Pseudomonas aeruginosa
Mahesh Bandara, 1,2 Padmaja Sankaridurg, 1,2 Hua Zhu, 1,2 Emma Hume, 1,2 dan Mark
Willcox1,2
1The School of Optometry and Vision Science , University of New South Wales, Sydney, Australia 2Brien Holden Vision
Research Institute, Sydney, Australia
Correspondence: Mark Willcox, Sekolah Optometry dan Vision Science, University of New South Wales, Sydney, NSW 2052,
Australia; m.willcox@unsw.edu.au. Dikirim: 20 Desember 2015 Diterima: 11 Februari 2016 Citation: Bandara M, Sankaridurg P,
Zhu H, Hume E, Willcox M. Pengaruh asam sa lisilat pada membran teome pro dan virulensi Pseudomonas aeruginosa.
Berinvestasi Ophthalmol Vis Sci. 2016; 57: 1213-1220. DOI: 10,1167 / iovs.15-18990
ABSTRAK
Tujuan :Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh asam salisilat pada proteome
membran, sensitivitas terhadap antibiotik, dan produksi keratitis mikroba oleh Pseudomo- nas
aeruginosa.
Metode : P. aeruginosa 6294 ditumbuhkan dengan adanya atau tidak adanya 30 mM asam
salisilat. Protein membran bakteri diekstraksi dalam buffer karbonat, dipisahkan menggunakan
elektroforesis gel dua dimensi dan diidentifikasi dengan spektrometri massa. Konsentrasi hambat
minimum (MIC) dari berbagai antibiotik ditentukan dengan menggunakan P. aeruginosa 6294
tumbuh di tidaknya asam salisilat. Model awal tikus keratitis mikroba digunakan untuk
menentukan apakah pengobatan dengan 30 mM asam salisilat dapat meningkatkan hasil infeksi.
Hasil :Pertumbuhan asam salisilat diubah proteome membran dari P. aeruginosa 6294. Delapan
belas protein, termasuk OprF, OprD, MexA, OprG, PilQ, dan flagellin-tipe A protein, yang
menurunkan regulasi, enam protein, termasuk OPRM dan OprB, yang diregulasi, dan sembilan
protein yang tidak terpengaruh oleh pertumbuhan asam salisilat. Pertumbuhan asam salisilat
sedikit meningkatkan resistensi terhadap antibiotik carbapenem tetapi tidak mempengaruhi MIC
dari antibiotik lain diuji. Pengobatan asam salisilat secara signifikan mengurangi skor klinis mata
dan beban bakteri di mata selama keratitis mikroba tetapi tidak berpengaruh pada jumlah
infiltrasi neutrofil.
Kesimpulan ;Asam salisilat mengubah protein membran dari P. aeruginosa, sedikit meningkat
perlawanan dari bakteri terhadap antibiotik carbapenem saja, dan mampu mengurangi
patogenisitas terkait dengan infeksi P. aeruginosa kornea tikus. Asam salisilat mungkin berguna
sebagai agen antimikroba dalam pengobatan Pseudomonas keratitis. Kata kunci: asam salisilat,
proteome membran, Pseudomonas aeruginosa, keratitis
Pendahuluan
Pseudomonas aeruginosa tetap yang paling umum adalah menyebabkan oportunistik patogen
infeksi dan kornea untuk orang-orang yang memakai kontak lenses.1 Annualized tingkat
kejadian keratitis mikroba bervariasi dalam studi, meskipun secara keseluruhan mereka berada
dalam perjanjian yang baik, dengan tingkat saat memakai diperpanjang (yaitu, orang tidur di
lensa) menjadi sekitar 20 per 10.000 pemakai per tahun.2 Salah satu masalah yang terkait dengan
infeksi mata dengan P. aeruginosa adalah tingkat peningkatan resistensi terhadap antibiotik
menjadi melaporkanworldwide.1,3
Ada banyak protein membran luar yang diketahui atau diprediksi (OMPs), termasuk porin
yang terikat membran, dalam genom P. aeruginosa PAO1. 14 Porins memiliki struktur
transmembran barrel dan memungkinkan akses zat seperti gula ke sel. 15 , 16 Porins dapat
berkontribusi pada produksi dan pelepasan sitokin proinflamasi dan menyebabkan cedera sel dan
apoptosis. 17 , 18 P. aeruginosa mengandung selubung sekresi terkait membran yang berbeda yang
terlibat dalam pelepasan sejumlah besar protein ekstraselular, termasuk faktor virulensi, ke
lingkungan luar. 19 Sistem sekresi yang berbeda terlibat dalam pelepasan protease alkali (tipe
I); Elastase (tipe II); Sitotoksin ExoU, ExoS, ExoT, dan ExoY (tipe III); Adhesin CdrA (tipe
V); Dan toksin Tse2 (tipe VI). Selain itu, beberapa struktur virulensi terkait permukaan lainnya,
seperti pili, flagella, lipopolisakarida, dan kapsul, juga melekat pada sel melalui membran luar
dan terpapar pada lingkungan luar.
P. aeruginosa bisa menjadi resisten terhadap banyak antibiotik yang relevan secara klinis,
jadi ada kebutuhan untuk menyelidiki agen alternatif untuk mengendalikan penyakit yang
disebabkan oleh bakteri ini. Asam salisilat dapat mengurangi keterikatan P. aeruginosa ke sel
epitel kornea manusia secara in vitro 21 dan menurunkan sejumlah faktor virulensi pada P.
aeruginosa , 22 , 23 bahkan pada konsentrasi yang tidak terlalu mempengaruhi
pertumbuhan. Namun, asam salisilat diketahui menginduksi resistansi P. aeruginosa terhadap
imipenem melalui downregulation OprD, namun tidak mempengaruhi sensitivitas terhadap
kloramfenikol, norfloksasin, tetrasiklin, atau cefpirome. 24 Asam salisilat dapat meningkatkan
permeabilitas membran luar P. aeruginosa ke laktam nitrocefin. 25 Untuk bakteri
terkait, Burkholderia cepacia , asam salisilat menginduksi resistansi terhadap ciprofloxacin,
kloramfenikol, dan trimetoprim, namun tidak sampai ceftazidime. Pertumbuhan asam salisilat
Escherichia coli menginduksi ketahanan reversibel terhadap kloramfenikol, ampisilin,
tetrasiklin, dan asam nalidiks. 27 Jika asam salisilat adalah agen antibakteri yang berguna, atau
agen tambahan yang digunakan bersamaan dengan terapi antibiotik tradisional dalam pengobatan
penyakit, pemahaman yang lebih rinci tentang tindakannya terhadap bakteri, pengembangan
resistensi, dan pengobatan pada model hewan adalah Dibutuhkan.
Strain Bakteri dan Kondisi Pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa 6294, yang diisolasi dari
kasus keratitis mikroba, 28 disubkultur dalam 10 mL kaldu kedelai tryptic (Oxoid, Ltd., Sydney,
Australia) pada suhu 37 C semalam. Kultur ditanam sampai fase diam tanpa agitasi dan sel
bakteri dipanen dengan sentrifugasi (3000 g , 10 menit, 20 C), dicuci dua kali, dan
ditangguhkan dalam PBS pada konsentrasi unit pengikat koloni 1 10 7 (cfu) / ML (OD 0,1 pada
660 nm).
Isolasi OMP dan Dua Dimensi
Bakteri ditambahkan 1:10 sampai 400 mL baik kaldu kedelai trypticase segar (TSB) saja
(kontrol) atau TSB segar dengan konsentrasi konsentrasi hambat sub-minimum (MIC)
konsentrasi (30 mM; MIC = 120 mM) 23asam salisilat dan Diinkubasi selama 20 jam. Sel-sel
dipanen dengan sentrifugasi pada 3000 g selama 10 menit pada suhu 20 C dan dicuci dua kali
di PBS. Pelet sel dikepang beku pada suhu -80 C dan dikeringkan beku. Protein membran luar
dibuat dengan metode ekstraksi natrium karbonat yang dimodifikasi seperti yang dijelaskan
sebelumnya oleh Nouwens et al. 29 dan beku-kering. Protein membran luar diperoleh dari dua
budaya terpisah dan dianalisis secara terpisah untuk memastikan reproduktifitas
Oksigen beku beku dilarutkan dalam buffer sampel 2oL isoelektrik (IEF)
(tetradecanoylamide-propyl-dimethyl ammoniopropane-sulforate-14 1% wt / vol [Calibiochem-
Novabiochem Co., San Diego, CA, USA]; tributyl phosphine [ TBM; Bio-Rad, Gladesville,
NSW, Australia] 2 mM; urea [BDH, Tingalpa, QLD, Australia] 7 M; Thiourea [Sigma, Castle
Hill, NSW, Australia] 2 M; pembawa ampholfi [Bio-Rad] 0.5 % Wt / vol; bromophenol
biru). Campuran sampel dimuntahkan selama 1 menit dan disentrifugasi (20.000 g , 10 menit, 4
C) untuk menghilangkan zat yang tidak larut. Sampel yang mengandung protein 250 g diisikan
ke 17 cm pH 4-7 strip kering gradien pH amobil (IGP; Bio-Rad) dengan rehidrasi semalam pada
suhu 18 C. Fokus isoelektrik dan elektroforesis SDS-gel berikutnya dilakukan seperti yang
dijelaskan oleh Nouwens dkk. 29 , 30 Bintik protein dicitrakan dan didigitasi menggunakan
PerkinElmer ProXPress Proteomic Imaging System (Melbourne, VIC, Australia). Elektroforesis
dua dimensi dilakukan secara rangkap tiga untuk setiap preparasi sampel; Dengan demikian,
dengan menggunakan persiapan OMP duplikat, enam gel dihasilkan untuk analisis.
Protein yang diekspresikan berbeda didefinisikan sebagai yang menunjukkan peningkatan
atau penurunan intensitas spot lebih besar dari 2 kali lipat rata-rata kontrol dari enam
gel. Perangkat lunak PDQuest (Bio-Rad) digunakan untuk analisis komparatif, kuantisasi spot,
perbandingan gel, dan analisis data gambar gel digital. Tiga puluh lima gel spot menunjukkan
perubahan yang dapat direproduksi secara melimpah, dan 12 titik yang tidak berubah, dipilih
untuk analisis lebih lanjut. Setiap titik protein diidentifikasi dengan pencarian terhadap
proyek sekuensing genom Pseudomonas untuk identifikasi spot yang meyakinkan,% cakupan
urutan, jumlah massa molekul peptida yang sesuai, dan massa protein total dan
p I digunakan. Identifikasi lebih lanjut pada identifikasi diberikan melalui spektrometri massa /
sekuens spektrometri massa dari delapan sinyal peptida terkuat yang dihasilkan dalam
pemindaian spektrometri massa pertama (MS).
Metode yang digunakan mengikuti yang digariskan oleh Clinical and Laboratory
Standards Institute (dokumen M7-A7; ISBN 1-56238-587-9) dengan menggunakan uji
mikrodilusi kaldu, dengan modifikasi berikut. Bakteri secara rutin ditanam di hadapan 30 mM
asam salisilat atau tanpa asam salisilat dan antibiotik berikut: ceftazidime (32-0,25 g / mL),
tetrasiklin (32-0,25 g / mL), siprofloksasin (2-0,015 g / mL) , Imipenem (32-0,25 g / mL),
meropenem (8-0.125 g / mL), dan eritromisin (640-10 g / mL). MIC ditentukan sebagai
konsentrasi antibiotik terendah yang menghambat pertumbuhan bakteri setelah inkubasi pada
suhu 37 C selama 18 jam. MIC bakteri yang tumbuh dengan keberadaan atau tidak adanya
asam salisilat dicatat dan semua percobaan dilakukan pada setidaknya dua kesempatan yang
berbeda
Hasil
Sebagian besar OMPs P. aeruginosa diselesaikan dalam kisaran p I dari 4 sampai 6 dan
massa molekul berkisar antara 18 sampai 45 kDa ( Gambar 1 ) seperti yang ditunjukkan
sebelumnya. 29 , 30 Sebanyak 47 titik protein, 35 titik yang dapat direproduksi secara reproduktif
pada pertumbuhan asam salisilat dan 12 titik yang tetap tidak berubah, diisolasi dan diidentifikasi
dengan desorpsi laser / dibantu matriks dibantu MS-flight setelah in-gel tryptic. intisari. Sebagian
besar protein membran yang ditandai dengan pemetaan massa peptida padapewarnaan P.
aeruginosa 6294 dicocokkan untuk membuka urutan frame baca dari database P.
aeruginosaPOA1. Sebagian besar tempat yang teridentifikasi diverifikasi sebagai OMP atau
fungsi yang tidak diketahui (Tabel 1 ) Tiga puluh lima dari 47 titik yang diidentifikasi terlihat
berubah dalam kelimpahan antara perawatan.Sebagian besar bintik protein hadir dalam
kelimpahan yang lebih rendah pada sampel yang diolah dengan asam salisilat bila dibandingkan
dengan kontrol ( Tabel 1 ). Protein berikut diturunkan: OprF, OprD, MexA, OprG, OprL, protein
yang berasal dari PA1041 (kemungkinan OMP), protein yang berasal dari PA2113 ( opdO ;
probable porin), prekursor protein fimbrial, PilQ, flagellin type-A, HsiC2, peptidyl -prolyl cis-
trans isomerase, ComL, protein yang berasal dari PA2800 ( VacJ ), aconitate hydratase-1, LptE
dan satu protein hipotetis (dari PA1324). Protein berikut diregenerasikan: OprB, protein yang
berasal dari PA2291 ( opbA ; probable porin ), protein yang berasal dari PA0162 ( opdC ;
probable protein), OprM, protein yang berasal dari PA2837 ( opmA ; probable OMP), dan D-ala-
D- Ala-karboksipeptidase Dua belas bintik yang mewakili sembilan protein tidak terpengaruh
oleh pertumbuhan asam salisilat ( Tabel 2 ), termasuk PagL, Opr86, dan OprH.
Gambar 1
Elektroforesis gel dua dimensi protein membran P. aeruginosa 6294. ( A ) Protein yang diambil
dari sel yang tumbuh di TSB saja. ( B ) Protein yang diekstraksi dari sel yang ditanam dalam
asam salisilat TSB + 30 mM. Angka mengacu pada protein yang diidentifikasi pada Tabel 1 .
Tabel 1
Protein luar membran P. aeruginosa Strain 6294 yang menunjukkan lebih dari 2-lipatan
perbedaan dalam kelimpahan setelah pertumbuhan asam salisilat
Tabel 2
Protein luar membran P. aeruginosa Strain 6294 yang tidak berubah oleh pertumbuhan
keberadaan asam salisilat.
Tabel 3 memberikan rincian MIC bakteri yang tumbuh dengan adanya atau
tidak adanya asam salisilat. Hanya dengan imipenem atau meropenem apakah ada
kenaikan MIC bila bakteri tersebut ditumbuhkan dengan adanya asam salisilat. Untuk
imipenem, pertumbuhan asam salisilat membuat sel bakteri menjadi intermediate
dalam resistensi / sensitivitas yang sensitif saat tumbuh dengan tidak adanya asam
salisilat. Meskipun MIC untuk meropenem meningkat, bakteri masih dianggap sensitif
terhadap antibiotik ini saat tumbuh dengan adanya asam salisilat ( Tabel 3 ).
Pengaruh Asam Salisilat Terhadap Produksi Keratitis Mikroba oleh P. aeruginosa 6294
Gambar 2 menunjukkan hasil pengobatan dengan asam salisilat pada keratitis mikroba
yang dihasilkan oleh P. aeruginosa 6294. Ada penurunan yang signifikan pada skor klinis (slit-
lamp) secara keseluruhan ( P = 0,005) dan jumlah bakteri yang tersisa dalam kornea 24 jam.
Setelah inisiasi infeksi ( P = 0,04). Namun, jumlah PMN yang menginfiltrasi kornea pada 24 jam
setelah infeksi tidak terpengaruh ( P > 0,05) dengan pengobatan dengan asam salisilat.
Gambar 2
Pengaruh asam salisilat terhadap produksi keratitis mikroba oleh P. aeruginosa 6294. ( A ) Skor
klinis. ( B ) Jumlah bakteri pada kornea pada tikus. ( C ) Jumlah PMN pada kornea pada tikus. *
Secara statistik berbeda dibandingkan dengan kontrol ( P <0,05).
Diskusi