INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Diagnstico del dengue.

Rol del Laboratorio de
Salud Pblica en el Per
Lic. TM. Nancy Susy Merino Sarmiento
Laboratorio Metaxnicas Virales
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
 Flavivirus: Virus del Dengue
Virion Virion
intracelular extracelular
(inmaduro) (maduro)

40-50 nm
Dmero E

ARN +
E M
prM

Flaviviridae 70nm Nucleocpside

Flavivirus

DENV 1, 2, 3 y 4 Barros VE & Figueiredo LTM, 2004

Barros BE & Figueiredo. LTM, 2004

El genoma codifica los genes estructurales y no estructurales.
 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
Dengue: Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control, WHO/HTM/NTD/DEN/2009.1
PRUEBAS DISPONIBLES EN EL PAIS
Pruebas para muestras < = 5 das
Virolgicas: Aislamiento viral en lnea C6-36.
Moleculares: RT-PCR convencional y en tiempo real.
ELISA Antgeno NS1
Secuenciacin gentica (genotipos).
Pruebas para muestras >= 6 das
Serolgicas: in house
ELISA IgM Tariki para dengue (Prod. por el INS)
ELISA IgG de captura para dengue (Infeccin secundaria).
ELISA IgG Indirecta (Infeccin pasada).
 Ficha Clnica
Tipo de muestra y Obtencin de
muestras
Transporte y conservacin de M.
Tipo de prueba
 En vigilancia centinela:
En pacientes ambulatorios: Dos centros
En pacientes hospitalizados: Todo paciente
hospitalizado, debe tener diagnstico

- En brotes y/o epidemias: 30 a 50 sueros.

 Tiempo de
Mtodo de Muestra Conservacin
Obtencin de muestras Cantidad resultado en el
Diagnstico Biolgica y Transporte
Sistema NETLAB

Sangre.- A pacientes con Estril. Enviar

Anticuerpos: IgM, tiempo de enfermedad en cadena de
Suero 2 ml 3 das.
IgG igual o mayor a 6 das. fro 2 8 C

Sangre.- A pacientes con

Estril. Enviar 3 das para PCR y
un tiempo de enfermedad
Suero 2 ml. en cadena de hasta 30 das para
Deteccin del igual o menor a 5 das.
fro 2 8 C aislamiento viral.
antgeno Ag NS1, (perodo virmico)
deteccin de ARN,
aislamiento viral y Tejido.- Realizar la Estril. Enviar
tipificacin de los necropsia dentro las 24 sin 3 das para PCR y
serotipos. horas de fallecimiento Tejido 2 cm3 preservante y hasta 30 das para
(Tejido bazo, hgado y/o en cadena de aislamiento viral.
rin). fro 2 8 C

Enviar en
Tejido.- Realizar la formol al 10%
necropsia dentro de las 24 tamponado, en
horas de fallecimiento un volumen 10
Histopatologa e (Tejido bazo, hgado y/o veces del
inmunohistoqumic rin). Tejido 2cm3 volumen de la 3 das.
a. muestra, a
temperatura
ambiente.
ELISA CAPTURA IgM

ELISA CAPTURA IgM: Infeccin reciente

PERSONAL DEL CNSP Y CNPB
CONTROL DE REACTIVIDAD: LAB. DE MET. VIRALES-CNSP
 Resultados de Sen, Esp, IV, VPP, VPN eI Kappa
obtenidos mediante el programa Epidat.

DESCRIPCION Valor IC (95%)

Sensibilidad (%) 98.67 96.50 100.00

Especificidad (%) 94.62 90.35 98.88

ndice de validez (%) 96.79 94.54 99.03

Valor predictivo + (%) 95.48 91.89 99.08

Valor predictivo - (%) 98.40 95.80 100.00

 NMERO NMERO
GRUPOS POSITIVOS %
DIAS MUESTRAS
A 1-2 44 6 13.64%
B 3-4 38 12 30.77%
C 5-6 23 12 47.83%
D 7-8 13 13 100%
E 9-10 7 7 100%
F 11- a ms 12 12 100%
TOTAL 137 62

44% positividad en sueros de pacientes con < 5 das, porcentaje significativo como para
considerar la necesidad de buscar anticuerpos IgM aun en este periodo de la enfermedad,
dentro de la vigilancia del dengue.
ELISA CAPTURA IgG DENGUE

ELISA CAPTURA IgG: Infeccin

secundaria

ELISA INDIRECTA IgG: Infeccin

pasada
- ELISA de captura de IgG: INFECCIONES SECUNDARIAS.
- ELISA IgG Indirecta: DETECTA ANTICUERPOS DE MEMORIA.

Sensitivity and specificity of three ELISA-based assays for discriminating primary

from secondary acute dengue virus infection

Vanda Akico Ueda Fick de Souzaa, Adriana Fumie Tatenoa, Renato Reis Oliveiraa, Renan B.
Dominguesb, Evaldo Stanislau Arajoac, Gustavo W. Kusterb, Cludio Srgio Pannutia

OBJETIVO:
Evala tres mtodos para discriminar infeccion primaria de secundaria basada en ELISA
(ELISA IgG captura, IgM/IgG ratio e IgG titer)
 PRUEBA ELISA ANTIGENO NS1
Detecta antgeno NS1
Diagnostico temprano de dengue.
Suero de 1-5 das
Sensibilidad 93%
Especificidad 98% ??????

Sensibilidad (97.3%) en inf. aguda primaria

Sensibilidad (70.0%) en inf. aguda segundaria

VPP 100%
VPN 97.3%.

V. Kumarasamya, A.H. Abdul Wahaba, S.K. Chuab, Z. Hassana, Y.K. Chema, M. Mohamada and K.B. Chua.
Evaluation of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for laboratory diagnosis of acute dengue
virus infection. Journal of Virological Methods Volume 140, Issues 1-2, March 2007, Pages 75-79
 Sensibilidad ELISA NS1 Tiempo de Sensibilidad
100.00% n
100.00%
84.00%
enfermedad ELISA NS1
90.00%
80.00% 1er da 100.00% 4
70.00%
55.00% 56.00% 58.59% 2do da 55.00% 38
60.00%
50.00% 3er da 84.00% 48
37.04%
40.00% 4to da 56.00% 43
30.00%
20.00%
5to da 37.04% 37
10.00% TE 5das 58.59% 169
0.00%
* Comparado con la seroconversin de ELISA IgG
1er da 2do da 3er da 4to da 5to da TE 5das

Especificidad ELISA NS1 Tiempo de Especificidad

n
100.00%
100.00% 91.30% 91.55%
enfermedad ELISA NS1
88.89% 90.00%
90.00% 1er da 50.00% 4
80.00%
70.00%
2do da 100.00% 38
60.00% 50.00%
3er da 91.30% 48
50.00%
4to da 88.89% 43
40.00%
30.00% 5to da 90.00% 37
20.00% TE 5das 91.55% 169
10.00%
* Comparado con la seroconversin de ELISA IgG
0.00%
1er da 2do da 3er da 4to da 5to da TE 5das
 PRUEBA
AgNS1 AgNS1 + IgM/IgG
DIAGNSTICA

Estndar Diagnostic, INC

Sensibilidad 40.6% (31.7-49.5) 73.4% (65.4-81.5)

Especificidad 95.1% (89.8-100) 91.5% (84.8-98.1)

Pan Bio

Sensibilidad 42.1% (31.7-49.5) 74.2% (66.1-82.3)

Especificidad 95.1% (89.8-100) 79.2% (69.9-88.6)

Evaluacin de pruebas rpidas de deteccin NS1Ag, IgM e IgG

Deteccin IgA Anti-dengue

ASSURE Dengue IgA Rapid

99.4 sensibilidad en I. primaria
99.2 sensibilidad en I. secundaria.
99.2 Especificidad.
. INS: Evalua la utilidad de ELISA
como alternativa del Dx. Fase crtica.
 Cultivo celular
C6-36 (glndulas salivales LINEA C6-36 NORMAL
Aedes albopictus.

LINEA C6-36 CON EFECTO CITOPATICO

 Aislamiento del virus Dengue
Inmunofluorescencia Indirecta
Acs. Monoclonales especficos tipo
 RT- PCR

Diagnstico
Vigilancia
Epidemiologa Molecular
Estudios etiopatogenia
Vacunas
 RT-PCR EN DENGUE
RT PCR Dengue Multiplex

Sensibilidad: 98%
Especificidad: 98%
PCR EN TIEMPO REAL

Detecta
Cuantifica carga viral
Diagnstico Inmunohistoqumico en
muestras fallecidos FHD/SCD

Necrosis Focal Clulas Kupffer

 INTERPRETACION DE RESULTADOS DE
LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO
DE DENGUE
CASO CONFIRMADO

Resultado Positivo por RT-PCR.

Resultado Positivo de aislamiento viral.
Resultado Positivo a antgeno NS1.
Resultado Positivo de IgM en una sola muestra
Evidencia de seroconversin en IgG en muestras
pareadas.
 CUADRO DE RESULTADOS

PRUEBA RESULTADO INTERPRETACION OBSERVACION

CASO DE DENGUE (CON
ELISA NS1 1 -5 POSITIVO CLINICA) inespecifico: Pac. Enf. Autoinmune.
DIAS NEGATIVO NO DESCARTA CASO SE SOLICITA SEGUNDA MUESTRA
CASO DE DENGUE (CON
RT- PCR 1 - 5 POSITIVO CLINICA) Contaminacin
DIAS NEGATIVO NO DESCARTA CASO SE SOLICITA SEGUNDA MUESTRA
CASO DE DENGUE (CON inespecifico: Pac. Enf. Autoinmune,
ELISA IGM 6 -10 POSITIVO CLINICA) lept. Malaria
DIAS NEGATIVO NO DESCARTA CASO SE SOLICITA SEGUNDA MUESTRA

ELISA IGG 1 -5 POSITIVO INFECCION SECUNDARIA CON LA CLINICA Y PCR Y NS1

DIAS NEGATIVO INFECCION PRIMARIA

Lab. Arbovirus-INS
Ingresar el
nombre de
usuario y
contrasea.

y hacer click en
login
REPORTE DE RESULTADOS POR INTERNET
(NET LAB)
 RED DE LABORATORIOS PARA EL DIAGNSTICO DE DENGUE

Bagua Iquitos

Cajamarca
Tumbes

Piura
Tarapoto
Chiclayo

Pucallpa
La Libertad
Cusco
Huaraz

4 DISAS - LIMA Puerto Maldonado

Lima**
Huancayo Abancay

Huancavelica Puno

Ayacucho
1 LAB. DE REFERENCIA NACIONAL Arequipa ELISA (IgM y Ag.NS1)

24 LAB. DE REFERENCIA REGIONAL Tacna

RT-PCR
 LABORATORIOS CONCORDANCIA CONCORDANCIA
REGIONALES (%) 2010 (%) 2011
TUMBES 85 100
PIURA 100 70
LAMBAYEQUE 90 100
LA LIBERTAD 100 95
LIMA ESTE 95 95
LIMA CIUDAD 100 95
AMAZONAS-BAGUA 100 100
LORETO 100 100
UCAYALI 100 100
MADRE DE DIOS 90 100
JUNIN 90 100
SAN MARTIN 100 90
 LABORATORIOS % DE
PRUEBA
EVALUADOR CONCORDANCIA
ELISA IgM DENGUE
100
INSTITUTO DE MEDICINA
ELISA IgG DENGUE 100
TROPICAL -PEDRO KOURI -
CUBA RT-PCR DENGUE EN IMPLEMENTACION

INSTITUTO DE
ENFERMEDADES VIRALES
HUMANAS - ARGENTINA ELISA IGM HANTA 100
ELISA IgM
F.AMARILLA 100
INSTTUTO ROBERT KOSH- RT-PCR F.AMARILLA
ALEMANIS 100
ELISA IGM -CHIK 100
CDC-COLORADO RT-PCR - CHIK 100
Factores que contribuyen a la diversidad gentica del virus dengue
y dos consecuencias evolutivas posibles (Holmes y Burch, 2000)

Mutacin
Virus con amplio rango de
Recombinacin propiedades patognicas?
Flujo gentico Diversidad
Gentica
Hospederos susceptibles Seleccin de cepas para
incrementar
Poblacin reservorio de transmisibilidad (alta
monos? viremia) y virulencia?
 DENV-1, 5 genotipos (I, II, III, IV y V).

DENV-2, 5 genotipos (Amrica, Amrica/Asia, Asitico I,

Asitico II y Selvtico, el cual es exclusivo de primates no
humanos).

DENV-3, 4 genotipos (I, II, III, IV); algunas clasificaciones

incluyen el genotipo V.

DENV- 4, 4 genotipos (I, II, III y Selvtico, tambin exclusivo

de primates no humanos)
 Genotipos del DENV-2

0,02 GENOTIPO
ASIA I
GENOTIPO
100
100
ASIA II
GENOTIPO 100
SELVTICO
100
100 GENOTIPO
Cepa Asia P4-1407
AMRICA/ASIA
100
96
Cepa Australiana
GENOTIPO Cepa Asitica
Cepas Africanas AMRICA Cepas Asiticas
Cepa Libreville 2007
GENOTIPO
COSMOPLITA

Leroy EM, Nkoghe D, Ollomo B, Nze-Nkogue C, Becquart P, Grard G, Pourrut X, et al. Concurrent
chikungunya and dengue virus infections during simultaneous outbreaks, Gabon, 2007. Emerg Infect Dis
Vol. 15, No. 4, April 2009. Disponible en: http://www.cdc.gov/EID/content/15/4/591.htm
Las secuencias que obtuvimos se agrupan con el
genotipo Amrica-frica, siendo el primer serotipo
que reingreso al Per en 1,990

Se mantiene la circulacin del mismo genotipo

desde su ingreso en el ao 1,990.

Aunque se han establecidos clados distintos que

tienen correlacin con el tiempo y espacio, se
puede observar la circulacin de tres linajes.
Las secuencias que obtuvimos hasta el presente
corresponden a los genotipos Amrica que ingres a
Per en 1,995 y al genotipo Amrica-Asia que
ingreso en el 2,001.

Se evidencia la relacin del genotipo Amrica Asia

con la presencia de dengue grave.
rbol filogentico obtenido para la cepa DENV-2 Per/ 121776510/ 2010
mediante el mtodo de Maximum Likelihood
Se gener un rbol filogentico considerando las
secuencias obtenidas en el presente estudio y algunas
secuencias reportadas por otros pases.

Las secuencias que obtuvimos corresponden al DENV-3

genotipo III o INDIA.

Se observa que desde su ingreso a Per, este genotipo

presenta alta dispersin, formando linajes que se agrupan
segn los aos y rea geogrfica, respectivamente.

La presencia de este genotipo ha sido permanente a la

fecha y esta relacionado con casos de DH.
Para el anlisis tambin se consideraron secuencias
reportadas al GENBANK por diferentes pases a fin de
establecer la distribucin filogentica descritos por Rico-
Hesse et. al.

Tambin se gener un rbol filogentico considerando las

secuencias obtenidas en el presente estudio y algunas
secuencias reportadas por otros pases.

Las secuencias que obtuvimos corresponden al DENV-4

genotipo II o INDONESIA.
 Genotipos circulantes en Per
SEROTIPO GENOTIPO AO DE INGRESO PER
DENV-1 AMERICA-AFRICA 1990
DENV-2 AMERICA 1995
AMERICA-ASIA 2001
DENV-3 INDIA 2001
DENV-4 INDONESIA 2001

Tasa de incidencia acumulada de dengue y serotipos. Per 1990-2011*

110 Den 4
100
TIA x 100 000

Den 3
90
80 Den 2
70 Den 1
60
50
40
30
20
10
0
90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11
Ao
LINEAS DE INVESTIGACION EN DENGUE
Prevalencia de serotipos en la poblacin
Identificacin de genotipos
Diseo y estandarizacin de nuevas herramientas
diagnosticas
Implementacin del diagnstico diferencial
Dinmica de transmisin del dengue en las diferentes
regiones.
Evaluar e incorporar la IgA anti-dengue en suero saliva y
orina y comparar con la IgM.
Aplicar la relacin entre IgM/IgG especfica para la protena
E/M del virus del dengue para distinguir las infecciones
primarias de las secundarias.
Vigilancia de virus en vectores.
Laboratorio de Microbiologa y Biomedicina
Chorrillos, Lima
Investigar para proteger la salud
PREMIO A LA CREATIVIDAD EMPRESARIAL
MIEMBROS DEL LABORATORIO DE
METAXENICAS VIRALES
Marco
Enrique
Miguel Tomas
Dina

Susy Paquita Dana Noelia