. Pada pH 3,0 ofloksasin berada
12,0
pada bentuk kation, sedangkan pada pH
pH Konsentrasi rata-rata SD * KV
12,0 berbentuk anion, dan zwitter ion pada
0,634 0,003 0,48%
pH 7,43. Ofloksasin dalam dapar fosfat pH 3,0
3.0 0,373 0,005 1,27%
memberikan panjang gelombang maksimum
295 nm. Panjang gelombang maksimum 0,252 0,004 1,61%
pada 295 nm terjadi karena terdapat gugus 0,677 0,01 1,49%
kromofor yang melibatkan posisi N1 menuju ke 7.4 0,421 0,005 1,12%
gugus karboksil13. 0,282 0,003 0,89%
Pergeseran hipsokromik atau 0,704 0,009 1,32%
pergeseran biru yang terjadi dari pH 3,0 12.0 0,425 0,006 1,30%
menjadi pH 7,4 (288 nm) disebabkan adanya 0,285 0,004 1,27%
konjugasi yang dihilangkan yaitu terjadinya
protonasi pada gugus karboksil14. Pergeseran *data disajikan sebagai rerata simpangan
batokromik atau pergeseran merah terjadi baku (n = 3)
saat pH dapar berubah dari pH 7,4 menjadi
12,0 (290 nm). Pergeseran ini terjadi karena c. Hasil uji ketepatan (Accuracy)
adanya protonasi pada gugus piperazinil Uji ketepatan digunakan untuk
sehingga ofloksasin berada dalam bentuk menunjukkan kedekatan hasil analisis dengan
anion. Ionisasi ofloksasin menjadi bentuk anion kadar analit yang sebenarnya. Uji akurasi
ini tidak menyebabkan perubahan panjang dalam penelitian ini dilakukan dengan
gelombang yang berarti karena tidak menggunakan metode akurasi baku. Hasil

79

Stomatognatic (J.K.G. Unej) Vol. 9 No. 2 2012: 77-81

persamaan regresi kurva baku pada pH 3,0 dengan rentang % recovery 89,93 104,25%.
adalah y = 0,06855x + 0,00276 dengan nilai r = Secara keseluruhan dapat dinyatakan bahwa
0,9998; sedangkan pada pH 7,4 adalah y = metode analisis spektrofotometri yang diujikan
0,06747x + 0,00033 dengan nilai r = 0,9999; dan merupakan metode yang akurat, tepat,
persamaan regresi kurva baku pada pH 12,0 simple, dan ekonomis untuk penetapan kadar
adalah y = 0,06847x + 0,00833 dengan nilai r = ofloksasin dalam pelarut dapar fosfat.
0,9999.
DAFTAR PUSTAKA
Tabel 6. Hasil uji ketepatan (accuracy)
ofloksasin dalam pelarut dapar fosfat pH 3,0; 1. Harmita, Petunjuk Pelaksanaan
7,4; dan 12,0 Validasi Metode dan Cara
Perhitungannya, Majalah Ilmu
pH % Recovery * Kefarmasian 2004; I (3): 117-135
92,13
2. Wu, C.Y., Benet, L.Z., Predicting Drug
3,0 89,93
Disposition via Application of BCS:
91,99 Transport/ Absorption/ Elimination
101,83 Interplay and Development of a
7,4 104,01 Biopharmaceutics Drug Disposition
104,25 Classification System,
101,17 Pharmaceutical Research, 2005; 22
12,0 98,83 (1): 11-23
100,54
*data disajikan sebagai rerata (n = 3) 3. Okeri, H.A., Arhewoh, I.M., Analytical
Profile of the Fluoroquinolone
Pengujian akurasi dilanjutkan Antibacterials, I. Ofloxacin, Afr. J.
dengan menggunakan sampel ofloksasin Biotechnol 2008; 7 (6): 670-680
pada konsentrasi tinggi, sedang, dan rendah
sehingga dapat diketahui ketepatan metode 4. Ross, D.L., Riley, C.M., Dissociation
spektrofotometri UV pada kadar yang and Complexation of the
berbeda. Akurasi dinyatakan sebagai Fluoroquinolone Antimicrobials an
persentase perolehan kembali (% recovery). update, J.Pharm. Biomed. Anal.,
Hasil uji menunjukkan rata-rata % recovery 1994; 2 (2): 1325 1331
ofloksasin dalam dapar fosfat pH 3,0; 7,4; dan
12,0 pada konsentrasi tinggi, sedang, dan 5. Ramesh, P.J., Basavaiah, K.,
rendah memberikan hasil yang baik dan Rajendraprasad, N., Devi, O.Z.,
memenuhi persyaratan untuk uji akurasi. Hasil Vinay, K.B., Spectrophotometric
% recovery dikatakan memenuhi syarat Determination of Ofloxacin in
apabila menunjukkan nilai persentase antara Pharmaceuticals by Redox Reaction,
80 110%11. J. of Applied Spectroscopy 2011; 78.
(3): 383-391
d. Hasil uji batas deteksi dan batas antitasi
(LOD dan LOQ) 6. Vinay, K.B., Revanasiddappa, H.D.,
Batas deteksi (LOD) dan batas Divya, M.R., Rajendraprasad, N.,
kuantitasi (LOQ) diperoleh dengan membuat Spectrophotometric Determination
lima konsentrasi di bawah konsentrasi terkecil of Ofloxaacin in Pharmaceuticals
pada uji linearitas. Hasil perhitungan and Human Urine, Eclet. Quim 2009;,
berdasarkan nilai absorbansi yang diperoleh 34 (4).
menunjukkan bahwa ofloksasin dalam pelarut
dapar fosfat pH 3,0: nilai LOD = 1,5x10-4 g/L 7. Huang, X.G., Zhang, H.S., Li, Y.X., Li,
dan LOQ = 4,9x10-4 g/L. Pada dapar pH 7,4 M.F., Simultaneous
ofloksasin memiliki nilai LOD = 0,1x10-4 g/L Spectrophotometric Determination
dan LOQ = 0,3x10-4 g/L, sedangkan pada of Norfloxacin, Ofloxacin, and
pH 12,0 nilai LOD = 0,1x10-4 g/L dan LOQ = Lomefloxacin in Rabbit Blood Serum
0,4x10-4 g/L. by Use of Chemometrics, J. Chil.
Chem. Soc. 2009; 54 (3): 204-207
KESIMPULAN
8. Bhusari, K.P., and Chaple, D.R.,
Metode analisis ofloksasin secara Simultaneous Spectrophotometric
spekrofotometer UV memberikan hasil yang Estimation of Ofloxacin and
memenuhi syarat linearitas, ketelitian, Ornidazole in Tablet Dosage Form.,
ketepatan, LOD, dan LOQ yang cukup baik. Asian J. Research Chem. 2009; 2 (1):,
Parameter linearitas memberikan korelasi 60-62
yang baik dengan r hitung lebih besar dari r
tabel. Hasil koefisien variasi memberikan hasil 9. Senthilraja, M., Simultaneous UV
yang baik dengan rentang 0,48 1,61% Spectrophotometric Method for the
menunjukkan ketelitian metode analisis yang Estimation of Nitazoxanide and
baik. Parameter ketepatan juga memberikan Ofloxacin in Combined Dosage
hasil yang baik dan memenuhi persyaratan


Studi Preformulasi: Validasi Metode Spektrofotometri (Buipratiwi W)

Form, Reserch J. Pharm. and Tech.


2008; 1(4): 469-471 13. Park, H.R., Chung, H.C., Lee, J.K.,
Bark, K.M., Ionization and Divalent
10. Anonim, Guidelines for The Cation Complexation of Quinolones
Validation of Analytical methods for Antibiotics in Aqueous Solution, Bull.
Active Constituent, Agricultural, and Korean Chem. Soc. 2000; 21 (9): 849-
Veterinary Chemical Products, 853
APVMA, 2004
14. Supratman, U., Elusidasi Struktur
11. Ermer, J., and Miller, J.H., Method Senyawa Organik, Widya
Validation in Pharmaceutical Padjadjaran, Bandung, 2010
Analysis, Willey VCH Verlag GmbH
an Co.Weinheim, 2005 15. Triola, M.F., Elementary Statistics
Update, 9th ed., Addison-Wesley.
12. Miller, J.C., and Miller, J.N., Statistics Pearson Education Inc., 2004: 499-
for Analytical Chemistry, 3rd Ed. John- 506
Wiley and Sons. Inc. New York, 1993

81

Anda mungkin juga menyukai