Report about the function of Okazakis fragment

TOPICS IN NANOBIOTECHNOLOGY

GRADUATE STUDIES IN CHEMICAL AND PROCESS ENGINEERING

Professor: Ciara K. O'sullivan

Eva Mara Lpez Mendoza

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Para comprender la funcion y actuacion del fragmento de Okasaki es necesario entender en que
consiste la replicacion del ADN y todas las estructuras puestas en juego.

El modelo de Watson y Crick para la estructura del ADN sugera un modo de replicacin
semiconservativa.
Sin embargo, mientras no se descartaran experimentalmente, tres modelos de replicacin eran
posibles:

Fig. 1. Modelos de reproduccin de ADN

El experimento de Matthew Meselson y Franklin Stahl (1958) demuestra que la replicacin del
ADN ocurre segn el modelo semiconservativo: cultivaron bacterias E.coli en un medio que
contena como nica fuente de nitrgeno cloruro amnico marcado con 15N hasta que lleg un
momento en que el ADN slo presentaba en sus bases nitrogenadas 15N. Posteriormente cambiaron
el medio de cultivo por otro con 14N normal. Las bacterias de la primera generacin presentaban en
su ADN 14N y 15N en igual cantidad. A continuacin se puede ver un esquema de la metodologa a
seguir y los resultados del experimento.

El proceso de replicacin es similar tanto en los organismos procariotas como en los eucariotas,
pero es en los primeros donde ms se conocen los detalles; en concreto la ms estudiada es la
replicacin en E.coli.

A continuacin se puede ver un esquema de la metodologa a seguir y los resultados del

experimento.

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 fig 2.Esperimento de Matthew Meselson y Franklin Stahl (1958) en E.coli.

La replicacin en Escherichia coli

Origen de replicacin y horquilla de replicacin

Los orgenes de replicacin suelen ser regiones ricas en pares A=T. El cromosoma bacteriano
contiene una sola regin de 245 pb, denominada oriC, donde se inicia la replicacin. Esta regin
contiene repeticiones de 9 pb y repeticiones de 13 pb.
A partir del origen la replicacin es bidireccional, lo que da lugar a la formacin de dos horquillas
de replicacin.
Puesto que el cromosoma bacteriano es circular, las dos horquillas acaban encontrndose en una
regin denominada ter.
La longitud de ADN que se replica a partir de un solo origen de replicacin se denomina
replicn. En E. coli el cromosoma entero constituye un replicn.

Sntesis continua y discontinua. Fragmentos de Okazaki.

La sntesis de ADN slo ocurre en sentido 5'-3'. Debido a que las cadenas del ADN son
antiparalelas, una de ellas se replicar en la misma direccin en que se desplaza la horquilla de
replicacin y la otra en la direccin contraria. La primera se sintetiza de modo continuo (cadena
lder), la segunda se sintetiza de modo discontinuo (cadena retrasada). Cada fragmento que se
sintetiza de la cadena retrasada se denomina fragmento de Okazaki.

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 fig 3 Sintesis de ADN

Enzimologa de la
replicacin
En 1957 Kornberg y colaboradores aslan la primera enzima de E. coli capaz de catalizar la
sntesis de ADN. Se denomina ADN polimerasa I (pol I).
Requerimientos de la polimerasa de ADN:
Los cuatro desoxirribonuclesidos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
ADN molde

En 1967, Goulian, Kornberg y Sinsheimer demuestran que el ADN del fago X174 sintetizado
in vitro con esta polimerasa es biolgicamente activo (capaz de dirigir la formacin de nuevos
fagos).
En 1969, Peter De Lucia y John Cairns descubren un mutante de E. coli deficiente en actividad
ADN polimerasa I (mutante en el gen polA). Este mutante, aunque con defectos en reparacin de
daos al ADN, era viable y, por tanto, capaz de replicar su ADN. Esto implicaba:
Existe en E. coli al menos otra enzima con capacidad para replicar el ADN
La polimerasa I slo tiene una funcin secundaria en la sntesis de ADN in vivo
Hasta ahora se han descubierto dos ADN polimerasas ms en E. coli: ADN polimerasas II y III.
Propiedades de las tres polimerasas de ADN bacterianas:

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La ADN polimerasa III es la responsable de la polimerizacin esencial para la replicacin.

Subunidades de la holoenzima de la ADN polimerasa III

La polimerasa de ADN no tiene capacidad para separar las dos cadenas ni para iniciar la
sntesis. Para esto se requieren otras protenas: helicasa, protenas de unin a ADN de cadena
simple (ssb), girasa, primasa. La unin de los fragmentos de Okazaki requiere una actividad
ligasa.
La iniciacin de la replicacin requiere las protenas DnaA, DnaB y DnaC. Dna B tiene actividad
helicasa, necesaria para romper puentes de hidrgeno y desenrollar las cadenas:

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 fig 4. Iniciacion de replicacion, actividad de enzima Helicasa.

Las protenas de unin a cadena simple (ssb) impiden que vuelva a formarse la doble hlice as
el avance de la horquilla de replicacin lleva a la formacin de superenrollamientos que
deben ser eliminados. Aqu interviene la girasa, un tipo de topoisomerasa, enzima capaz de
cortar y reunir cadenas de ADN.

La cadena lder necesita un solo cebador de ARN, que es una corta cadena de ARN con una
secuencia complementaria de una de las porciones de las hebras del ADN y frente a la cual se
coloca. En la hebra que tiene el sentido 3'--5' la ADN -polimerasa va colocando nucletido tras
nucletido a continuacin del ARN cebador. Esta hebra complementaria que va creciendo en
sentido 5'--3' es la hebra conductora.
En la hebra opuesta del ADN original no se puede realizar el mismo proceso porque discurre en
sentido 5'--3'. Por tanto, a continuacin del ARN cebador se coloca un fragmento de Okazaki y,
despus de ste, un nuevo ARN cebador seguido de otro fragmento de Okazaki.
En este momento acta una ribonucleasa que elimina el ARN cebador que est entre dos fragmentos
de Okazaki. El hueco que queda es rellenado por la ADN-polimerasa. El proceso continuara con la
colocacin de un nuevo ARN cebador, otro fragmento de Okazaki, eliminacin del ARN cebador y
llenado del hueco por la ADN -polimerasa. Y as sucesivamente. La hebra que se sintetiza de esta
manera es la retardada y crece en sentido 3'--5'.

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 fig 5 Replicacion de cadena de ADN.

Errores en la replicacion.

La ADN polimerasa III introduce un nucletido incorrecto cada 105 nucletidos. El mecanismo
corrector de pruebas, basado en la actividad exonucleasa 3'-5', reduce la tasa de error a 1 cada 107.
Adems, despus de la replicacin existen mecanismos de reparacin que hacen descender la tasa
de error a 10-9 se trata de un complejo enzimtico que detecta el nucletido mal emparejado, lo

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elimina y regenera la secuencia correcta. De este modo se logra alcanzar una perfeccin de un error
cada 1010 pares de bases..