Pelaksanaan Praktikum
A. Tujuan
1. Untuk mengetahui teknik pemeriksaan jumlah bakteri pada makanan dan
minuman.
2. Untuk menentukan jumlah bakteri pada makanan dan minuman yang diuji (Kue
Sus, Es Teler, dan Daun Kemangi).
1
metode hitung pada cawan petri (standard plate count), metode pengamatan langsung
dengan kaca obyek atau metode hitung dengan menggunakan haemocytometer , metode
ukur kekeruhan (turbidimetri) menggunakan spektrofotometer dan metode jumlah
perkiraan terdekat (Braddy, 1999).
Dalam praktikum ini bahan makanan yang akan diperiksa angka kumannyaadalah kue
sus dan daun kemangi, dan minuman yang akan diperiksa adalah Es Teler. Metode
perhitungan angka kuman yang digunakan dalam praktikum pemeriksaan kue sus, daun
kemangi,dan Es Teler adalah metode Angka Lempeng Total denganmetode tuang (pour
plate).
Cara perhitungan ini didasarkan pada anggapan bahwa sel-sel mikroorganismeyang
terdapat dalam sampel atau bahan jika dicampur atau dibiakkan masing-masing akan
membentuk koloni yang nampak dan terpisah. Jadi yang terhitung adalah kumanyang
hidup (viable) dan dapat tumbuh membentuk koloni dalam suasana
yangdisediakan.Poulasi kuman yang ditentukan (dihitung) per-mL untuk bahan cair
dan per-gram untuk bahan padat.
B. Bahan-bahan
1. Sampel
a. Padat : Kue Sus
b. Cair : Es Teler
c. Sayuran : Kemangi
2. Media NAP (Nutrient Agar Plate)
3. Larutan PZ steril
a. @9 ml 5 tabung untuk 1 sampel
b. 90 ml dalam Erlenmeyer (untuk sampel padat)
2
IV. Cara Kerja
A. Pembuatan Media Nutrient Agar Plate / NAP
a. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
b. Menimbang 5,6 gram media NB (8 g / L) dan 14 gram (1,5%) agar-agar.
c. Melarutkan media dengan aquades sampai volume 700 ml lalu didihkan.
d. Mensterilisasi media dalam autoclave pada suhu 121 C selama 15menit.
e. Mendiamkan media samapi suhunya turun menjadi 45-50 C
3
C. Prosedur Kerjauntuk Sampel Cair (Es Teler)
1) Menyiapkan 5 tabung berisi masing-masing 9 ml PZ steril (tabung 1-4 sebagai
tabung uji, dan tabung terakhir sebagai control negative).
2) Memipet 1 ml sampel menggunakan mikropipet dan tip steril, dan dipindahkan
kedalam tabung pertama berisi 9 ml PZ steril (factor pengenceran 1/10),
homogenkan.
3) Setelah itu 1 ml dari tabung pertama dipipet dan dipindahkan ke tabung 2 (factor
pengenceran 1/102), homogenkan.
4) Lakukan hal yang sama pada langkah 2 sampai tabung terakhir atau tabung ke 4
(factor pengenceran 1/104), 1 ml dari tabung terakhir bisa dibuang/tidak.
5) Pada tabung control negative ditambahkan 1 ml PZ steril kemudian dihomogenkan
6) Dari masing-masing tabung (tabung uji dengan factor pengenceran dan tabung
control negative) masing-masing dipipet 1 ml larutan dan dimasukkan ke dalam
plate steril yang sesuai.
7) Menambahkan masing-masing 24 ml media NAP suhu 45-50 C ke dalam semua
plate, homogenkan dengan cara menggoyang plate.
8) Biarkan sampai membeku kemudian Inkubasi pada incubator suhu 37 C selama 18-
24 jam.
9) Kemudian hitung jumlah koloni yang tumbuh pada plate dan jumlah bakterinya
dalam satuan CFU / ml sampel.
4
4) Selanjutnya 1 ml dari tabung tersebut dipipet menggunakan mikropipet dan tip
steril, dan dipindahkan kedalam tabung pertama berisi 9 ml PZ steril (factor
pengenceran 1/10), homogenkan.
5) Setelah itu 1 ml dari tabung pertama dipipet dan dipindahkan ke tabung 2 (factor
pengenceran 1/102), homogenkan.
6) Lakukan hal yang sama pada langkah 5 sampai tabung terakhir atau tabung ke 4
(factor pengenceran 1/104), 1 ml dari tabung terakhir bisa dibuang/tidak.
7) Pada tabung control negative ditambahkan 1 ml PZ steril kemudian dihomogenkan
8) Dari masing-masing tabung (tabung uji dengan factor pengenceran dan tabung
control negative) masing-masing dipipet 1 ml larutan dan dimasukkan ke dalam
plate steril yang sesuai.
9) Menambahkan masing-masing 24 ml media NAP suhu 45-50 C ke dalam semua
plate, homogenkan dengan cara menggoyang plate.
10) Biarkan sampai membeku kemudian Inkubasi pada incubator suhu 37 C selama 18-
24 jam.
11) Kemudian hitung jumlah koloni yang tumbuh pada plate dan jumlah bakterinya
dalam satuan CFU / cm2 sampel.
V. Interpretasi Hasil
Ketentuan Koloni yang dihitung :
o Koloni yang tumbuh dengan jumlah 30 300 ( kurang dari 30 tidak
dihitung, lebih dari 300 dinyatakan dengan TBUD / Terlalu Banyak Untuk
Dihitung)
o Koloni yang tumbuh membentuk koloni yang besar dihitung 1
o Koloni yang bertumpuk membentuk rantai dan garis tebal dihitung 1
Jumlah bakteri yang telah dihitung menggunakan rumus dinyatakan sebagai berikut
o Untuk sampel padat satuan yang digunakan CFU / g sampel
o Untuk sampel cair satuan yang digunakan CFU / ml sampel
o Untuk sampel sayuran satuan yang digunakan CFU / cm2 permukaan
Es Teler (Cair)
Daun Kemangi
(Sayuran)
102 265
6
103 102
104 194
105 5
10 TBUD
7
102 TBUD
103 160
104 35
10 1
8
102 4
103 3
104 2
VII. Perhitungan
A. Rumus perhitungan :
1.
Bakteri
koloni P
Vol . sampel
Bila plate control negative ditumbuhi koloni, maka :
( koloniK negatif ) P
Bakteri
Vol . sampel
2. Untuk sampel Sayuran
Bakteri
1
V p koloni P
L
Vol . sampel 9
Keterangan :
P : Pengenceran
Knegatif : Jumlah koloni pada control negatif
L : Luas permukaan sampel
Hasil Perhitungan
26.500+102.000+ 1.940.000
3
2.068 .500
3
10
Dik : koloni pada
10 = TBUD
102 = TBUD
3
10 = 160
104 = 35
Volume spl = 1 ml
Dit : Bakteri = ?
Jawab :
Pada Pengenceran 103
160 1000
Bakteri1
1
= 160.000 CFU / ml sampel
Bakteri1 + Bakteri2
Bakteri (rata-rata)
2
160.0000+350.000
2
510.000
2
11
Dikarenakan jumlah koloni yang tidak memenuhi persyaratan koloni yang
dihitung yaitu 30 300 koloni, maka jumlah bakteri dihitung menggunakan
jumlah koloni terbanyak.
1
V p koloni P
Bakteri L
Vol . sampel
1 2
10 4 10
= 4
1
1000
=
1
= 1.000 CFU / cm2 sampel
VIII. Pembahasan
Semua makhluk hidup membutuhkan makanan, sebagai sumber tenaga kita dari
mulai nasi, buah-buahan, sayuran, daging, lauk-pauk, dan sebagainya.Makanan sangat
disukai manusia, yang pada umumnya juga disukai mikroorganisme.Dengan demikian
mikroorganisme merupakan saingan bagi manusia.Pasti ada virus, jamur, maupun bakteri
pada makanan mentah dan makanan yang sudah dimasak. Untuk makanan mentah sudah
sewajarnya manusia akan mengolah makanan itu agar dapat dimakan dan tidak
menimbulkan sakit bagi manusia sendiri. Dan banyak cara yang dilakukan manusia untuk
mengolah makanan tersebut.Bila makanan telah dihinggapi mikroorganisme akan
mengalami penguraian nilai gizi makanan berkurang serta kelezatannya, bahkan makanan
yang telah dalam keadaan terurai dapat menyebabkan sakit sampai mati bila ada orang
yang memakan makanan itu.
Pemeriksaan mikrobiologis untuk pemeriksaan bahan makanan memanfaatkan
teknik-teknik mikroskopis dan metode-metode pembiakan.Bermacam-macam media
selektif dan diferentsial diguakan secara ekstensif untuk memudahkan isolasi dan
penghitungan tipe-tipe mikroorganisme tertentu. Macam pemeriksaan yang dilakukan
ditentukan oleh tipe produk pangan yang akan diperiksa dan tujuan pemeriksaaan.
Berbagai prosedur dan teknik yang digunakan dalam pemeriksaan mikrobiologis
terhadap spesimen makanan disajikan secara skematis sebagai berikut.
a. Preparasi Sampel
12
Dalam praktikum ini, untuk sampel Es Teler, karena sampel dengan konsistensi
cair, dapat langsung dilakukan pengenceran. Kemudian, sampel Kue Sus dengan
konsistensi padat, digerus terlebih dahulu agar menjadi butiran-butiran sekecil
mungkin (menjadi suspensi) menggunakan mortal dan pestle, kemudian ditimbang
sesuai ukuran yang telah ditentukan dan kemudian dimasukkan ke dalam wadah
(tabung erlenmeyer). Serta untuk sampel sayuran (Daun Kemangi), preparasi sampel
dilakukan dengan membuat pola secara umum 2 x 3 cm pada daun sayuran yang
selanjutnya digunting dan dimasukkan ke dalam tabung berisi PZ steril.
b. Homogenisasi
Homogenisasi dilakukan untuk memperoleh penyebaran bakteri yang sebaik
mungkin dan merata.Sehingga meskipun bahan yang diperiksa sedikit, hasil
pemeriksaannya dapat mewakili keadaan sampel untuk keseluruhan. Homogenisasi
dalam praktikum ini dilakukan sebelum dan sesudah sampel ataupun hasil
pengenceran dipindahkan ke tabung/tempat lain.
c. Pengenceran
Sebelum ditanam pada media pembenihan, dilakukan pengenceran terhadap
sampel makanan dan minuman tersebut menggunakan PZ (Physiologic
Zoid).Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada
perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Dalam praktikum ini digunakan
perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga
pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran
sebelumnya. Pengenceran pertama dilakukan dengan mencampurkan 1 mL sampel
dengan 9 mL PZ (NaCl 0,85%). Kemudian hasil pengenceran ini dipipet 1 mL untuk
diencerkan lebih lanjut pada tabung berikutnya (pengenceran kedua).Cara tersebut
diulangi hingga pengenceran terakhir.Larutan PZ berperan sebagai penyangga pH
agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan.
d. Inokulasi (Penanaman)
Kuman pada Media NAP (Nutrient Agar Plate) dengan Metode Angka Lempeng
Total dan cara Metode Tuang Teknik Inokulasi (penanaman bakteri) merupakan
kegiatan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan
tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Medium yang baru harus nutrisi yang
berkembang biak dengan baik. Pada praktikum ini, alat yang akan digunakan
sebelumnya harus disterilisasi terlebih dahulu agar semua alat dan bahan yang akan
digunakan steril/tidak ada mikroorganisme penganggu sehingga tidak akan
mempengaruhi hasil pemeriksaan akhir. Sterilisasi adalah suatu proses untuk
mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda.
Teknik inokulasi yang dilakukan dalam praktikum ini, yaitu dengan metode
Angka Lempeng Total secara pour plate (cawan tuang). Metode Angka Lempeng
Total. Metode pour plate (cawan tuang) adalah teknik penanaman dengan cara
mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan
(agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau
di dalam agar. Media yang digunakan adalah media Nutrient Agar.Media Nutrient
Agar merupakan media pertumbuhan umum, media pemerkaya dan termasuk media
non-selektif. Artinya pada media Nutrient Agar, kuman apa saja dapat tumbuh dengan
bebas.
Metode ALT ini merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah
kuman dengan alasan sebagai berikut :
1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung
2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus.
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang
terbentuk mungkin berasal dari satu sel dengan penampakan pertumbuhan
spesifik.
14
Inokulasi dilakukan dengan cara memipet masing-masing 1 mL hasil pengenceran
ke dalam plate, kemudian dituangkan 15-20 mL media NAP (Nutrient Agar Plate).
Setelah itu, diputar-putar sehingga antara sampel dan media NA homogen dan bakteri
menyebar secara merata.Selain itu disiapkan pula media kontrol yang berfungsi
sebagai acuan. Pembuatan media kontrol diperlakukan sama seperti sampel, hanya
saja media kontrol terbuat dari campuran media NA dan larutan PZ (NaCl 0,85%).
Hal yang perlu diperhatikan dalam inokulasi kuman ini antara lain
Semua alat dan bahan yang akan digunakan harus dalam keadaan steril.
Dalam memipet dan pemindahan bakteri dikerjakan secara aseptis.
e. Inkubasi
Setelah penanaman bakteri pada media, kemudian diinkubasi pada inkubator pada
suhu 37C selama 1 x 24 jam untuk memberikan kesempatan kepada bakteri
memanfaatkan media untuk pertumbuhannya. Pada saat inkubasi, setiap sel
mikroorganisme hidup dalam susu kedelai dan bubur injin yang diperiksa akan
tumbuh menjadi satu koloni. Setelah diinkubasi, dilakukan penghitungan jumlah
koloni untuk memperkirakan jumlah mikroorganisme dalam sampel makanan dan
minuman tersebut.
15
Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.
Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidakdihitung.
Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.
Plate yang dihitung hanya plate yang mengandung 30-300 koloni.
Dalam 1 sampel yang diuji, hasil pemeriksaan angka bakteri pada pengenceran
yang berbeda akan menghasilkan jumlah koloni yang berbeda pula, namun jumlah bakteri
yang dihitung tetap sama/hamper sama (dikali dengan pengenceran). Sehingga untuk
menyatakan jumlah bakteri pada suatau sampel hanya dengan merata-ratakan jumlah
bakteri yang diperoleh pada tiap pengenceran.Namun hasil yang diperoleh pada
praktikum ini menunjukkan jumlah bakteri yang jauh berbeda untuk setiap pengenceran
yang dilakukan. Hal tersebut dapat terjadi akibat kesalahan selama bekerja, seperti kurang
aseptis, kurang teliti saat proses pengenceran, dan lain-lain yang dapat mempengaruhi.
IX. Kesimpulan
Berdasarkan hasil yang diperoleh pada praktikum Pemeriksaan Angka Bakteri pada
Makanan dan Minuman, maka dapat disimpulkan bahwa
a. Pada sampel Kue Sus ditemukan bakteri dengan jumlah 689.500 CFU / g sampel.
b. Pada sampel Es Teler ditemukan bakteri dengan jumlah 255.000 CFU / ml sampel.
Sehingga berdasarkan PEDOMAN KRITERIA CEMARAN PADA PANGAN SIAP
SAJI DAN PANGAN INDUSTRI RUMAH TANGGAsampel Es Teler yang termasuk
dalam Minuman Termasuk Es, jumlah bakterinya melebihi batas maksimum yaitu 1 x
105 koloni / ml sampel. Maka Es Teler tersebut tidak layak untuk dikonsumsi.
c. Pada sampel Daun Kemangi, ditemukan bakteri dengan jumlah 1.000 CFU / cm 2
sampel. Sehingga berdasarkan SNI 7388 : 2009, Batas maksimum cemaran
mikroba dalam pangansampel Daun Kemangi yang termasuk dalam Sayuran
Kering, jumlah bakterinya berada dibawah batas maksimum yaitu 1 x 10 5 koloni / g
sampel. Maka Daun Kemangi tersebut layak untuk dikonsumsi.
16