EXTRACCIN ADN PLASMDICO

Ref. ADNPLASMIDO (25 extracciones)

1. OBJETIVO DEL EXPERIMENTO

El objetivo de este experimento es introducir los principios de la extraccin de

ADN plasmdico a partir de clulas bacterianas.
Los estudiantes aprendern la estructura y funcin de los plsmidos de ADN.
2. INTRODUCCION
Los plsmidos son fragmentos extracromosmicos de cidos nuclicos (ADN o ARN)
que aparecen en el citoplasma de algunos procariotas. Son de tamao variable, aunque
menor que el cromosoma principal. Cada bacteria puede tener uno o varios a la vez.

Los plsmidos tienen una conformacin variable que puede ser lineal, circular o con
estructura superenrrollada (supercoiled DNA).
De forma natural los ADN plasmdicos existe como molcula superenrrollada
(Forma I), este ADN superenrrollado est doblado en s y tiene una estructura ms
condensada y enredada que el mismo ADN cuando est relajado.

El ADN purificado debe ser un crculo cerrado covalentemente y estar en forma de

estructura superenrrollada, esta estructura en la clula es causada por la accin de unos
enzimas llamados girasas y esto tiene importantes consecuencias biolgicas. Si uno o
ms fosfatos unidos al esqueleto del ADN superenrrollado son eliminados o rotos
(nicks), la molcula pasa a una forma relajada llamada ADN circular (Forma II). Las 2
cadenas del ADN circular no estn cerradas covalentemente y se mantienen unidas por
puentes de hidrgeno entre las bases.

El ADN plasmdico superenrrollado purificado con el tiempo y lentamente desarrolla

nicks y se convierte en Forma II, esto se debe a que el ADN en Forma I no es tan
estable como las formas circulares o relajadas.

Cada tipo de plsmido presenta un control de su replicacin diferente, existiendo

plsmidos cuya replicacin est acoplada con la replicacin del cromosoma bacteriano y
otros cuya replicacin no est relacionada con la del cromosoma. El tipo de genes que
portan los plsmidos es variado, tratndose generalmente de genes que aportan ventajas
adaptativas a la bacteria que los porta: genes de resistencia a antibiticos, genes de
produccin de sustancias txicas para otras bacterias o genes que codifican enzimas
tiles para degradar sustancias qumicas.

Los plsmidos se pueden clasificar siguiendo distintos criterios. Uno de estos criterios
es el tipo de genes que portan. As se define el grupo de plsmidos con genes de
degradacin de sustancias, otro grupo con genes de fertilidad, el que porta genes de
virulencia o el grupo que porta genes de resistencia.

Los plsmidos son herramientas muy tiles en ingeniera gentica para la

transformacin gnica y la manipulacin gentica de procariotas y eucariotas. Los
plsmidos empleados en ingeniera gentica se llaman vectores. Son muy tiles para
sintetizar en grandes cantidades protenas de inters, como la insulina o los antibiticos,
mediante un procedimiento conocido como transformacin. El proceso de
transformacin comienza con la seleccin de un plsmido adecuado, en el que se
introducen los genes que se quieren expresar con protocolos especficos que usan
enzimas de restriccin y DNA ligasa. Posteriormente se transforma un tipo de bacteria
con el plsmido modificado y se seleccionan las bacterias transformadas que produzcan
las sustancias deseadas. Estas bacterias se cultivan en sistemas de tipo biorreactores
para su crecimiento en grandes cantidades. En este proceso se eligen plsmidos con
caractersticas que permitan seleccionar las bacterias transformadas en un medio de
cultivo como por ejemplo plsmidos con genes de resistencia a antibiticos o con genes
de enzimas que sinteticen compuestos coloreados.

Aunque los plsmidos no pueden sintetizar una envoltura proteica y se transfieren con
dificultad de una clula a otra se ha hipotetizado que podran ser los precursores de los
primeros virus.
En este experimento el plsmido pGAL de 6751 pares de bases que ha sido modificado
por ingeniera gentica ser aislado a partir de clulas bacterianas que se suministran
con el kit. El plsmido pGAL contiene el gen de E.coli que codifica para la
galactosidasa que en presencia del galactsido artificial X-GAL producir colonias
de color azul , esto se debe a que cuando la galactosidasa rompe el X-GAL se
produce un producto azul, esta propiedad permitir distinguir en una placa de cultivo
que clulas bacterianas tienen el plsmido pGAL. Adems este plsmido confiere
resistencia al antibitico ampicilina ya que contiene el gen que codifica para la
lactamasa que inactiva la ampicilina.

3. COMPONENTES

Pellets bacterianos que contiene el 25 unidades

plsmido pGAL
DANAGENE Plasmid Mini Kit 25 extracciones

Componentes necesarios y NO suministrados

Microcentrifuga.
Microtubos y micropipetas.
Etanol 100%.
Sistema de electroforesis bsico (aparatos y reactivos).
Sistema de deteccin de cidos nucleicos.
4. PRCTICA
Esta prctica, que permite aislar el plsmido pGAL de clulas bacterianas, se lleva a
cabo con el kit comercial DANAGENE Plasmid Mini Kit. Este kit permite la extraccin
del ADN plasmdico utilizando un mtodo denominado de lisis alcalina y tratamiento
con RNAsa que permiten la obtencin de un lisado celular claro con mnima cantidad
de ADN y ARN contaminante. En presencia de sales caotrpicas, el ADN plasmdico se
une a las membranas de slica de unas columnas presentes en el kit. Los contaminantes
son eliminados con un tampn de lavado y el ADN plasmdico es eluido con un tampn
de elucin.

Seguir las instrucciones de trabajo incluidas en el kit.

1. Si no se disponen de un sistema bsico de electroforesis, contactar con el

departamento tcnico de DanaGen-BioTed bioted@arrakis.es que le podr
suministrar todos los materiales necesarios para llevar a cabo la electroforesis de
los resultados de la extraccin de ADN plasmdico.

2. Si no se dispone de un sistema de visualizacin del ADN propio (Bromuro de

etidio, SBRY Green, etc) se le puede suministrar nuestro DANABLUE o
GELSAFE (necesita un transiluminador UV).

5. RESULTADOS
M 1 2 3 4

M: Marcador peso molecular.

1. Plsmido pGAL.
2. Plsmido pGAL.
3. Plsmido pGAL.
4. Plsmido pGAL.
Tincin realizada con nuestro sistema NO TXICO DANABLUE