Revista Microbiologia 2016 PDF

ISSN 2415-251X
Clinica de Enfermedades Infecciosas

Hospital Roosevelt
Revista de microbiologia Volumen No. 1
Enero - Marzo 2016

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
ISSN 2415-251X
Clinica de Enfermedades Infecciosas

Hospital Roosevelt
Revista de microbiologia Volumen No. 1
Enero - Marzo 2016
EDITOR DE LA REVISTA
Licda Maria Remey Gordillo

Coordinadora General Area de Microbiologia y Hospital Roosevelt
Dr. Carlos Meja Villatoro

Jefe de la Clnica de Enfermedades Infecciosas
Hospital Roosevelt
CONTRIBUCIONES
Autores:
Licda Maria Remey Gordillo

Licda. Julia Mirelia Cali Arriaga
Licda. Jackelyn Paola Tol Urizar
Licda. Alejandra Castillo
Licda. Veronica Itzep
Licda. Rosa Alvarez
Licda. Diana Baldizn
Licda. Margarita Boloix
Sr. Hctor Cat
Licda. Lis Jerez
Licda. Ana Luca Lemus
DIAGRAMACIN Y DISEO
Mellross Elswith Salazar Alvarez
Editorial
La Microbiologa Clnica tiene como objetivo principal establecer el agente causal de las infec-
ciones que afectan al hombre. El Diagnstico debe ser certero y oportuno, capaz de dirigir un
tratamiento adecuado que conlleve a la recuperacin del paciente. El logro del diagnstico se
basa en la estandarizacin adecuada de los procedimientos y el conocimiento y uso adecuado
de diferentes tecnologas dirigidas al tipo de microorganismo sospechoso.
En respuesta a las diversas necesidades se tom la iniciativa de actualizar a los profesionales de
diversas reas de la salud, mediante la informacin de temas bsicos a travs de un Diplomado
de Microbiologa Clnica en el cual se incluyeron temas de resistencia antimicrobiana, biologa
molecular, diagnstico y tratamiento de hongos sistmicos y tuberculosis con la participacin de
conferencistas expertos en los temas.
Entre las actividades que se realizaron en el Diplomado se tuvieron:
1. Conferencias tericas donde se presentaron y discutieron temas en aspectos generales y es-

pecficos sobre diagnstico, procedimientos estndar, tratamiento de infecciones causadas por
microorganismos bacterianos.
2. Investigacin sobre un tema especfico sobre resistencia antimicrobiana.
3. Elaboracin y presentacin de un manual de procedimientos estndar acorde a las necesi-

dades, capacidades y disponibilidad de recursos para el diagnstico bacteriano microbiolgico.
El Diplomado se desarroll en el Hospital Roosevelt con el apoyo del Programa de Postgrado y

Maestra de la Unidad de Enfermedades Infecciosas que funciona en Hospital Roosevelt desde
el ao 2004 y que es avalado por las autoridades docentes y administrativas del hospital Roose-
velt y de la Facultad de Medicina de la Universidad Francisco Marroqun. Tuvo una duracin de
6 meses.
Los principales objetivos especficos que se deseaba alcanzar fueron:
1. Asistir y fortalecer los conocimientos de los laboratoristas y mdicos de instituciones clnicas

pblicas y privadas sobre los principios y la prctica del diagnstico de microorganismos bacte-
rianos, pruebas y tratamiento antimicrobiano.
2. Conocer y aplicar los reportes de susceptibilidad correctos para guiar el tratamiento del pa-
ciente, logrando que los laboratorios radicados en distintos hospitales y a nivel comunitario sigan
con exactitud los mismos procedimientos de pruebas y de control de calidad.
3. Conocer y aplicar el manejo de bases de datos que permitan tener informacin que pueda
ser utilizada por especialistas en enfermedades infecciosas, epidemilogos y otros funcionarios
responsables de la salud para establecer patrones de resistencia a agentes antimicrobianos,
promoviendo el tratamiento ptimo e implementando medidas para limitar la difusin de organis-
mos resistentes en los hospitales y la comunidad.
Al Diplomado se inscribieron un total de 67 personas, 42 profesionales, de los cuales 4 eran M-

dicos y 38 Qumicos Bilogos, 20 eran estudiantes con pensum cerrado de la carrera de Qumica
Biolgica y 4 tcnicos de laboratorio clnico. Se retiraron 9 personas, quedando 58.
Dentro de la poblacin de profesionales Qumicos Bilogos se tuvo la participacin de profesio-
nales que provenan de Quetzaltenango, Solol, Chimaltenango, Antigua Guatemala, Amatitln,
Mazatenango. El 21% de toda la poblacin estaba trabajando en hospitales en la iniciativa pri-
vada.
De los 67 inscritos, completaron el diplomado 58 personas, 52 aprobaron el diplomado lo que

represent un 90% del total de asistentes, 6 no aprobaron, 10.3% y 9 se retiraron. El puntaje
ms alto fue de 89 puntos y el ms bajo de 61 puntos, con una media de 76 puntos. nicamente
7 profesionales obtuvieron puntajes por encima de los 80 puntos. El porcentaje de asistencia
fue del 86% en los 10 mdulos. El porcentaje de puntualidad fue del 48%.
El mdulo que present mayor dificultad fue el de Resistencia Antimicrobiana, lo que se reflej
en los puntajes obtenidos durante el segundo examen parcial que evalu este mdulo, nica-
mente el 50% de la poblacin aprob. Debido a la dificultad se tom la decisin para el II Diplo-
mado ampliar el mdulo y reforzar los temas sobre resistencia.
En general se puede concluir con los resultados obtenidos que los temas tratados fueron correc-
tamente orientados y asimilados por los participantes. Y la elaboracin de manuales contribuy
a una mejor estandarizacin microbiolgica en los lugares de trabajo de donde provenan los
profesionales que elaboraron los trabajos.
Los profesionales participantes completaron la asistencia a X mdulos con diferentes temas mi-
crobiolgicos y desarrollaron trabajos de investigacin. La siguiente edicin presenta los traba-
jos ms importantes referentes a la informacin que proveen. Son el reflejo del esfuerzo de sus
realizadores para proporcionar informacin estandarizada de procedimientos diarios que son
bsicos en el trabajo diario en Microbiologa. Representan un importante aporte en los temas
desarrollados y son herramientas fundamentales para los laboratorios que trabajan Microbiolo-
ga.
Licda. Maria Remei Gordillo

Dr. Carlos Mejia Villatoro
Manual de tinciones en Microbiologia Clinica -1-1-
Introduccin -1-1-
Generalidades -1-1-
Normas de seguridad en el laboratorio -1-1-

Preparacin, fijacin y coloracin de frotes -2-2-
Tinciones en Microbiologa Clnica -3-3-

Tinciones simples -3-3-
Tincin de Azul de Metileno de Loeffler -4-4-
Tincin de Azul de Lactofenol -4-4-
Tincin Naranja de Acridina -4-4-
Tincin de Negro de Clorazol -4-4-
KOH con Tinta Azul Parker -5-5-

Tinciones diferenciales -6-6-
Tincin de Gram -6-6-
Tincin de Wright -7-7-
Tincin de Giemsa -8-8-
Tincin de Ziehl-Neelsen -8-8-
Tincin de Kinyoun -10-10-
Tincin de Ziehl-Neelsen Modificado -11-11-
Tincin selectiva de esporas Wirtz-Conklin -11-11-
Tincin de cido Perydico de Schiff (PAS) -12-12-

Tinciones especiales -13-13-

Tinta China -13-13-
Tincin de Auramina-Rodamina -13-13-
Tincin Blanco de Calcofluor -14-14-
Tincin de Gomori-Grocott -14-14-
Referencias -16-16-
Manual de Microbiologia -16-16-
Introduccin -17-17-
Generalidades -17-17-
Normas Mnimas de Seguridad en el Laboratorio de Micro-

biologa -16-16-
Organizacin de rea de Trabajo -16-17-
Generalidades de la Estructura Bacteriana -18-18-
Bacterias Gram positivo -18-18-
Bacterias Gram negativo -19-19-
Tinciones Bsicas -19-19-
Tincin de Gram -19-19-
Principio -19-19-
Procedimiento de la Tincin de Gram -19-19-
Tincin Ziehl Neelsen -19-19-
Principio -19-19-
Procedimiento de Tincin de Ziehl Neelsen -20-20-
Tincin de Kinyoun -21-21-
Principio -21-21-
Procedimiento de Tincin Kinyoun -21-21-
-21-21-
Tincin Kinyoun Modificado
-21-21-
Principio
-21-21-
Procedimiento de Tincin Kinyoun Modificado
-21-21-
Observacin en Fresco
-21-21-
Principio -21-21-
Procedimiento de Observacin en Fresco -21-21-
Toma de Muestra y Procedimientos -21-21-
Orocultivo -21-21-
Propsito e importancia -21-22-
Recoleccin de la muestra y transporte -22-22-
Procedimiento -22-22-
Aislamiento Primario -22-22-
Identificacin Streptococcus pyogenes -22-22-
Procedimiento -22-23-
Cultivo de Garganta Especial -23-23-
Propsito -23-23-
Recoleccin de Muestra y Transporte -24-24-
Toma de muestra para Corynebacterium diphteriae -24-24-
Toma de Muestra para Neisseria meningitidis y Bordetella -24-24-
pertussis -24-24-
Aislamiento primario -25-25-
Corynebacterium diphteriae -25-25-
Neisseria meningitidis -25-25-
Bordetella pertussis -25-25-
-25-25-
Identificacin de principales Microorganismos
-25-25-
Corynebacterium diphtheriae
-25-25-
Neisseria Meningitidis
-25-25-
Bordetella pertussis
-25-25-
Hemocultivo y Mielocultivo -27-27-
Propsito -27-27-
Toma de muestra -27-27-
Procedimiento de incubacin -27-28-
Identificacin de principales microorganismos -28-29-
Lquido cefalorraqudeo y otros lquidos estriles -29-30-
Propsito -30-31-
Aislamiento Primario del Lquido Cefalorraqudeo u otros L-
quidos Estriles -31-a la-33-
Coprocultivo 33-34-
-34-34-
Propsito e Importancia
-34-34-
Salmonella sp
-34-34-
Shigella
-34-34-
Vibrio Cholerae
-34-34-
Procedimiento para aislar Salmonella sp, Shigella sp -35-36-
Procedimiento para aislamiento de Vibrio cholerae -35-36-
Identificacin de principales Microorganismo -37-37-
Pruebas Bioqumicas -37-38-
Identificacin de Salmonella sp -38-39-
Identificacin de Shigella sp -39-40-
Identificacin de Vibrio cholerae -40-41-
Urocultivo -41-41-
Recoleccin de la Muestra y Transporte -41-42-
Asilamiento primario -41-41-
Identificacin de principales microorganismo -42-42-
Escherichia coli -42-43-
Klebsiela pneumoniae -43-43-
Klebsiella oxytoca -44-44-
Proteus mirabilis -44-44-
Pseudomonas aeruginosa -44-44-
Secreciones Varias -45-45-
-45-45-
Secreciones de heridas y abscesos
-45-45-
Propsito e importancia
-45-45-
Recoleccin de la muestra y transporte
-45-45-
Toma de muestra de Herida
-45-45-
Toma de muestra de Absceso -45-45-
Toma de muestra en quemaduras -45-45-
Toma de muestra de ojo -45-45-
Toma de muestra de Odo -45-45-
Esquema de identificacin de Cocos Gram positivo -46-47-
Identificacin de Gram negativo Fermentadores Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae -47-47-
Identificacin de Gram Negativo no Fermentador Pseudo-
monas aeroginosa -47-47-
Secrecin Vaginal -47-47-
Propsito -47-47-
-48-48-
Identificacin de principales microorganismo
-48-48-
Identificacin presuntiva de N. gonorrhoeae
-48-48-
Identificacin de Gardnerella vaginalis
-49-49-
Identificacin de Streptococcus agalactiae
-49-49-
Identificacin de Candida albicans -49-49-
Esputo de cultivo bacteriano -49-49-
Propsito -50-50-
Realizacin del frote del Esputo -50-50-
Criterio de Murria -50-50-
Identificacin de Principales Microorganismo -51-51-
Identificacin de Streptococcus pneumoniae -51-51-
Identificacin de Haemophilus influenzae -51-51-
Anexos -51-51-
Prueba de Catalasa -52-52-
Prueba de Coagulasa -53-53-
Prueba de Manitol Sal -53-53-
Prueba de DNasa -53-53-
Prueba de Novobiocina -53-53-
Prueba de Bacitracina A -54-54-
Prueba de PRY (pirrolidonilarilamidasa) -54-54-
Prueba de CAMP -54-54-
Prueba de Hidrlisis de Hipurato -54-54-
-55-55-
Bilis Esculina
-55-55-
Crecimiento de NaCl 6.5%
-56-56-
Prueba de Sensibilidad a Optoquina
-56-56-
Solubilidad en Bilis
-56-56-
Prueba de Satelitismo -56-56-
Factor de Crecimiento XV -56-56-
Bibliografa -57-a la -59
Manual de Procedimientos Tamizaje, Aislamiento,
Identificacion y Sensibilidad de Micobacterias -60-60-
Introduccin -60-60-
Generalidades -61-61-
Tuberculosis pulmonar y tuberculosis extrapulmonar -61-62-
Niveles de laboratorio -62-62-
Nivel i -62-62-
Nivel ii -62-62-
Nivel iii -62-62-
Toma de muestra y procedimientos por tipo de muestra -63-63-
Muestras de orina -63-64-
Toma de muestra -64-64-
Chorro medio u orina al vuelo -64-64-
Sondas permanentes -64-64-
Puncin o aspirado suprapbico -64-64-
Catter -64-64-
Procesamiento de la muestra -64-64-
Requerimientos e instrucciones especiales de muestra de orina -64-64-
Preparacin de la muestra previo a la elaboracin de frotes -64-64-
Muestras de sangre y mdula sea -64-64-
Medio de cultivo para aislamiento de micobacterias de muestras de -65-65-
sangre y mdula sea
-65-66-
Toma de muestra de sangre y mdula sea
-66-66-
Precauciones para el uso de los frascos
-67-67-
Tratamiento de la muestra en el laboratorio
-67-67-
Preparacin de la muestra previo a la elaboracin de frotes -67-67-
Muestras de lquido cefalorraqudeo, lavados y otros lquidos corporales -67-68-
Toma de muestra para lquido cefalorraqudeo -68-68-
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra -68-68-
Preparacin de la muestra para la elaboracin de frotes -68-68-
Muestras de heces -68-69-
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la Muestra de
heces -69-69-
Preparacin de la muestra de heces para la elaboracin de frotes -69-69-
Muestras de biopsias y secreciones varias -70-70-
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra -70-70-
Preparacin de la muestra para la elaboracin de frotes -70-70-
muestras de esputo -70-71-
toma de muestra. -71-71-
Procedimiento para obtencin de la muestra. -71-71-
Procesamiento de la muestra de esputo --
Preparacin y observacin directa de una muestra 71-72-
Preparacin de un extendido -73-73-
Procedimientos de tincin alcohol-cido resistencia -73-73-
Coloracin de ziehl-neelsen: -73-74-
Coloracin de kinyoun: -74-74-
Interpretacin e informe de baciloscopas -75-75-
Pruebas de tamizaje -75-75-
Prueba de lam -75-75-
Genexpert -76-76-
-76-77-
Cultivo de micobacterias en lowenstein jensen
-77-79-
Muestras
-80-80-
Mtodos para decontaminacin de muestras.
Mtodo de n-acetil-l-cistena-hidrxido de sodio (nalc-naoh)
-81-82-
Mtodo del hidrxido de sodio -83-83-
Mtodo del cido oxlico -83- 84-
Mtodo mycoprep bbl (mtodo comercial) -85-85-
Inoculacin de tubo bactec mgit 960 (indicador de crecimiento de micobac- -86-86-
terias). -86- 87-
Mtodos de identificacin -89-89-
Test de cido nicotnico para tb bbl taxo (niacina) -89-92-
Tiras bbl taxo para prueba de nitritos -92-92-
Deteccin de antgeno mpt64 -92-93-
Identificacin de especies comunes de micobacterias (genotype mycobac-
terium cm) -94-107-
Identificacin de especies adicionales (genotype mycobacterium as) -108-113-
Identificacin del complejo mycobacterium tuberculosis (genotype mtbc) -114-118-
Sensibilidad antibitica -118-118-
Introduccin -118-118-
Mtodos de determinacin de sensibilidad antifmica -119-119-
Mtodo de las proporciones de canetii -119-125-
Mtodo de pcr: identificacin del complejo mycobacterium tuberculosis
(genotype mtbdrplus) -125-131-
Mtodo de sensibilidad antifmica por bactec mgit 960 sire kit -131-133-
Bibliografia -134-134-
Normas de Publicacin -135-139-
MANUAL DE TINCIONES
EN MICROBIOLOGA CLNICA
Julia Mirelia Cali Arriaga
Jackelyn Paola Tol Urizar
I. INTRODUCCIN
El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de Microbiologa,

con el fin de conocer todas las tcnicas de tinciones que sirven de base en las identificaciones
bacterianas, a la vez se hace mencin de las normas de bioseguridad tiles para mantener la se-
guridad dentro del laboratorio y de quienes laboran en el, as como tambin el procedimiento de
elaboracin de frotes y fijacin de los mismos. Adems est elaborado de tal manera que sea apli-
cable al funcionamiento actual de los diferentes procedimientos del Laboratorio en Microbiologa
II. GENERALIDADES 9. Conocer el manejo de todos los equipos y

reactivos a emplear antes de iniciar las activi-
A. Normas mnimas de seguridad dades o hacer uso de ellos. Si usted tiene al-
en el laboratorio de microbiologa guna duda, dirjase al supervisor o encargado
del rea.
1. Entrar al laboratorio en forma ordenada, 10. Mantener el rea de trabajo ordenada, li-
dejar las carteras, libros y otros objetos per- bre de libros, cuadernos u objetos personales,
sonales en el lugar que se les indique para exceptuando aquellos equipos y materiales
tal fin. necesarios para la realizacin del trabajo.
2. Llevar puesta la bata de laboratorio en 11. Tener cuidado cuando manipule el meche-
todo momento. La misma debe permanecer ro. Nunca debe dejar ste desatendido.
completamente cerrada. 12. Regresar los reactivos y equipos emplea-
3. Limpiar y desinfectar las superficies de dos (microscopio, mechero, etc.), limpios y de
trabajo, antes de comenzar y al finalizar el manera ordenada a su respectivo lugar una
trabajo. vez finalizada la actividad. Reporte cualquier
4. Lavar las manos con agua y jabn antes dao de los mismos al supervisor.
de realizar las actividades programadas, an- 13. Colocar los materiales de vidrio contami-
tes de salir del laboratorio y siempre despus nados en los recipientes dispuestos para tal
de manejar materiales que se sabe o se sos- fin. 14. No usar ningn reactivo que no est
pecha que son contaminantes. debidamente identificado, verificar las etique-
5. Llevar un calzado apropiado, preferible- tas de los mismos y estar seguro de cmo em-
mente cerrado y de suela antideslizante en plearlo.
las reas de laboratorio. 15. No devolver sustancias a sus envases ori-
6. Evitar llevar al laboratorio, accesorios que ginales.
podran ser fuente de contaminacin (por 16. Emplear pipeteador o bomba de vacio al
ejemplo joyas). medir lquidos. Est rigurosamente prohibido
7. Recoger el cabello largo. Evitar desplaza- pipetear con la boca.
mientos innecesarios, movimientos bruscos. 17. Realizar solamente aquellas actividades
Hablar slo lo indispensable. programadas y asignadas, no llevar a cabo
8. No comer, beber, fumar, almacenar comi- experimentos actividades no autorizadas.
da, objetos personales o utensilios, aplicarse 18. Reportar inmediatamente cualquier acci-
cosmticos ni ponerse o quitarse lentes de dente al supervisor o encargado del rea (de-
contacto en ningn rea del laboratorio. rrame de material contaminado, heridas, que-
maduras, etc.), ninguno puede ser catalogado
. como menor.
Pg. 1
Si el cromforo es un in positivo el coloran-
te es de tipo bsico, pero si la carga es ne-
19. Reducir al mnimo la formacin de aeroso- gativa ser de tipo cido. La mayora de las
les durante la realizacin de cualquier trabajo. bacterias son teidas por colorantes bsicos,
20. Extremar las precauciones cuando se que permeas la pared celular y se adhieren
utilicen agujas y jeringas para evitar la ino- por enlaces inicos dbiles a molculas con
culacin accidental y la generacin de ae- cargas negativas de la clula bacteriana. La
rosoles durante su manipulacin y desecho. tincin de las bacterias con azul de metileno,
21. Emplear tcnicas aspticas para el manejo es un ejemplo de tincin simple que facilita la
de cultivos de microorganismos (OMS, 2005) . observacin de forma, tamao y arreglo de
las clulas (Aquiahuatl, Prez, 2004).
B. Preparacin, fijacin y coloracin
de frotes 1. Preparacin de frote:
Debido al pequeo tamao de la mayora de a. Muestras slidas

microorganismos, se requiere de un microsco-
pio ptico, ya sea de campo claro o de campo Tomar la muestra con un hisopo, de preferen-
oscuro para hacer la descripcin morfolgica cia que el material no sea algodn, puede ser
de stos. El microscopio de uso ms comn es dacrn o alginato de calcio.
del de campo claro, en el que la observacin
de clulas cicas es limitada debido a que las Rodar el hisopo con la muestra sobre una l-
clulas son incoloras y permiten el paso de una mina portaobjetos limpia de manera que se
gran cantidad de luz (Aquiahuatl, Prez, 2004). obtenga una preparacin homognea (mis-
mo grueso aproximado en toda la lmina) de
La observacin de frotes teidos es ms reco- sta forma los colorantes penetran de mane-
mendable. El frote se prepara haciendo una ra adecuada en las estructuras presentes en
extensin de los microorganismos sobre una la muestra.
superficie transparente, en la cual se fijan y ti-
en los microorganismos. De acuerdo al nme- Dejar secar al aire o secar aplicando calor
ro de soluciones colorantes y a los objetivos de suave debajo de la lmina portaobjetos sin
estudio se pueden realizar diferentes tipos de quemar la muestra (Gordillo, 2005).
tinciones como son: simples, diferenciales y es-
peciales (Aquiahuatl, Prez, 2004). b. Muestras lquidas
Los frotes de cultivos lquidos se deberan fijar
con alcohol para evitar residuos del medio, que Tomar una pequea porcin del lquido ya
al quemarse darn interferencias en las obser- sea con pipeta pasteur estril, asa en argolla
vaciones y los de colonias de medios slidos flameada, asa estril descartable. Colocar en
se fijan generalmente con calor. Despus de la lmina, NO restregar la muestra.
la fijacin, los frote son teidos con diferentes
colorantes sintticos derivados de anilina en su Dejar secar al aire o secar aplicando calor
mayora (Aquiahuatl, Prez, 2004). suave debajo de la lmina portaobjetos sin
quemar la muestra (Gordillo, 2005).
Los colorantes ms utilizados son sales for- 1) Fijacin del frote
madas por iones coloridos cargados co-
nocidos como cromforos. Por ejemplo: Fijar los frotes de cultivos lquidos con dos
gotas de metanos o etanol absoluto y dejar
secar al aire (hacer esto en zonas alejadas
del mechero).
Pg. 2
Este es un colorante catinico y se combi-
na fuertemente con los componentes celula-
Los frotes de cultivos slidos, completamente res cargados negativamente, con los cidos
secos se fijarn con calor. Para esto se debe nuclicos y los polisacridos cidos (Kone-
pasar la lmina rpidamente 2 3 veces en el man, Allen, Janda, Procop, Schreckenberger,
interior de la parte amarilla de la flama del me- Woods, 2008).
chero, evitando el sobrecalentamiento. Dejar
enfriar a hasta alcanzar temperatura ambien- b. Materiales y Reactivos
te (Aquiahuatl, Prez, 2004). Azul de metileno
Alcohol etlico 95%
Incinerador, mechero Bunsen o de alco-
hol
Pinzas
Portaobjetos
Cultivos bacterianos de 24 horas o mues-
tra biolgica
Microscopio
Aceite de inmersin
Soporte de Tinciones
Goteros
Agua desmineralizada
Cronmetro
c. Procedimiento
Extender la muestra en un portaobjetos
limpio y fijar la muestra.
Cubrir la extensin con azul de metileno
de Loeffler durante 1-2 minutos
Retirar exceso de colorante y lavar con
abundante agua desmineralizada.
Figura 1. Preparacin y fijacin de frotes bacteria- Dejar secar a temperatura ambiente.
nos a partir de cultivos slidos y lquidos.
d. Resultados
III. TINCIONES EN MICROBIOLOGA
CLNICA
A. Tinciones simples
Son aquellas en donde se utiliza un solo colo-
rante, es simple y fcil su realizacin.
1. Tincin de Azul de Metileno de

Loeffler
a. Principio
Es una tincin simple utilizada para una gran Figura 2. Clulas epiteliales ncleos
variedad de microorganismos, sin embargo teidos de azul oscuro y citoplasma
su uso es especfico para detectar bacterias azul plido, bacterias pequeas azu-
en frotes de lquido cefalorraqudeo en casos les apenas visibles (100X).
de sospecha de meningitis bacteriana.
Pg. 3
d. Resultados
2. Tincin de Azul de Lactofenol
a. Principio
La tincin de Azul de lactofenol se emplea
para observar hongos. Es una tincin simple
(un slo colorante) y como tal est basada en
la afinidad del colorante por componentes de
las clulas, en este caso por las estructuras
fngicas.El azul de lactofenol tiene tres carac-
tersticas que lo hacen especial para obser-
var dichas estructuras en los hongos del tipo
moho obtenidos en los cultivos por aislamiento. Figura 3. Estructuras fngicas de coloracin azul.
El fenol destruye la flora acompaante (algu- 3. Tincin Naranja de Acridina

nas veces en los cultivos, juntos a los hongos
pueden crecer colonias de bacterias). El ci- a. Principio
do lctico conserva las estructuras fngicas al El fluorocromo naranja de acridina se une al
crear, por decirlo de algn modo, una pelcula cido nucledo ya sea en su forma nativa o
que las protege provocado por un cambio de desnaturalizada. En algunas preparaciones
gradiente osmtico entre el interior y el exterior de naranja de acridina, el color de la fluores-
de dicha estructura. El azul de algodn tiene la cencia puede variar, dependiendo del pH y de
capacidad de adherirse a las hifas y conidios la concentracin. A pH neutro las bacterias,
de los hongos microscpicos (Garca, Beltran, hongos y material celular se tien de naran-
Guzmn, Len, Arredondo y Fonseca. 2001). ja rojizo, pero a pH cido las bacterias y los
hongos mantienen su color naranja rojizo, pero
b. Materiales y Reactivos el material de fondo se tie de amarillo ver-
Solucin de azul de lactofenol doso. Se utiliza para la deteccin de hongos
Cultivo a evaluar y bacterias en muestras clnicas principalmen-
Asas te (Flores, Albarado, Thomas, Lobo. 2008).
Portaobjetos
Cubreobjetos b. Materiales y Reactivos
Microscopio
Solucin de naranja de acridina 0.7% (na-
Aceite de inmersin ranja de acridina doble sal, buffer de aceta-
Mechero tos pH:4,0)
Agua salina fisiolgica I ncinerador, mechero Bunsen o de alcohol
Pinzas
c. Procedimiento Portaobjetos
Cultivos bacterianos de 24 horas o mues-
Colocar una gota de agua salina fisiolgica tra biolgica
sobre el portaobjetos. Microscopio de epifluorescencia
Con el asa picar el cultivo y expandir por Soporte de Tinciones
encima de la gota de agua salina fisiolgica, Goteros
hasta que no se seque. Agua desmineralizada
Despus seca la muestra, tomar una gota Cronmetro
de azul de lactofenol y se aade sobre la
muestra. c. Procedimiento
Se cubre la muestra con el cubreobjetos Se cubrir la lmina con la solucin de
Observar en el microscopio. naranja de acridina por dos minutos.
Procurar que no queden burbujas de aire Lavar con agua de chorro abundante.
en la preparacin, ya que sino lo que se ob- Dejar secar al aire para su posterior
servara mayoritariamente sern las burbu- observacin
jas.
Pg. 4
aproximadamente por dos minutos.
Observar al microscopio en los objetivos de
d. Resultados 10X y 40X.
Las lminas deben enfocarse utilizando un mi-
croscopio de epifluorescencia, utilizando filtro d. Resultados
azul o amarillo estndar. La coloracin observada es negro con diferente
intensidad segn el grosor de la quitina.
Figura 4. Tincin de ascosporas.

Figura 5. Examen directo con negro de clorazol se
4. Tincin de Negro de Clorazol observa parnquima y estructuras fngicas de menos
tamao e intensidad (40X).
a. Principio
El colorante negro de clorazol permite visualizar 5. KOH con Tinta Azul Parker
rpida y con claridad las estructuras fngicas,
unindose a la quitina, sin embargo, debe te- a. Principio
nerse especial cuidado ya que el reactivo se de- La bsqueda de estructuras fngicas utilizando
grada con la luz. Es ideal para coloraciones en hidrxido de potasio como
fresco y es necesario apoyarse en el hidrxido aclarante de la queratina es un mtodo sencillo,
de potasio (KOH) para la eliminacin de la que- pero este mtodo clsico ha sido mejorado con
ratina presente en la muestra (Arreaza, 2008). el uso de tinta azul Parker lo cual colorea el fon-
do de la tincin con la estructura fngica y las
b. Materiales y Reactivos contrasta para facilitar su visualizacin (Prez,
Negro de clorazol Weiss, Villanueva, s.f.).
Dimetil sulfoxido (DMSO) b. Materiales y Reactivos
KOH 40% KOH/Tinta Parker relacin 1.1
Portaobjetos Portaobjetos
Cubreobjetos Cubreobjetos
Bistur Bistur
Muestra biolgica Muestra biolgica
Microscopio Microscopio
Goteros Goteros
Agua desmineralzada Agua desmineralizada
Cronmetro
c. Procedimiento
Tomar una porcin pequea de la muestra c Procedimiento
(si es necesario triturar con un bistur las es- Tomar una porcin pequea de la muestra
camas) y colocar en un portaobjetos. (si es necesario triturar con un bistur las es-
Agregar una gota de la solucin de negro de camas) y colocar en un portaobjetos.
clorazol. Agregar una gota de KOH 20% preparado
Colocar el material con una lmina cubre con tinta azul Parker.
objetos y dejar incorporarse en la muestra
Pg. 5
d. Resultados Portaobjetos
Cultivos bacterianos de 24 horas
Palillos
Microscopio
Aceite de inmersin
Goteros
Agua destilada
Solucin de cristal Violeta
Lugol
Safranina
Figura 6. Examen directo de piel con KOH 20% y tinta Etanol 95%
azul Parker, hifas segmentadas y ramificadas dicot- Cronmetro
micamente
c. Procedimiento
B. Tinciones diferenciales
Cubrir el frote con Cristal Violeta durante 3
min.
Son aquellas donde se utilizan dos o ms co-
Retirar el colorante mediante un suave la-
lorantes y en contaste permite la diferenciacin
vado con agua, deslizando el agua sobre el
del microorganismo o la visualizacin de la es-
portaobjetos, para no desprender la muestra.
tructura deseada.
Cubrir ahora con Lugol durante 1 min., rea-
lizar otro lavado suave. Todas las clulas se
1. Tincin de Gram
teirn de violeta.
Agregar unas gotas de etanol 95%, desli-
a. Principio
zndolo por el portaobjetos, hasta que las
De gran importancia en Microbiologa porque
gotas que salen no tengan casi color. Las c-
permite diferenciar dos grandes grupos de bac-
lulas gram- pierden el colorante violeta y que-
terias (gram positivo y gram negativo), segn
darn incoloras. Las gram + seguiran violeta.
se comporten ante esta tincin. El fundamen-
Aadir una el colorante safranina (colorante
to radica en la diferente estructura de la pared
de contraste) por 2 min.
celular de ambos grupos: las bacterias gram
Lavar el colorante con agua. Este coloran-
positivo tienen una gruesa capa de peptidogli-
te slo entrar en las bacterias gram , que
cano en su pared, mientras que las bacterias
quedarn rojas. Las gram + seguirn violetas.
gram negativo tienen una capa de peptidogli-
Secar las preparaciones sobre papel de fil-
cano ms fina y una capa lipopolisacardica
tro.
externa. Tras la tincin con el primer colorante
Observarlas al microscopio utilizando el ob-
(Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol
jetivo de inmersin
que arrastrar al colorante slo en las bacte-
rias gram negativo, mientras que en las bacte- d. Resultados
rias gram positivo el colorante queda retenido
y permanecern azules. Las gram negativo se
teirn despus con un colorante de contras-
te (safranina) para que puedan observarse, de
color rosado al microscopio (Lpez-Jcome y
otros, 2014).
b. Materiales y Reactivos
Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
Asa de Siembra en argolla Figura 7. Se observa cocos gram negativo de color rojo por la
safranina y bacilos gram positivo de color morado por el cristal
Pinzas
violeta.
Pg. 6
bulos sanguneos. El colorante deber cubrir
completamente el portaobjetos, pero no debe
2. Tincin de Wright derramarse por los bordes. Deber agregar-
a. Principio se una cantidad adicional si ste se comienza
Esta tincin tiene diversos usos en microbio- a evaporar.
loga; en la parasitologa, se le emplea en la Agregar directamente al colorante un volu-
bsqueda de hematozoarios como Plasmodium men igual de amortiguador de Wright, para
spp. El reactivo de Wright est compuesto por evitar la coloracin dbil. Esperar la forma-
eosina y azul de metileno, cuando ste se oxida cin de brillo metlico. Puede usarse de igual
se conoce como azur B a una concentracin de manera agua desmineralizada. Dejar actuar
0.8 g/L empleando como solvente alcohol met- de 10-15 minutos.
lico. La eosina es un colorante cido que tiene Lavar con agua en el chorro cuidadosamen-
afinidad por componentes alcalinos. La eosina Y te hasta que la extensin presente un aspec-
es la ms utilizada en procedimientos rutinarios. to rosado al examinarlo a simple vista.
Es un compuesto cido cuya propiedad est ba- Limpiar el dorso del portaobjetos con una
sada en su polaridad negativa, lo que le permite gasa o algodn humedecido en alcohol para
enlazarse con constituyentes celulares de carga eliminar cualquier resto de colorante.
positiva; por esta razn, colorea componentes Secar al aire y observar con el microscopio
citoplasmticos y se les conoce como acidfilos. con el objetivo de inmersin
La tonalidad resultante de la tincin con eosina
es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo d. Resultados
intenso en el caso de los eritrocitos. El tpico co- Los eritrocitos se observarn de color na-
lor de los ncleos celulares, mayoritariamente ranja o rosado.
morado, se basa en la interaccin molecular en- El citoplasma de los monocitos presentarn
tre eosina y un complejo azul de metileno-DNA. una tonalidad azul griscea con grnulo roji-
La intensidad de la coloracin depende del con- zos bastante finos y sus vacuolas caracters-
tenido de azur B y de la relacin con la eosina ticas. El citoplasma de los linfocitos presenta-
amarilla (Ortega, Garibaldi. 2009) r varias tonalidades azules.
Los ncleos de los linfocitos y neutrfilos
b. Materiales y Reactivos aparecern de color prpura oscuro. Los n-
Alcohol 96% cleos de los monocitos de color prpura algo
Alcohol Metlico ms claros (lila).
Portaobjetos Los grnulos de los eosinfilos son de color
Wright-Giemsa Stain, Modified rojo-anaranjado intenso. Los grnulos de los
Cubetas para tincin basfilos prpura azulado muy oscuro. Los
Pizetas con agua desmineralizada grnulos de los neutrfilos se aprecian de co-
Toalla de papel lor lila, bastante finos.
Guantes Las plaquetas toman coloracin violeta o
Microscopio prpura.
Libreta
Contador celular
Cronmetro
c. Procedimiento
Colocar el frote secado al aire sobre una
rejilla o cubeta de tincin con el frote hacia
arriba
Figura 8. Frote perifrico con parsitos intracelulares, teidos
Cubrir completamente el portaobjetos con el de color violeta
colorante de Wright gota a gota.
Dejarlo que permanezca en el frote aproxi-
madamente de 5-8 minutos, para fijar los gl-
Pg. 7
eliminar cualquier resto de colorante.
Secar al aire y observar con el microscopio
3. Tincin de Giemsa con el objetivo de inmersin.
a. Principio d. Resultados
Es la segunda coloracin en uso, luego de la Los ncleos celulares se tornan violeta in-
tincin de Wright, y en importancia de las mez- tenso.
clas de Romanowsky. Es quizs la mejor mo- Es frecuente encontrar en el mtodo de
dificacin de este tipo de coloraciones para Giemsa que la granulacin eosinfila no
descubrir parsitos en la sangre, como en el presenta la tonalidad rojo-anaranjada ca-
caso de malaria (Plasmodium spp.) y tripano- racterstica sino que presenta una tonalidad
somiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de pardo rojizo. Esta dificultad puede prevenir-
Giemsa tambin da excelentes resultados para se aadiendo una gota de fucsina fenicada
la tincin rutinaria de frotes sanguneos. Cuan- por cada 10ml de alcohol metlico utilizado.
do se va a teir con este colorante, debe fijarse Las granulaciones neutrfilas (lila) y los
primero la muestra con metanol absoluto por un hemates (rojo plido) se tien mal; sin
tiempo mnimo de tres minutos (cuando la pre- embargo, esta coloracin permite diferen-
paracin no incluye metanol). El colorante en ciar algunas formas de metamielocitos que
solucin nunca se utiliza de manera directa, por pueden ser confundidos con los monocitos,
lo que se debe diluir con la solucin amortigua- pues el protoplasma de los monocitos que-
dora en una proporcin de 1:10 1:20 y el tiem- da de color azulado y el de los metamieloci-
po de coloracin podr ser de 10 20 minutos, tos de color rosa.
respectivamente (Ortega, Garibaldi. 2009). El citoplasma de los linfocitos presenta
una tonalidad azul definida y sus ncleos
b. Materiales y Reactivos violetas de intensidad variable.
Los grnulos basfilos y las plaquetas se
Colorante de Giemsa (constituido por una tien de color azul, no obstante stas lti-
mezcla de azul de metileno, eosina y varios mas presentan corpsculos violetas inter-
azures en dilucin acuosa). nos.
Pinzas
Portaobjetos
Muestra biolgica
Microscopio
Aceite de inmersin
Goteros
Cronmetro
Figura 9. Frote perifrico con clulas sanguneas de
c. Procedimiento color violeta y eritrocitos de color rosado a rojo.
Sumergir el frote verticalmente en una solu-
cin de Giemsa preparada temporalmente a 4. Tincin de Ziehl-Neelsen
partir de 1 volumen de la solucin colorante
ms 9 volmenes de solucin tampn (pBs, a. Principio
pH 6.8) o bien en agua desmineralizada. La tincin de Ziehl-Neelsen (Z-N) fue desarrolla-
Esperar durante 10-20 minutos. da inicialmente por Paul Ehrlich para poner de
Lavar el frote con abundante agua, directa- manifiesto la presencia de los bacilos causan-
mente del chorro. tes de la tuberculosis en muestras clnicas de
Limpiar el dorso del portaobjetos con una pacientes. Esta tcnica es capaz de diferenciar
gasa o algodn humedecido en alcohol para los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).
Pg. 8
do con fucsina bsica fenicada recin filtrada.
Dispensar el colorante con suavidad, sin sal-
La tcnica de Z-N fuerza la penetracin de la picar y sin tocar con el gotero o con el embu-
fucsina bsica en la pared celular mediante la do los extendidos.
accin combinada del fenol y el calor, que au- Con la llama de un hisopo embebido en
mentan la fluidez de la capa de cidos micli- alcohol calentar suavemente por debajo de
cos: el calor derrite el componente ceroso y el los extendidos, con movimientos de vaivn,
fenol acta a modo de disolvente, permitiendo el hasta que observe que se desprenden los
paso del colorante bsico que se une a los ci- primeros vapores blancos. No calentar con
dos miclicos con carga negativa. Cuando cesa mechero.
la aplicacin de calor y/o se elimina el exceso En caso de derrame del colorante, reponer
de fenol mediante un lavado con agua, la pared la fucsina, no dejar secar el preparado.
recupera su consistencia cerosa, pero las mol- En el trmino de aproximadamente cinco
culas de fucsina quedan atrapadas en su espe- minutos calentar tres veces hasta emisin de
sor. Con la coloracin de Z-N se observan como vapores; esto es suficiente para que la fucsi-
bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo na penetre adecuadamente en el bacilo y se
fucsia, destacndose claramente contra el fon- fije a sus lpidos. No hervir la fucsina porque
do azul (Lpez y otros, 2014). la pared de los bacilos puede destruirse y co-
lorearse mal.
b. Materiales y Reactivos Con una pinza, levantar cuidadosamente la
Azul de metileno lmina portaobjetos desde el extremo ms
Alcohol cido cercano al operador. Enjuagar con abundan-
Fucsina te agua a baja presin, con un frasco o un
Mechero grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la
Portaobjetos superficie eliminando totalmente la solucin
Cubetas para tincin de fucsina. Girar el extendido y lavar con cui-
Pizetas con agua destilada dado tambin la parte posterior.
Toalla de papel Inclinar el portaobjetos para eliminar el ex-
Guantes ceso de agua y as evitar diluir los reactivos
Microscopio que se utilizarn a continuacin.
Libreta
Cronmetro 2) Decoloracin
Cubrir la totalidad del extendido con solu-
c. Procedimiento cin decolorante y dejar actuar aproximada-
mente 3 minutos.
1) Coloracin Enjuagar con abundante agua a baja pre-
Disponer dos varillas de vidrio en forma pa- sin.
ralela, a una distancia de aproximadamente Verificar que el extendido se ha decolora-
5 cm entre una y otra, una sobre un soporte do (las partes ms gruesas del extendido a lo
dentro del lavabo/pileta de coloracin. sumo conservan un leve tinte rosado). Si se
Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para observan cmulos rojos o coloracin rosada
las tinciones a realizar en la jornada. Si el n- intensa, volver a cubrir con solucin decolo-
mero de baciloscopia a colorear es pequeo, rante, dejarla actuar entre uno y tres minutos
se puede filtrar la fucsina directamente cuan- y enjuagar nuevamente.
do se la deposita sobre el extendido a travs Eliminar el exceso de agua inclinando el
de un pequeo embudo con papel de filtro. portaobjetos
Colocar sobre el soporte las lminas fijadas 3) Coloracin de fondo
conservando el orden numrico con el exten- Cubrir todo el extendido con solucin de
dido hacia arriba y manteniendo una separa- azul de metileno.
cin de al menos 1cm entre ellas. Dejar actuar durante un minuto.
Cubrir totalmente la superficie del extendi-
Pg. 09
croscopio, un manchado diapositivas Kinyoun
mostrar bacilos como organismos rojos y no
Enjuagar las lminas en ambas caras con cido-rpido como el azul. Se basa en el com-
agua a baja presin y limpiar parte inferior portamiento cido-resistente de la cubierta de
con un algodn si ha quedado coloreada. algunos parsitos como Isospora y Cryptospo-
Observar si las lminas conservan la nu- ridium, los cuales se tien de rojo y destacan
meracin clara y visible. Si no es as volver a sobre un fondo verde o azul, dependiendo del
numerarlas. colorante de contraste usado (Ortigoza Gutie-
Dejar secar las lminas a temperatura am- rrez, y Cruz Aguilar, s.f.).
biente, apoyndolas en posicin vertical en
un soporte sobre un papel absorbente. No b. Materiales y Reactivos
apoyar papel absorbente sobre el extendido.. Fucsina fenicada
Verde de malaquita o Azul de metileno
d. Resultados Alcohol metlico
Alcohol etlico
Alcohol cido
Aceite de inmersin
Portaobjetos
Puente de tincin
Microscopio
c Procedimiento
Realizar un frote de la muestra.
Dejar secar perfectamente.
Cubrir las gotas con unas gotas de alcohol
metlico y dejar que seque.
Cubrir la preparacin con fucsina fenicada
durante 5 mins.
Lavar con alcohol cido durante 3 min.
Figura 10. Se observa las bacterias alcohol cido re- Enjuagar con agua corriente
sistentes (BAAR) de color rojo fucsia y el resto de mi- Coloracin de contraste, agregar verde de
croorganismos y dems componentes del campo de
malaquita o azul de metileno dejar actuar du-
color azul.
rante 1 min.
Lavar con agua corriente y dejar secar.
5. Tincin de Kinyoun
Observar con objetivo de inmersin.
a. Principio
d. Resultados
El Kinyoun mancha es un mtodo para teir mi-
croorganismos resistentes a los cidos, es-
pecficamente Mycobacterium y Nocardia. El
procedimiento para la coloracin de Kinyoun
es similar a la tincin de Ziehl-Neelsen, pero
no implica el calentamiento de las diapositivas
siendo stained.1 El mtodo de tincin de Kin-
youn utiliza carbolfucsina como una mancha
principal, seguido de decoloracin con una so-
lucin de cido-alcohol y azul de metileno como
Figura 11. Se observan los BAAR de color rojo, las
contrateir. Kinyoun carbolfuschsin tiene una dems estructuras se tien del color del colorante de
mayor concentracin de fenol y fucsina bsica contraste en este caso verde de malaquita.
y no requiere de calefaccin con el fin de man-
char properly.1 Cuando se observa bajo un mi-
Pg. 10
Cubrir la lmina con colorante azul de meti-
leno por 30 segundos.
6. Tincin de Ziehl-Neelsen Modificado Lavar el exceso de colorante con abundante
agua del chorro.
a. Principio Dejar secar a temperatura ambiente y ob-
Esta tincin es til para visualizar quistes de servar al microscopio.
protozoos intestinales que tienen la propiedad
de ser cido-alcohol resistente (AAR). Cryptos- d. Resultados
poridium, Cyclospora e Isospora suelen produ-
cir diarrea persistente, sobre todo en pacientes
inmunocomprometidos o con infeccin por el
VIH.
La tcnica de Ziehl-Neelsen modificado fuerza

la penetracin de la fucsina fenicada en la pa-
red celular mediante la accin combinada del
fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la
capa de cidos miclicos. Con el lavado con
agua, la pared recupera su consistencia cero-
Figura 12. Se observa Quistes de Cryptosporidium
sa, pero el colorante fucsina queda dentro del (AAR) de color rojo fucsia con contraste azul en el fon-
parsito y este se destaca en contraste al fondo do.
azul (EHAS, 2012).
7. Tincin selectiva de esporas Wirtz-
b. Materiales y Reactivos Conklin
Carbol fucsina (fucsina fenicada)
Azul de metileno a. Principio
Alcohol-cido La produccin de endosporas bacterianas es
Mechero una forma de resistencia de algunos gneros de
Portaobjetos bacterias gram positivas, debido a la ubicacin
Cubetas para tincin intracelular las esporas no se tien convencio-
Pizetas con agua destilada nalmente. Por esta razn se utiliza la tincin de
Toalla de papel Wirtz-Conklin , en donde los microorganismos
Guantes son teidos en caliente con el colorante verde
Microscopio de malaquita y que el calor aumenta la permea-
Libreta bilidad de la membrana bacteriana y de la espo-
Cronmetro ra, posterior a esto se realiza una decoloracin
a travs del lavado con abundante agua y los
c. Procedimiento extremos de la bacteria son teidos posterior-
En una lmina portaobjetos hacer un exten- mente con el colorante de contraste safranina
dido delgado de la muestra de heces, dejar (Vzquez, Martn, Siloniz, Serrano, 2010).
secar a temperatura ambiente y fijar la mues-
tra con calor pasando dos o tres veces por b. Materiales y Reactivos
mechero. Verde de malaquita
Cubrir la lmina con colorante carbol fucsina Safranina
y aplicar calor hasta la emisin de vapores Etanol 95%
y mantener por 5 minutos, evitando la ebulli- Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
cin del colorante. Pinzas
Lavar el exceso con agua del chorro. Portaobjetos
Decolorar con alcohol-cido durante 20-30 Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra
segundos. biolgica
Lavar con abundante agua del chorro. Microscopio
Pg. 11
tincin es un mtodo qumico muy utilizado en
histologa y permite la deteccin de hongos en
Aceite de inmersin muestras de tejidos (Pontn, Llovo, 2007).
Goteros b. Materiales y Reactivos
Agua desmineralizada Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
Cronmetro Pinzas
Portaobjetos
c. Procedimiento Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra
Fijar la muestra en una lmina portaobjetos. biolgica
Cubrir la lmina con colorante verde de Microscopio
malaquita y aplicar calor hasta la emisin de Aceite de inmersin
vapores y mantener por 5 minutos. Soporte de Tinciones
Lavar el exceso con agua del chorro. Goteros
Cubrir con la lmina con colorante safrani- Agua desmineralizada
na por 1 minuto. Cronmetro
Lavar el exceso de colorante con abundan- cido peridico
te agua del chorro. Reactivo de Schiff
Dejar secar a temperatura ambiente y ob-
servar al microscopio. c. Procedimiento
Cubrir el material fijado en la lmina con
d. Resultados acido peryodico al 0,5% durante 5 minutos.
Lavar con agua destilada.
Agregar el reactivo de Schiff. 20 minutos.
Lavar con agua del chorro.
Dejar secar al aire para su posterior obser-
vacin
d. Resultados
Figura 13. Tincin de esporas en Bacillus subtilis, la

flecha indica la espora teida en verde. Microscopia
de campo claro 100X.
8. Tincin de cido Perydico de Schi-

ff (PAS) Figura 14. Se observa dentro del tejido, la presencia
de levaduras de Candida spp.
a. Principio
Se realiza un tratamiento al material con cido C. Tinciones Especiales
periydico 0,5%, el cual oxida los 1,2-glicoles Se basan en el hecho que distintas estructuras
formndose grupos aldehdos en los glucanos y celulares tienen distinta composicin qumica,
mananos de las paredes celulares de hongos, de modo que se tien selectivamente con cier-
con el reactivo de Schiff (preparacin de fucsina tos colorantes.
bsica y metabisulfito de sodio) los aldehdos
reaccionan dando un color rojo luminoso. Esta
Pg. 12
Portaobjetos
Cubreobjetos
1. Tinta China Pipeta
a. Principio
Fue desarrollada originalmente para micros- c. Procedimiento
copia de luz con el fin de rodear y delinear las En una lmina portaobjetos colocar una
bacterias no teidas u otros materiales biolgi- gota de la tinta china.
cos. Utilizamos diferentes mtodos para evaluar Esterilizar el asa y tomar una muestra de
estructuras individuales, tan pequeas como las cultivo del hongo o en el caso de la muestra
vesculas sinpticas e incluso de gran tamao, de LCR colocar con una pipeta una gota so-
como los microorganismos unicelulares. Este bre la tinta.
mtodo es muy til, aunque est limitado por la Con el cubreobjetos mezclar la tinta con la
presencia de un fondo oscuro que no permitir muestra
la correcta identificacin de forma ntida y deta- Colocar el cubreobjetos sobre la prepara-
llada de los componentes de dichas estructuras. cin
Observar la placa en el microscopio a 40x
En microbiologa, la tincin de Tinta China pro- y 10x
porciona un resultado presuntivo de la presen-
cia de Cryptococcus neoformans, microorga- d. Resultados
nismo causante de meningitis en pacientes con
inmunosupresin, siendo la tcnica ms utiliza-
da para poner de manifiesto su cpsula. Este
hongo presenta dos formas durante su ciclo vi-
tal: una forma asexual y una forma sexual; en la
primera se presenta como levaduras encapsu-
ladas que se reproducen por gemacin y puede
ser visualizada por medio de la tinta china. El
principio es simple, ya que slo se requiere de-
positar una gota de la muestra clnica sobre un
portaobjetos, posteriormente se coloca el colo-
rante y se observa al microscopio sin necesidad Figura 15. Se observa levaduras capsuladas de C.
de fijacin, algunas estructuras difundirn el co- neoformans 40X.
lorante y otras no, lo que permitir un contraste
de las estructuras observadas. Se han utilizado 2. Tincin de Auramina-Rodamina
diferentes colorantes: uno de ellos es la men-
cionada tinta china, la cual tie el fondo de la a. Principio
muestra de un color oscuro y la cpsula del C. Los cidos miclicos de las paredes celulares
neoformans permanece sin teir. La principal de las micobacterias poseen afinidad para los
dificultad con la tincin negativa es que los mi- fluorocromos auramina y rodamina. Estos colo-
croorganismos tienden a contraerse durante el rantes se fijan a las bacterias, que aparecen de
periodo de secado; para evitarlo, se ha optado color amarillo o naranja brillante contra un fondo
por usar la tincin negativa hmeda, en la cual verdoso. El permanganato de potasio, empleado
los organismos se suspenden en una pelcula como contraste, evita la fluorescencia inespec-
de tinta china o mancha oscura y el contorno de fica. Todos los microorganismos cido-alcohol
la cpsula puede ser observado sin el peligro de resistentes, incluyendo los esporozoarios par-
contraccin (Lpez-Jcome y otros, 2014). sitos, se tien con estos colorantes. Un aspecto
importante de la coloracin rodamina-auramiria
b. Materiales y Reactivos es que luego los frote pueden ser reteidos con
Asa la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun direc-
Tinta China tamente sobre la tincin con el fluorocromo, si
Mechero se elimina antes el aceite de inmersin.
Pg. 13
carinii. Maeda & Ishida en 1967, describieron
De esta forma, los resultados positivos pueden que este blanqueador de algodn fluorescente,
ser confirmados con las coloraciones tradicio- poda teir hongos al exponerlo a la luz UV. Ha-
nales, que adems permiten la diferenciacin geage y Harrington lo utilizaron para la tincin de
morfolgica (Garca, Beltran, Guzmn, Len, tejidos fijados en parafina, logrando identificar
Arredondo y Fonseca. 2001). hifas y esporas. La tincin se basa en la capa-
cidad del blanco de calcoflor para unirse a los
b. Materiales y Reactivos 1-3, 1-4 polisacridos (celulosa y quitina) de
Microscopio de flourescencia la pared fngica, y en que el compuesto exhibe
Fluorocromos: auromina, rodamina fluorescencia cuando se expone a luz ultravio-
Solucin decolorante leta, permitiendo delinear claramente elemen-
Permanganato de potasio (contraste) tos fngicos. Al igual que en un examen directo
Glicerol se observarn hifas anchas, no septadas, con
Fenol ramificaciones en ngulo recto. Se puede uti-
Agua desmineralizada lizar en tejidos frescos y/o congelados, fijados
Portaobjetos en parafina y en cultivos puros. Este mtodo
Cubreobjetos no sirve para teir bacterias. Otros elementos
Mechero como por ejemplo fibras vegetales (algodn)
que pudieran teirse, deben diferenciarse cui-
c. Procedimiento dadosamente por la morfologa. Para realizar
Fijar el frote al calor, en un mechero esta tincin, el tejido debe ser tratado con KOH
Teir el frote 15 minutos con los fluorocro- al 10% e igual proporcin de solucin de calco-
mos auramina-rodamina flor al 0,05%. Para examinar el extendido se
Aclarar con agua. requiere un microscopio de fluorescencia. Las
Coloracin de contraste con permanganato estructuras fngicas se observarn verde claro
de potasio durante 3 minutos
Aclarar con agua destilada o azul, dependiendo del filtro UV que se utilice
Lavar con agua y dejar secar al ambiente (Ortigoza Gutierrez y Cruz Aguilar, s.f.).
d. Resultados b. Materiales y Reactivos

Fenol
cido lctico y azul de algodn
Fucsina acida
Rojo allura
Azul brillante
Colorante vegetal
cido actico
Glicerina
c. Procedimiento
El tejido a evaluar debe ser tratado con KOH
al 10% e igual proporcin de solucin de cal-
Figura 16. Las bacterias alcohol cido resistentes se coflor al 0,05%.
observan en el microscopio de flourescencia (luz ultra- Para examinar el extendido se requiere un
violeta) como bacterias de color amarillo anaranjado so- microscopio de fluorescencia.
bre un fondo oscuro. Colocar en un portaobjetos la muestra
Agregar una gota de KOH dimetil sulfxido y
3. Tincin Blanco de Calcofluor una gota de calcofluor
Mezclar, colocar el cubreobjetos
a. Principio Despus de hacer ocurrido la clarificacin,
Es un mtodo de tincin fluorescente para la observar con el microscopio de flourescencia
deteccin de hongos incluyendo Pneumocystis (verde brillante o blanco azulado).
Pg. 14
c. Procedimiento
Cubrir la muestra fijada en el portaobjetos
d. Resultados con la solucin de cido crmico al 10% du-
Las fibras elsticas y colgeno se observan con rante 10 minutos.
fluorescencia amarillo verdosa, estas se pue- Lavar con abundante agua desmineralizada.
den confundir con hongos y levaduras, se dife- Cubrir con la solucin de metabisulfato sdi-
rencian en la fluorescencia. co 1% durante 1 minuto.
Lavar con abundante agua desmineralizada.
Introducir la lmina en un recipiente con la
solucin de metenamina-nitrato de plata, di-
cha solucin debi ser previamente calentada
en bao de mara a 800C por 6 minutos, Una
vez introducida la lmina se debe mantener
las condiciones durante 5 minutos ms hasta
observar el cambio de color en solucin de
marrn a negro.
Figura 17. Se observarn hifas anchas, no septadas, con
Lavar con abundante agua desmineralizada.
ramificaciones en ngulo recto con fluorescencia blanca.
Cubrir el portaobjetos con la solucin de clo-
ruro de oro 1% de 2 a 5 segundos y lavar con
4. Tincin de Gomori-Grocott agua desmineralizada.
Cubrir el portaobjetos con la solucin verde
a. Principio brillante 0.2% en cido actico glacial durante
Es una coloracin especial para hongos, la co- 1 minuto.
loracin est basada en la presencia de cido Lavar con abundante agua desmineralizada
crmico, los grupos hidroxilo de los polisacri- y dejar secar a temperatura ambiente.
dos de la pared celular de los hongos son oxi-
dados a aldehdos y estos a su vez reducen el d. Resultados
complejo nitrato-plata metenamina producien-
do la coloracin caf o negra. Utiliza un buffer
(bisulfito de sodio) y tambin un colorante de
contraste (cloruro de oro) y uno de fondo (verde
brillante) (Pontn, Llovo, 2007).
b. Materiales y Reactivos
cido crmico
Bisulfito de sodio
Metenamina.-nitrato de plata
Cloruro de oro
Verde brillante
Pinzas Figura 18. Se observa levaduras de C. neoformans
Portaobjetos 100X
Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra
biolgica IV. Referencias
Microscopio
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Instituto Nacional de Rehabilitacin. Ciudad de
Mxico, DF. Vol. 3 (1). pp 10-18.
Pg. 16
MANUAL DE MICROBIOLOGIA
Alejandra Castillo
Veronica Itzep
1 Introduccin tes.
- El personal de laboratorio debe utilizar equi-
Las enfermedades infecciosas constituyen un po de proteccin apropiados (lentes, mascarilla)
problema de salud pblica cada vez en aumen- para evitar en lo posible aerosoles o salpicadu-
to generando costos altos para su tratamiento, ras de las muestras. Las muestra que se deben
esto se ha debido al uso indiscriminado de an- centrifugar debe ser tapadas previamente, al
tibiticos generando la desimanacin de bac- destapar algn tubo usar gasas para evitar los
terias multiresistente en el mbito hospitalario aerosoles.
o comunitario, dificultando el adecuado trata- - Desinfectar las mesas de trabajo antes y des-
miento. pus del manejo de material infeccioso, con al-
Los pacientes hospitalizados como no hospita- cohol al 70% o hipoclorito de sodio.
lizados presentan una variedad de sintomato- - Recipientes adecuados para desechos de ma-
logas, poniendo en evidencia el tipo de enfer- teriales como placas, tubos, muestras clnicas.
medad pero en otros casos dificulta al mdico
poder diagnosticar, por lo recurren al laboratorio
El personal de laboratorio debe utilizar equipo
de microbiologa para poder obtener diagnsti- de proteccin como, bata, lentes, mascarillas y
cos certeros y poder tratar al paciente efectiva-guantes.
mente. Al momento de toma de muestras se debe tener
El objetivo del presente manual es poder utili- en cuenta las siguientes instrucciones:
zarlo como una gua de procesos facilitando el - Verificar que el rea de trabajo est limpia
diagnostico de algunas enfermedades infeccio- - Contar con todo los materiales adecuados para
sas frecuentes, describiendo los procedimientos la toma de muestras como, medios de transpor-
de aislamiento como las tcnicas presuntivas y te, hisopos, lancetas, portaobjetos, jeringas,
confirmatorias de identificacin. solucin salina, alcohol al 70%, torniquetes, ga-
sas, frascos estriles, bajalengua, etc.
2 Generalidades - Identificar al paciente, verificar si esta con tra-
2.1 Normas Mnimas de Seguridad en tamiento de antibitico, revisar el rea de toma
el Laboratorio de Microbiologa de muestra o qu tipo de prueba solicitan el m-
dico. Apuntando las anotaciones.
La bioseguridad se refiere a los procesos de - Previo a la toma de muestra verificar y preparar
manejo de los agentes infecciosos para evitar el material adecuado para la toma de muestra.
o proteger al personal de laboratorio, al medio - Rotular los materiales a utilizar
ambiente y a paciente de un riego biolgico. El - Lavarse las manos antes del proceso y usar
manejo de microorganismos dentro del laborato- guantes limpios
rio debe realizarse con mucha precaucin para - Realizar la toma de muestra segn el procedi-
evitar infecciones accidentales. Debe tenerse miento adecuado.
en cuenta las siguientes indicaciones para el
manejo de muestras microbiolgicas: 2.2 Organizacin de rea de Trabajo
- Acceso limitado al rea de trabajo,
- Lavar las manos, antes y despus del manejar El mobiliario debe ser fuerte y resistente. Los
material infeccioso con jabn germicida o con espacios entre mesas, cabinas y equipo han de
alcohol a 70% en caso de manejo de microor- ser de fcil acceso para la limpieza.
ganismos gram positivo.
- No comer, ni beber alimentos dentro del rea - Contar con una campana microbiolgica tipo
de trabajo. No fumar. I o II.
- Utilizar descartador para objetos punzocortan-
Pg. 17
Membrana Citoplsmica: localizada por debajo
de la pared celular, que est formada por una
- Contar con asa calibrada de 0.001, asa en ar- bicapa de fosfolpido integral y protenas peri-
golla y asa en punta. Para Micologa asa en L, fricas empotradas. La membrana citoplsmica
pinzas. cumple la funcin de barrera osmtica, tienen
- La superficie de las mesas de trabajo han de permeabilidad selectiva y permite el ingreso de
ser impermeables al agua y resistente al calor nutrientes y la salida de desechos por mecanis-
moderado, solventes orgnicos, cidos, lcalis mos de transporte activo y pasivo.
y otros productos qumicos. Citoplasma: en el citoplasma bacteriano se
- La silla que se usen deben estar cubiertas por puede dividir en tres partes, regin citoplsmi-
material que no sea de tela y que se puede lim- ca de apariencia granular conteniendo RNA,
piar fcilmente. regin nuclear o cromatinica que contiene DNA
- La iluminacin ser adecuada para todas las y la parte liquida que mantiene disueltos los
actividades. Evitar reflejos y brillos molestos. elementos nutritivos. El ARN combinada con
- Contar con mechero de Alcohol o Bunsen con protenas forma una masa densa y compacta
gas propano, que la llama sea azul. llamadas ribosomas.
- Contar con un microscopio binocular, aceite
de inmersin, laminillas, cubreobjetos, palillos. 2.3.1 Bacterias Gram positivo
- Contar con colorantes para Gram, Zn, KOH,
Giemsa. La envoltura de la bacteria comprende de mem-
brana citoplasmtica y una pared celular com-
2.3 Generalidades de la Estructura puesta por una gruesa capa de peptidoglicano
Bacteriana de 20 a 80 nm, que rodea a la anterior. La pa-
red celular se une a la membrana citoplasmti-
Las diferentes estructuras bacterianas se pue- ca mediante molculas de cido lipoteicoico. La
den dividir en elementos obligatorios para poder capa de peptidoglicano confiere gran resisten-
sobrevivir como pared celular, membrana celu- cia a estas bacterias y responsable de retener
lar, ribosomas y material gentico y elementos el cristal violeta durante la tincin de Gram. El
facultativos son los que estn presentes en al- cido teicoico de la pared que est en la super-
gunas celular y pueden seguir viviendo si pier- ficie y se une solo a la capa de peptidoglicano,
den alguna capacidad fisiolgica o patolgica este cido es el responsable del determinante
como pilis o fimbrias, cpsula y esporas. antignico del organismo. (fig. 1)
Pared Celular: est ubicada por fuera de la
membrana plasmtica, es una estructura vital
para las bacterias que la poseen. Su funcin es
proteger a la bacteria de presin osmtica entre
el medio interno de la bacteria y del exterior, ba-
rrera contra sustancias toxicas qumicas y bio-
lgicas y le proporciona rigidez a las bacterias.
Est constituida por aminocidos, aminoaz-
cares, azcares y grasas. Todas las bacterias
contienen en la pared celular peptidoglicano,
que consiste en cadena lineal de dos azcares
alternados, N-acetilglucosamina y cido N-ace-
tilmurmico que se halla ligado un tetrapptido.
La pared celular permite clasificar las bacterias
en Gram positivo que son capaces de retener
el colorante cristal violeta luego de la decolo-
racin con alcohol cetona y Gram negativo que
pierden el colorante cristal violeta despus de
la decoloracin.
Pg. 18
funcin dar color a todas las clulas. El segun-
do reactivo el lugol, actuando como mordiente,
2.3.2 Bacterias Gram negativo haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared celular de la bacteria. El
La envoltura de la bacteria est compuesta tercer reactivo el decolorante Alcohol-acetona,
por una membrana citoplasmtica, una pared donde los organismos Gram positivo no se de-
celular delgada de 2 a 7 nm de peptidoglicano coloran y los Gram negativo si lo hacen. Y el
y una membrana externa. Entre la membrana cuarto reactivo el colorante de contraste Sa-
citoplasmtica y la membrana externa se locali- franina, poniendo de manifiesto las bacterias
za el espacio periplsmico, relleno de una sus- Gram negativas.
tancia denominada periplsma la cual contiene
enzimas para la nutricin, enzimas inactivadora 2.4.1.2 Procedimiento de la Tincin de
de antibiticos y protenas de transporte. Gram
La membrana externa contiene diversas prote-
nas: porinas, lipopolisacridos (LPS) y fosfolpi- a. Preparacin del Frote
dos. El lipopolisacrido forma tres regiones: po- - Tomar la muestra con un hisopo de dacron o
lisacrido O (antgeno O), polisacrida central alginato de calcio.
(KDO) y el lipido A (endotoxina). (fig. 2) - Rodar el hisopo sobre un portaobjeto
- En caso de muestras liquidas tomar una por-
cin con un asa en argolla flameada y fra, colo-
carlo en un portaobjeto.
- Dejar secar al aire o acelerar el secado acer-
cando el portaobjeto al mechero, pero con pre-
caucin porque el calor puede degradar o defor-
marse las bacterias.
b. Preparacin de la tincin
- En una bandeja con dos varillas colocar el frote
en forma horizontal
- Colocar el Cristal Violeta suficiente cantidad,
dejar actuar durante 1 minuto
- Lavar suavemente con agua
- Colocar el mordiente Yodo, dejar actuar por 1
minuto
- Lavar suavemente con agua
- Decolorar con Alcohol-Acetona, agregando
gota o gota hasta que salga casi claro o ligera-
2.4 Tinciones Bsicas mente azul
2.4.1 Tincin de Gram - Lavar con agua
2.4.1.1 Principio - Agregar safranina como contraste, dejar actuar
por 1 minuto
Es el mtodo de tincin diferencial ms utiliza- - Lavar con agua
do en bacteriologa, siendo esencial para la cla- - Dejar secar la muestra
sificacin y diferenciacin de microorganismos, - Examinar al microscopio con objetivo 100X de
la cual divide las bacterias en dos grupos, las inmersin de aceite. Gram Positivo se tien de
Gram positivas y las Gram negativas. La reac- morado y Gram negativo de rosado. (fig. 3)
cin de la tincin de Gram est basada en la di-
ferencia en la composicin qumica de la pared
celular bacteriana.
La tincin consta de 4 reactivos qumicos, el pri-
mero es el colorante primario cristal violeta, su
Pg. 19
- Cubrir el frote con el reactivo Carbn fucsina,
2.4.2 Tincin Ziehl Neelsen - Por debajo del frote calentar con suavidad has-
2.4.2.1 Principio ta la aparicin de vapores durante 1 minuto
- Dejar el colorante durante 4-5 minutos, sin ca-
Es una tcnica de tincin diferencial rpida y lentar
econmica, usada para identificar microorga- - Lavar el frote con agua de chorro y eliminar el
nismos patgenos como M. tuberculosis o el exceso de agua
gnero Apicomplexa (coccidios intestinales) en- - Decolorar el frote con alcohol-cido
tre otros. - Lavar el frote con agua de chorro y eliminar el
El fundamento de la tincin se basa en resistir exceso de agua
a la decoloracin con alcohol-acido despus de - Cubrir el frote con el reactivo azul de metileno
la tincin con colorantes bsicos. Las paredes durante 1 minuto
celulares de ciertas bacterias contienen cidos - Lavar el frote con agua de chorro, dejar secar
grasos (cidos miclicos) de cadena larga que al aire
les confiere la propiedad de resistir la decolo- - Observar el frote con microscopio con objetivo
racin. 100X en busca de BAAR
La tcnica consiste en la penetracin de carbn
fucsina en la pared celular mediante el calor
como mordiente, luego de cesar la aplicacin
de calor la pared celular cerosa recupera su
consistencia quedando atrapado el colorante.
Las bacterias que resisten la decoloracin son
de color rojo observndolo como bastoncitos
delgados, ligeramente curvos. (fig. 4)
2.4.2.2 Procedimiento de Tincin de

Ziehl Neelsen
a. Preparacin del frote

- Con un palillo o un asa flameada y fra tomar
muestra y colocarla en un portaobjeto limpio
- Dejar secar a ambiente
- Fijar al calor la muestra, con cuidado
b Preparacin de coloracin
- En una bandeja con varillas colocar el frote en
posicin horizontal
Pg. 20
2.4.4.2 Procedimiento de Tincin Kin-
youn Modificado
2.4.3 Tincin de Kinyoun
2.4.3.1 Principio - Flamear el frote para fijarlo
- Colocar el frote en posicin horizontal en una
La tincin es similar a la tincin de Ziehl Nee- bandeja con varillas
lsen, siendo una coloracin en frio, utilizando - Cubrir el frote con fucsina-fenicada durante 5
un reactivo especial que adems de fucsina minutos
agrega una concentracin alta de fenol. El fe- - Lavar con agua de chorro
nol disuelve los lpidos de la pared celular per- - Decolorar con un cido dbil cido sulfrico,
mitiendo que el colorante primario entre entr, durante aproximadamente 3 minutos
evitando el calentamiento. (fig. 5 ) - Lavar con agua de chorro
- Cubrir el frote con el colorante de contraste
2.4.3.2 Procedimiento de Tincin Kin- Azul de Metileno durante 3 minutos
youn - Lavar con agua de chorro, dejar secar
- En una bandeja con dos varillas, colocar la
laminilla en posicin horizontal 2.4.5 Observacin en Fresco
- Cubrir la laminilla con carbn fuscina-fenifica- 2.4.5.1 Principio
da durante 5 minutos
- Lavar con agua de chorro Son todas aquellas formas o mtodos de ob-
- Decolorar con alcohol-acido servacin, mediante los cuales los objetos a in-
- Lavar con agua de chorro vestigarse no sufren cambios o alteraciones en
- Cubrir con el colorante de contraste por 1 mi- cuando a su forma, estructura o composicin
nuto qumica. Es til para observar especies que se
- Lavar con agua de chorro, secar al aire daaran al teirla o fijarlas, como espirilos, as
como observar movilidad, fenmeno de multipli-
cacin o esporulacin. (fig. 6)
2.4.4 Tincin Kinyoun Modificado

2.4.4.1 Principio
3 Toma de Muestra y Procedimientos
Parecida a la coloracin de Kinyoun o en frio,
haciendo la fijacin con alcohol metlico para 3.1 Orocultivo
preservar las estructuras celulares y utilizando 3.1.1 Propsito e importancia
cido sulfrico al 2% en agua destilada rempla-
zando al alcohol-acido. Esta prueba se realiza para detectar infecciones
en la garganta causada por Estreptococos del
grupo A causando amigdalitis o faringitis.
Pg. 21
Carnero al 5% en un extremo de la caja reali-
zando el inoculo.
El rea farngea puede estar colonizada por g. Enviarlo inmediatamente al laboratorio
varias bacterias como Staphylococcus, Strep-
tococcus, micococos, Moraxella catarrhalis, 3.1.3 Aislamiento Primario
Corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyro- a. Proceder a realizar el estriado en Agar San-
monas, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela, gre Carnero al 5%, realizando dos cortadas de
Peptostreptococcus, Actinomyces, levadura, aproximadamente 1 cm para aumentar la identi-
etc., pero el microorganismo ms frecuente que ficacin de la beta hemolisis. Entre cada estria-
causa faringitis es el Streptococcus pyogenes da y cortada no flamear el asa. (fig. 8)
3.1.2 Recoleccin de la muestra y

transporte
Previo a la toma de muestra el paciente no debe

estar tomando antibiticos, no haber realizado
gargarismo con algn antisptico y no es nece-
sario que el paciente se presente en ayuno. En
algunos casos el procedimiento puede causar
nauseas o vmitos.
3.1.2.1 Procedimiento
a. Que el paciente este sentado, pedirle que
trague saliva dos veces b. Incubar por 18 a 24 hrs a 35-36 C introducir-
b. Indicarle al paciente que vea hacia arriba, lo en una jarra con veladora con el objetivo de
abra la boca y diga aahh crear un ambiente de C02
c. Con ayuda de un bajalengua presionar la c.Buscar colonias de pequeas de 1 a 1.5 mm
lengua hacia abajo y con una linterna observar de dimetro rodeada de un halo de hemolisis
el rea afectada, en busca de reas inflamada, completa sospechosas con beta-hemolisis sos-
con pus o ulceras blanquecinas.(fig. 7) pechosas de S. pyogenes
d. Con un hisopo estril de dacrn proceder a la
toma de muestra, con el mayor cuidado de no 3.1.4 Identificacin Streptococcus
tocar paredes de la boca ni la lengua. pyogenes
Es el principal microorganismo patgeno hu-

mano que produce infeccin local o sistmica
y trastornos inmunitarios postestreptoccicos.
Puede causar Faringitis, Erisipe, Celulitis, Gan-
grena estreptoccica, Fiebre puerperal, Pioder-
mia estreptoccica, Sndrome de Choque Toxi-
co, fiebre reumtica y glomerulonefritis.
La prueba de catalasa es negativa, susceptible
al Taxo A (bacitracina 0.04 U) formando un halo
de inhibicin, resistente al Taxo SXT, la identifi-
cacin de pirrolidonilarilamidasa (PYR) y la de-
teccin del Antgeno A de Lancefield. (fig. 9)
e. Introducir el hisopo en el medio de transporte
Todd Hewitt, llevarlo a la brevedad posible al 3.1.4.1 Procedimiento
laboratorio. a. Despus de la incubacin de 16 a 24 horas
f. En caso de realizar la inoculacin directa rea- del asilamiento primario, proceder a buscar co-
lizar la inoculacin en medio de Agar Sangre de lonias sospechosas de beta hemolisis.
Pg. 22
b. Trasladar una o varias colonias a un agar sangre carnero al 5% en el centro y proceder a realizar
un estriado en forma de tapete
c. Con una pinza flameada y fra colocar un disco de Taxo A (bacitracina 0.04 U)en el centro
d. Incubar por 16 a 24 horas en ambiente de CO2
e. Examinar la caja para observacin de un halo de inhibicin alrededor del Taxo A. La presencia
del halo indica que se aislo S. pyogenes (fig. 10)
f. Proceder a realizar la prueba de susceptibilidad y pruebas serologas de aglutinacin para con-
firmacin del grupo
3.2 Cultivo de Garganta Especial

3.2.1 Propsito
La presencia de las bacterias especiales por cultivo se realiza mediante solicitud e investigacin
justificada.
Pg. 23
Corynebacterium diphtheriae: conocido como
bacilo Klebs-Lffler, causante de la difteria, es
investigada por sintomatologa que presenta el
paciente, siendo: formacin de pseudo-mem-
branas (pellejos) de color gris en la garganta,
que sangran mucho al desprenderse, fiebre y el
paciente se encuentra severamente intoxicado,
afectando las amgdalas, garganta, nariz, mio-
cardio, fibras nerviosas o piel. Bacterias Gram
Positiva, catalasa positiva, inmvil, no espuru-
lados, bacilos rectos o ligeramente curvados
2-6 um de largo y 0.5 um de dimetro, a menu-
do con en forma de V lo que se conoce como
forma de letras chinas. 3.2.2.2 Toma de Muestra para Neisse-
Neisseria Meningitidis: Causante de severa y ria meningitidis y Bordetella pertussis
contagiosa meningitis, y se investiga principal-
mente el Lquido Cefalorraqudeo, la presencia El cultivo de garganta/nasofarngeo para el ais-
la bacteria se realiza en cultivo de garganta en lamiento de N. meningitidis, debe obtenerse de
personal que han estado en contacto con el pa- personal que han tenido contacto directo con al-
ciente, siendo mdicos, enfermeras, tcnicos gn paciente que se ha detectado la presencia
de laboratorio, siendo importante identificar y de la bacteria en LCR, se obtiene mayor por-
erradicar la bacterias con tratamiento para evi- centaje de aislamiento en toma de muestra na-
tar la desimanacin. sofarngea que de garganta. Figura No. 12
a. Colocar al paciente con la cabeza inmovili-
Bordetella pertussis: Causante de la tos fe- zada
rina, tambin conocida con tos convulsa o co- b. Con el pulgar de la mano, levantar suave-
queluche. Se caracteriza por inflamacin tra- mente la punta de la nariz
queobronquial y accesos tpicos de tos violenta c. Introducir un hisopo de alginato de calcio en
y espasmdica con sensacin a asfixia. Coco- unos de los orificios nasales
bacilo Gram Negativo pequeo mide alrededor d. Mover el hisopo hacia atrs y hacia arriba a
de 0,3-0,5 m de ancho y entre 1,0 y 1,5 m de lo largo del tabique nasal, hasta llegar a la parte
largo, aerobios, posee capsulas, presenta fila- posterior de la faringe.
mentos similares a pilis. e. Retirar el hisopo con cuidado
f. Inocular el hisopo en medio de transporte o
3.2.2 Recoleccin de Muestra y Trans- directamente en el medio de cultivo.
porte g. Con otro hisopo tomar muestra y realizar un
3.2.2.1 Toma de muestra para Coryne- frote gram
bacterium diphteriae
a. Con buena iluminacin examinar la gargan-
ta, bajar la lengua con ayuda de un bajalengua,
buscar areas necrticas o grisceas (pseudo-
membrana) Fig. 11
b. Con un hisopo alginato de calcio estril frotar
firmemente las lesiones, retirar el hisopo con
cuidado de no tocar las paredes ni la lengua
de la boca. Tomar por lo menos 3 muestras con
hisopo
c. Un hisopo realizar un frote gram
d. Inocular en los medios de cultivo.
Pg. 24
das en Agar Chocolate-Telurito para realizar las
pruebas de Catalasa y Nitritos
3.2.3 Aislamiento primario Catalasa: Positivo
3.2.3.1 Corynebacterium diphteriae Nitritos: Positivo
a. Inocular el hisopo en un medio inclinado de Reporte:
Loeffer (suero animal ms caldo glucosado coa- Si la morfologa del crecimiento en medio Loe-
gulado) el medio es de color crema plido. ffler es tpica informar,
b. El segundo hisopo inocular en agar Chocola- Se aisl un bacilo gram-positivo, de morfologa
te-Telurito de Potasio compatible con Corynebacterium diphtheriae.
c. Proceder a estriar los medios de cultivo Si la morfologa microscpica de crecimiento en
d. Incubar ambos medios aerobicamente por medio Loeffler es tpica y hay colonias negras en
36C por 18 a 24 horas Agar Chocolate-Telurito reportar:
e. Un tercer hisopo inocular en agar Sangre Se aisl Corynebacterium diphtheriae. Identi-
Carnero al 5% para investigar Streptococcus ficacin preliminar, pendiente de demostrar la
pyogenes, incubar en ambiente CO2 produccin de toxina en vitro o in vivo
f. Teir el frote Gram y buscar caractersticas de
la bacteria
3.2.3.2 Neisseria meningitidis

a. Inocular un hisopo en medio de de Thayer
Martin
b. Estriar el inoculo e incubar a 36C en ambien-
te CO2 por 18-24 horas
c. Teir el frote Gram
3.2.3.3 Bordetella pertussis

a. Inocular un hisopo en medio de agar Bor-
det-Gengou o Agar Regan-Lowe
b. Estriar el inoculo e incubar a 36 por 4-5 das3.2.4.2 Neisseria Meningitidis
c. Teir el frote gram a. Despus de la incubacin observar colonias
en Agar Chocolate pequeas, grises, brillantes y
3.2.4 Identificacin de principales Mi- ligeramente mucosas
croorganismos b. Realizar un frote Gram con cuidado, observar
3.2.4.1 Corynebacterium diphtheriae diplococos Gram-negativo en forma de granos
a. Despus de la incubacin del medio Loeffler de caf, agrupados en pareja
con dos a ocho horas, preparar dos frotes uno c. Realizar un subcultivo para obtener un cultivo
para gram y otro para Azul de metileno, con cui- puro en agar Chocolate sin inhibidores de colo-
dado de remover lo menos posible nias caractersticas y morfologa microscpicas
b. Tincin de Gram: bacilos gran-positivo pleo- de la bacteria para las pruebas de identificacin
mrficos y en forma de maza, agrupadas en for- como Oxidasa, utilizacin de azucares y prue-
ma de letras chinas o en formas de V o Y. bas serolgicas.
c. Tincin de Azul de Metileno: utilizar Azul de
Metileno de la coloracin de Ziehl Neelsen ob- Prueba de Oxidasa
servar el mismo patrn que el gram, solo que la a. Tomar una porcin de la colonia a estudio, con
coloracin es discontinua en forma de bandas un palillo de madera o un asa plstica, frotar so-
azules por los corpsculos metacromticos de bre un disco con reactivo de oxidasa.
polimetafosfato. b. La reaccin positiva se da en 10 segundos,
d. En agar Chocolate-Telurito se observan colo- con una coloracin morado oscuro a negro indi-
nias de color negro intenso. cando prueba positiva.
e. Sulcultivar en Agar Sangre de Carnero al 5%
colonias caractersticas de C. diphtheriae creci-
Pg. 25
Utilizacin de Azucares Mtodo Agar Cistina
Tripticasa ACT
a. Se utiliza un juego de 4 tubos con agar ACT
con distintas azucares (glucosa, maltosa, lac-
tosa y sacarosa)
b. Tomar una pequea cantidad con un asa
en punta del crecimiento de un cultivo de N.
meningitidis, de un cultivo puro de 24 horas en
agar Sangre y Chocolate
c. Inocular pinchando varias veces los 10 mm
superiores del medio. Y repetir el proceso con
los otros tubos usando un asa flameada y fra.
d. Cerrar los tubos e incubarlos a 35C por lo
menos 72 horas hasta 5 das antes de descar- Colonias de B. pertussis
tarlos como negativo Figura No. 14
e. Si se genera una turbidez visible y un color
amarillo en la porcin superior del medio, es 3.3 Hemocultivo y Mielocultivo
indicativo de crecimiento y produccin de aci- 3.3.1 Propsito
do, intepretando como positiva la prueba.
N. meningitidis, oxida glucosa y la maltosa, El hemocultivo sirve para detectar las bacte-
pero no la lactosa ni la sacarosa. (Tabla No. 1) rias que se estn reproduciendo en la sangre,
lo que provoca septicemia. El mielocultivo es
Tabla No. 1 Utilizacin de Azucares el cultivo de mdula sea y sirve para detectar
bacterias en esta muestra, especialmente Sal-
monella typhi.
El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente
estril, por lo tanto, la presencia de microorga-
nismo o sus productos constituyen un proble-
ma para todos los rganos y sistemas que son
irrigados por el mismo. La deteccin e identifi-
cacin de los diversos microbianos, es de vital
importancia desde el punto de vista clnico para
instaurar una terapia antimicrobiana adecuada
y desde el punto de vista epidemiolgico.
Pg. 26
f. Dispensar el volumen de sangre obtenido rpi-
da y suavemente en el medio de cultivo lquido
3.3 Hemocultivo y Mielocultivo con anticoagulante
3.3.1 Propsito g. Limpiar con alcohol al 70% para remover el
yodo el cual puede causar irritacin en algunos
El hemocultivo sirve para detectar las bacterias pacientes.
que se estn reproduciendo en la sangre, lo que Las botellas de hemocultivo inoculadas deben
provoca septicemia. El mielocultivo es el cultivo ser enviadas inmediatamente al laboratorio evi-
de mdula sea y sirve para detectar bacterias tando una agitacin vigorosa, sin refrigerar. Si
en esta muestra, especialmente Salmonella no es posible llevarlas de inmediato, conservar-
typhi. las a temperatura ambiente por un corto perodo
El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente de tiempo sin alterar la viabilidad de las bacte-
estril, por lo tanto, la presencia de microorga- rias. Por un periodo mayor deben conservarse
nismo o sus productos constituyen un proble- en incubadora a 35C.
ma para todos los rganos y sistemas que son En sepsis: se recomienda tomar dos muestras
irrigados por el mismo. La deteccin e identifi- de lugares distintos en un lapso de media hora.
cacin de los diversos microbianos, es de vital En endocarditis, obtener tres muestras de dife-
importancia desde el punto de vista clnico para rentes lugares en un lapso de 1 a 2 horas.
instaurar una terapia antimicrobiana adecuada
y desde el punto de vista epidemiolgico. 3.3.3 Aislamiento primario
3.3.3.1 Procedimiento de incubacin
3.3.2 Recoleccin de la muestra y a. Al obtener la muestra en el frasco de hemocul-
transporte tivo, incubar el frasco a 35-36C hasta por 7 das
b. Examinar visualmente y con luz transmitida
El momento ideal para obtencin de la muestra los frascos de hemocultivo despus de 12 y 24
es justo antes del pico ms alto de fiebre, sin horas de incubacin.
esperar el pico mximo de temperatura, ya que c. Observar si presenta turbidez o lisis de glo-
en este momento hay mayor destruccin del bulos rojos indicando crecimiento bacteriano,
microorganismo. Antes de recibir terapia antimi- entonces realizar una coloracin Gram y un sub-
crobiana, si est recibiendo ya terapia antimi- cultivo., si no presenta cambios seguir incuban-
crobina tomar muestra en el momento de baja do por 7 das.
concentracin del antibitico.
3.3.2.1 Toma de muestra

a. Seleccionar el sitio de puncin,
b. Preparar el sitio, lavar con agua y jabn. Lim-
piar con alcohol etlico a 70%. Si el paciente no
es alrgico al yodo, lavar en forma concntrica
con tintura de yodo por 30 segundos
c. Desinfectar las tapas de la botella del hemo-
cultivo con alcohol o yodo.
d. Proceder a la venopuncin con jeringa, ex-
traer el volumen de sangre necesario para obte-
ner una dilucin en una proporcin de 1:5 o 1:10
Volumen de muestra: neonatos 0.5 ml Subcultivo

Nios 1-5 ml
Adultos 10 ml a. Los subcultivos deben realizarse en cabina o
e. Retirar la ligadura y la jeringa al terminar de cerca de un mechero de bunsen
obtener la sangre, colocar una torunda de algo- b. Realizar los subcultivos ciegos dentro de las
dn 12 a 24 horas de incubacin
Pg. 27
c.Antes de realizar el subcultivo, desinfectar la superficie de la tapa del frasco con alcohol al 70%
d. Con una jeringa estril, extraer a travs del tapn de la muestras
e. Inocular una gota de muestra del hemocultivo en un extremo de la superficie de las placas de
Agar Sangre, Agar MacConkey, Agar Chocolate y Agar Manitol sal.
f. Tambin colocar una gota sobe un portaobjeto para la tincin de Gram
g. Proceder a realizar la dispersin para obtener colonias aislada
h. Incubar las placas de Agar sangre carnero 5% y Agar Chocolate a 35-36C por 24 horas en
ambiente de CO2; las placas de MacConkey y Manitol Sal incuabar en ambiente aerobiosis.
i. Observar el gram si se observa morfologa bacteriana informar al medico
j. Si no hay crecimiento a las 24 horas, seguir incubando hasta por 48 horas.
k. Si no hubiera desarrollo bacteriano, repetir el procedimiento de sulbcultivo al 5to y 7 mo dia.
l. Streptococcus pneumoniae tiene tendencia a autolisis, deben ser subcultivado a las 12-17 horas
de incubacin, repetir a las 48 horas y 7mo da de incubacin sin presentar cambio de coloracin
o turbidez.(Tabla No. 2)
Tabla No. 2 Alteracin del hemocultivo y posible bacteria
3.3.4 Identificacin de principales microorganismos
Staphylococcus coagulasa negativo, corinebacterias y especies de bacillus son contaminantes

frecuetnes y a menudo se aslan en solo una de tres muestras o el paciente no presenta sntomas.
Algunas bacterias frecuente en hemocultivos positivos son:
- Salmonella typhi
- Escherichia coli
- Streptococcus pneumoniae
Pg. 28
Staphylococcus aureus
- Streptococcus pyogenes
- Pseudomonas aeruginosa
- Haemophilus influenzae
3.4 Lquido cefalorraqudeo y otros lquidos estriles

3.4.1 Propsito
Demostrar mediante el cultivo de Lquido Cefalorraqudeo (LCR) u otro tipo de lquido el diagnos-
tico microbiolgico de una infeccin.
Las infecciones del SNC puede ser causada por bacterias, virus, hongos o parsitos que se ha-
llan en el medio ambiente o que forman parte de la flora normal de la superficies corporales; los
agentes causales son introducidos previamente en los tejidos perifricos del hospedero y se diri-
gen al SNC a travs del torrente sanguneo o ocasionado por traumatismos craneoenceflicos.
Pg. 29
Las bacterias que tiene mayor importancia en el lquido cefalorraqudeo son:
Bacterias Gram Negativo
Neisseria meningitidis
Haemophilus influenzae
Escherichia coli y otras enterobacterias
Pseudomonas aeruginosa
Bacterias Gram Positivo

Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Lysteria monocytogenes
Entre otros microorganismos esta Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Cryptococcus

neoformans.
Los sntomas de irritacin de las meninges son fiebre, dolor de cabeza, vmitos, rigidez, dolor
de nuca, reflejos aumentados y petequias en la piel.
3.4.2 Recoleccin de Muestra y Transporte
Las muestras de lquido LCR u otro lquido corporal estril deben ser tomadas por un profesional
capacitado, antes de iniciar tratamientos con antibiticos, colectadas en recipientes estriles por
lo menos tres frascos para citolgico (recuento de glbulos rojos, recuento de glbulos blancos,
formula diferencial), qumico (glucosa, protena entre otros) y microbiolgico.
Deben ser transportadas inmediatamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no des-
pus de 30 minutos de recolectada. Rotular la muestra adecuadamente y tipo de muestra. Si el
mdico sospecha de bacilos alcohol acido resistente BAAR o de hongos debe notificarlo para
evaluar.
Pg. 30
levaduras encapsuladas sembrar en agar Sa-
Los lquidos o fluidos corporales estriles son: bourod por 4 semanas
- Lquido cefalorraqudeo e. Tomar una o dos gotas de lquido con una pi-
- Lquido ventricular (cisternal o craneal) peta pasteur estril o jeringa estril e inocular
- Lquido abdominal (peritonel, de dilisis o los medios de cultivo slidos, Agar Sangre Car-
bilis) nero 5%, Agar Chocolate, Agar Manitol Sal, Agar
- Lquido pleural, toracentesis y empiema ( MacConkey.
obtenido del torax) f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero
- Lquido pericardio al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 y
-Lquido sinovial Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente ae-
La muestra de Lquido Cefalorraqudeo LCR se robiosis, a 36C, revisar a las 24 horas.
obtiene por puncin lumbar, se sugiere por lo g. Si el laboratorio cuente con pruebas para de-
menos la coleccin de la muestra en tres tubos teccin de antgenos, realice estas pruebas con
separados para analizar qumica (glucosa, pro- una pequea cantidad del LCR o del sobrena-
tenas entre otros), citolgico (glbulos rojos, dante del LCR.
glbulos blancos y formula diferencial) y cultivo h. Si no se observa crecimiento deben ser rein-
microbiolgico de preferencia el tubo no. 2 o el cubados los medios por 72 horas antes de des-
ms turbio para el anlisis microbiolgico. cartados.
i.Si presenta desarrollo de microorganismos so-
bre los medios de cultivo slidos realizar colora-
cin Gram, de acuerdo a lo observado proceder
a montar las pruebas de identificacin y antibio-
grama.
Reportar al mdico inmediatamente lo observa-
do en la tincin de Gram, ZN o Tinta China.
Segunda Porcin
a Proceder a realizar el examen macroscpico
(color, aspecto, volumen ) y citolgico del Lqui-
do estril
b. El examen citolgico de la segunda porcin
se analizara
- Recuento de glbulos rojos
- Recuento de glbulos blanco
Figura No. 16 - Formula diferencial
c Es este tubo tambin puede realizarse prue-
3.4.3 Aislamiento Primario del Lquido bas de latex para identificacin de Criptococ-
Cefalorraqudeo u otros Lquidos Est- cus neoformans, H. influenzae, N. meningitidis,
riles. Streptococcus pneumoniae y del grupo B-hemo-
litico.
Primera porcin Tercera Porcin
a. Tomar un tubo con muestra y Centrifugar la Proceder a realizar el examen qumico con eva-
muestra a 3,000 rpm durante 10 minutos luacin de glucosa y protenas.
b.Descartar el sobrenadante y con el sedimen- d. Si en la coloracin de Tinta China se obser-
to proceder a realizar frotes para Gram y Zielh van levaduras encapsuladas sembrar en agar
Neelsen ZN; Tinta China Sabourod por 4 semanas
c.Si se observan Bacilos Alcohol Acido Resis- e.Tomar una o dos gotas de lquido con una pi-
tente sembrar en Lowenstein Jensen, siguiendo peta pasteur estril o jeringa estril e inocular
el protocolo para aislamiento e identificacin de los medios de cultivo slidos, Agar Sangre Car-
micobacterias por 60 das nero 5%, Agar Chocolate, Agar Manitol Sal, Agar
d.Si en la coloracin de Tinta China se observan MacConkey.
Pg. 31
Interpretacin
Tincin del Gram del sedimento del LCR:
f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero - Observar diplococos Gram Negativo, forma de
al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 rion, en parejas como grano de caf, compati-
y Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente bles con N.meningitidis.
aerobiosis, a 36C, revisar a las 24 horas. - Cocobacilos Gram Negativo pleomrficos, con
g.Si el laboratorio cuente con pruebas para de- escasa formas bacilares, compatible con H. in-
teccin de antgenos, realice estas pruebas con fluenzae
una pequea cantidad del LCR o del sobrena- - Cocos Gram Positivo, lanceolado, ovalado, dis-
dante del LCR. puestos en parejas o cadena cortas, la capsula
h.Si no se observa crecimiento deben ser rein- se insina como un halo claro alrededor de las
cubados los medios por 72 horas antes de des- bacterias, compatible con S. pneumoniae.
cartados. - Bacilos Gram Negativo, compatible con Ente-
i.Si presenta desarrollo de microorganismos so- robacterias o Pseudomonas sp.
bre los medios de cultivo slidos realizar colora- - Levaduras redondas con gemacin, Gram po-
cin Gram, de acuerdo a lo observado proceder sitivo, se insina cpsula hacer tinta china, para
a montar las pruebas de identificacin y antibio- verificar la presencia de C. neoformans
grama. Tincin de Ziehl Neelsen
Reportar al mdico inmediatamente lo observa- - Si se observan bacilos alcohol cido resistente
cortos, morfologa compatible con M. tuberculo-
do en la tincin de Gram, ZN o Tinta China. sis o otras micobacterias.
Segunda Porcin Al observar crecimiento a las 24 o 48 horas y
a. Proceder a realizar el examen macroscpico observar crecimiento en distintos medios como
(color, aspecto, volumen ) y citolgico del Lqui- gua (Tabla No. 4)
do estril
b. El examen citolgico de la segunda porcin Tabla No. 4
se analizara
- Recuento de glbulos rojos
- Recuento de glbulos blanco
- Formula diferencial
c Es este tubo tambin puede realizarse prue-
bas de latex para identificacin de Criptococ-
cus neoformans, H. influenzae, N. meningitidis,
Streptococcus pneumoniae y del grupo B-he-
molitico.
Tercera Porcin
Proceder a realizar el examen qumico con eva- Realizar Frote gram de las colonias para confirmar morfo-
luacin de glucosa y protenas. loga y proceder a identificacin (tabla No. 5)
3.4.4 Identificacin de principales mi-
croorganismos Tabla No. 5
Pg. 32
identificar ms de 40 serotipos. Los factores de
virulencia son Endotoxina, que se libera tras la
3.5 Coprocultivo lisis de la bacteria, que contribuye a la irritacin
de la pared intestinal y la Exotoxina o Toxina
3.5.1 Propsito e Importancia Shiga que es una protena termolbil inmuno-
gnica, su accin afecta tanto al intestino como
Mtodo utilizado para identificar diferentes mi- sistema nervioso central.
croorganismos causantes de enfermedades
gastrointestinales, provocando diarreas, vmi- 3.5.1.3 Vibrio Cholerae
tos, fiebre y dolores estomacales.
Los principales enteroptogenos estn: Salmo- El gnero Vibrio agrupa a ms de 30 especies,
nella sp, Shigella sp y Vibrio cholerae. pero slo 12 se consideran patgenas para el
ser humano. La especie ms patgena es V.
3.5.1.1 Salmonella sp cholerae, segn el antgeno somtico (O) se
subdivide en los grupos O1, O2, O3 y O139. El
El gnero Salmonella se incluye en la fami- Vibrio cholerae grupo O1 presenta 2 biotipos; el
lia Enterobacteriaceae, integrada por bacilos Clsico, y Eltor y ambos biotipos pueden perte-
Gram negativo anaerobios facultativos, son fer- necer a dis serotipos principales Ogawa e Inaba.
mentadores de glucosa pero no lactosa, suelen Los vibrios causantes de clera son Vibrio cho-
ser mviles por sus flagelos peritricos excepto lerae grupo O1 y grupo O139, fabrican una en-
S. gallinarum, no esporulados, producen cido dotoxina que es la determinante de las diarreas
sulfrico y no producen ureasa. secretoras tpicas del clera.
Se distinguen tres nicas especies patgenas Son bacilos Gram negativo, con forma de coma,
primarias: S. thphi, S. Cholerae-suis y S. en- aerobios y anaerobios facultativos. No esporula-
teritidis. Segn la serotipificacin de Kauffman dos, tiene flagelo polar. Fermenta la glucosa sin
y White, estas se clasifican en ms de 2000 produccin de gas, catalasa positivo y la mayo-
serotipos con base en antgenos flagelares H ra es oxidasa positiva. Tiene Antgeno somtico
(proteicos) y antgeno somticos O (fraccin po- (O), antgeno flagelar (AgH), sus factores de vi-
lisacrida del lipopolisacaridos bacilar). S. typhi rulencia son mucinasa y la toxina colrica.
posee adems un antgeno de virulencia (Vi)
3.5.2 Recoleccin de Muestra y Trans-
3.5.1.2 Shigella porte
a. No estar tomando antibiticos
Shigella es un bacilo Gram negativo, inmvil, no b. Colectar la muestra de heces frescas en un
formadoras de esporas e incapaces de fermen- frasco limpio y estril de boca ancha enviarlo an-
tar la lactosa, que puede ocasionar diarrea en tes de 1 hora al laboratorio
especialmente en nios. c. Si no puede emitir muestra de heces se pue-
Existen varias especies diferentes y son clasifi- de proceder a toma de muestra con hisopo. En
cados en cuatro subgrupos nios introducir el hisopo 2.5 cm y en adultos
- Serogrupo A: S. dysenteriae (12 serotipos): introducirlo 4 cm; dar 3 vueltas a la derecha y 3
causa disentera bacilar grave y complicaciones vueltas a la izquierda
- Serogrupo B: S. flexneri (6 serotipos): causa d. Si la muestra es tomada con hisopo introdu-
disentera bacilar moderada cirlo en el medio de transporte como Cary Blair,
- Serogrupo C: S. boydii (23 serotipos): causa e. Enviar la muestras tomadas lo antes posible
disentera bacilar moderada al laboratorio
- Serogrupo D: S. sonnei (1 serotipo): causa di-
sentera bacilar leve 3.5.3Aislamiento Primario
Shigella tienen un patrn antignico complejo, 3.5.3.1 Procedimiento para aislar Sal-
la mayor parte de las especies comparten el an- monella sp, Shigella sp
tgeno O con otras enterobacterias. El antgeno a. Procesar la muestra lo ms pronto posible
O (somtico) es un lipopolisacrido que permite
Pg. 33
b. Con un hisopo estril o asa en argolla tomar
muestras de heces donde hay presencia de
moco, pus o sangre.
c. Tomar un hisopo o una asada de muestra y
colocarlo en caldo de selenito por 12 a 24 horas
a 35-36C (inhibiendo la flora normal y permite
el desarrollo de salmonella sp y Shigella sp.
d. Tomar tercer hisopo o asa con muestra e
inocular los medios de cultivo selectivos como
MacConkey Sorbitol y XLD o SS, realizando un
inoculo de 1 cm.
e. Con un asa en argolla flameada y fra proce-
der a estriar
f. Incubar por 24 a 48 hrs a 35-36C
g. Revisar la presencia de colonias sospecho-
sas tabla no. 1, realizar identificacin y anti-
biograma
El Agar MacConkey Sorbitol utilizado para bus-
car Escherichia coli O 157:H7 en nios menores
de 5 aos.
Caractersticas macroscpicas en los medios

de cultivo de las bacterias ms importantes (Ta-
bla No. 6 y figuras 17) 3.5.3.2 Procedimiento para aisla-
miento de Vibrio cholerae
Tabla No. 6 a. Procesar la muestra lo ms pronto posible o muestra
proveniente en medio de transporte de Cary Blair
b.Con un hisopo estril o asa en argolla tomar muestras
de heces donde hay presencia de moco, pus o sangre.
c.Tomar un hisopo o asa de muestra y colocarlo en Agua
Peptonada Alcalina por 6 a 8 hr a 35-36 C para enrique-
cimiento de Vibrio cholerae
d.Sulcultivar en medio TCBS (tiosulfato, citrato sales bilia-
res y sacarosa y Agar Sangre
e. Con un asa en argolla flameada y fra proceder a estriar.
Incubar por 24 hrs a 35-36C
f.Revisar la presencia de colonias circulares de borde en-
tero de color amarillo (sacarosa positivo) en medio TCBS y
en agar Sangre colonias hemolticas. (Figura 18)
Pg. 34
- Proceder a picar una vez el medio por el cen-
tro al fondo del tubo
- Sin sacar el asa recta del tubo estriar el sland
del medio
- Incubar a 36 C por 18 / 24 hrs
- Leer la reaccin
B. LIA Agar Lisina Hierro

Mide la capacidad del microorganismo para
descarboxilar un aminocido (lisina o arginina)
para forma una amina con la consiguiente alca-
linidad, ponindose de manifiesto por el viraje
del indicador prpura de bromocresol. El medio
es de color prpura intenso pH 6.
Procedimiento
- Con un asa recta no flameada del proceso
del TSI,
- Desenrosque el tubo y flamee la boca del
tubo
- Proceder a picar el medio tres veces hasta el
fondo y estriar el sland
- Incubar a 36C por 18 a 24 hrs
- Leer la reaccin
3.5.4 Identificacin de principales Mi- Tabla No. 6 Interpretacin TSI y LIA

croorganismo
3.5.4.1 Pruebas Bioqumicas

Las pruebas bioqumicas consisten en distin-
tos test qumicos, la cual se fundamentan en
demostrar si el microorganismo es capaz de
fermentar azcares, presencia de enzimas,
degradacin de compuestos; con el objetivo de
diferenciar bacterias.
Para la realizacin de las pruebas bioqumicas
se debe tener cuidado utilizar mesclar bacte-
rias y tomar proceder con aislamientos puros.
A. TSI Agar hierro triple azcar

Determinar la capacidad de la bacteria para
degradar los azucares y la formacin de gas
y Acido Sulfhidrico. Color es rojo ladrillo ana-
ranjado pH 7.4. . La fermentacin aerbica se
produce en el sland del tubo y la anaerbica en
el fondo del tubo.
Procedimiento
- Con un asa recta picar una colonia sospecho-
sa que este aislada
- Desenrosque el tubo y flamee la boca del
tubo
Pg. 35
2. Descarboxilacin de Ornitina, capacidad del
organismo de descarboxilar un aminocido
C.Citrato para formar una amina, por consiguiente la
La utilizacin de citrato como nica fuente de alcalinizacin
carbono es una prueba til en la identificacin 3. Produccin de Indol El triptfano es un ami-
de enterobacterias, se detecta mediante el nocido que puede ser oxidado por ciertas bac-
crecimiento y alcalinizacin del medio a pH 7.6, terias formando tres metabolitos, Indol, Escatol,
el aumento de pH se visualiza con el indicador y Indolacetico.
Azul de Bromotimol que vira el medio de color Procedimiento
verde a azul oscuro. - Con un asa en lnea flameada y fra tomar una
Procedimiento colonia
- Con un asa flameada y fra tomar una colonia - Desenroscar el frasco y flamear la boca del
aislada tubo
- Desenrosque el tubo y flamee la boca del - Introducir el asa en medio del agar hasta el fon-
tubo do
- Proceda a estriar el sland - Incubar por 18-24 hr a 36C
- Incubar a 36 C por 18-24 horas - Para la prueba de Indol, agregar 5 gotas del
- Interpretar reactivo de Kovacs, agitar suavemente
Interpretacin - Interpretar
Positivo: Crecimiento y viraje azul
Negativo: Sin viraje el medio (verde) Interpretacin
Produccin de Orinitina: Positivo: color purpura
D. UREA Negativo: color amarillo al fondo del tubo
La triptena y la glucosa aportan los nutrientes Produccin de Indol: Positivo: anillo rojo en la
para el desarrollo del microorganismo, el rojo superficie
de fenol es el indicador del pH y el cloruro de Negativo: no produce color
sodio mantiene el balance osmtico. Las bac- Movilidad: Positivo: Los microorganismos mvi-
terias que hidrolizan la urea por medio de la les migran de la lnea de siembre hacia el medio
enzima ureasa liberan amoniaco y dixido de formando turbidez
carbono, esto alcaliniza el medio virando el rojo Negativo: crecimiento bacteriano solo en la lnea
de fenol de amarillo al Rosado Intenso, esta de siembra.
prueba puede realizarse en medio liquido o 3.5.4.2 Identificacin de Salmonella sp
slido. El medio es de color amarillo.
Procedimiento
- De un cultivo puro tomar una colonia con una
asa flameada y fra
- Desenrosque el medio y flamee la boca del
tubo
- Estriar la superficie del sland
- Incubar por 18 a 24 hrs a 36C
- Leer reaccin
Interpretacin
Positivo: Rosado intenso
Negativo: Sin viraje el medio (Amari-
llo)
E. MIO (Movilidad, Indol y Orinitina)

Utilizado para la identificacin de enterobacte-
rias sobre la base de:
1. Movilidad:
Pg. 36
- Mezcle la suspensin y el antisuero completa-
mente y a modo de mecedora mueva el portaob-
jeto repetidamente para observar aglutinacin
bajo luz brillante y sobre un fondo negro. Si la
reaccin es positiva en 30 seg a 1 min aparecer
una precipitacin.
- Si presenta aglutinacin en el control se trata
de una cepa rugosa, y no puede ser serotipifi-
cado.
3.5.4.3 Identificacin de Shigella sp

a. Reaccin bioqumica
b. Tincin de Gram
Salmonella typhi
c. Serolgica
Los cultivos de TSI sospechosa de S. typhi de-
ben analizarse serolgicamente con antisueros
de Salmonella Vi y O del grupo D. El antgeno
Vi es capsular puede enmascarar la reaccin
del grupo somtico O, por lo que aislamientos
de Salmonella typhi sern normalmente positi-
vos tanto Vi como para el antisuero D.
Procedimiento
- En un portaobjeto lmpido colocar tres peque-
as gotas de solucin salina
- Tomar una porcin del crecimiento de la super-
ficie de TSI y suspender cada gota de solucin
salina, mezclar
- Aadir una pequeas gota de antisuero O del
grupo D a una suspensin y una pequea gota
del antisuero Vi a una segunda. La tercera sus-
pensin ser control
Pg. 37
3.5.4.4 Identificacin de Vibrio chole-
rae
b. Tincin de Gram
a. Reaccin bioqumica
b. Tincin de Gram
c. Serologa
S. dysenteriae es las mas comn en desintera, los aisla-

mientos con reacciones tpicas en la pruebas bioqumicas
deben estudiarse primero con el antisuero mo-
novalente A1, despus con el antisuero poliva-
lente B y por ultimo el antisuero polivalente D.
Procedimiento
c. Prueba de Cuerda
- En un portaobjeto dividirlo y en cada seccin La prueba se utiliza para distinguir cepas de
colocar una gota de solucin salina V. cholerae de Aeromonas. El desoxicolato de
sodio lisas las bacterias, la solucin perder la
- Tomar muestra de las colonias sospechosas
turbidez y el ADN se desprender de las clulas
del TSI u otro medio no selectivo causando la viscosidad.
- Emulsifique el crecimiento en cada gota de Procedimiento
solucin salina, mezcle completamente las sus- - En un portaobjeto colocar una gota de desoxi-
pensin para hacerla moderadamente lechosa colato sdico al 0.5 %
- Tomar una colonia a analizar previamente in-
- Aadir una gota pequea de antisuero y una
cubada en Agar Infusin de Corazn por 18 a
se usara como control 24 hrs
- Mezclar bien la suspensin y el antisuero para - Interpretar
observar autoaglutinacin. Interpretacin
- Observar el portaobjeto bajo una luz brillante Positivo: Vibrio cholerae; otros vibrios darn po-
y sobre un fondo negro. Reaccin positiva den- sitivo o positivo dbil
Negativo: Aeromonas
tro de 30 seg a 1 min.
- Si observar una el control que es la colonia
con solucin salina, se debe observar una mez-
cla homognea, si hay presencia de aglutina-
cin no sirve para serotipificado.
Pg. 38
nios.
Llevar la muestra inmediatamente al laborato-
3.6 Urocultivo rio, no pasando ms de una hora despus de la
3.6.1 Propsito e importancia recoleccin.
El urocultivo es utilizado para la identificacin Mujeres:

de microorganismos causantes de infecciones
urinarias asintomticas o sintomticas que van a. Realizar la limpieza en el rea genital, sepa-
precedidos de leucocitosos y bacteriuria. Bajo rando los labios mayores, con gasas estril con
condiciones normales no hay bacterias en el jabn antisptico limpiar y con otra gasa estril
tracto urinario. El microorganismo principales con agua quitar el jabn
de infeccin urinaria son bacilos gram nega- b. Dejar secar
tivo y con mayor frecuencia es la Escherichia c. Proceder a recolectar la muestra en un frasco
coli, seguido de Klebsiella sp, Enterobacter sp., estril boca ancha, descartando la primera por-
Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa, de me- cin de la orina en el sanitario y luego recolectar
nor importancia estn los cocos gram positivos la otra porcin a medio chorro
como Enterococcus sp., Staphylococcus au- d. Trasladarla inmediatamente al laboratorio.
reus, S. epidermidis, S. saprophyticus y hongos. Hombres:
Cultivos de orinas con presencia de 2 a ms mi- a. Realizar la limpieza en la punta del pene con
croorganismos es indicio de una mala limpieza gasa estril con antisptico, luego con otra gasa
por lo tanto es una contaminacin. con agua estril quitar el jabn.
El criterio de Kass, es til para interpretar del b. Dejar secar.
crecimiento del bacteriano y ser considerada c. Proceder a la recoleccin de la muestra en
una verdadera infeccin urinaria, siendo este frasco estril boca ancha, descartando la prime-
criterio de igual o mayor a 100,000 UFC/ML ra porcin de la orina en el sanitario y recolectar-
(UFC/ml Unidad formadora de colonias por mi- la otra porcin a medio chorro.
lilitro). d. Trasladar inmediatamente al laboratorio.
3.6.2 Recoleccin de la Muestra y 2. Puncin Supra-pbica

Transporte Esta por ser una tcnica delicada debe ser toma-
da por un mdico pediatra. Es la obtencin de la
De preferencia que el paciente no este con te- muestra por jeringa estril. Esto solo se hace en
rapia antibitica previa a la recoleccin de la casos de que los cultivos aerobios dan negativos
muestra, la muestra adecuada es la primera de y con sintomatologa, malformacin de la uretra
la maana, de no ser posible por lo menos pa- o sospecha de infeccin por un anaerobio.
sar dos horas sin orinar para recolectar la mues-
tra. Al momento de tener la muestra enviarla lo
ms antes posible al laboratorio no mayor de 2
horas. Recolectar en frasco estril previa limpie-
za adecuada.
Existen varios procesos de recoleccin de la
muestra:
1. Chorro medio
Nios: Realizar la limpieza en el rea con agua
y jabn, secar, colocar la bolsita de recoleccin
de orina peditrica adecuadamente (varones
que el pene quede introducido en el agujero
de la bolsita y mujercitas que el agujero quede
en el centro donde saldr la orina). No dejar la
bolsita por ms de una horas colocada en los
Pg. 39
3. Sondas permanentes
Este procedimiento se utiliza en aquellos enfer-
mos con sonda permanente en los que no es
posible retirar o reemplazar la sonda.
Se desinfecta la parte externa de la sonda en la
zona proximal con alcohol yodado y se punza
la sonda con aguja y jeringa estril. Se vuelca
el contenido en forma asptica en un frasco es-
tril.
Criterio de Kass
- Recuentos inferiores a 10,000 UFC/ml, con

hallazgos de cultivos polimicrobianos indican
que hubo una posible contaminacin.
- Recuentos de 10,000 a 100,000 UFC/ml, po-
sible bacteriuria
3.6.3 Asilamiento primario - Recuentos igual o mayor a 100,000 UFC/ml
- Proceder a sembrar la orina con un asa cali- en pacientes asintomticos tienen una probabi-
brada; se utiliza medios de cultivo de Agar San- lidad del 80% de presentar bacteriuria significa-
gre Carnero al 5% permitiendo el crecimiento tiva, probabilidad que aumenta hasta el 96% en
de todo tipo de bacterias, Agar MacConkey paciente sintomtico.
permitiendo el crecimiento de bacterias Gram - Muestras obtenidas por Puncin Suprapbica
negativo. Tambin puede usarse Chromocult o cualquier recuento de colonia es significativo.
CLED este inhibe el swarming de Proteus sp
- Con un asa calibrada de 0.001 ml flameada 3.6.4 Identificacin de principales mi-
y fra proceder a tomar la muestra de orina pre- croorganismo
viamente agitada y abierta cerca del mechero
- Realizar un lnea con el asa calibrada en el 3.6.4.1Escherichia coli
centro de la placa de Agar Sangre y otra lnea Reaccin bioqumica
con el asa flameada y fra en la placa de Mac-
Conkey de igual manera
- Con un asa no calibrada realizar las estras en
forma de zigzag.
- Incubar el Agar Sangre en jarra con candela
ambiente de CO2 y el Agar MacConkey en ae-
robiosis a 35-36 C por 18 a 24 hrs.
- Interpretacin, si no hay crecimiento en un
cultivo por 48 horas reportar Negativo a las 48
horas de Incubacin, si hay presencia de creci-
miento contar el nmero de colonias presentes
y multiplicar por 1000 si se usa asa calibrada
de 0.001 y multiplicas por 100 si se us asa
calibrada de 0.01 ml realizar la identificacin de
la bacteria por medio de reacciones qumicas.
Tener en cuenta el criterio de Kass.
Pg. 40
Escherichia coli (gram negativas)
con la tincin de Gram.
Pg. 41
Pg. 42
- Desinfectar la superficie con alcohol al 70% o
3.7 Secreciones Varias yodo
3.7.1 Secreciones de heridas y absce- - Introducir la aguja a travs de la piel o la pared
sos de absceso y aspirar aproximadamente 1 ml del
3.7.1.1 Propsito e importancia material purulento
- Colocarlo en un frasco estril o un medio de
Est indicado para detectar la presencia de transporte y enviar inmediatamente al laborato-
bacterias causantes de infecciones en piel, ojo, rio
odos, quemaduras, abscesos y otros. La piel
es el rgano ms accesible del cuerpo que pue- 3.7.1.2.3 Toma de muestra en quema-
de tener mayor probabilidad de ser daado o duras
traumatizado, causando dolor, hinchazn, calor - Limpiar y retirar el tejido muerto o quemado an-
y enrojecimiento alrededor de la herida hasta tes de la obtencin de la muestra (hisopado del
formar abscesos. La infeccin puede ser mono- exudado o una biopsia)
microbianas o polimicrobianas. - Llevar la muestra del tejido en frasco estril
Los microorganismos ms frecuentes S. aureus,
S. epidermides, Enterococos, E. coli, Klebsiella 3.7.1.2.4 Toma de muestra de ojo
sp, Enterobacter sp, P. aeruginosa, Candida al- - Realizar la toma de muestra antes de colocado
bicans. analgsicos locales, colirio o antibiticos
- Proceder a la toma de muestra con hisopo ro-
3.7.1.2 Recoleccin de la muestra y tando suavemente el hisopo en el ngulo interno
transporte Previo a tomar la muestra del ojo e introducirlo en el medio de transporte
el paciente no debe estar tomando an- - Con un hisopo estril y hmedo con solucin
tibitico. salina tomar la muestra y realizar los frotes gram
- Si es para investigar Chlamydia trachomatis,
3.7.1.2.1 Toma de muestra de Herida verter el prpado y frotar con una torunda la su-
- Realizar una buena asepsia de los bordes con perficie conjuntival y teir con coloracin Giem-
solucin salina estril, realizando de adentro sa. Observar inclusiones intracitoplasmaticas
hacia fuera en forma concntrica
- Separa suavemente los bordes de la herida
con el pulgar e ndice de la mano.
- Con la otra mano, con cuidado de no tocar los
bordes cutneos, introducir la punta del hisopo
en la profundidad de la herida, rotando el hisopo
y avanzando hacia fuera.
- Obtener dos muestras
o Una para cultivo, introduciendo en un medio
de transporte amies, stuart.
o La segunda para realizar una coloracin
Gram, KOH o ZN realizar inmediatamente. 3.7.1.2.5 Toma de muestra de Odo
- Enviar el medio de transporte al laboratorio.
- Limpiar el canal auditivo externo con un hisopo
3.7.1.2.2 Toma de muestra de Absceso impregnado con Sol. Salina estril
- Proceder a la toma de muestra con el medio
La toma de muestra de absceso debe ser toma- de transporte, de atrs hacia delante y de abajo
da por aspiracin con jeringa. hacia arriba
-Realizar un frote para coloracin Gram con un
- Realizar una limpieza de la superficie con so- hisopo estril humedecido con sol. Salina est-
lucin salina, debe realizarse de adentro hacia ril, por sospecha de hongo
fuera en forma concntrica.
Pg. 43
3.7.1.3 Aislamiento primario
- Realizar el inoculo en los medios de cultivo; si es material purulento colocar una gota en un
extremo del medio de cultivo; los medios de cultivo a usar son Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar
MacConkey, Agar Manitol Sal
- Flamear y enfriar un asa en argolla y proceder a estriar. A modo de obtener aislamiento de colo-
nias.
- Incubar el Agar sangre y Agar Chocolate en jara con candela a 37C y el Agar MacConkey y
Manitol sal en aerobiosis a 37C por 24 horas
- Observar crecimiento identificando bacterias patgenas. Realizar antibiograma
- Realizar la fijacin del frote gram con el mechero y proceder a teirlo con la coloracin Gram o
ZN.
- Si a las 24 horas no hay crecimiento incubar por 24 horas ms.
3.7.1.4 Identificacin de principales microorganismos

3.7.1.4.1 Esquema de identificacin de Cocos Gram positivo
Tabla No. 7 Identificacin de Staphylococcus aureus y coagulasa negativa
Pg. 44
Tabla No. 8
Identificacin de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y alfa hemolisis
Tabla No. 9
Identificacin de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y beta hemolticos
Tabla No. 10
Identificacin de Cocos Gram positivo, catalasa negativa y gamma hemolisis
Pg. 45
3.7.1.4.3 Identificacin de Gram Nega-
3.7.1.4.2 Identificacin de Gram negativo no Fermentador Pseudomonas ae-
tivo Fermentadores Escherichia coli, roginosa
Klebsiella pneumoniae y Enterobacter Pseudomonas aeroginosa es fcil de reconocer
cloacae en medios de aislamiento primario por la morfo-
En agar MacConkey visualizar la morfologa de loga de la colonia que son generalmente plana,
las colonias, (Tabla No. 11 Fig. 19) algo extendidas, bordes aserrados y tienen un
Escherichia coli: lactosa positiva, colonias de brillo metlico, por la produccin de pigmentos
borde entero, color fucsia opacas de 2-3mm de difusibles si est presente porque algunas cepas
dimetro. Usualmente se observa una zona opa- no lo producen y son bastante mucoides y son
ca alrededor de la colonia. aislados de pacientes con fibrosis qustica y el
Klebsiella pneumoniae: colonias de borde ente- olor caracterstico.(Tabla No. 12, figura No. 20)
ro color rosado a rosado oscuro de 3-4 mm de
dimetro y aspecto mucoide. Tabla No. 12
Enterobacter spp: colonias de borde entero, co-
lor rosada 2-4 mm de dimetro, no tan mucoide
como Klebsiella pneumoniae.
Pg. 46
Mujeres adultas
- Colocar a la paciente en una camilla en po-
3.7.2 Secrecin Vaginal sicin ginecolgica, introducir el especulo hasta
visualizar el cuello
3.7.2.1 Propsito - Introducir el hisopo tomar una muestra e intro-
ducirlo en un medio de transporte Stuart o Amies
La mucosa genital es una regin vulnerable a la o Amies con carbn
infeccin producida tanto por microorganismos - Proceder a tomar dos muestras con hisopo,
constitutivos de la microbiota habitual como por uno para hacer el extendido para la tincin y otro
los adquiridos de forma exgena a travs del colocarlo en solucin salina estril para observa-
contacto sexual, estn normalmente coloniza- cin en fresco
das por diferentes microorganismos que inclu- - Las muestras en medio de transporte deben
yen estafilococos coagulasa negativo, corine- ser enviada inmediatamente al laboratorio, si no
bacterias, estreptococos, bacterias anaerobias es posible mantenerlo a temperatura ambiente y
y con menor frecuencia levaduras. En edad re- no exceder de 18 horas.
productiva destaca la presencia de Lactobaci- En mujeres embarazadas, en busca de Strep-
llus acidophilus, ejerciendo un control biolgico tococcus agalactiae (beta-hemolitico del grupo
y un mecanismo de defensa para el epitelio va- B) se recomienda la toma de muestra introdu-
ginal. Las infecciones del tracto genital femeni- ciendo el hisopo por el canal vaginal sin colocar
no pueden ser de origen endgeno, causadas especulo.
principalmente por Gardnerella vaginalis, Strep-
tococcus agalactiae o Candida sp.
3.7.2.2 Recoleccin de la muestra y

transporte
Condiciones previas a la obtencin de la mues-
tra, no estar en tratamiento de antibitico, no
realizarse ducha vaginales ni relaciones sexua-
les 24 horas antes de la toma de muestra. Y no
baarse el da de la recoleccin de la misma.
Tabla No. 13
En Nias
En nias NO utilizar especulo.
- Colocar a la nias en posicin ginecolgica
- Realizar una previa limpieza para evitar conta-
minacin con flora colonizante
- Utilizar hisopos finos estriles (Dacron) hume-
decido con solucin salina y proceder a tomar la
muestra desde los labios menores, introducirlo
en medio de transporte Stuart o Amies o Amies
con carbn
- Utilizar otro hisopo para el extendido
Pg. 47
Tabla No. 14
3.7.2.3 Aislamiento Primario
- Proceder a realizar el inoculo en medios

de cultivo como Agar Sangre, Agar Choco-
late, Agar MacConkey, Thayer Martin, Mani-
tol Sal, rotando el hisopo sobre la superficie.
- Con asa en argolla flameada y fra proce-
der a dispersar la muestra en cuatro cua-
drantes a modo de tener colonias aisladas.
- Incubar las placas de Agar San-
gre, Chocolate y Thayer Martin a 35-
36C en medio de CO2 por 24 horas Diagrama de identificacin de N. gono-
- Las placas de MacConkey y Manitol Sal incubar- rrhoeae
la a 35-#6C en ambiente aerobiosis por 24 horas
- Concluida las 24 horas observar cre-
cimiento de colonias sospechosas,
3.7.2.4 Identificacin de principales

microorganismo
Examen en Fresco: Informar la presencia

de clulas descamativas, leucocitos y bac-
terias, presencia o ausencia de levaduras
y de trofozooitos de Trichomonas vaginalis.
Gram: Identificar clulas clave, que son c-
lulas descamativas recubiertas por coco-
bacilos gram variable, Lactobacilos, pre-
sencia de polimorfonucleares, levaduras. 3.7.2.4.2 Identificacin de Gardnere-
Giemsa: Observar cuerpos de inclusin lla vaginalis
sugestivas de C. trachomatis. La tcni- Es un bacilo inmvil no encapsulado de 0.5 por
ca citolgica tiene baja sensibilidad, pu- 1.5 a 3 mm, anaerobio facultativo, catalasa y
diendo confirmar por medio de tcnicas inmu- oxidasa negativo. El diagnostico se basa en la
nolgicas o ampliacin de cidos nucledos. presencia de al menos tres de cuatro criterios
clnicos por Amsel:1) Descarga fina, blanca ad-
3.7.2.4.1 Identificacin presuntiva de herente y homognea, 2) pH superior a 4.5, 3)
N. gonorrhoeae Prueba de Amina Positiva y 4) Clulas indicado-
ras o clula clave Tabla No. 15 y Fig. 23
Diplococos gram negativo en pareja, ttradas o Prueba de Aminas: olor caracterstico a pescado
racimo en la tincin de gram, las colonias de color al aadir 1 gota de KOH a una gota de la secre-
rosada a caf o grisceas y brillantes de 0.5-1.0 cin.
de dimetro en medios agar Thayer Martin, oxi-
dasa positiva. Pruebas suplementarias tpicas de
N. gonorrhoeae son (Tabla No. 14 figura No. 22)
Pg. 48
Tabla No. 15
3.7.2.4.4 Identificacin de Candida

albicans
Se caracteriza por presentar colonias cremosas
de color blanco-amarillento, lustroso poco eleva-
do y de bordes bien definidos Figura No. 25
Tubos germinales
- Suspender un inculo de la cepa pura de can-
dida de 24 horas de desarrollo en plasma huma-
no fresco (plasma EDTA)
- Incubar por 2 horas aproximadamente a 35-
36C
- Luego colocar dos gotas en un portaobjeto,
cubrir con cubreobjeto, observar al microscopio
con objetivo 40X
- Interpretacin:
3.7.2.4.3 Identificacin de Strepto- Positivo: visualiza una estructura elongada que
coccus agalactiae se origina a partir de la levadura.
Streptococcus agalactiae o Estreptococo grupo Negativo: se ven las levaduras redondas sin
B de Lancenfield, es aerobio facultativo, gram elongacin.
positivo, diplococo que se agrupan en cadena,
en agar sangre carnero al 5% crecen las colo-
nias de color gris a blanquecino, brillantes y un
poco ms brillantes, produce beta hemolisis Ta-
bla No. 16 y fig. 24.
Tabla No. 16
Pg. 49
Chocolate, Agar Manitol Sal y Agar MacConkey
- Con un asa en argolla flamea y fra proceder
3.8 Esputo de cultivo bacteriano a realizar los estriados a modo de obtener colo-
3.8.1 Propsito nias aisladas
- Incubar el Agar Sangre y Chocolate en me-
El esputo es un material mucoso que se segre- dio de CO2 y los medios de Manitol Sal y Mac-
ga en los pulmones o bronquios. El cultivo de Conkey en ambiente aerobios a 35-36C
esputo est indicado para investigar infeccio- - Realizar frote para tincin de Gram y Ziehl Ne-
nes respiratorias inferiores que pueden causar elsen
neumona, bronquitis o tuberculosis. - Proceder a verificar colonias sospechosas de
La neumona bacteriana o infeccin pulmonar patogenicidad y realizar pruebas primarias y
puede ser causada por: confirmatorias, y el antibiograma
a. Neumona Neumocccica: el agente causal
es el Streptococcus pneumoniae. Valoracin de la muestras es adecuada toman-
b. Neumona No Neumocccica: el agente cau- do en cuenta el criterio de Murria con un frote
sal son Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus teido de Gram.
aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus
influenzae, y ocasionalmente por otras entero- 3.8.3.1 Realizacin del frote del Esputo
bacterias. - Colocarlo una porcin de la muestra sobre un
portaobjeto y con otro portaobjeto colocarlo en-
La muestra de esputo es muy importante para cimas y realizar leve presin luego deslizar los
poder realizar una buena identificacin por tal portaobjetos en direcciones contrarias, a modo
razn la muestra debe ser tomada adecuada- de obtener frotes delgados
mente y rechazar las muestras que estn con- - Dejar secar, y fijarlos con calor sobre el me-
taminadas con saliva. chero pasando el portaobjeto tres veces
- Realizar la tinciones solicitadas, tincin de
3.8.2 Recoleccin de la muestra y gram y/o tincin de ziehl neelsen (ver Sec. 2.4)
transporte
Condiciones previas antes de la toma de mues- 3.8.3.2 Criterio de Murria
tra que el paciente no debe estar con terapia Para evaluar que la muestra este correctamen-
antibitica, de preferencia la primera muestra te tomada se debe realizar un frote gram ob-
de la maana y no realizar gargarismos con an- servarlo al microscopio con objetivo seco dbil
tispticos. (100x) evaluando las siguientes condiciones
Procedimiento segn el criterio de Murray y Washington don-
- Indicar al paciente que se realice un lavado de son aceptables las muestras del grupo 4 y 5
bucal con agua, no cepillar los dientes con pas- Tabla No. 17:
ta dental
- Que el paciente se acuesta en la cama boca Tabla No. 17
abajo, que desgarre con fuerza el esputo
- Depositar la muestra en un frasco estril de
boca ancha
- Enviar lo ms pronto posible al laboratorio
3.8.3 Aislamiento primario

- Proceder a inocular los medios de cultivo te-
niendo en cuenta todas las medidas de biose-
guridad
- Con un palillo estril o asa flameada y fra se-
leccionar porciones del esputo que contenga
sangre o pus
- Inocular en Agar Sangre Carnero al 5%, Agar
Pg. 50
3.8.4 Identificacin de Principales Mi-
croorganismo
3.8.4.1 Identificacin de Streptococ-

cus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae es el agente co-

mn de las enfermedades respiratorias bajas
y altas, tales como neumona y otitis media
aguda, y meningitis.
3.8.4.2 Identificacin de Haemophilus

influenzae
Es el agente etiolgico ms frecuente de enfer-

medades como neumona, meningitis, otitis me-
dia y conjuntivitis. Son bacilos gram negativo,
pequeos o cocobacilos, anaerobios facultati-
vos, requieren factores de crecimiento X y V (X
= hematin, V = nicotinamide adenine dinucleoti-
de(NAD)), crecen en agar chocolate pero no en
agar sangre de carnero y tienen un olor picante
a indol, catalasa positivo, oxidasa positiva Figu-
ra No. 26
Pg. 51
una gota de plasma humano o de conejo sobre
un portaobjeto
4 Anexos - Mezclar suavemente con el asa y despus por
4.1 Prueba de Catalasa rotacin
til para comprobar la presencia del enzima ca- - Observar si hay aglutinacin microscpica in-
talasa que se encuentra en la mayora de las dicando positiva la prueba
bacterias aerobias y anaerobias facultativas
que contiene citocromo, excepto Streptococcus Positivo hay aglutinacin dentro 5 a 20 segun-
sp. dos
Material Negativo no hay aglutinacin dentro de 3-4 mi-
- Portaobjeto nutos
- H2O2 al 30% En tubo
Procedimiento - Tubo de vidrio estril colocar 0.5 ml de una
- En un portaobjeto colocar una gota de H2O2 dilucin 1:4 de plasma humano o de conejo
al 30% - Tomar una asada de bacterias, rotar suave-
- Tomar con una asa una colonia pura de 18-24 mente el tubo sin sacudir
horas y extender la colonia sobre el agua oxi- - Incubar por 4-6 horas observar a cada 30 mi-
genada suave nutos a 35C
Positivo: formacin de burbujas - No sacudir el tubo en cada chequeo, inclinar el
Negativo: no se observan burbujas tubo suavemente para ir observando el coagulo.
- Descartar el portaobjeto en recipiente con Positivo: formacin de un cogulo
desinfectante Negativo: el plasma permanece lquido y no se
form el cogulo.
4.2 Prueba de Coagulasa

Prueba usada especficamente para diferenciar
las especies del gnero Estafilococos. 4.3 Prueba de Manitol Sal
Procedimiento
- Sembrar la bacteria a estudio en un medio ma-
nitol sal
-Incubar a 36C durante 18-24 horas
Positivo: Presencia de crecimiento y cambio de
La coagulasa es una enzima producida por S. color amarillo del medio indica utilizacin del
aureus, estable al calor, resistente a temperatu- manitol (S. aureus)
ras arriba de 60C por 30 minutos. Negativo: No hay cambio de color en el medio,
Material permanece rosado o rojizo. (S. epidermidis )
- Plasma EDTA
- Portaobjeto o tubo
Procedimiento
En portaobjetos
- Preparar una suspensin gruesa y bien ho-
mognea de cada microorganismo en una so-
lucin salina estril.
- Colocar una suspensin de la bacteria con
Pg. 52
4.4 Prueba de DNasa
El Staphylococcus aureus, produce una DNAa-
sa termoestable que hidroliza DNA. La pro-
duccin de DNAsa puede determinarse incor-
porando cido desoxirrubonucleico (DNA) en
agar nutritivo
Material
- Agar nutritivo o agar DNAsa con azul de tolui-
dina 0.1 gr/l
- HCL 1%
Procedimiento
- Inocular la bacteria a estudio en mancha den-
sa sobre el agar nutritivo
- Incubar de 18 a 24 horas
- Revelar con HCL 1% que precipita el DNA
nativo del medio si se usa solo el agar Nutritivo
Interpretacin: Colonias rodeadas por una
zona clara donde el ADN ha sido despolimeri-
zado e hidrolizado es una prueba positiva.
- Si se utiliza Agar DNasa, realizar una siembra
espesa formando un pequeo crculo de aprox.
1 cm
- Incubar a 36C de 18-24 horas ambiente 4.5 Prueba de Novobiocina
aerbico Se basa en que ciertas bacterias son sensibles
Positivo: produccin de un halo rosado alrede- a la novobiocina.
dor de la colonia que produce DNAsa. Procedimiento
Negativo: no hay cambio de coloracin en el - Realizar una suspensin de la bacteria a es-
medio. Alrededor de la colonia permanece tudio en caldo de tripticasa soya al 0.5 de Mac-
azul. Farland
- Inocular en agar Mueller Hinton con la metodo-
loga de Kirby Bauer
- Colocar el disco de novobiocina 5ug
- Incubar a 37 C por 24 horas
- Un dimetro mayor o igual a 16mm de inhibi-
cin considerado como susceptible.
Sensible: S. epidermides
Resistente: S. saprophyticus
Pg. 53
contenga PYR L-pirrolidonil-b-naftilamida
- Incubar por 4 horas a 35C
4.6 Prueba de Bacitracina A - Luego agregar un colorante diazo (NN-dime-
Esta prueba til para el diagnstico presuntivo til-amino-cinamaldehdo)
de Streptococcus beta hemoltico del grupo A Positivo: un desarrollo de color rojo positivo
de Lancefield. (Estreptococos del grupo A y Enterococos)
Material Negativo: no hay cambio de color o se observa
- Agar Sangre Carnero al 5% un color naranja
- Disco de Bacitracina de 0.04 U Nota: algunos estafilococos pueden dar positiva
la prueba.
Procedimiento
- De una aislamiento puro de la colonia beta
hemoltica, suspender en 1 ml de caldo triptica-
sa alcanzar una turbidez similar al 0.5 MacFar-
land
- Con un hisopo realizar el inoculo en un agar
sangre carnero al 5%,
- Proceder a estriar en forma de tapete
- Con una pinza flameada y fra colocar un fis-
co de Bacitracina 0.04 U (Taxo A) en el centro
- Incubar por 16-24 horas en jarra con candela
- Examinar y observar un halo de inhibicin
alrededor del disco de Taxo A.
4.8 Prueba de CAMP
Prueba para identificacin presuntiva de Es-
treptococos del grupo B (Streptococcus agalac-
tiae beta hemolitico), es el nico que produce
una prueba de CAMP positiva. La prueba de-
tecta una protena extracelular estable al calor
difusible producida por Estreptococos del grupo
B que mejora la hemlisis de eritrocitos por el
Staphylococcus aureus.
Material
- Cepa ATCC S. aureus ATCC 25923
- Agar Sangre de Carnero 5%
Procedimiento
- La cepa de S. aureus ATCC 25923 rayar una
lnea recta a travs del centro de la placa de
Agar Sangre Carnero.
- Perpendicular a la raya del S. aureus realizar
el inoculo de la bacteria a estudio realizando
4.7 Prueba de PRY (pirrolidonilarila- una lnea recta de 2-3 cms de longitud, pero sin
midasa) tocar.
Es una prueba presuntiva tanto Estreptococos - Incubar la placa a 37C durante 18 24 ho-
del grupo A como del grupo D. Reemplaza la ras, en ambiente aerbico.
prueba de Bacitracina y la prueba de toleran- Positivo: aparece como hemlisis punta de
cia a la sal para Estreptococos del grupo A y flecha entre la unin del crecimiento del S.
especies de Enterococo respectivamente. La aureus y Estreptococos del grupo B.
enzima detectada es la pirrolidonil arilamidasa Negativo: no se observa la formacin de flecha
Procedimiento de hemlisis.
- Inocular la bacteria a estudio en caldo de que
Pg. 54
Procedimiento
- Una colonia aislada, sembrar en estra en la
zona del pico de flauta.
- Incubar a 35-36C durante 24-48 horas
Interpretacin
La aparicin de un color castao oscuro o ne-
gro en el medio indica hidrlisis de la esculi-
na. Si no hay cambio se considera negativa la
prueba
4.9 Prueba de Hidrlisis de Hipurato

Detectar la capacidad de la bacteria de hidro-
lizar el hipurato mediante la enzima hipurica-
sa. La hidrlisis de hipurato dar como resul-
tado glicina, que reaccionara con la ninhidrina
provocando un cambio de color.
Material
- Tubos con 0.4 ml de hipurato de sodio al 1%
Procedimiento
- Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipura-
to de sdio con el microorganismo 4.11 Crecimiento de NaCl 6.5%
- Incubar por dos horas 36-37C Diferenciacin de Streptococcus del grupo D
- Agregar 0.2 de ninhidrina, si agitar con respecto a Enterococos.
Positivo: Color morado fuerte ( S. agalactiae) Procedimiento
Negativo: no hay cambio de color (S. faecalis) - Inocular 2 3 colonias del microorganismo
en el medio de caldo tripticasa soya + 6.5% de
NaCl
- Incubar a 35C por 24-48 horas
- Observar el caldo de cultivo
Positivo: turbidez (enterococos)
Negativo: limpio no se observa crecimiento
4.10 Bilis Esculina

Propiedad de algunos microorganismos de hi-
drolizar el glucsido esculina en esculetina y
glucosa, la esculetina producida reacciona con
un sal de hierro incorporada al medio, dando
un color castao oscuro o negro.
Pg. 55
- Agregar 0.5 ml de solucin salina al otro tubo
Control
4.12 Prueba de Sensibilidad a Optoqui- - Agitar suavemente ambos tubos e incubarlos a
na 35C por 3 horas
La prueba se utiliza un disco de 6mm con 5ug Positivo: Desaparece la turbidez del tubo prueba
de optoquina, tiene como objetivo diferenciar (S. pneumoniae)
Streptococcus pneumoniae de las de Estrepto- Negativo: permanece turbio.
coco viridans. En Agar
Procedimiento - Colonias aisladas en un agar sangre de car-
- Inocular una colonia alfa-hemoltica con un asa nero, agregar una gota de deoxicolato de sodio
estril en una placa de Agar Sangre Carnero al al 2% (diluir el reactivo al 10% 1:10 con agua
5%, extender la bacteria. destilada)
- Colocar aspticamente un disco de optoquina - Sin invertir la caja incubar a 35C por 30 minu-
o disco P sobre el estriado. tos
- Incubar en ambiente de CO2 por 18-24 horas Positivo: las colonias desaparecen dejando una
a 36C. zona de hemlisis parcial en el rea donde se
- Interpretar los resultados encontraban. (S. pneumoniae)
Sensible: presencia de un halo mayor a 14mm Negativo: Las colonias son insolubles y perma-
(S. pneumoniae), si se usa disco de 10 mm el necen intactas. (Estreptococos del grupo viri-
halo ser mayor o igual a 16mm dans)
Resistente: No hay presencia de halo de inhibi-
cin son estreptococos viridans
4.13 Solubilidad en Bilis 4.14 Prueba de Satelitismo

La prueba de solubilidad en bilis es otra prueba Se conoce como satelitismo al fenomeno de
para identificacin de S. pneumoniae. H. influenzae de crecer en colonias diminutas
cercanas a una bacteria productora de factor V
Procedimiento cuando se cultiva en agar sangre de carenro.
En tubo Esto ocurre generalmente con Staphylococcus
- Transferir 0.5 ml de un cultivo de 18-24 horas beta hemoltico porque produce altas cantidades
de un caldo TOdd Hewitt a dos tubos limpios. de factor V (NAD).
- Agregar una gota de rojo de fenol a cada uno
de los tubos Procedimiento
- Ajustar el pH a 7 con NaOH 0.1N -En un agar Sangre de Carnero al 5% estriar en
- Agregar 0.5ml de doxicolato de sodio al 10% a toda la superficie en una sola direccin de Hae-
uno de los dos tubos (Prueba) mophilus.
Pg. 56
- Tomar una asada de un cultivo de Staphylo-
coccus aureus o beta hemoltico, realizando
una estria perpendicular al sembrado.
- Incubar en jarro con canderla o en CO por 24
horas a 36C,
- Luego examinar el crecimiento de pequeas
colonias puntiformes muy cerca de la estria de
estafilococo.
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Pg. 59
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TAMIZAJE, AISLAMIENTO,
IDENTIFICACION Y SENSIBILIDAD DE MICOBACTERIAS
Rosa Alvarez, Diana Baldizon

Margarita Boloix, Hctor Cat
Lis Jerez, AnaLucia Lemus
1. INTRODUCCION
En la ltima dcada, la tuberculosis (TB) ha resurgido como una de las mayores causas de muerte
ya que anualmente se registran cerca de 3 millones; en 1995 caus ms de 75,000 muertes en
Latino Amrica y el Caribe, lo cual significa que cerca de 1,100 personas enfermaron y ms de
200 murieron por TB cada da. Se estima que existen 8.8 millones de nuevos casos cada ao
que corresponden a 52,000 muertes por semana o ms de 7,000 cada da, lo que se traduce en
ms de 1,000 nuevos casos cada hora, cada da. Estas tasas de muerte reflejan solo parcialmen-
te la tendencia global de la TB, ya que ms del 80% de los pacientes se encuentran en la edad
econmicamente activa (15 49 aos). Se estima que en el ao 2000, 2 mil millones de personas
se encuentran infectadas con M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium, 3 millones de
personas mueren anualmente por complicaciones de tuberculosis en todo el mundo. Se calcula
que hay 8 millones de nuevos casos cada ao, el 95% de los cuales aparecen en pases en vas
de desarrollo. En los pases industrializados, el 80 % de los casos aparecen en personas mayores
de 50 aos; en los pases en vas de desarrollo el 80% se produce entre los 15 y los 50 aos. Se
estima que 3 millones de personas que padecen tuberculosis tambin tienen VIH/SIDA.
Existen factores predisponentes en los pases en vas de desarrollo como:
Inmigracin de personas de zonas de alta endemicidad.
Condiciones socioeconmicas bajas en ciudades con alta poblacin.
Aumento de personas infectadas con VIH/SIDA.
Durante las primeras dcadas del siglo XX, se dio una disminucin progresiva de la incidencia de
la tuberculosis, y alcanz su menor nivel a comienzos de la dcada de 1980. Muchos microbi-
logos pensaron que la tuberculosis estaba por ser vencida, dado que la enfermedad alcanz la
lnea basal de cero en muchas partes del mundo a fines de la dcada de los 70s. Pero sucedi
todo lo contrario.
Actualmente las tasas de morbilidad y mortalidad han aumentado, con el aparecimiento de cepas
resistentes de Mycobacterium a mltiples drogas y por el VIH/SIDA.
Para Guatemala la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) report una tasa de incidencia de 80
por cada 100,000 habitantes en el ao 2000.
La epidemia del Sndrome de Inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y el descenso de los estnda-
res socioeconmicos, entre otros, contribuyen al resurgimiento de
la enfermedad en pases industrializados. Aunque en la mayora
de los pases en desarrollo, la TB ha sido siempre endmica, su
severidad se ha incrementado debido a la pandemia del Virus de
Inmunodeficiencia Humana (VIH) y a los niveles de pobreza impe-
rantes. La situacin de la TB a nivel mundial se ha agravado con
el aparecimiento de cepas multirresistentes a las drogas antituber-
culosas, que incrementan las tasas de mortalidad y representan
un serio problema para el control de esta enfermedad, por ello la
realizacin de una susceptibilidad antibitica con un perfil delimita-
do de antibiticos es de gran ayuda para poder evitar y/o disminuir
la multirresistencia y poder brindar tratamientos efectivos.
Pg. 60
La TB puede ser tanto pulmonar, que es la ms
2. GENERALIDADES comn y ocurre en ms del 80% de los casos,
como extrapulmonar. Es importante mencionar
La TB es una enfermedad infecciosa aguda o que aproximadamente un 90% de las personas
crnica que en nues- que se infectan nunca desarrollan la enferme-
tro medio es la infec- dad ya que el bacilo permanece dormido den-
cin humana ms im- tro del organismo del husped y su presencia
portante causada por (infeccin) puede determinarse por una reac-
micobacterias puede cin positiva a la prueba tuberculnica PPD
afectar a cualquier (derivado proteico purificado). Adems es ne-
tejido del organismo cesario poder determinar la presencia de la en-
pero generalmente se fermedad para poder minimizar la cantidad de
localiza en los pulmo- pacientes con cepas resistentes a los medica-
nes por la inhalacin mentos antituberculosos y poder disminuir con
del agente causal que por lo general es Myco- ello la cantidad de enfermos bacilferos crnicos
bacterium tuberculosis (muy rara vez M. bovis o en las comunidades.
M. africanum). El nombre de Tb deriva de la for-
macin de unas estructuras celulares caracte- 3. PROPSITO E IMPORTANCIA
rsticas denominadas tuberculomas, donde los
bacilos quedan encerrados. Este microorganis- La finalidad primordial es demostrar por medio
mo, tiene forma bacilar, es aerobio estricto, de de coloraciones, pruebas de tamizaje, cultivos
crecimiento lento, inmvil, no poseen cpsula especiales y pruebas de identificacin la pre-
ni producen esporas, se tie con dificultad por sencia de bacterias que pertenecen al gnero
su contenido alto de grasas en la pared celular Mycobacterium, especialmente Mycobacterium
por lo que el colorante a utilizar debe poseer tuberculosis. Aproximadamente doce especies
fenol y/o realizarse con calor por lo que una vez de ste gnero se asocian a infeccin humana,
teidas con fuchsina carblica (fenolada) no se pero en nuestro medio Mycobacterium tubercu-
decoloran al agregar el alcohol acidificado y de losis es la especie de mayor importancia.
all el trmino Bacilos alcohol cido resisten- La deteccin de micobacterias es una gran res-
tes (BAAR). Es resistente al fro, la congela- ponsabilidad para el laboratorio de microbiolo-
cin y desecacin. Es muy sensible al calor, la ga, ya que un resultado positivo de frote o culti-
luz solar y ultravioleta. Se divide lentamente, vo implica serias consecuencias para el paciente
por lo que su crecimiento es lento. y afecta su vida con un tratamiento especfico
por varios meses, o incluso aos; por lo que un
La TB se transmite de un enfermo con tubercu- resultado positivo debe informarse de inmediato
losis pulmonar a otras personas por medio de al mdico responsable. Se debe tener todo el
pequeas gotitas que el paciente expulsa, al to- cuidado de no confundir las muestras, especial-
ser o estornudar. El riesgo a infectarse depen- mente cuando hay en grandes cantidades; se
de de la concentracin de gotitas en el aire y recomienda trabajarlas de cinco en cinco. Esto
del perodo de tiempo que se respire; se reduce evitara que se den resultados falsos ya que los
mediante la renovacin del aire, por ventilacin mismos traeran serias consecuencias para el
del exterior y paciente.
por la expo-
sicin a la luz 3.1. TUBERCULOSIS PULMONAR Y TU-
solar o rayos BERCULOSIS EXTRAPULMONAR
ultravioleta. El diagnstico de la TB extrapulmonar depende
Cada enfermo de la probabilidad de encontrar los bacilos en
puede conta- los sitios de infeccin, los cuales se encuentran
giar a 10 a 15 en cantidades muy pequeas, excepto si hay
personas. caseificacin o formacin de cavidades,
Pg. 61
4.1. Nivel I
las biopsias del tejido pueden rendir resultados
positivos en comparacin a los fluidos en donde Realiza lo siguiente:
el nmero de los bacilos se ve disminuido por la a. Recoleccin de muestras clnicas adecuadas
dilucin. El diagnstico de la TB extrapulmonar (incluyendo esputo inducido por aerosol).
es difcil a menudo por su localizacin en sitios b. Transporte y envo de muestras a un labora-
del organismo de acceso complicado, adems torio de nivel superior para el aislamiento e iden-
el carcter serio de esta forma de tuberculosis tificacin.
se debe frecuentemente a su diagnstico tar- c. Puede preparar y examinar frotes para el
do. diagnstico presuntivo y/o como monitoreo del
progreso de los pacientes diagnosticados que
Previo a la estn siendo tratados con medicamentos.
pandemia del
VIH, aproxi- 4.2. Nivel II
madamente
el 15% de Adems de todas las funciones del laboratorio
los nuevos Nivel I, realiza lo siguiente:
casos de TB a. Procesa muestras para su cultivo en medios a
eran extra- base de huevo y medios a base de agar y hue-
pulmonares. vo.
Estos casos b. Identificacin de Mycobacterium tuberculosis
son de difcil c. Puede realizar estudios de susceptibilidad an-
diagnstico, dado que son menos comunes a timicrobiana con drogas antituberculosas prima-
los mdicos y porque los sitios de infeccin son rias
menos accesibles y visibles. La TB extrapulmo- d. Retiene cultivos de micobacterias para test
nar ms frecuente son la linftica, pleural, geni- adicionales o repeticin de pruebas (se reco-
tourinaria, miliar, sea, menngea y peritoneal. miendan 6 meses de retencin)
Los pacientes con TB pulmonar activa son alta-
mente infecciosos para otros pacientes y para 4.3. Nivel III
el personal de cuidados de salud, como ya se
ha mencionado en la parte de introduccin del Adems de las funciones de los laboratorios I y
presente trabajo. Este tipo de transmisin se II, realiza lo siguiente:
asocia a desarrollo rpido de la enfermedad en a) Identificacin de todas las especies micobac-
unas cuatro semanas, con mal pronstico. De terianas de muestras clnicas
igual manera este tipo de transmisin contribu- b) Puede realizar estudios de susceptibilidad
ye en los casos de alta resistencia. . antimicrobiana de micobacterias
El aumento de casos de Tb extrapulmonar, crea c) Puede dirigir investigaciones y brindar entre-
la necesidad de un mejor diagnstico y nuevas namiento.
tcnicas para el aislamiento y susceptibilidad
micobacteriana, estableciendo como punto cr- 5. TOMA DE MUESTRA Y PROCEDI-
tico el menor tiempo posible para el aislamiento MIENTOS POR TIPO DE MUESTRA
y la informacin sobre la drogo resistencia de
las micobacterias. TOMA DE MUESTRA
4.NIVELES DE LABORATORIO Actualmente se realiza la implementacin de

Los niveles de laboratorio en micobacteriologa tcnicas que producen resultados exactos y pre-
han sido adoptados por la Sociedad Torcica cisos en menor tiempo. El motivo principal es el
Americana (American Thoracic Society), la cual mejoramiento de la calidad del servicio que se le
ha establecido tres niveles de la siguiente ma- presta al paciente y al sistema hospitalario.
nera:
Pg. 62
mal que contamina la orina a su paso, de tal
manera que la orina por miccin contiene un
Para lograr esto es necesario que todo el per- pequeo nmero de bacterias. Debido a que es
sonal mdico y de enfermera encargado de necesario distinguir los microorganismos con-
la obtencin y extraccin de muestras conozca taminantes de los etiolgicamente importantes,
los procedimientos estandarizados para tales se debe de efectuar un examen cuantitativo de
propsitos, a manera de evitar falsos resulta- orina para que los resultados puedan ser signi-
dos. ficativos.
Para una seleccin y recogida correctas de ma-
terial de cultivo es necesario comprender las lo-
calizaciones, variedades y papel de la microbio-
ta normal de la regin urinaria.
5.1.2. Toma de Muestra
La toma de muestra de orina es muy importan-

te, pues la veracidad de los resultados depende
casi en un 100% de la forma correcta en la cual
Es preciso entonces, establecer la responsabi- se recolect la muestra.
lidad e importancia de la TOMA DE MUESTRA,
ya que resulta ser la clave en el aislamiento de TABLA No 1. BACTERIAS COMUNES EN
cualquier microorganismo, depende de esta en VIAS GENITO-URINARIAS
un 100% obtener resultados satisfactorios, en
menor tiempo, lo que conduce a un tratamiento
efectivo del paciente.
Para obtener un buen resultado en el aisla-
miento de microorganismos, en especial de
micobacterias, es preciso comenzar con una
buena toma de muestra, tener una buena es-
tandarizacin en el preparado de medios de
cultivo, con los que se har el aislamiento co-
rrecto para tener una identificacin posterior. La
pureza del aislamiento determinar el xito de
la sensibilidad y por consiguiente del tratamien-
to del paciente.
5.1. MUESTRAS DE ORINA
5.1.1. Propsito e importancia
En la actualidad, el examen de micobacterias

en la orina se hace cuando hay signos o sn-
tomas de una tuberculosis renal, insuficiencia
renal o hipertensin. Debe hacerse siempre en
personas, en que se sospecha infeccin gene-
ral y ya ha sido comprobado que no es de tipo
bacteriano, o tengan antecedentes de tubercu-
losis. Washington JA. Bacteriologa Mdica. En Lynch MM
La orina excretada por el rin es estril a me- Diagnstico Clnico por el laboratorio
nos que el rin este infectado. La orina de la +/- Irregular + comn ++ predominante
vejiga no contaminada tambin es estril. Sin
embargo, la uretra contiene una microbiota nor-
Pg. 63
inyectar la muestra en un tubo expulsando las
burbujas de aire que pueda contener la jeringa,
5.1.2.1. Chorro medio u orina al vuelo y se lleva de inmediato al laboratorio.
Este tipo de muestra constituye la nica mues-
Hombre: tra de orina aceptable para cultivos anaerobios,
Limpiar el meato urinario con agua y jabn. se indica nicamente en pacientes con bacte-
Colectar la orina a la mitad de la miccin en riuria anaerobia. Este tipo de infeccin es rara
un recipiente estril tratando de que la orina no y se sospecha su existencia cuando aparecen
toque la boca del frasco. cultivos negativos de especimenes con frotes
Llevar la orina al laboratorio. positivos para tincin de Gram.
Mujer: 5.1.2.4. Catter

Limpiar la vulva con bastante agua y jabn,
teniendo cuidado de quitar bien el jabn. NO es aconsejable debido al riesgo de bacte-
Secar el rea. riuria asociada al procedimiento. El riesgo es del
Separando los labios, colectar la orina a la mi- 1% en hombres y mujeres ambulatorias, y hasta
tad de la miccin en un recipiente estril tratan- el 20% en mujeres en trabajo de parto.
do de no topar la boca del frasco con los labios.
Llevar la orina al laboratorio. 5.1.3. Procesamiento de la muestra
Nios: Como se mencion con anterioridad la orina es

En los nios pequeos para evitar al mximo estril, pero tambin puede encontrarse conta-
la contaminacin es necesario limpiar la regin minada con alguna bacteria adems de encon-
genital con agua y con jabn y/o con solucin trarse presente la micobacteria. Por lo que toda
salina. muestra de orina debe pasar por un proceso de
Colocar la bolsa estril sobre la regin. decontaminacin.
En el momento de obtener la muestra, retirar
cuidadosamente la bolsa, de manera que la ori- 5.1.4. Requerimientos e instrucciones
na no se escurra. especiales de muestra de orina
Cerrar la bolsa y llevar inmediatamente al la-
boratorio. a. Recolectar 40 ml de orina como mnimo
b. No debe ser recoleccin por fracciones, ni ori-
5.1.2.2. Sondas permanentes na de 24 horas
c. La primera orina de la maana
En caso de tenerse un catter a permanencia d. Tomarla con todas las medidas aspticas se-
con un sistema cerrado de coleccin, obtener aladas con anterioridad
la muestra: e. Utilizar un frasco estril, de boca ancha.
a. Limpiar el rea del catter o sonda con anti- f. Si se trata de un beb se tomar en una bolsi-
sptico. ta peditrica.
b. Utilizando una aguja y jeringa estriles intro- g. El protocolo de evaluacin es enviar cinco
ducir en el rea desinfectada. muestras de forma seriada
c. Dejar la muestra dentro de la jeringa. NO
trasvasar a un recipiente estril. 5.1.5. Preparacin de la muestra pre-
d. NO recolectar la muestra de la bolsa o des- vio a la elaboracin de frotes
conectando el catter del tubo de recogida.
a. Mezclar cuidadosamente la muestra a mane-
5.1.2.3. Puncin o aspirado suprapbi- ra de obtener una muestra representativa
co b. Transferirla a un tubo con tapn de rosca. Uti-
lizar la mayor cantidad posible
En este procedimiento se obtiene la muestra. c.Centrifugarla por 15min a 3000rpm
Directamente de la vejiga. Se recolecta con
aguja y jeringa estriles; se efecta la puncin;
Pg. 64
tivo para la recuperacin de micobacterias de
muestras sanguneas y MO. El medio incluye
d. Descartar el sobrenadante con cuidado de un agente ltico (saponina), SPS y otros suple-
no perder la mayor cantidad de sedimento mentos que eliminan el paso de procesamiento,
e. Tomar con una pipeta de vidrio 1 gota del se- evitan la coagulacin de la sangre y mejoran
dimento y colocarla en un portaobjetos, esperar el crecimiento de las micobacterias. Se puede
a que se seque dentro de la campana (repetirlo inocular directamente un volumen de 3 a 5 ml
por 3-5 veces) a manera de obtener un frote de sangre, y se incuban entre 35C 36C.
que contenga una cantidad representativa Las botellas contienen 29 ml de medio y un sen-
f. Esperar a que se seque por lo menos 10 mi- sor interno que detecta dixido de carbono como
nutos para evitar que se lave al teir indicador de crecimiento microbiano. El sistema
registra lecturas cada 10 minutos.
5.2. MUESTRAS DE SANGRE Y MDU-
LA SEA REACTIVOS
En condiciones normales la sangre y la mdula a. Botellas de tapn negro

sea (MO) son estriles. Debido a que la piel BacT/Alert MB: frascos estri-
normal est cubierta de abundante microbiota les y desechables, contienen 29
normal es muy importante tomar la muestra en ml de medio y un sensor interno
condiciones totalmente aspticas. que detecta dixido de carbono
como indicador del crecimiento
NOTA IMPORTANTE: Todos los espec- bacteriano. NO AIREAR LAS BO-
menes deben de considerarse potencialmente TELLAS. El medio contiene:
infecciosos, por lo que deben de tenerse en Caldo Middlebrook 7H9 (0.47%
cuenta las medidas universales para p/v)
su manipulacin y desecho adecua- Sntesis pancretica de casena
do. (0.1% p/v)
Observaciones importantes Glicerol (1.0% p/v)
La recuperacin de micobacterias en SPS (0.025% p/v)
un hemocultivo depende de los si- Agua purificada
guientes factores: b. Lquido de enriqueci-
miento MB7BacT: El conteni-
Obtencin de la muestra de sangre en condi- do total del frasco es de 5.5 ml. Se
ciones aspticas. compone de:
Cantidad de sangre cultivada y momento de la Albmina srica bovina (14.5%
toma de muestra. p/v)
La relacin entre la sangre y el caldo de cul- Cloruro Sdico (2.5% p/v)
tivo, la cual debe ser 1:10, es decir sangre al cido oleico (0.174 % p/v)
10%. Saponina (4.4% p/v)
Se debe de tomar el hemocultivo antes de ini- Agua purificada
ciar un tratamiento con antibiticos
c. Suplemento de antibiticos: Re-
5.2.1. Medio de cultivo para aislamien- quiere de dos componentes los cuales
to de micobacterias de muestras de se complementan:
sangre y Mdula sea
Botellas de tapn negro para aislamiento de mi-

cobacterias tanto de sangre como de MO. Las
botellas BacT/ALERT MB en combinacin con
el Lquido de enriquecimiento y el suplemento
de antibiticos son un medio de cultivo selec-
Pg. 65
vena y obtener aspticamente 3ml-5ml de san-
Manejo del suplemento antibitico ya gre.
reconstituido: g. Inyectar la sangre en la botella que contiene
Reconstituir con 10 ml del lquido reconstitu- el caldo. Se debe de inyectar la sangre suave-
yente. mente sin hacer presin en el mbolo, de mane-
Guardar en refrigeracin una vez reconstituido ra que se evite la hemlisis que puede interferir
de 2-8C en el momento de la interpretacin de la positi-
Es estable 7 das despus de reconstituido. vidad del cultivo.
Un vial de 10 ml de antibitico reconstituido h. Despus de obtenida la muestra, llevar los
alcanza para 20 botellas. frascos al laboratorio lo ms rpidamente po-
sible. Antes de transcurridos 30 minutos. En el
Conservacin del medio de cultivo Botellas para transcurso de este tiempo se le debe agregar
obtencin de la muestra. tanto el suplemento antibitico como el lquido
Conservar los frascos en un lugar seco, fres- de enriquecimiento, una vez transcurrido este
co, en oscuridad y a temperatura ambiente. NO tiempo, no tendr ningn valor para la muestra
REFRIGERAR. Una exposicin prolongada a el agregar ambos constituyentes.
la luz directa podra alterar el indicador fluores- i. NO REFRIGERAR por ninguna razn.
cente. j. Colocar la identificacin correspondiente en el
Por ningn motivo deben de airearse las bote- frasco utilizando NICAMENTE la zona des-
llas. tinada para ello. NO COLOCAR MASKING
TAPE, MICROPORE, o cualquier otro tipo de
5.2.2. Toma de muestra de sangre y tape alrededor del frasco.
Mdula sea Procedimiento para toma de muestra de Mdula
Procedimiento para toma de muestra de sangre sea.
por venopuncin. a. Las muestras de mdula sea para cultivo
a. Tomar la botella para micobacterias. Revisar de micobacterias siempre deben ser obtenidas
y examinar los frascos con el fin de eliminar por el mdico, quien puncionar el esternn o
cualquier frasco que presente signos de con- la cresta ilaca. Procesar exactamente igual que
taminacin o defectos. Identificar con los datos para muestra de sangre.
del paciente. b. Tomar la muestra tomando todas las medidas
b. Tomar la botella, Retirar la cpsula o tapn aspticas necesarias
de proteccin que se encuentra en el tapn del c. De la PRIMERA FRACCIN obtenida ino-
frasco. NO DESCARTARLA, y con algodn cular las cajas de petr que contienen agar Sa-
empapado en solucin yodada al 3% en alco- bouraud, Micosel y Micosel con sangre ya que
hol (tintura) limpiar perfectamente bien el tapn sta es la porcin ms rica en lo que a celulari-
perforable. Dejar secar mientras se atiende al dad se refiere.
paciente. d. De la SEGUNDA FRACCIN inocular un
c. Extraer las muestras de manera asptica con volumen de 3 a 5 ml en las botellas para cul-
el fin de reducir los riesgos de contaminacin. tivo BacT/ALERT MB que en combinacin con
Utilizar en general una jeringa o un dispositivo el Fluido de enriquecimiento y el suplemento de
de toma de muestra con cnula antibiticos son un medio de cultivo selectivo
d. Colocar la ligadura en el brazo del paciente; para la recuperacin de micobacterias de mues-
palpar la vena y localizar exactamente el sitio tras sanguneas y otros lquidos
de la puncin. e. Si va a llevarse en jeringa debe ser la mayor
e. Limpiar el sitio exacto donde se localiz la cantidad posible con un anticoagulante como
vena con un algodn empapado de tintura de SPS heparina en relacin 1:1 (No utilizar
yodo al 3%. con movimientos en crculo, hacien- EDTA)
do una espiral que inicia en el sitio de puncin f.Transportarlas a temperatura ambiente al labo-
y termina en la parte de afuera. NO vuelva a ratorio durante la primera hora luego de la toma
palpar la vena. Dejar secar. de muestra (NO REFRIGERARLAS)
f. Con aguja y jeringa estriles, puncionar la
Pg. 66
alcanzar la temperatura ambiente) con una je-
ringa estril en forma asptica.
5.2.3. Precauciones para el uso de los f.NO DEBEN DE TRANSCURRIR MAS
frascos DE 30 MINUTOS PARA AGREGAR EL
LIQUIDO DE ENRIQUECIMIENTO Y EL
a. Los frascos de cultivo de micobacterias son SUPLEMENTO ANTIBITICO, DESDE
para uso in vitro. EL MOMENTO EN QUE FUE TOMADA
b. Antes de utilizarlos los frascos deben ser LA MUESTRA. Un mayor tiempo puede al-
observados. NO utilizar frascos que presenten terar los resultados.
signos de contaminacin, Ej.: color amarillo o g. Luego de haber tratado las botellas (lquido
turbidez. No utilizar frascos que presenten al- de enriquecimiento y suplemento antibitico)
gn dao. introducir la botella en el equipo BacTAlert 3D y
c. No pegar nada sobre la ventana de lectura, registrarlo, asignndole una posicin.
y tampoco sobre el cdigo de barras. Utilizar h. Registrar la posicin y completar la hoja de
UNICAMENTE la zona de identificacin. registro con los datos correspondientes.
d. No descartar la cpsula o tapn de protec- i. Llenar la hoja de trabajo adjuntando la pape-
cin. Colocarla en el frasco nuevamente des- leta y colocarla en su cartapacio respectivo.
pus de haber inoculado ste. j. Leer diariamente la botella durante 42 das.
e. Antes de inocular la botella desinfectar el ta- k. Si el equipo da alarma de positivo, sacarlo y
pn con alcohol o solucin yodada. colocar en la hoja de registro la fecha y la hora
f. Inyectar aspticamente con la aguja montada a la cual dio positivo. Hacer frote de Ziehl Nee-
en la jeringa, el volumen necesario de sangre, lsen y reportarlo.
teniendo cuidado de NO PRODUCIR HEMLI- l. Si el cultivo es negativo, luego de 42 das de
SIS ya que esta interfiere en la lectura de los incubacin, hacer un frote de ZN al caldo de
frascos. la botella, si es negativo, reportarlo negativo.
g. Los frascos inoculados deben de ser trans- Anotar en la hoja de registro la fecha y la hora.
portados al laboratorio en el menor tiempo po-
sible. 5.2.5. Preparacin de la muestra pre-
h. NO ABRIR EL FRASCO POR NINGN vio a la elaboracin de frotes
MOTIVO.
SANGRE Y MDULA SEA
5.2.4. Tratamiento de la muestra en el a. Transferir a un tubo estril con tapn de ros-
laboratorio ca
b. Centrifugar la mayor cantidad de la muestra
Una vez que la botella ha sido ingresada correc- posible por 15min a 3000rpm
tamente al laboratorio proseguir de la siguiente c. Descartar el sobrenadante con mucho cuida-
manera: do porque la mayor de la parte como su nom-
a. Chequear que los datos del paciente estn bre lo indica es lquida
completos, tanto en la papeleta de ingreso d. Del sedimento tomar de 2-3 gotas para rea-
como en la botella. lizar el frote
b. Identificar las pruebas que se le realizarn a e. Si es Lquido Cefalorraqudeo: tomar con
la botella y si es el medio adecuado para ello. una pipeta de vidrio 1 gota del sedimento y co-
Botellas de tapn negro para cultivo y aisla- locarla en un portaobjetos, esperar a que se
miento de micobacterias. seque (repetirlo por 3-5 veces)
c. Retirar la tapa de proteccin y limpiar con al- f.Hacer la tincin
cohol el tapn perforable.
d. Agregar 1.0 ml de lquido de enriquecimiento 5.3. MUESTRAS DE LQUIDO CEFALO-
con una jeringa estril en forma asptica. RRAQUDEO, LAVADOS Y OTROS L-
e. Posterior al lquido de enriquecimiento, agre- QUIDOS CORPORALES
gar 0.5 ml de Suplemento de antibitico (esta
solucin debe de sacarse de la refrigeradora y 5.3.1. Propsito e importancia
Pg. 67
El LCR usualmente se colecta en 3 o 4 partes,
El diagnstico rpido, temprano y preciso de de 2 a 5ml cada una, en tubos o recipientes es-
meningitis tiene un lugar predominante en- triles. Esto permite el examen ms convenien-
tre las urgencias mdicas. Depende en alto te y de ms confianza para los distintos valores
porcentaje de mantener un elevado ndice de que determinan la conducta a seguir por el m-
sospecha, de obtener en forma adecuada las dico.
muestras y examinarlas a la mayor brevedad.
Debido al elevado riesgo de muerte y/o dao El anlisis bsico efectuado al LCR y al Lquido
tisular irreversible, a menos que se inicie un tra- pleural y otros lquidos corporales:
tamiento inmediato, rara vez hay una segunda Cultivo de rutina
oportunidad de obtener una segunda muestra Cultivo para tuberculosis y hongos.
pretratamiento, lo que hace esencial la primera Anlisis qumico (protenas y glucosa)
muestra para el diagnstico etiolgico especfi- Anlisis fsico y citolgico (aspecto del lquido,
co y ptima atencin al paciente. recuento de clulas, frmula diferencial).
El dato diagnstico ms urgente es la diferen- Pruebas de ltex para deteccin de antgeno
ciacin entre la meningitis bacteriana purulenta de Cryptococcus neoformans.
y la meningitis granulomatosa y la meningitis
viral. 5.3.3. Requerimientos e instruc-
ciones para el procesamiento de la
Las muestras que se incluyen dentro de Lqui- muestra
dos corporales son:
Lquidos corporales
Lquido cefalorraqudeo (LCR) 5-10 ml como mnimo (enviar el mximo de
Lquido ventricular volumen posible)
Lquido abdominal (peritoneal, de paracente- Obtenido en condiciones aspticas
sis, dilisis biliar) En recipiente estril
Lquido pleural, toracentesis y empiema (obte- Enviar la muestra fraccionada para otros ex-
nidos de trax) menes microbiolgicos
Lquido pericrdico
Lquido sinovial Lavados
5-10 ml como mnimo
5.3.2. Toma de muestra para Lquido Recipiente estril y desechable
Cefalorraqudeo En ayunas (para asegurar coleccionar la
muestra que ha sido tragada durante el sueo)
La puncin lumbar se lleva a cabo con tcnica El Broncoscopio debe estar estril (evitar con-
asptica estricta, teniendo cuidado de no pro- taminar con agua de chorro por las micobacte-
vocar compresin del bulbo por extraccin rpi- rias saprofticas)
da del lquido cuando la presin intracraneana
esta notablemente elevada. 5.4. MUESTRAS DE HECES
5.4.1. Propsito e importancia
Demostrar por medio de cultivo, la presencia

de micobacterias. Es decir, micobacterias que
infectan el intestino. Esto causa diarrea, dolor
abdominal, fiebre y en ocasiones la muerte.
Es importante que en pacientes con VIH/SIDA
se realice un diagnstico diferencial de la si-
guiente manera, utilizando las siguientes tincio-
nes:
Pg. 68
Recipiente estril (frasco o caja de petri de vi-
drio sellado (a))
No sumergir las muestras en solucin salina,
formol o formalina
Secreciones
0.5 ml como mnimo
En recipiente estril, de preferencia en jerin-
gas (si se va a coleccionar la muestra por medio
de una puncin es mejor si se cuenta con las de
tipo tuberculina)
El rea de toma de muestra debe estar bien
limpia
5.4.2. Requerimientos e instrucciones Si son hisopos deben transportarse en Stuart
para el procesamiento de la muestra o Amies
de heces
5.5.2. Preparacin de la muestra para
1 gr. aproximadamente la elaboracin de frotes
En recipiente estril, desechable y de boca an-
cha Biopsias de tejido
Llevar inmediatamente al laboratorio Colocarla en una caja de petri estril de vidrio
preferentemente
5.4.3. Preparacin de la muestra de Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, so-
heces para la elaboracin de frotes lucin salina o agua destilada estril
Triturar con bistur la biopsia en partes peque-
Observar las caractersticas de la muestra y as a manera de formar una mezcla homognea
buscar la parte dnde se encuentre mucoso o Transferir la solucin a un tubo
con estras de sangre Agitar por 5min aproximadamente en vortex
De esta muestra suspender 1 gramo apro- Centrifugar la solucin por 15min a 3000rpm
ximadamente en 2-5ml de caldo 7H9 Middle- Descartar el sobrenadante
brook, solucin salina o agua destilada estril Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar
en un tubo estril el frote
Agitar en vrtex por 5min Hacer la tincin
Centrifugar por 15min a 3000rpm
Descartar el sobrenadante con cuidado de no Biopsias de Hueso
perder la mayor cantidad de sedimento Colocarla en una caja de petri estril de vidrio
Del sedimento tomar de 2-3 gotas para reali- preferentemente
zar el frote Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, so-
Hacer la tincin lucin salina o agua destilada estril
Si no se observan BAAR NO procesar la Triturar con bistur a manera de formar partcu-
muestra para cultivo las lo ms pequeas posibles.
Hacer por lo menos tres improntas frotando
5.5. MUESTRAS DE BIOPSIAS Y SE- una laminilla contra otra a manera de obtener
CRECIONES VARIAS un frote en cada uno de los extremos y uno en el
centro de la lmina portaobjetos
5.5.1. Requerimientos e instrucciones Hacer la tincin
para el procesamiento de la muestra
5.6. MUESTRAS DE ESPUTO
Biopsias La muestra de esputo es de utilidad para investi-
1 gr. aproximadamente gar la causa de infecciones respiratorias inferio-
Obtenido en condiciones aspticas res (bronquitis, neumona) y en la investigacion.
Pg. 69
cualquier muestra que no cumpla con el Valor
de tuberculosis. Siempre hay bacterias en una Q establecido.
muestra de esputo, por la contaminacin del
material bronquial con saliva. Una muestra de 5.6.2. Procedimiento para obtencin
esputo es satisfactoria para estudio si contiene de la muestra.
secreciones respiratorias inferiores.
Esputo para infeccin bacteriana
Muestras que consisten solo de material hiali-
no o liquido o con abundante saliva son recha- Obtenerse la primera muestra de la maana,
zadas por inadecuadas y no ser procesadas dado que el la ms espesa y no est contami-
(Ver Valor Q.). En casos muy especiales puede nado con comida.
estudiarse una puncin transtraqueal. Aspira- Indicar al paciente que al despertar se enjua-
dos o lavados bronquiales son adecuados en el gue la boca con agua corriente (sin ningn tipo
paciente intubado o en respirador, si se trans- de antisptico o pasta dental). Luego acostado
porta el material al laboratorio en una jeringa o en su cama, boca abajo, expectore esputo con
contenedor estril. fuerza, tosiendo, y lo deposite directamente en
un recipiente estril de boca ancha (proporcio-
La neumona bacteriana, o infeccin del pul- nado por el laboratorio), sin mantenerlo en la
mn causada por bacterias puede ser de dos boca para evitar que se mezcle con saliva.
tipos: Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo muco-
- Neumocccica: Causada por Streptococcus purulento son suficientes para el gram y el cul-
pneumoniae tivo de rutina, as tambin para el cultivo de mi-
- No neumocccica: Causada por Klebsiella cobacterias (BK).
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Strepto- Llevar la muestra de inmediato al laboratorio.
coccus pyogenes, Haemophilus influenzae y Realizar el valor Q, para establecer la calidad
rara vez por otras bacterias. de la muestra y establecer si es apta para su
procesamiento.
Los cultivos bacterianos del esputo son un pro-
blema importante, suelen ser recolectados sin 5.6.3. Procesamiento de la muestra de
cuidado, y a menudo son mas representativos Esputo
de saliva que de las secreciones respiratorias Para que una muestra de esputo, sea vlida
inferiores, adems contienen de ordinario gran para su adecuado cultivo, debe de cumplir con
cantidad de bacterias propias de la cavidad oral ciertos criterios. Estos criterios determinan la
y en pacientes graves hospitalizados contienen Calidad de la muestra, y su representatividad.
con frecuencia bacilos gram negativo que han A continuacin se encuentra la tabla para Cl-
colonizado la orofaringe despus de la hospita- culo de valor Q. Este mtodo se basa en la
lizacin. Este tipo de cultivos carece de sensibi- cuantificacin de leucocitos polimorfonucleares
lidad y especificidad y son, por lo tanto, difciles y clulas epiteliales presentes en la muestra, de
de interpretar. manera que la relacin entre stos determina el
Valor de la calidad del esputo, y por consiguien-
5.6.1. Toma de muestra. te su aceptacin o rechazo para cultivarse.
La infeccin bacteriana de trquea y bronquios

produce abundante esputo. En el caso del diag-
nstico de neumona y tuberculosis es crucial
obtener una buena muestra. El cultivo de ma-
terial no satisfactorio (saliva), causa confusin
al mdico, ya sea porque no se detect el ver-
dadero patgeno, o se cultiv un patgeno in-
cidental sin importancia como agente etiolgico
primario. Por esta razn el laboratorio rechaza
Pg. 70
TABLA No. 2 DETERMINACIN DEL VALOR Q
TABLA No. 3 Resumen de Requerimientos de Muestras
Pg. 71
La sensibilidad del frote se incrementa de
acuerdo al tipo de coloracin. Son ms sensi-
6. PREPARACIN Y OBSERVACIN DI- bles los frotes teidos con Auramina-Rodami-
RECTA DE UNA MUESTRA na, tincin fluorescente que necesita de un mi-
croscopio fluorescente. Estas tcnicas aunque
Las tinciones utilizadas para observacin di- ms sensibles resultan ser ms costosas y no
recta son Ziehl Neelsen, Kinyoun y Aurami- cualquier laboratorio cuenta con un microsco-
na-Rodamina, conocidas como tinciones de pio de fluorescencia.
alcohol-cido resistencia y juegan un importan-
te papel en el diagnstico temprano de infec- La importancia de conocer la sensibilidad y la
ciones por micobacterias. La baciloscopa ha especificidad de la baciloscopa en especme-
sido adoptada por la mayora de los pases en nes de formas pulmonares y extrapulmonares
desarrollo como el procedimiento diagnstico de la tuberculosis, se encuentra en el hecho de
de eleccin en los enfermos sintomticos res- que en muchas instituciones de atencin m-
piratorios por ser un mtodo sencillo, rpido, dica y servicios de urgencias no cuentan con
confiable y econmico. otros mtodos diagnsticos de reconocida sen-
Las paredes celulares de las micobacterias sibilidad y especificidad como el cultivo. Si bien
debido a su alto contenido de lpidos, le con- la complejidad del cultivo y su costo resultan ser
fieren la propiedad de ligarse al colorante de mayores que la baciloscopa, es mejor alterna-
carbolfuchsina y ser decolorados con una solu- tiva en comparacin a otras tcnicas sofistica-
cin de alcohol cido, de ah su nombre Bacilos das. Por lo tanto, la baciloscopa no puede ser
Alcohol cido Resistente (BAAR). Del mismo utilizada como nica opcin en el diagnstico
modo, los cidos miclicos de la pared celu- de la tuberculosis extrapulmonar y se debe utili-
lar de las micobacterias tienen afinidad por los zar el cultivo en todos los especmenes no pul-
fluorocromos auramina-rodamina, los cuales monares.
emiten fluorescencia a cierta longitud de onda En un estudio realizado en el Hospital Universi-
en el microscopio de fluorescencia, permitien- tario de la Universidad Len, Mxico, se lleg a
do observar a las micobacterias fcilmente. establecer que nicamente pudieron detectar-
se el 30% de los casos por medio de un frote di-
Respecto a la especificidad es de 99%, ya que recto, y no un 70% como lo seala la literatura.
en la mayora de los casos los BAAR observa-
dos en esputo corresponden a Mycobacterium Como sabemos existen muestras en las cuales
tuberculosis. Pero respecto a su sensibilidad no la cantidad de bacilos se encuentra muy diluida
es ptimo, ya que puede existir variacin del y no llega a ser suficiente para ser detectada
9-46%. Se estima que deben existir de 5,000- mediante un frote directo de la muestra, y ni aun
10,000 bacilos/ml de expectoracin para que cuando la misma es centrifugada, por lo que no
puedan ser detectados al microscopio. Es por puede confiarse solamente en la baciloscopa y
ello que se recomienda que las muestras para cualquier caso que sea altamente sospechoso
tincin sean de forma seriada mnimo tres), y debe de ser cultivado y esperar el resultado de
en el caso de orina se recomienda que sean ste, para dar como negativo al paciente.
cinco.
6.1. Preparacin de un extendido
En la enfermedad extensa donde se eliminan Todas las fases de preparacin del extendido
grandes cantidades de micobacterias, existe deben ser sistematizadas y estandarizadas; la
una buena relacin entre frote y cultivo y la sen- disposicin del material debe ser siempre la
sibilidad es alta. Pero muchos pacientes pre- misma, de manera que se pueda obtener una
sentan enfermedad mnima o menos avanzada seguridad mxima y garantizar la calidad de la
donde la cantidad de micobacterias es menor tcnica.
y la correlacin disminuye llegando a ser de un Algunas recomendaciones son las siguientes:
2540%. - Cada serie de muestras a procesar no debe
exceder de doce.
Pg. 72
Fijar el extendido pasndolo por encima del
incinerador dentro de la campana (es el ms
- Debe utilizarse un portaobjetos (laminilla) por seguro).
cada de las muestras. Pasar la lmina por el rea azul de la llama de
- Los portaobjetos deben ser nuevos de prefe- un mechero Bunsen tres o cuatro veces, pero
rencia en buen estado y desgrasados (sumer- evite el sobrecalentamiento.
girlos en alcohol al 95% y pasarlas por la llama Permita que los frotes se fijen en un calentador
del mechero) elctrico (65 a 70C) al menos por 2 horas.
- Los colorantes deben conservarse en frascos Colocar las lminas en un recipiente con me-
de color mbar por un mximo de 3 meses. tanol absoluto por un minuto (puede haber con-
taminacin de muestras por micobacterias suel-
Algunas muestras necesitan tratamiento previo tas).
para poder realizar los extendidos, para esto NOTA: la fijacin por calor puede que no mate
revise cada una de las secciones por tipo de todas las micobacterias, por lo tanto las lminas
muestra, en la seccin Preparacin de la mues- deben ser manejadas cuidadosamente y des-
tra para la elaboracin de frotes. cartadas en un recipiente adecuado despus de
su observacin.
Procedimiento h. Antes de sacar las manos de la campana qui-
a. Asignar un nmero de identificacin a la tarse un par de guantes, dejarlo dentro de ella
muestra y colocarlo a la laminilla con tinta inde- dentro de una bolsa de descarte.
leble i. LOS FROTES TANTO POSITIVOS COMO
b. Ordenar las muestras con numeracin ascen- NEGATIVOS DEBEN GUARDARSE POR LO
dente de forma horizontal. MENOS SEIS MESES.
c. Colocar cada laminilla frente al envase co-
rrespondiente teniendo el cuidado de no dejar 6.2. Procedimientos de Tincin alco-
impresiones digitales en la parte de la lmina hol-cido resistencia
reservada para el extendido.
d. Colocarse la bata, la mascarilla, doble par de El diagnstico de las micobacterias es basado
guantes y lentes de seguridad. en la observacin de BAAR en las muestras y su
e. Realizar los frotes colocando la muestra uti- cultivo in vitro, para poder observarlos es nece-
lizando un asa bacteriolgica, un palillo o una sario realizar coloraciones como la de Ziehl-Ne-
pipeta sobre la laminilla dependiendo el tipo de elsen (utiliza calor) o Kinyoun (no utiliza calor y
muestra, haciendo un extendido fino y circu- su fuchsina es ms concentrada).
lar, de aproximadamente 3 cm. de dimetro y La caracterstica de alcohol-cido resistencia
en dos terceras partes de la laminilla (No hacer tpica de las micobacterias hace que la bacilos-
ms de un frote por laminilla para evitar confu- copa tenga una importancia fundamental ya
siones), luego se dejan secar dentro de la cam- que se utiliza para seguir el curso del tratamien-
pana. Para que se sequen se necesita por lo to y para dar de alta al paciente en el hospital,
menos esperar de 10 a 15 minutos. para luego poder continuar con su tratamiento
f. Si se trata de esputo es preferible hacer el fro- ambulatorio.
te con palillo de madera cortado en L ya que
por la consistencia mucosa de la muestra tien- 6.2.1. Coloracin de Ziehl-Neelsen:
de a adherirse mayor cantidad de muestra en a) Fijar el frote con calor dentro de la campana
l que en un asa. Se debe tener en cuenta que b) Dejar enfriar
el lugar en dnde hay ms probabilidades de c) Colocar papel filtro
encontrar bacilos est en las partculas slidas, d) Agregar fuchsina carbnica sobre el frote, ca-
verdosas y sanguinolentas de la expectoracin lentar cuidadosamente la lmina por debajo, ya
y en gran medida el resultado del examen desea con un mechero o con un algodn con al-
pende de la eleccin de esas partculas. cohol hasta emitir vapores blancos (no hervir) y
g. Fijar el frote por alguno de los siguientes m- dejar reposar por 5 minutos.
todos:
Pg. 73
debe repetirse el frote.
g) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso En caso de que se observen bacilos con mor-
h) Agregar azul de metileno fologa dudosa solicitar una nueva muestra
i) Permitir el reposo del colorante por 1-2 minu- para control.
tos Si el frote es muy grueso es probable que se
j) Lavar con agua de chorro desprenda de la lmina durante la coloracin
k) Permitir que el frote se seque al aire por esto debe evitarse la transferencia de BAAR
l) Examinar con objetivo de inmersin de una preparacin a otra por medio del aceite
de inmersin, lentes sucios o colorantes (por lo
6.2.2. Coloracin de Kinyoun: que debe limpiarse con papel limpialentes entre
una y otra muestra)
a) Fijar el frote con calor dentro de la campana Ocasionalmente, la buena seleccin de las
b) Agregar fucshina de Kinyoun sobre el frote y partes anormales de la muestra para preparar el
dejar reposar por 4 minutos frote puede dar resultados mucho mejores que
c) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso el uso de concentraciones.
d) Agregar alcohol-cido y dejar reposar por 1-2 Puede ocurrir que la misma muestra sea nega-
minutos tiva por frote, pero positiva por cultivo pero no lo
e) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso contrario, porque la baciloscopa es menos sen-
f) Agregar azul de metileno sible para detectar micobacterias que el cultivo.
g) Permitir el reposo del colorante por 1-2 mi- Un frote para diagnstico de Tb debe exami-
nutos narse de 8-10 minutos antes de darse por nega-
h) Lavar con agua de chorro tivo. Si se trata de LCR debe observarse an
i) Permitir que el frote se seque al aire por ms tiempo.
j) Examinar con objetivo de inmersin La liberacin irregular de micobacterias de los
focos endotraqueales puede dar frotes positivos
6.3. Interpretacin e informe de Baci- y negativos en el mismo paciente.
loscopas
Hay varias tablas para el reporte de la cuantifi-
Los extendidos deben examinarse total y cui- cacin de baciloscopa. La siguiente forma de
dadosamente con lente de inmersin (100x) y reportar ha sido estandarizada por la Asociacin
oculares 10x y una gota de aceite de inmersin. Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Res-
Se debe limpiar completamente el lente de piratorias de los Estados Unidos. con el objeto
inmersin entre una y otra muestra que se ob- de poder comparar los resultados de distintos
serve. laboratorios y poder orientar de forma adecua-
Los bacilos son aproximadamente de 1 a 10 da al personal mdico.
m de largo y aparecen como bacilos como Tabla No. 3 Cuantificacin de Baciloscopa
bastoncitos delgados bien definidos, ligera-
mente curvos (pueden aparecer doblados) te-
idos de rojo brillante (se aprecian mejor con
luz intensa), generalmente con grnulos ms
coloreados en su interior, aislados, en parejas o
en pequeos grupos, destacados sobre el azul
claro de la tincin de fondo.
NOTA: algunas micobacterias distintas a Myco-
bacterium tuberculosis pueden aparecer pleo-
mrficas que van desde bacilos largos hasta
Fuente: Asociacin Nacional de Tuberculosis y Enferme-
formas cocoides.
dades Respiratorias de Estados Unidos.
En el frote pueden aparecer artefactos alco-
BAAR (Bacilos alcohol-cido resistentes)
hol-cido resistentes, especialmente si el frote
es grueso o no fue suficientemente decolorado.
En caso que se observen muy escasos BAAR
Pg. 74
trocelulosa capturan este complejo inmunolgi-
co que se hace visible gracias a la presencia
del marcador de oro coloidal.
Un resultado positivo (una banda visible de co-
lor prpura/gris) indica que el antgeno LAM de
las micobacterias est presente en la muestra
en el lmite de deteccin de la prueba o por en-
cima de l.
Fuente: Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social Un resultado negativo (sin banda visible de co-
de Guatemala. lor purpura/gris) indica que este no est presen-
(mayor) (menor)
NOTA: De 1-4 BAAR en toda la lmina Repetir muestra te o que se encuentra por debajo del lmite de
Si la cantidad de BAAR en la nueva muestra sigue sien- deteccin. Con el fin de garantizar la validez del
do la misma el resultado es POSITIVO (+) ensayo se ha incorporado una banda de control
de procedimiento en el dispositivo del ensayo.
7. PRUEBAS DE TAMIZAJE
Materiales
Las pruebas de tamizaje son pruebas que ayu- Tarjetas de anlisis de la prueba Alere Deter-
dan a dar un diagnstico presuntivo de infec- mineTM TB LAM Ag 10 tarjetas (10 pruebas por
cin por Mycobacterium tuberculosis. Se ob- tarjeta)
tiene un resultado ms rpido que el cultivo y Recipientes de recoleccin de orina
generalmente ms sensible que las tinciones. Pipetas con precisin de 60 L
Sin embargo, deben ser interpretadas correla- Tips descartables
cionando la clnica del paciente y los datos de Temporizador
la historia clnica del paciente.
Obtencin de la muestra
7.1. PRUEBA DE LAM Antes de recoger la muestra de orina, se reco-
Principio mienda limpiar la zona genitourinaria con una
La prueba de antgeno de LAM es un anlisis toalla limpia. Recoja la orina en un recipiente
inmunocromatogrfico diseado para la de- estndar de recoleccin de orina fresca.
teccin cualitativa del antgeno lipoarabinoma- Conservacin de la muestra
nano (LAM) de las micobacterias en orina hu- 1.Si se conservan a temperatura ambiente las
mana. La prueba Alere DetermineTM TB LAM muestras de orina fresca pueden utilizarse a lo
Ag emplea anticuerpos altamente purificados, largo de las 8 horas siguientes a la obtencin.
especficos del principal antgeno polisacrido 2. Si el anlisis se va a realizar a lo largo de los
del gnero Mycobacterium: lipoarabinomanano 3 das posteriores a la obtencin de las muestra
(LAM). de orina, estas deben almacenarse a una tem-
peratura de entre 2 y 8 C. Si el anlisis se va a
Estos anticuerpos se utilizan tanto como traza- realizar ms de 3 das despus, se deben con-
dores de captura como de deteccin. Los an- gelar las muestras a -20 C o menos.
ticuerpos de captura se absorben en la mem- 3. Si las muestras estn congeladas o refrige-
brana de nitrocelulosa de las tiras reactivas. El radas, se deben poner a temperatura ambiente
anticuerpo de deteccin se marca con un con- una hora antes de utilizarlas.
jugado de partculas de oro coloidal. 4.Las muestras congeladas pueden contener
agregados. Todas las muestras congeladas se
Una vez que la muestra de orina se haya agre- deben centrifugar a 10,000 g durante 5 minutos
gado a la seccin de muestra, los anticuerpos a temperatura ambiente. La muestra a utilizar
conjugados con oro coloidal se adhieren al an- se recoge con cuidado del sobrenadante.
tgeno LAM y la muestra los libera de la seccin 5.Evitar ciclos de congelado/descongelado re-
petidos. No se pueden utilizar las muestras que
de conjugado. A continuacin, los anticuerpos
se hayan congelado y descongelado ms de
anti-LAM inmovilizados en la membrana de ni-
tres veces.
Pg. 75
Procedimiento
1. El nmero deseado de unidades de prueba

de las 10 tarjetas de anlisis pueden extraerse
doblando o rasgando la perforacin.
Inserto Prueba de LAM, Alere
NOTA:
La extraccin de las unidades de prueba debe iniciarse 7.2. GENEXPERT
en el lateral derecho de la tarjeta de anlisis con el fin
de conservar el nmero de lote que aparece en el lateral Principio
izquierdo de esta.
El anlisis debe iniciarse a lo largo de las 2 horas poste-
El sistema GeneXpert integra y automatiza el
riores a la retirada de la cubierta protectora de aluminio
de cada prueba. procesamiento de muestras, la amplificacin de
cidos nucleicos y la deteccin de las secuen-
2. Retire la cubierta protectora de aluminio de cias diana en muestras sencillas o complejas
cada prueba. mediante ensayos de PCR y PCR de transcrip-
tasa inversa en tiempo real. El sistema consta
3. Aplique 60 L de la muestra (pipeta de pre- de un instrumento, una computadora, un lector
cisin) a la seccin de muestra (seccin blanca de cdigos de barras y un software precargado
marcada con el smbolo de la flecha). para la realizacin de pruebas con las mues-
tras recogidas y la visualizacin de los resulta-
4. Espere un mnimo de 25 minutos y lea el re- dos. Este sistema requiere el uso de cartuchos
sultado. Visualice la tira en un entorno con una GeneXpert desechables de un solo uso para
iluminacin interior estndar o en la sombra. los reactivos y el proceso de PCR. Dado que
No la visualice bajo la luz directa del sol. Los los cartuchos son independientes, se elimina
resultados permanecen estables hasta unos 35 el riesgo de contaminacin cruzada entre las
minutos despus de haber aplicado la muestra. muestras.
Si han transcurrido ms de 35 minutos no lea
los resultaos de la muestra. El Xpert MTB/RIF incluye reactivos para la de-
teccin de MTB y la resistencia a RIF, as como
Control de calidad un control de procesamiento de la muestra
(SPC, por sus siglas en ingles) para controlar el
En la tira de reaccin se debe observar una procesamiento adecuado de las bacterias dia-
banda control de la prueba. Si, una vez aca- na y detectar la presencia de inhibidores en la
bado el ensayo, la banda de control no torna a reaccin PCR. El control de comprobacin de la
un color purpura/gris, el resultado de la prueba sonda (PCC, por sus siglas en ingls) comprue-
no es vlido y no se debe volver a analizar la ba la rehidratacin de los reactivos, el llenado
muestra. del tubo de PCR en el cartucho, la integridad de
la sonda y la estabilidad del colorante.
Interpretacin de los resultados
Los cebadores del Xpert MTB/RIF Assay am-
Para facilitar la lectura e interpretacin de los plifican una parte del gen rpoB que contiene la
resultados cuando stos se observan muy p- regin central de 81 pares de bases. Las son-
lidos, se puede utilizar la Tarjeta de Escala de das son capaces de distinguir entre la secuen-
Referencia (incluida en el kit), la cual se sostie- cia natural conservada y las mutaciones de la
ne a la par del resultado. regin central que se asocian a la resistencia a
rifampicina.
Pg. 76
3. Aparecer una pantalla para seleccionar se-
sin en windows, seleccione cepheid e intro-
Materiales duzca la contrasea cphd
Cartuchos Xpert MTB/RIF con tubos de reac- 4. Al ingresar a windows, el software de genex-
cin integrados. pert se iniciara automticamente, si no, presio-
Sistema GeneXpert Dx equipado con el sof- ne el icono de genexpert dx software en el es-
tware GX4.0. critorio.
Recipientes estriles y hermticos, con tapa 5. Introducir el usuario y contrasea correspon-
para toma de muestra. diente para cada usuario.
Guantes desechables y proteccin ocular 6. Al ingresar, aparecer un recuadro pregun-
Etiquetas o rotulador permanente tando si quiere hacer algn manejo de la base
Pipetas de transferencia para el procesamien- de datos, presionar no.
to de la muestra 7. Luego aparecer un recuadro preguntando si
quiere hacer un backup, presionar no.
Procedimiento 8. Al terminar de ingresar los mdulos del ge-
Limpie adecuadamente el rea de trabajo nexpert deben aparecer en el lado izquierdo
(pase un algodn con cloro 10% y luego otro como disponibles.
con etanol 70%, secar con algodn) 9. El equipo est listo para usar.
Remueva un cartucho y un vial del reactivo de
muestra del kit GeneXpe rt MTB/RIF Actualizacin de un test (nueva versin)
Agregue 2 volmenes de reactivo de muestra 1. Introduzca el cd que viene con el nuevo kit
por una de esputo en el recipiente colector (2:1) de reactivos en el lector del cds del computador.
NOTA: para este paso, se puede utilizar la muestra di- 2. Dentro del software, presione el botn definir
recta; es decir, sin haber realizado proceso de deconta- ensayo.
minacin o se puede utilizar muestra ya decontaminada.
En general, todas las muestras se decontaminan primero 3. Presione el botn importar en la parte infe-
y nicamente las muestras de lquido cefalorraqudeo se rior de la pantalla.
utilizan directas. Para ver el proceso de decontaminacin 4. En la ventana que se despliega seleccionar el
de muestras previo a este paso, consultar seccin 8.2 y directorio del cd en la barra superior.
ubicar el mtodo de decontaminacin que se est reali- 5. Abra la carpeta de que corresponde para el
zando, de preferencia el mtodo de NALC-NaOH ya sea
con reactivos preparados in house o comerciales. sistema genexpert (nombre de la prueba ge-
nexpert system).
Enrosque adecuada mente la tapa 6. En la carpeta seleccione el archivo con termi-
Asegrese que la tapa cierre adecuadamente. nacin .gxa
Mezcle el contenedor vigorosamente 10- 20 7. Presiona aceptar
veces. 8. En la parte izquierda de la pantalla definir
Dejar reposar a temperatura ambiente por 15 ensayo aparecer la nueva versin del test ac-
minutos (al minuto 10 vuelva a mezclar). tualizado listo para usarse.
Utilizando la pipeta desechable transfiera,
CUIDADOSAMENTE la muestra (llene la pipe- Realizacin del test en el GeneXpert
ta hasta la marca). 1. Presione el primer botn en la parte superior
Agregue la muestra al contenedor de mues- del software crear ensayo
tra, despacio, evite salpicaduras. 2. En la ventana que se despliega lea el cdigo
Cierre la tapa del cartucho. de barras del cartucho del ensayo ya preparado.
Coloque el cartucho en el equipo antes de 30 3. Al leer el cdigo de barras en la ventana apa-
minutos recer la informacin del ensayo a realizar.
4. Coloque la identificacin de la muestra en el
Encendido del equipo apartado id de muestra.
1. Encienda el equipo presionando el switch en 5.Si desea cambiar el modulo en el que ser
la parte posterior del equipo genexpert. procesada la muestra seleccinelo.
2. Encienda la computadora. 6.Cuando est listo para procesar la muestra
presione el botn iniciar.
Pg. 77
1. Despus de terminar de procesar las mues-
7. Aparecer el recuadro para que introduzca tras, saque los cartuchos de los mdulos.
de nuevo su usuario y contrasea, introdzca- 2. Cierre el software presionando en la x de la
los. parte suprior derecha.
8. Al darle ok la luz del mdulo seleccionado 3. Aparecer un recuadro preguntando si quiere
para procesar la muestra empezara a parpa- hacer algn manejo de la base de datos, presio-
dear. nar no.
9. Introduzca el cartucho en el mdulo y cierre 4. Luego aparecer un recuadro preguntando si
la compuerta. quiere hacer un backup, presionar no.
10. El equipo iniciara 5. El software se cerrara.
11. a procesar su muestra. El tiempo restante 6. Presione inicio en la barra de inicio de win-
depender del ensayo a realizar. dows.
7. Presione apagar
Inserto del test MTB/RIF Cepheid 8. Apague el monitor.
Apagado del equipo Resultados e interpretacin
Pg. 78
malaquita) en Middlebrook 7H10 (sales de
fosfato y magnesio, vitaminas, cofactores, cido
Precauciones y limitaciones olico, albmina, catalasa, glicerol y dextrosa)
cuando es necesario enriquecer las muestras,
Trate todas las muestras biolgicas, incluidos recuperarlas o para conservacin de cepas se
los cartuchos usados, como posibles agentes utiliza el segundo medio de cultivo que se ha
transmisores de infecciones. mencionado.
Todas las muestras biolgicas debern tratarse
con las medidas de precaucin habituales
Utilice guantes protectores desechables, bata
de laboratorio y proteccin ocular cuando mani-
pule las muestras y los reactivos.
Lvese las manos a fondo tras manipular las
muestras y los reactivos de la prueba.
Siga los procedimientos de seguridad del cen-
tro para trabajar con productos qumicos y ma-
nipular muestras biolgicas.
Si se va a procesar ms de una muestra a
la vez, abra solo un cartucho, aada la mues-
tra tratada con el reactivo de la muestra (o una
muestra liquida descontaminada) y cierre el car-
8.1. Muestras
tucho antes de aadir la muestra tratada con el
reactivo de la muestra al siguiente cartucho.
Las muestras para realizarles cultivo de mico-
No abra la tapa del cartucho Xpert MTB/RIF
bacterias estn clasificadas dentro de dos cate-
salvo para aadir la muestra tratada.
goras:
No use un cartucho que se haya cado o agita-
De origen pulmonar (esputo, liquido y biopsia
do despus de aadir la muestra tratada.
pleural, hisopados larngeos, cepillados y lava-
dos bronquiales).
8. CULTIVO DE MICOBACTERIAS EN
De origen extrapulmonar (orina, heces, piel,
LOWENSTEIN JENSEN
sangre, mdula sea, tejidos blandos, aspirados
suprapbicos de vejiga, biopsias, lquido cefalo-
Los procedimientos para obtener el crecimiento
rraqudeo (LCR), lquido pericrdico, lquido pe-
in vitro de las micobacterias son especializados;
ritoneal, secreciones varias, fluidos y muestras
deben seguirse estrictamente las instrucciones
tisulares en general).
para tener xito en su recuperacin. Por lo gene-
De estas categoras hay dos niveles:
ral, las muestras para cultivo contienen muchas
bacterias de las microbiotas, especialmente el
Tabla No. 5 Tipos de muestras.
esputo que siempre se contamina con microbio-
ta de la boca. Adems el esputo es una mues-
tra difcil de manipular por su mucosidad, tena-
cidad y adherencia. Por estas razones para su
cultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo
lquido y descontaminarse; es decir darle algn
tratamiento qumico para destruir las bacterias
contaminantes que crecen rpido, pero sin des-
truir a las micobacterias.
El cultivo se realiza en Lowenstein Jensen que

es un medio muy nutritivo (Huevos enteros fres-
cos, fcula de papa, glicerol, sales de fosfato
y magnesio, L-asparagina, glicerol y verde de
Pg. 79
bovina 0.2%, o caldo lquido para micobacte-
rias (Ej. Middlebrook 7H9 Dubos) al triturador
Las muestras normalmente contaminadas ya de tejido. Si la muestra es mucoide puede agre-
sea por microbiota normal que es arrastrada al garse N-acetil-L-cistena (NALC)
obtenerla o por su propia naturaleza requieren - Mantener el tubo de lado e insertar el pistilo.
el paso de digestin-decontaminacin, por el Empujar la muestra al fondo del tubo
contrario las muestras normalmente no conta- - Detener el tubo en la mano, empujar el pistilo
minadas no lo requieren pero en la mayora de hacia delante y atrs en ngulo 90
los casos pueden requerir de concentracin. En - Triturar la muestra hasta lograr una suspen-
la tabla No.6 se encuentra la preparacin se- sin homognea
gn tipo de muestra previo al procedimiento de - Remover cuidadosamente el pistilo del tubo.
decontaminacin. Utilizar un volumen pequeo de medio para en-
* Si se cuenta con triturador para biopsias pro- juagar la punta del pistilo dentro del recipiente
ceder de la siguiente manera: de descarte
- Transferir la muestra al triturador de tejido es- - Tapar el tubo con un tapn de rosca estril
tril usando un asa o aguja para colocarla en la
pared lateral del tubo del triturador
- Agregar 10 partes de NaCl 0.85%, albmina
TABLA No. 6 PREPARACION DE MUESTRAS PREVIO AL PROCEDIMIENTO
DECONTAMINACION
Pg. 80
preparacin genera calor.
8.2. Mtodos para decontaminacin Combinar volmenes iguales de las solucio-

de muestras. nes 1 y 2, autoclavear a 121C por 15 minutos
en balones de preferencia con tapn de rosca.
Las micobacterias se recuperan ptimamente NOTA: la solucin puede ser guardada a tempe-
de muestras clnicas cuando se utilizan mto- ratura ambiente, pero es preferible que se man-
dos para liberarlas de clulas y fluidos corpo- tenga en refrigeracin; la desventaja de tenerla
rales (digestin) y para remover o reducir los preparada es que el hidrxido de sodio forma
organismos competidores (decontaminacin). estructuras blancas como precipitado y en ste
Ningn mtodo es ideal para todas las mues- caso ya no puede utilizarse; por lo que de pre-
tras clnicas en todas las circunstancias. Algu- ferencia hay que prepararlo el da que va a ser
nos mtodos utilizan un solo reactivo tanto para utilizado.
digerir como para decontaminar, mientras que
otros utilizan reactivos separados para estas A continuacin se presentan cantidades de di-
dos funciones. Cualquiera que sea el mtodo gestor y decontaminante dependiendo de la
elegido, se debe estar prevenido de las limita- cantidad de solucin total necesaria para traba-
ciones inherentes al mtodo por lo que deber jar un determinado nmero de muestras:
seguir el procedimiento de digestin-deconta-
minacin que maximice la recuperacin de mi- Tabla No. 7 Cantidades para la prepa-
cobacterias a partir de muestras no estriles. racin del Digestante-Decontaminante
8.2.1. Mtodo de N-Acetil-L-Ciste-

na-Hidrxido de Sodio (NALC-NaOH)
Principio:
La N-acetil-L-cistena (NALC) es un agente mu-
coltico que a concentraciones de 0.5 a 2.0%
puede digerir rpidamente an el esputo ms
tenaz en slo 2 minutos. La decontaminacin Buffer de fosfatos 0.067 M (pH 6.8)
se lleva a cabo por medio de una solucin pre-
parada con hidrxido de sodio y citrato de so- a. Buffer alcalino stock
dio. Na2HPO4 (Fosfato disdico anhidro) 9.47 gr
Agua desmineralizada 1000 ml
Materiales:
Indicar en la etiqueta y en el libro de trabajo b. Buffer cido stock
la fecha de inicio y expiracin. Etiquetar todos KH2PO4 (fosfato monopotsico) 9.07 gr
los reactivos con fecha de preparacin, receta, Agua desmineralizada 1000 ml
contenido, concentracin, condiciones de al-
macenamiento. Agregar cada sal a balones volumtricos de
1000 mL.
Solucin stock de Citrato de Sodio-NaOH Adicionar agua desmineralizada a la marca de
Solucin 1 (2.9%) 1000 mL.
- Citrato de sodio dihidratado 29g Cada buffer puede ser transferido a recipien-
- Agua desmineralizada 1000ml tes con tapn de rosca y esterilizados a 121C
Solucin 2 (4%) por 15 min, para ser mezclados despus, o pue-
NaOH en granallas 40g den combinarse inmediatamente y esterilizarse
Agua desmineralizada 1000ml La solucin puede ser guardada a temperatura
ambiente pero es preferible que se refrigere (2-
Precaucin el NaOH es custico y su 8C).
Pg. 81
i. De preferencia descartar el sobrenadante en
un recipiente de descarte que contenga fenol
c.Solucin de trabajo de buffer de fosfatos (pH al 5% y del sedimento remover una porcin (ya
6.8) sea una asada grande de preferencia 2-3 go-
Combinar volmenes iguales de los stocks altas con una pipeta estril) para colocar sobre el
calino y cido 640ml del fosfato disdico con medio slido de cultivo.
360ml de la solucin de fosfato monopotsico y j. Inocular el sedimento de la muestra en 2 tubos
chequear el pH de la solucin. de Lwenstein Jensen.
Agregar pequeas cantidades de buffer alcali- k. Incubar los tubos de forma horizontal a 37C
no para incrementar el pH o pequeas cantida- por 2-5 das
des de buffer cido para disminuirlo. l. Seguir incubando los tubos de forma vertical
en una gradilla.
Solucin NALC-NaOH-Citrato de sodio m. Realizar lecturas 2 veces por semana.
Justo antes de usar, combinar el NALC con n. Observar crecimiento de colonias con las si-
la solucin de NaOH-Citrato de sodio. La so- guientes caractersticas: color crema, rugosas,
lucin detrabajo puede ser utilizada por las 2 secas y bien adheridas al medio.
horas consecutivas de su preparacin, luego o. Realizar frotes con Zielh Neelsen, para com-
debe descartarse. probar crecimiento de bacilos alcohol cido re-
sistentes.
Procedimiento p. Si se completan 8 semanas y no hay creci-
miento se dejan de incubar y se reportan como
a. Agregar un volumen de la solucin de trabajo negativos para micobacterias.
NALC-NaOH-Citrato de sodio igual al volumen
de la muestra en un tubo Falcon con tapn de 8.2.2. Mtodo del Hidrxido de
rosca. Sodio
b. Mezclar suavemente y de forma invertida Principio:
para asegurar que la solucin tenga contacto
con todas las superficies del interior del tubo y El hidrxido de sodio es tanto un digestante
tapn. como un decontaminante, y su efecto es muy
c. Agitar el tubo (muestra + solucin de trabajo) bueno. Su actividad mucoltica ms efectiva
en Vortex por 5 a 30 segundos hasta dejar la ocurre a una concentracin de 4%.
muestra licuada, se debe evitar una agitacin
en exceso ya que NALC es inestable en pre- Materiales:
sencia de oxgeno y adquiere un color amarillo Solucin NaOH 4%
por oxidacin de NALC, si esta coloracin se - Granallas de NaOH 40g
da el NALC se inactiva. - Agua desmineralizada 1000ml
d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a -Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121C.
temperatura ambiente por 15 minutos para que
se lleve a cabo el proceso de decontaminacin. Procedimiento
e. Si fuera necesaria una decontaminacin ms a. Agregar un volumen de NaOH igual al volu-
activa, incrementar la concentracin de sosa men de la muestra en un tubo con tapn de ros-
de la tabla al 5% o al 6% en lugar de aumentar ca.
el tiempo de exposicin al reactivo decontami- b. Mezclar suavemente y de forma invertida el
nante. tubo.
f. Neutralizar la muestra aadiendo agua des- c. Agitar el tubo (muestra + NaOH) en Vortex
tilada estril buffer de fosfatos (pH 6.8) hasta por 30 segundos.
la marca de 45-50; para detener el proceso de d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a
decontaminacin. temperatura ambiente por 15 minutos para que
g. Mezclar de forma invertida y suave el tubo. se lleve a cabo el proceso de decontaminacin.
h. Centrifugar a 3000rpm en centrfuga refrige- e.Diluir la muestra con agua desmineralizada
rada durante 15 minutos. para detener el proceso de decontaminacin.
Pg. 82
c. Agitar el tubo (muestra + cido oxlico) en
Vortex por 30 segundos.
f. Mezclar de forma invertida y suave el tubo. d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a
g. Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos. temperatura ambiente por 30 minutos para que
h. De preferencia descartar el sobrenadante en se lleve a cabo el proceso de decontaminacin.
un recipiente de descarte que contenga fenol e. Diluir la muestra con solucin salina 0.85%
al 5% y del sedimento remover una porcin estril para detener el proceso de decontamina-
(ya sea una asada grande de preferencia 2-3 cin.
gotas con una pipeta estril) para colocar sobre f. Mezclar de forma invertida y suave el tubo.
el medio slido de cultivo. g. Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos.
El NaOH debe utilizarse a la menor concentra- h. De preferencia descartar el sobrenadante en
cin que efectivamente digiera y decontamine un recipiente de descarte.
efectivamente las muestras. Si ocurre conta- i. Agregar algunas gotas de rojo de fenol al se-
minacin excesiva con el uso de NaOH 2% hay dimento.
que incrementar la concentracin primero al j. Neutralizar el sedimento con NaOH 4% hasta
3% y luego a 4% antes de aumentar el tiempo obtener un color rosa plido.
de exposicin. k. Del sedimento remover una porcin (ya sea
una asada grande de preferencia 2-3 gotas
8.2.3. Mtodo del cido Oxlico con una pipeta estril) para colocar sobre el me-
Principio: dio slido de cultivo.
El cido oxlico (cido etanodioico) es comn a

muchas plantas y vegetales por lo que depen-
de de un viraje de colores para poder deconta-
minar efectivamente las muestras.
Materiales:
a. Reactivo de cido oxlico al 5%
cido oxlico 50gr
Agua desmineralizada 1000ml
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a
121C. 8.2.4. Mtodo MycoPrep BBL (mtodo
comercial)
b. Indicador de Rojo de fenol Principio
Rojo de fenol 8mg La mayora de las muestras enviadas para con-
NaOH 20ml firmacin de infeccin por micobacterias con
Agua desmineralizada 000ml cultivo estn contaminadas por la microbiota
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a normal. Por esta razn deben ser tratadas con
121C. un procedimiento de digestin y descontamina-
Disolver el rojo de fenol en NaOH al 4% en un cin. La solucin de N-acetil-L-cistena-hidrxi-
agitador magntico, puede que se requiera de
do sdico (NALC-NaOH) es Cuando el reactivo
calentamiento leve. Transferir la solucin a un
se diluye con la muestra en cantidades iguales
baln volumtrico y aforar a 1000ml con agua
provee digestin y decontaminacin con una
destilada. Guardar la solucin a temperatura
ambiente. concentracin NaOH al 1 %, el citrato de sodio
enlaza los iones de metal pesado presentes en
Procedimiento la muestra que pueden inactivar el NALC. El
a. Agregar un volumen de cido oxlico al 5% tampn fosfato ph 6.8 disminuye la actividad de
igual al volumen de la muestra en un tubo con la solucin de NALC-NaOH y reduce la grave-
tapn de rosca. dad especfica de la muestra. Materiales
b. Mezclar suavemente y de forma invertida el Verificar la etiqueta y fecha de expiracin.
tubo.
Pg. 83
si las ampollas estn rotas, ausentes o bien si
no contienen polvo. No utilice si hay evidencia
de deterioro (e. g. el color del reactivo se vuel-
Materiales ve amarillo). No utilice el tampn fosfato si los
paquetes estn desgarrados o abiertos.
Verificar la etiqueta y fecha de expiracin.
Reactivo BBL MycoPrep Frmula aproxima- RECOGIDA Y MANIPULACIN DE LAS
da (ajustada y/o enriquecida para satisfacer MUESTRAS
los criterios de rendimiento) por un litro de agua
Se requiere la utilizacin de prcticas y proce-
- NaOH en granallas 20g dimientos de bioseguridad de nivel 2 y equipo e
- Citrato trisdico (Na3C6H5O7.2H2O) 14.5g instalaciones para contencin cuando se mani-
Cada ampolla de vidrio sellada dentro del fras- pulen muestras clnicas sin producir aerosoles,
co contiene un mnimo de 0.370 g de NALC(- como en la preparacin de frotis acidorresisten-
C5H9NO3S) tes. Todas las actividades que generen aeroso-
les deben llevarse a cabo en una campana de
Tampn fosfato BBL Mycoprep Frmula apro- flujo laminar nivel II. Se requiere utilizacin de
ximada (ajustada y/o enriquecida para satisfa- prcticas de bioseguridad de nivel 3 y equipo e
cer los criterios de rendimiento) por 500 ml de instalaciones para contencin en las activida-
agua purificada des de laboratorio que incluyan la propagacin
y manipulacin de cultivos de M. tuberculosis
-Fosfato disdico (Na2HPO4) 2.37g y M. bovis. Los estudios en animales tambin
-Fosfato monopotsico (KH2PO4) 2.27g requieren la implementacin de procedimientos
especiales.
Ph Final de 6.8
Advertencias y precaucin: Para uso de diag- Procedimiento
nostico in vitro.
a. Prepare el tampn fosfato BBL MycoPrep
El reactivo NALC-NaOH contiene alcalinos segn sea necesario, vaciando el contenido de
fuertes y causa quemaduras graves. Se debe un paquete en un matraz volumtrico de 500
usar guantes y proteccin para los ojos y la mL y rellenado con agua purificada. Transfiera
cara. El NaOH irrita los ojos y la piel. En caso la solucin tampn a un envase con tapa de
de contacto con los ojos o la piel, enjuagar in- rosca y pngala en el autoclave a 121 C du-
mediatamente con un producto para lavado rante 15 minutos con la tapa floja. Djela enfriar
ocular o abundante agua potable durante al a temperatura ambiente y apriete la tapa.
menos 15 minutos y consulte al mdico. Si es
ingerido, tome leche, clara de huevo o abun- b. Con cuidado para no derramarlo, afloje la
dante agua y consulte al mdico. Mantenga tapa de rosca del frasco de reactivo MycoPrep.
fuera del alcance de los nios. Extraiga todo exceso de aire del frasco y ase-
gure la tapa. Coloque el frasco en posicin ver-
Precaucin: Rompa la ampolla cerca del tical y apritelo hasta que se rompa la ampolla.
centro una sola vez. No siga manipulando la (Nota: el frasco de 150 mL contiene dos ampo-
ampolla ya que el frasco de plstico puede per- llas y se deben romper las dos). Agite suave-
forarse y causarle heridas. mente para disolver el NALC.
Instrucciones para el almacenamien- Evite agitar en exceso. UNA VEZ ROTA LA

to: En cuanto se reciba, guardar a una tempe- AMPOLLA, EL REACTIVO DEBE USAR-
ratura entre 15 y 30C. No congelar. No abrir SE EN UN LAPSO DE 24 HORAS.
hasta que vayan a utilizarse.
Deterioro del producto: No utilice los reactivos
Pg. 84
cimiento BACTEC MGIT y la mezcla antibitica
BBL MGIT PANTA est destinado para la detec-
c. En un gabinete de seguridad biolgica, utili- cin y recuperacin de micobacterias utilizan-
ce un tubo para centrifuga estril libre de aero- do los sistemas BACTEC MGIT 960. Los tipos
soles de 50 mL y con tapa de rosca, aada can- de muestras aceptables son muestras clnicas
tidades iguales de la muestra y de la solucin digeridas y decontaminadas (excepto orina) y
de NALC-NaOH activada (aproximadamente 5 fluidos corporales estriles (excepto sangre).
mL de cada uno)
Principio
d. Tape el tubo para centrifuga y mezcle en
un vortex hasta que la muestra se lice. Si la Se tiene un compuesto fluorescente en la parte
muestra es muy viscosa aada ms solucin inferior de los tubos de 16x100 mm de fondo re-
de NALC-NaOH y vuelva a mezclar. dondo. El compuesto fluorescente es sensible
a la presencia de oxgeno disuelto en el caldo.
e. Deje reposar la mezcla a temperatura am- Al inicio la gran cantidad de oxgeno disuelto
biente durante 15 minutos y agite suavemente apaga las emisiones procedentes del compues-
de vez en cuando. Evite tratar la muestra en to y se puede detectar muy poca fluorescencia.
exceso. Ms tarde, los microorganismos que respiran
activamente consumen el oxgeno y permiten
f. Aada el tampn de fosfatos ya preparado al que se detecte la fluorescencia.
tubo para centrifuga hasta alcanzar los 40 mL
y mezcle. Centrifugar entre 15 y 20 minutos a Los tubos que se introducen en el instrumento
3,000 gravedades.
BACTEC MGIT son incubados continuamente a
37C y este controla los tubos cada 60 minutos
g. Decante con cuidado todo el fluido sobrena-
para detectar un aumento en la fluorescencia.
dante
El anlisis de la fluorescencia, este anlisis se
h. Aada una pequea cantidad de tampn de utiliza para determinar si el instrumento detecta
fosfatos con un pH 6.8 (0.5 a 2 mL) y vuelva a el tubo como positivo con organismos viables.
suspender el sedimento. Utilice la suspensin Cada tubo positivo contiene aproximadamente
para preparar frotis y para los procedimientos 105 a 106 UFC/ml. Los frascos de cultivo que
micobacteriolgicos. permanecen negativos durante un mnimo de
42 das (hasta 56 das) y que no muestran in-
Control de Calidad del Usuario: dicios de ser positivos se retiran del instrumen-
Examine los componentes del equipo de cada to como negativos y se esterilizan antes de ser
lote o envo que se reciba por Deterioro del Pro- desechados.
ducto.
Inocular una caja de agar sangre para bs- El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT
queda de bacterias u hongos contaminantes. se aade a cada tubo MGIT para proporcionar
Inocular los reactivos del Mycoprep (buffer y substancias esenciales para el crecimiento rpi-
solucin NaOH-citrato de sodio-NALC en tubo do de micobacterias. El cido oleco es usado
de medio slido y tubo de medio lquido para por las micobacterias y es muy importante en el
verificar esterilidad. metabolismo micobacteriano. La albmina ac-
ta como agente protector al ligar cidos grasos
8.3. Inoculacin de Tubo Bactec MGIT libres que pueden ser txicos para las especies
960 (Indicador de crecimiento de Mi- de Mycobacterium, ayudando a su recupera-
cobacterias). cin. La dextrosa es una fuente de energa.
El uso del tubo BBL MGIT indicador de creci-

miento enriquecido con el suplemento de cre-
Pg. 85
La catalasa destruye las peroxidasas txicas Base de caldo Middlebrook 7H) modificado
que pueden estar presentes en el medio. 5.9 g.
La contaminacin se reduce al suplementar el Peptona de casena 1.25 g.
caldo de base con el suplemento de crecimien-
to BACTEC MGIT/mezcla antibitica BBBL El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT
MGIT PANTA antes de la inoculacin con una contiene 15 mL de Caldo de enriquecimiento
muestra clnica. Middlebrook OADC.
Frmula aproximada por L de agua purificada:
Materiales y Reactivos Albumina bovina 50.0 g
Catalasa 0.03 g.
El tubo indicador de crecimiento BBL MGIT Dextrosa 20.0 g
contiene: 110 uL de indicador fluorescente y 7 cido olico 0,1 g.
mL de caldo. El indicador contiene cloruro pen- Estearato de polioxietileno (POES) 1.1g.
tahidratado de Tris-4, 7-difenil-1, 10-fenantroli-
na rutenio en una base desilicona. Los tubos MGIT 960 INGRESO O EGRESO DE TU-
se limpian con un chorro de CO2 al 10% y se BOS O GRADILLAS
cierran con tapones de polipropileno. 1.Ingreso de los tubos o gradillas al equipo (este
Formula aproximada por L de agua purificada procedimiento no es realizado por nosotros)
del tubo indicador de crecimiento BBL-MGIT: A.Ingreso desde el instrumento
Pg. 86
Despus del ingreso de los tubos, el instrumento automticamente realizara la lectura de los
tubos cada hora durante el tiempo necesario para la interpretacin del procedimiento.
MANTENIMIENTO DIARIO MGIT 960
Verificar luces internas y externas:
Correcto funcionamiento
Pg. 87
Verificar de Temperatura
Correcto funcionamiento
Pg. 88
Registrar los resultados con una amina primaria o secundaria (anilina).
Kilburn y Kubica modificaron utilizando una tira
9. MTODOS DE IDENTIFICACIN impregnada con los reactivos. El tiocianato po-
tsico acidificado con cloramina T libera cloruro
9.1. TEST DE CIDO NICOTNICO PARA de ciangeno, el cual reacciona con cido ni-
TB BBL TAXO (NIACINA) cotnico y produce un color amarillo. Si no hay
cido nicotnico no aparece ningn color.
Principio Materiales
Las tiras de anlisis de cido nicotnico para TB Las tiras de anlisis de cido nicotnico para
contienen reactivos para la deteccin de la pro- TB BBL Taxo son tiras de papel absorbente im-
duccin de cido nicotnico por micobacterias. pregnadas con tiocianato potsico, cloramina
Se utiliza el control de cido nicotnico para TB T, cido citrco y aminosalicilato de sodio.
BBL taxo como control positivo en el anlisis de
cido nicotnico. Los discos de papel control estn impregnados
con nicotinamida. Cuando se usan siguiendo
Todas las micobacterias producen cido nico- las instrucciones, producen una solucin ama-
tnico, o niacina, sustancia que desempea rilla equivalente aproximadamente a 5 ug de
un papel esencial en las reacciones de oxida- cido nicotnico.
cin-reduccin. Debido al bloqueo de una va Medios de cultivos.
metablica, M. tuberculosis y ciertas cepas ais- Agua destilada o desionizada estril o solu-
ladaS de M. simiae y de M. chelonae producen cin salina 0.85% estril.
las mayores cantidades de este compuesto. El Tubos estriles de 13 x 75 mm.
cido nicotnico se acumula en los medios de Tapones para tubo.
cultivo en los que estn creciendo los microor- Pipetas de trasferencia estril.
ganismos y puede extraerse de dichos medios. Pinzas.
El cido nicotnico producido por el microorga- Cepas para control de Calidad
nismo reacciona con el bromuro de ciangeno y
Pg. 89
jo en cada uno de los tubos (control positivo,
control negativo, muestra) y taparlos inmedia-
Almacenamiento: Conservar las tiras a 2 a 8 tamente.
C. La fecha de vencimiento es vigente para el d. Mezclar gentilmente pero no agitar. Repetir
producto cuando est envasado en su recipien- este movimiento despus de 5 a 10 min.
te intacto y ha sido conservado segn las ins- e. Despus de 15 min. pero no ms de 30 min.,
trucciones. comparar el color de los extractos
f. Autoclavear y descartar los tubos despus de
Preparacin de la muestra completar la prueba.
Agregar 1.5 ml de solucin salina 0.85% o Resultados

agua desmineralizada estril a un cultivo de 3-4 Un resultado positivo para el test de niacina se
semanas de crecimiento con al menos 50 a 100 evidencia por la aparicin de color amarillo en
colonias. el extracto de la muestra y en el control positivo;
Frotar con un asa plstica estril sobre el cre- la ausencia de color en el control negativo.
cimiento para permitir la extraccin de la niaci-
na. No utilizar cultivos contaminados. Precauciones
Inclinar los tubos de modo que la superficie
del medio est en posicin horizontal y cubierta
con el lquido utilizado. Permitir que permanez-
ca en esta posicin por 20 a 30 minutos.
Cuidadosamente remover aproximadamente
0.6 ml del extracto de cada muestra con una
pipeta estril y transferirlo a un tubo de 13 x 75
mm.
a. Preparacin de controles
* Positivo:
-Colocar 0.6 ml de solucin salina 0.85% nicamente cultivos de 3 a 4 semanas de cre-
agua desmineralizada estril en un tubo de 13 cimiento con al menos 50 a 100 colonias deben
x 75 mm usarse en el test de produccin de niacina. Una
-Agregar uno de los discos control de niacina, menor cantidad de colonias puede dar resulta-
tapar y agitar moderadamente 3 veces por 15 dos negativos o dudosos.
min. No deben utilizarse cultivos contaminados.
-Rotular como control positivo. Deben observarse las precauciones para el
manejo de Mycobacterium tuberculosis al rea-
*Negativo: lizar sta prueba.
-Colocar 0.6 ml de solucin salina 0.85% Los tubos tapados deben ser autoclaveados
agua desmineralizada estril en un tubo de 13 despus de completar la prueba.
x 75 mm
- Rotular como control negativo. Limitaciones
Aunque un resultado fuertemente positivo para
Procedimiento el test de niacina en micobacterias no cromo-
gnicas, es altamente indicativo de Mycobacte-
a. Procesar el cultivo como se indica en prepa- rium tuberculosis se considera nicamente una
racin de la muestra y colocar 0.6 ml del extrac- identificacin preliminar de este organismo. La
to de cada muestra en tubos de 13 x 75 mm identificacin completa y final de Mycobacte-
b. Mantener a mano los tubos control positivo y rium tuberculosis y otras micobacterias clnica-
negativo mente significativas se basa en los resultados
c. Utilizando pinzas flameadas, dejar caer una obtenidos en una batera de informacin que in-
tira del test de niacina, con la flecha hacia aba- cluye test bioqumicos, patrones de susceptibi-
lidad antibitica y caractersticas morfolgicas.
Pg. 90
Almacenamiento
Conservar las tiras de 2 a 8 C. No exponer
Se considera que los medios de cultivo desarro- a humedad y temperaturas elevadas. Proteger
llados en medios a base de huevo son los que de la luz, las tiras son fotosensibles. La fecha
producen los resultados ms homogneos, se de vencimiento es vigente para el producto
obtienen resultados satisfactorios con agar de cuando est envasado en su recipiente intacto
Middlebrook y Cohn suplementado con cido y ha sido conservado segn las instrucciones.
asprtico al 0.1 %.
Procedimiento
a. Utilice un cultivo de 3 4 semanas hecho en
medio de Lowenstein-Jensen, medio Petragna-
ni u otro medio de huevo coagulado.
b. Aada 0.5 ml de agua destilada a un tubo
limpio de 20x110mm con tapn de rosca.
c. Utilizando una pipeta estril de 1 mL o una
9.2. TIRAS BBL TAXO PARA PRUEBA esptula, saque dos agregados de colonias del
DE NITRITOS cultivo. Aada las colonias al agua destilada y
disperse las colonias utilizando la pipeta o la es-
Principio ptula. Alternativamente, aada 1.5 ml de solu-
Se utilizan para detectar los microorganismos cin salina estril en cada cultivo inclinado y re-
nitrato reductasa positivos, especialmente mi- mueva el cultivo para una suspensin espesa.
cobacterias en la prueba de reduccin de ni- Transfiera 0.5 ml de esta suspensin de cultivo
trato. a un tubo vaco y estril para analizar.
La capacidad que tiene la micobacteria de re- d. Con las pinzas esterilizadas al fuego, aada
ducir los nitratos a nitritos es til para diferen- cuidadosamente una tira BBL Taxo para prue-
ciarlas. Esta prueba separa las micobacerias ba de nitrito al tubo. Oriente la tira para poder
de crecimiento lento que son nitrato positivas introducir primero la parte inferior de la misma,
como ejemplo M. tuberculosis, M. kansasii y sealada con una flecha, en el tubo. Sostenga
M. fortuitum de las de crecimiento rpido que el tubo en sentido vertical.
son negativas o dbilmente positivas como por e. Cierre el tubo con el tapn e incbelo a 35 +/-
ejemplo M. bovis, M. avium complex y M. intra- 2C durante 2 horas. Agite el tubo suavemente
cellulare. al concluir la primera y la segunda hora de incu-
La presencia de la enzima nitrato reductasa se bacin. No incline el tubo
detecta por la produccin de un producto final f. Despus de 2 horas de incubacin, incline el
coloreado. tubo cuidadosamente de un lado a otro 6 veces
para humedecer la tira entera. Inclnelos tubos
Materiales a temperatura ambiente para cubrir la tira con el
Las tiras BBL Taxo para prueba de nitrito son lquido. Deje los tubos en esta posicin durante
tiras de papel absorbente impregnadas de ni- 10 min.
trato sdico tamponado, cido ctrico, yoduro Resultados
potsico y almidn. El cambio del color de la parte superior de la tira
Medios de cultivos. a azul claro o azul oscuro indica la reduccin
Agua destilada o desionizada estril. de nitrato. La ausencia de un cambio de color
Tubos estriles de 20 x 110 mm con tapn de indica una reaccin negativa.
rosca. Control de Calidad
Pipetas de trasferencia o esptula. Especificaciones de la identidad, las tiras de pa-
Pinzas. pel blancas con flecas negras apuntando hacia
Incubadora. abajo.
Cepas para control de Calidad Respuesta del cultivo: Prepare tubos con agua
destilada. Inoclelos con los organismos a ana-
lizar.
Pg. 91
anticuerpo-conjugado coloide dorado, se une
al antgeno MPT64 en la muestra, en medio
Introduzca las tiras en los tubos con la flecha lquido.
apuntando hacia abajo. Incube a 35 +/- 2C
durante 2 horas. La presencia del color azul El complejo entonces continua fluyendo y se
en la parte superior de la tira indica una reac- une al anti- MPT64 monoclonal de ratn sobre
cin positiva. la fase slida en la lnea de prueba, producien-
do una banda de color de rojo a purpura. En
ausencia del MPT64 no hay lnea en la regin
de banda de prueba.
Materiales y Reactivos
Dispositivo de prueba individualmente empa-

Limitaciones cado en una bolsa de aluminio con un dese-
La prueba de reduccin de nitrato es valiosa cante
para l identificacin de M. tuberculosis y otras Buffer de extraccin (para preparacin de
micobacterias clnicamente significativas. Sin muestras a partir de cultivos slidos).
embargo, esta prueba es slo una parte de la Instrucciones de uso.
batera bioqumica necesaria para la identifica-
cin preliminar de estos organismos. Procedimiento
9.3.
DETECCIN DE ANTGENO a. Retirar el dispositivo de prueba de su bol-
MPT64 sa de aluminio y ubquelo sobre una superficie
plana y seca.
Principio b. Adicionar 100l del cultivo lquido (o 100l
Prueba de casete que consta de una almoha- del cultivo solido suspendido en buffer) dentro
dilla para la muestra, una almohadilla de conju- del pozo de muestra.
gado dorado, una membrana de nitrocelulosa c. Cuando la prueba comience a correr, se
y una almohadilla absorbente. Los anti-MPT64 ver el color purpura desplazndose a travs
monoclonal de ratn estn inmovilizados so- de la ventana de resultados en el centro del
bre la membrana de nitrocelulosa como ma- dispositivo de prueba.
terial de captura (lnea del test). Tiene aa- d. Interprete los resultados de prueba 15 mi-
didos otros anticuerpos los cuales reconocen nutos despus de la aplicacin de la muestra.
otros eptopes del MPT64, conjugados con las
partculas del coloide dorado, fueron usados
para la captura del antgeno y la deteccin en
un ensayo tipo sndwich. El dispositivo de la
prueba rpida SD BIOLINE Ag MPT64 tiene
una letra C (Lnea control) y la letra T (Lnea
de prueba) sobre la superficie del casete.
Ambas lneas, control y test no son visibles
en la ventana de resultado antes de la aplica-
cin de cualquier muestra. La Lnea Control
es usada como control del procedimiento. La
lnea control debe siempre aparecer si el pro-
cedimiento de prueba es realizada adecua-
damente y los reactivos de prueba de la lnea
control estn funcionando. Cuando la muestra
es aplicada en el pozo de muestras, esta flu-
ye lateralmente a travs de la membrana, el
Pg. 92
La hibridacin incluye los siguientes pasos: des-
naturalizacin qumica del producto a amplificar;
Resultados hibridacin de amplicones de una sola cadena,
marcados con biotina, a sondas unidas a mem-
brana; lavado astringente; adicin de conjugado
de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una
reaccin de tincin mediada por AP. Una planti-
lla asegura la interpretacin sencilla y rpida del
esquema de bandas obtenido.
MATERIALES
Agua destilada (para uso en biologa molecu-
lar)
Bao de agua
Bao de agua con agitacin/TwinCubator
Bao de ultrasonidos
Centrfuga de mesa
Cronmetro
ADN polimerasa termoestable con tampn (re-
comendacin: HotStarTaq DNA Polymerase de
Qiagen)
Guantes desechables
Precauciones Papel absorbente
Todos los procedimientos se deben realizar en Pinzas
campanas biolgicamente seguras. Use tubos Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 L
de ensayo con tapa para evitar infeccin del Plataforma de agitacin/TwinCubator
usuario cuando requiera de cultivos con mues- Probeta graduada
tras. Puntas de pipeta desechables con filtro
Reactivos para extraccin de ADN, as como
9.4. IDENTIFICACIN DE ESPECIES equipos necesarios
COMUNES DE MICOBACTERIAS (Ge- Termociclador (rango de calentamiento 3C/
noType Mycobacterium CM) seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin
+/0,2C)
PRINCIPIO Termmetro calibrado
El kit GenoType Mycobacterium CM (Common Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa
Mycobacteria) est basado en la tecnologa
DNASTRIP y permite la identificacin de las si- 1. Preparacin de muestra y controles (si apli-
guientes especies de micobacterias: M. avium can controles)
ssp., M. chelonae, M. abscessus, M. for- Las muestras para extraccin son a partir de
tuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas
scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, en 300 L agua ultrapura libre de DNasa y RNa-
M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa.
ulcerans, M. tuberculosis complex, y M. xenopi. Las muestras tambin pueden extraerse a partir
El procedimiento completo se divide en tres pa- de cultivos positivos en medio lquido, se trasla-
sos: extraccin de ADN procedente de cultivo da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
(placas de cultivo/medio lquido; los reactivos DNasa y RNasa.
necesarios no se suministran), una amplifica-
cin mltiplex con primers marcados con bio-
tina (la ADN polimerasa termoestable no se in-
cluye), y una hibridacin reversa.
Pg. 93
5 L 10x de tampn para incubacin de poli-
PROCEDIMIENTO merasa no suministrado.
x L de solucin MgCl21) no suministrado
EXTRACCIN DE ADN 1-2 unidades de DNA polimerasa termoesta-
Puede usarse un crecimiento bacteriano en ble (consulte el manual) no suministrado
placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi- y L de agua para obtener un volumen de 45
ddlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC, l (sin considerar el volumen de enzima) no
MB-Check). Este test no puede usarse para suministrado.
detectar micobacterias directamente de mues- Aada 5 L de solucin de ADN (20-100 ng
tras de pacientes. La zona de trabajo ha de es- de ADN) para obtener un volumen final de 50
tar libre de ADN amplificado. Es crucial el ca- L (sin considerar el volumen de enzima).
lentamiento de las muestras a 95C durante,
al menos, 20 minutos con objeto de inactivar 1) Dependiendo del sistema enzima/tampn
bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- usado, la concentracin ptima de MgCl2 pue-
quier procedimiento de extraccin de ADN que de variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta
produzca ADN de bacterias amplificable. El si- que algunos tampones para incubacin ya con-
guiente protocolo rpido normalmente produce tienen MgCl2.
ADN adecuado para amplificacin:
La evaluacin del rendimiento del ensayo Ge-
1a. Cuando use crecimiento bacteriano en me- noType Mycobacterium CM fue realizada utili-
dio slido, recoja bacterias con un asa de ino- zando la Polimerasa HotStarTaq ADN de Qia-
culacin y suspndalas en aproximadamente gen. Las cantidades necesarias por muestra
300 L de agua (grado Biologa Molecular). cuando utilice esta enzima son las siguientes:
1b. Cuando use crecimiento bacteriano pro-
cedente de medio lquido, aplique directamente 35 L de PNM suministrado
1 mL. Concentre las bacterias mediante centri- 5 L 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (con-
fugacin 15 min en una centrfuga de sobreme- tien e 15 mM de MgCl2) no suministrado
sa en un rotor con contenedor de aerosoles y 2 L 25 mM de solucin MgCl2 no suminis-
en una cabina de seguridad de clase II a 10000 trado
x g aproximadamente. Deseche el sobrenadan- 0,2 L (1 U) de HotStarTaq no suministrado
te y resuspenda las bacterias en 100-300 L de 3 L de agua (para uso en biologa molecular)
agua (ver ms arriba) con un vrtex. no suministrado
2 Incube las bacterias procedentes del aparta- 5 L de solucin de DNA (aada el ADN en
do 1a o 1b durante 20 min a 95C en un bao una zona distinta)
de agua. La concentracin final de MgCl2 en la mezcla
3 Incube durante 15 min en un bao de ultra- de amplificacin ser de 2,5 mM.
sonidos.
4 Centrifugue durante 5 min a mxima veloci- Determine el nmero de muestras a amplificar
dad y utilice directamente 5 L del sobrenadan- (nmero de muestras a analizar ms las mues-
te para la PCR. En caso de que la solucin de tras de control). Por ejemplo, un control de con-
ADN haya de almacenarse por perodos pro- taminacin contiene 5 L de agua en lugar de
longados de tiempo, transfiera el sobrenadante solucin de ADN. Prepare una mezcla que con-
a un tubo nuevo. tenga todos los reactivos excepto la solucin de
ADN y mezcle bien. No utilice vrtex.
AMPLIFICACIN Alicuote la mezcla madre en volmenes de 45
Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en l en tubos preparados de PCR.
una habitacin libre de ADN. La muestra debe
aadirse en un rea separada.
Mezcle por tubo:
35 L de PNM suministrado
Pg. 94
uno de los pocillos usados.
2. Aada a la solucin 20 L de muestra am-
2) Perfil de amplificacin plificada, pipetee arriba y abajo para mezclar
bien e incube a temperatura ambiente durante
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos
usando pinzas e identifquelas marcando bajo
el marcador coloreado con un lpiz. Lleve siem-
pre guantes cuando manipule tiras.
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) pre-
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta
que la solucin tenga un color homogneo.
Tenga la precaucin de no derramar solucin
en los pocillos cercanos.
Los productos para amplificacin pueden alma- 4. Ponga una tira en cada pocillo.
cenarse entre +8 y 20C. Las tiras tienen que quedar completamente cu-
Para comprobar la reaccin de amplificacin, biertas por la solucin y el lado con la sonda
aplique directamente 5 L de cada muestra a hacia arriba (identificable por el marcador co-
un gel de agarosa al 2% sin la adicin de tam- loreado prximo al extremo inferior). Usando
pn de carga. Los amplicones tienen una longi- pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha-
tud aproximada de 230 pb (Control de Gnero) berse girado durante su inmersin. Limpie cui-
y 200 pb (Control Universal/amplicon espe- dadosamente las pinzas despus de cada uso
cie-especfico). para evitar contaminacin. Ello, es tambin de
aplicacin en los pasos siguientes.
HIBRIDACIN 5. Ponga la bandeja en el bao de agua con
Preparacin agitacin o en el TwinCubator durante 30 minu-
Precaliente en bao de agua con agitacin o tos a 45C.
TwinCubator a 45C; la mxima desviacin to- Ajuste la frecuencia de agitacin del bao de
lerada en la temperatura idnea es de +/1C. agua para que realice una mezcla completa y
Precaliente las soluciones HYB y STR a 37- constante de la solucin. Para obtener una ade-
45C antes de usar. cuada transferencia de calor, la bandeja debe
Los reactivos han de estar libres de precipitado estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de
(tenga en cuenta, no obstante que la solucin su altura.
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. 6. Aspire completamente el Tampn de Hibrida-
Caliente a temperatura ambiente los restan- cin.
tes reactivos, con la excepcin del CON-C y Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada
el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el a una bomba de vaco.
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el 7. Aada 1 mL de Solucin de Lavado Astrin-
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 gente (STR, roja) a cada tira e incube durante
con sus tampones respectivos (CON-C con 15 minutos a 45C en un bao con agitacin o
CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades TwinCubator.
necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera- Desde este paso, en adelante, trabaje a tem-
tura ambiente. Para cada tira aada 10 L de peratura ambiente. Elimine completamente la
concentrado a 1 mL de los respectivos tampo- Solucin de Lavado Astringente.
nes. Diluya el CON- C antes de cada uso. El Deseche la Solucin de Lavado en un contene-
SUB-C diludo es estable durante 4 semanas si dor y elimine todo el lquido restante volcando
se almacena a temperatura ambiente y se pro- la bandeja y golpendola suavemente sobre un
tege de la luz. papel absorbente. Ello es tambin de aplicacin
a todos los dems pasos de lavado.
1.Dispense 20 L de la Solucin de Desnatu-
ralizacin (DEN, azul) en una esquina de cada
Pg. 95
8.Lave una vez cada tira con 1 mL de Solucin
de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agi-
tado del TwinCubator (elimine el RIN despus
de la incubacin).
9. Aada 1 mL de Conjugado diludo (ver ms
arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
sobre la plataforma de agitado del TwinCuba-
tor.
10. Elimine la solucin y lave cada tira dos ve-
ces durante 1 minuto con 1 ml de Solucin de
Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
aproximadamente con 1 mL de agua destila-
da (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma
de agitacin del TwinCubator (deseche la solu-
cin cada vez).
Asegrese de eliminar cualquier resto de agua
despus del lavado anterior.
11. Aada 1 mL de sustrato diludo (ver ms Control de Conjugado (CC)
arriba) a cada tira e incube sin agitacin y pro- Debe aparecer una lnea en esta zona, docu-
tegindolas de la luz. mentando la eficacia del conjugado unido y la
Dependiendo de las condiciones del test (por reaccin del sustrato.
ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in-
cubacin del sustrato puede variar entre 3 y 20 Control Universal (UC)
minutos. Tiempos prolongados de incubacin Esta zona detecta, como es conocido, todas
del sustrato pueden conducir a una tincin in- las micobacterias y miembros del grupo de
crementada del fondo y podra dificultar la in- bacterias gram-positivas con alto contenido de
terpretacin de los resultados. G+C. Si esta zona y el Control de Conjugado
12. Detenga la reaccin aclarando brevemente se tien como positivas, pero el restante es-
por dos veces con agua destilada. quema de bandas no puede ser asignado a
13. Usando pinzas, saque las tiras de la ban- una micobacteria especfica, se deben aplicar
deja y squelas entre dos capas de papel ab- mtodos adicionales para identificar la espe-
sorbente. cie bacteriana correspondiente.
Solamente han de considerarse aquellas ban-
RESULTADOS E INTERPRETACIN das cuyas intensidades sean tan fuertes, o
Pegue las tiras y almacnelas protegidas de la ms fuertes, que la intensidad del Control Uni-
luz. Con cada kit se proporciona un formulario versal.
de evaluacin. Cuando se utilice este formula-
rio de evaluacin, pegue las tiras reveladas en Control de Gnero (GC)
los campos marcados, alineando las bandas La coloracin en esta zona documenta, como
CC y UC con las respectivas lneas del formu- conocida, la presencia de un miembro del g-
lario. Anote el nmero de las bandas positivas nero Mycobacterium. La intensidad de esta
en la penltima columna y determine la especie banda vara dependiendo de la especie de Mi-
con la ayuda de la tabla de interpretacin y re- cobacteria.
gistre el nombre de las especies identificadas La banda del Control de Gnero puede des-
en la ltima columna. La plantilla suministrada aparecer a pesar de la presencia de DNA mi-
cobacteriano; sin embargo, siempre que est
tambin sirve como ayuda para evaluacin y presente un patrn de bandeo especfico de
ha de ser alineada con las bandas UC y CC de especie, la reaccin de amplificacin se llev
la tira. Cada tira tiene un total de 17 zonas de acabo correctamente y el resultado del ensayo
reaccin (ver esquema). es vlido.
Pg. 96
Otras bandas
Cuando no aparece patrn de bandas espec- Sondas Especficas; para la evaluacin ver la
fico de especie, un patrn que indique la pre- tabla de interpretacin.
sencia de una bacteria gram-positiva con alto
contenido en G+C puede, en casos raros, estar No todas las bandas de una tira han de mostrar
originado por una Micobacteria que no puede la misma intensidad.
ser detectada por este kit. Por favor, tenga en Si fue usada una gran cantidad de amplicn,
cuenta que puede identificar especias adiciona- pueden aparecer bandas adicionales.
les de micobacterias con el kit GenoType Myco-
bacterium AS. TABLA DE INTERPRETACIN
pacientes de riesgo (infectados por microorga-

PRECAUCIONES nismos patgenos incluyendo Hepatitis B y Vi-
Almacene la Mezcla del Primer/Nucletido rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los
(PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cual- cultivos realizados a partir de esas muestras
quier fuente potencial de DNA contaminante. Si deben ser etiquetados y manejados siempre
se requiere almacenar durante ms de 4 sema- bajo las condiciones de seguridad adecuadas,
nas, almacene a 20C. A fin de evitar congela- de acuerdo con las guas institucionales. Ob-
ciones y descongelaciones repetidas, alicuote serve todas las normas medioambientales y de
el PNM. Almacene el resto de los componentes seguridad, tanto federales, estatales como lo-
del kit en 2-8C. No utilice los reactivos des- cales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.
pus de su fecha de caducidad. El tratamiento y preparacin de la muestra, in-
Los especmenes de los pacientes y los culti- cluyendo el paso de inactivacin por calor, de-
vos realizados a partir de especmenes de pa- ben ser llevados a cabo en una cabina de se-
cientes deben ser considerados siempre como guridad de clase II.
potencialmente infecciosos. Las muestras de
Pg. 97
personas cualificadas, bien entrenadas en el
procedimiento de utilizacin del ensayo y fami-
Antes del paso de inactivacin por calor las liarizadas con mtodos de biologa molecular.
muestras deben ser centrifugadas en un rotor La evaluacin de este sistema de anlisis fue
con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime-
contenedor de aerosoles solamente en la ca- rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
bina de seguridad. Despus de la inactivacin caractersticas de rendimiento de este ensayo
por calor se puede utilizar un rotor standard no han sido validadas para todas las polimera-
para centrifugar las muestras fuera de la cabina sas disponibles comercialmente, el usuario es
de seguridad. el encargado de evaluar la aplicabilidad de otras
Observe las precauciones normales para pre- polimerasas distintas de las arriba menciona-
parar la amplificacin. Es esencial que todos los das.
materiales y reactivos usados para extraccin
de DNA y amplificacin estn libres de DNasas. 9.5. IDENTIFICACIN DE ESPECIES
ADICIONALES (GenoType Mycobacte-
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- rium AS)
mar las siguientes medidas especiales de se-
guridad: PRINCIPIO
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) contie- El kit GenoType Mycobacterium AS (Additinonal
ne <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel. Species) est basado en la tecnologa DNAS-
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- TRIP y permite la identificacin de las siguientes
metil Sulfxido y es irritante. especies de micobacterias:
M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M.
LIMITACIONES celatum, M. smegmatis, M. genavense, M.
Los miembros del M. tuberculosis complex no lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M.
pueden ser diferenciados. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kan-
Antes de la amplificacin, el DNA ha de ser ais- sasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, y M.
lado de cultivo bacteriano realizado por un m- shimoidei.
todo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que El procedimiento completo se divide en tres pa-
la muestra de DNA ha sido amplificada eficien- sos: aislamiento de ADN procedente de cultivo
temente durante la reaccin de amplificacin. (placas de cultivo/medio lquido; los reactivos
El test slo funciona dentro de los lmites de las necesarios no se suministran), una amplifica-
regiones genmicas para las que los primers cin mltiplex con primers marcados con biotina
y sondas han sido elegidos. El anlisis de se- (la ADN polimerasa termoestable no se incluye),
cuencias potenciales permanece reservado y una hibridacin reversa.
para la reanudacin de investigaciones. La hibridacin incluye los siguientes pasos: des-
La presencia de mltiples especies de bacte- naturalizacin qumica del producto a amplificar;
rias en la muestra a analizar puede dificultar la hibridacin de amplicones de una sola cadena,
interpretacin de resultados. marcados con biotina, a sondas unidas a mem-
Como cualquier sistema de deteccin basado brana; lavado astringente; adicin de conjugado
en la hibridacin, este sistema contempla la po- de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una
sibilidad de que variaciones de las secuencias reaccin de tincin mediada por AP. Una planti-
en las regiones genmicas que fueron elegidas lla asegura la interpretacin sencilla y rpida del
para los primers y sondas, y la deteccin de re- esquema de bandas obtenido.
giones para las cuales el kit no fue diseado,
pueden conducir a resultados falsos. Debido a MATERIALES
la gran variabilidad existente en los genomas Agua destilada (para uso en biologa molecu-
bacterianos es posible que ciertos sub-tipos lar)
puedan no ser detectados. El test refleja los co- Bao de agua
nocimientos de Hain Lifescience. Bao de agua con agitacin/TwinCubator
La utilizacin de este ensayo est limitada a Bao de ultrasonidos
Pg. 98
un asa de inoculacin y suspndalas en apro-
ximadamente 300 l de agua (grado Biologa
Centrfuga de mesa Molecular).
Cronmetro 1b. Cuando use crecimiento bacteriano proce-
ADN polimerasa termoestable con tampn dente de medio lquido, aplique directamente 1
(recomendacin: HotStarTaq DNA Polymerase ml. Concentre las bacterias mediante centrifu-
de Qiagen) gacin 15 min en una centrfuga de sobremesa
Guantes desechables en un rotor con contenedor de aerosoles y en
Papel absorbente una cabina de seguridad de clase II a 10000 x
Pinzas g aproximadamente. Deseche el sobrenadante
Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l y resuspenda las bacterias en 100-300 L de
Plataforma de agitacin/TwinCubator agua (ver ms arriba) con un vrtex.
Probeta graduada 2. Incube las bacterias procedentes del aparta-
Puntas de pipeta desechables con filtro do 1a o 1b durante 20 min a 95C en un bao
Reactivos para extraccin de ADN, as como de agua.
equipos necesarios 3 Incube durante 15 min en un bao de ultraso-
Termociclador (rango de calentamiento 3C/ nidos.
seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin 4 Centrifugue durante 5 min a mxima veloci-
+/0,2C) dad y utilice directamente 5 l del sobrenadan-
Termmetro calibrado te para la PCR. En caso de que la solucin de
Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa ADN haya de almacenarse por perodos prolon-
gados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
PREPARACIN DE LA MUESTRA un tubo nuevo.
Las muestras para extraccin son a partir de
colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas AMPLIFICACIN
en 300 l agua ultrapura libre de DNasa y RNa- Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en
sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. una habitacin libre de ADN. La muestra debe
Las muestras tambin pueden extraerse a partir aadirse en un rea separada.
de cultivos positivos en medio lquido, se trasla-
da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de Mezcle por tubo:
DNasa y RNasa. 35 L de PNM suministrado
PROCEDIMIENTO merasa no suministrado.
x L de solucin MgCl 1) no suministrado
EXTRACCIN DE ADN 1-2 unidades de DNA polimerasa termoestable
Puede usarse un crecimiento bacteriano en pla- (consulte el manual) no suministrado
cas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Midd- y L de agua para obtener un volumen de 45
lebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC, MB- l (sin considerar el volumen de enzima) no
Check). Este test no puede usarse para detectar suministrado.
micobacterias directamente de muestras de pa- Aada 5 L de solucin de ADN (20-100 ng de
cientes. La zona de trabajo ha de estar libre de ADN) para obtener un volumen final de 50 L
ADN amplificado. Es crucial el calentamiento (sin considerar el volumen de enzima).
de las muestras a 95C durante, al menos, 20 1) Dependiendo del sistema enzima/tampn
minutos con objeto de inactivar bacterias vege- usado, la concentracin ptima de MgCl puede
variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que
tativas. Se puede seguir cualquier procedimien- algunos tampones para incubacin ya contie-
to de extraccin de ADN que produzca ADN de nen MgCl .
bacterias amplificable. El siguiente protocolo r- La evaluacin del rendimiento del ensayo Geno-
pido normalmente produce ADN adecuado para Type Mycobacterium AS fue realizada utilizan-
amplificacin: do la Polimerasa HotStarTaq DNA de Qiagen.
1a. Cuando use crecimiento bacteriano en me- Las cantidades necesarias por muestra cuando
dio slido, recoja las colonias de bacterias con utilice esta enzima son las siguientes:
Pg. 99
HIBRIDACIN
Preparacin
35 L de PNM suministrado Precaliente en bao de agua con agitacin o
5 L 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (contie- TwinCubator a 45C; la mxima desviacin to-
ne 15 mM de MgCl2) no suministrado lerada en la temperatura idnea es de +/1C.
2 L25 mM de solucin MgCl2 no suminis- Precaliente las soluciones HYB y STR a 37-
trado 45C antes de usar.
0,2 L (1 U) de HotStarTaq no suministrado Los reactivos han de estar libres de precipitado
3 L de agua (para uso en biologa molecular) (tenga en cuenta, no obstante que la solucin
no suministrado CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
5 L de solucin de DNA (aada el DNA en Caliente a temperatura ambiente los restan-
una zona distinta) tes reactivos, con la excepcin del CON-C y
La concentracin final de MgCL2 en la mezcla el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
de amplificacin ser de 2,5 mM. Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
Determine el nmero de muestras a amplificar con sus tampones respectivos (CON-C con
(nmero de muestras a analizar ms las mues- CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
tras de control). Por ejemplo, un control de con- necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera-
taminacin contiene 5 L de agua en lugar de tura ambiente. Para cada tira aada 10 L de
solucin de ADN. Prepare una mezcla que con- concentrado a 1 mlL de los respectivos tampo-
tenga todos los reactivos excepto la solucin de nes. Diluya el CON- C antes de cada uso. El
ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la SUB-C diludo es estable durante 4 semanas si
mezcla madre en volmenes de 45 L en tubos se almacena a temperatura ambiente y se pro-
preparados de PCR. tege de la luz.
1. Dispense 20 L de la Solucin de Desnatu-
2) Perfil de amplificacin *) ralizacin (DEN, azul) en una esquina de cada
uno de los pocillos usados.
2. Aada a la solucin 20 L de muestra am-
plificada, pipetee arriba y abajo para mezclar
bien e incube a temperatura ambiente durante
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos
usando pinzas e identifquelas marcando bajo
el marcador coloreado con un lpiz. Lleve siem-
pre guantes cuando manipule tiras.
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) pre-
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta
que la solucin tenga un color homogneo.
en los pocillos cercanos.
4. Ponga una tira en cada pocillo.
Los productos para amplificacin pueden alma- Las tiras tienen que quedar completamente cu-
cenarse entre20CY 8 C biertas por la solucin y el lado con la sonda
Para comprobar la reaccin de amplificacin, hacia arriba (identificable por el marcador co-
aplique directamente 5 l de cada muestra a un loreado prximo al extremo inferior). Usando
gel de agarosa al 2% sin la adicin de tampn pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha-
de carga. Los amplicones tienen una longitud berse girado durante su inmersin. Limpie cui-
aproximada de 230 pb (Control de Gnero) y dadosamente las pinzas despus de cada uso
200 pb (Control Universal/amplicon espe- para evitar contaminacin. Ello, es tambin de
cie-especfico). aplicacin en los pasos siguientes.
Pg. 100
crementada del fondo y podra dificultar la inter-
pretacin de los resultados.
12. Detenga la reaccin aclarando brevemente
5. Ponga la bandeja en el bao de agua con por dos veces con agua destilada.
agitacin o en el TwinCubator durante 30 minu- 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande-
tos a 45C. ja y squelas entre dos capas de papel absor-
Ajuste la frecuencia de agitacin del bao de bente.
agua para que realice una mezcla completa
y constante de la solucin. Para obtener una RESULTADOS E INTERPRETACIN
adecuada transferencia de calor, la bandeja Pegue las tiras y almacnelas protegidas de la
debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 luz. Con cada kit se proporciona un formulario
de su altura. de evaluacin. Cuando se utilice este formula-
6. Aspire completamente el Tampn de Hibri- rio de evaluacin, pegue las tiras reveladas en
dacin. los campos marcados, alineando las bandas
Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada CC y UC con las respectivas lneas del formu-
a una bomba de vaco. lario. Anote el nmero de las bandas positivas
7. Aada 1 mL de Solucin de Lavado Astrin- en la penltima columna y determine la especie
gente (STR, roja) a cada tira e incube durante con la ayuda de la tabla de interpretacin y re-
15 minutos a 45C en un bao con agitacin o gistre el nombre de las especies identificadas
TwinCubator. en la ltima columna. La plantilla suministrada
Desde este paso, en adelante, trabaje a tem- tambin sirve como ayuda para evaluacin y ha
peratura ambiente. Elimine completamente la de ser alineada con las bandas UC y CC de la
Solucin de Lavado Astringente. tira. Cada tira tiene un total de 17 zonas de re-
Deseche la Solucin de Lavado en un contene- accin (ver esquema).
dor y elimine todo el lquido restante volcando
la bandeja y golpendola suavemente sobre un
papel absorbente. Ello es tambin de aplicacin
8. Lave una vez cada tira con 1 mL de Solucin
de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agita-
do del TwinCubator (elimine el RIN despus de
la incubacin).
9. Aada 1 mL de Conjugado diludo (ver ms
arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
10. Elimine la solucin y lave cada tira dos ve-
ces durante 1 minuto con 1 ml de Solucin de
Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
aproximadamente con 1 ml de agua destilada Control de Conjugado (CC)
(ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de Debe aparecer una lnea en esta zona, docu-
agitacin del TwinCubator (deseche la solucin mentando la eficacia del conjugado unido y la
cada vez). reaccin del sustrato.
Asegrese de eliminar cualquier resto de agua
despus del lavado anterior. Control Universal (UC)
11. Aada 1 mL de sustrato diludo (ver ms Esta zona detecta, como es conocido, todas las
arriba) a cada tira e incube sin agitacin y pro- micobacterias y miembros del grupo de bacte-
rias gram-positivas con alto contenido de G+C.
tegindolas de la luz. Si esta zona y el Control de Conjugado se tien
Dependiendo de las condiciones del test (por como positivas, pero el restante esquema de
ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in- bandas no puede ser asignado a una micobac-
cubacin del sustrato puede variar entre 3 y 20 teria especfica, se deben aplicar mtodos adi-
minutos. Tiempos prolongados de incubacin cionales para identificar la especie bacteriana
del sustrato pueden conducir a una tincin in- correspondiente.
Pg. 101
contenido en G+C puede, en casos raros, estar
originado por una Micobacteria que no puede
Control de Gnero (GC) ser detectada por este kit. Por favor, tenga en
La coloracin en esta zona documenta, como cuenta que puede identificar especias adiciona-
conocida, la presencia de un miembro del g- les de micobacterias con el kit GenoType Myco-
nero Mycobacterium. La intensidad de esta bacterium AS.
banda vara dependiendo de la especie de Mi-
cobacteria. Otras bandas
La banda del Control de Gnero puede desapa- Sondas Especficas; para la evaluacin ver la
recer a pesar de la presencia de DNA micobac- tabla de interpretacin.
teriano; sin embargo, siempre que est presen-
te un patrn de bandeo especfico de especie, No todas las bandas de una tira han de mostrar
la reaccin de amplificacin se llev acabo co- la misma intensidad.
rrectamente y el resultado del ensayo es vlido. Si fue usada una gran cantidad de amplicn,
Cuando no aparece patrn de bandas espec- pueden aparecer bandas adicionales.
fico de especie, un patrn que indique la pre-
sencia de una bacteria gram-positiva con alto TABLA DE INTERPRETACIN
Cuando utilice bacterias crecidas en medio l- idntica morfologa de colonias).

quido, la contaminacin bacteriana puede posi-
blemente generar el mismo patrn de bandas.
Este resultado, por tanto, es vlido nicamente
cuando el DNA fue aislado del crecimiento bac-
teriano en medio slido (colonias individuales/
Pg. 102
2) M. nebraskense muestra el mismo patrn de tes de riesgo (infectados por microorganismos
bandas que M. haemophilum. patgenos incluyendo Hepatitis B y Virus de
3) Si se genera este patrn de bandas con el Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cultivos
kit GenoType Mycobacterium AS, se puede di- realizados a partir de esas muestras deben ser
ferencia entre M. szulgai y M. intermedium uti- etiquetados y manejados siempre bajo las con-
lizando GenoType Mycobacterium CM.. M szul- diciones de seguridad adecuadas, de acuerdo
gai mostrar bandeo en las bandas 1, 2, 3, 10 con las guas institucionales. Observe todas las
y 11, y M. Intermedium mostrar bandeo en las normas medioambientales y de seguridad, tanto
bandas 1, 2, 3 y 10. federales, estatales como locales. Lleve siem-
4) Debido a variaciones de secuencia M. kan- pre guantes y ropa adecuada.
sasii puede producir 4 patrones diferentes de El tratamiento y preparacin de la muestra, in-
bandeo. cluyendo el paso de inactivacin por calor, de-
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu-
PRECAUCIONES ridad de clase II. Antes del paso de inactivacin
Almacene la Mezcla del Primer/Nucletido por calor las muestras deben ser centrifugadas
(PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cual- en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir
quier fuente potencial de DNA contaminante. Si el rotor con contenedor de aerosoles solamente
se requiere almacenar durante ms de 4 sema- en la cabina de seguridad. Despus de la inac-
nas, almacene a 20C. A fin de evitar congela- tivacin por calor se puede utilizar un rotor stan-
ciones y descongelaciones repetidas, alicuote el dard para centrifugar las muestras fuera de la
PNM. Almacene el resto de los componentes del cabina de seguridad.
kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus de Observe las precauciones normales para prepa-
su fecha de caducidad. rar la amplificacin. Es esencial que todos los
Los especmenes de los pacientes y los cultivos materiales y reactivos usados para extraccin
realizados a partir de especmenes de pacientes de DNA y amplificacin estn libres de DNasas.
deben ser considerados siempre como poten-
cialmente infecciosos. Las muestras de pacien-
Pg. 103
(GenoType MTBC)
PRINCIPIO
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- El kit GenoType MTBC est basado en la tec-
mar las siguientes medidas especiales de se- nologa DNASTRIP que permite en base a los
guridad: polimorfismos genticos, por los que la ADN
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) con- girasa B diferencia genticamete de especies/
tiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y cepas pertenecientes al grupo Mycobacterium
piel. tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- BCG, M. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae,
metil Sulfxido y es irritante. M. microti, y M. tuberculosis/M. canettii.
El procedimiento completo se divide en tres pa-
LIMITACIONES sos: extraccin de ADN procedente de cultivo
Antes de la amplificacin, el ADN ha de ser ais- (placas de cultivo/medio lquido; los reactivos
lado de cultivo bacteriano realizado por un m- necesarios no se suministran), una amplifica-
todo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que cin mltiplex con primers marcados con bio-
la muestra de ADN ha sido amplificada eficien- tina (la ADN polimerasa termoestable no se in-
temente durante la reaccin de amplificacin. cluye), y una hibridacin reversa.
El test slo funciona dentro de los lmites de La hibridacin incluye los siguientes pasos:
las regiones genmicas para las que los pri- desnaturalizacin qumica del producto a am-
plificar; hibridacin de amplicones de una sola
mers y sondas han sido elegidos. El anlisis de cadena, marcados con biotina, a sondas unidas
secuencias potenciales permanece reservado a membrana; lavado astringente; adicin de
para la reanudacin de investigaciones. conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina
La presencia de mltiples especies de bacte- (AP), y una reaccin de tincin mediada por AP.
rias en la muestra a analizar puede dificultar la Una plantilla asegura la interpretacin sencilla y
interpretacin de resultados. rpida del esquema de bandas obtenido.
Como cualquier sistema de deteccin basado
MATERIALES
en la hibridacin, este sistema contempla la
posibilidad de que variaciones de las secuen- Agua destilada (para uso en biologa molecu-
cias en las regiones genmicas que fueron lar)
elegidas para los primers y sondas, y la detec- Bao de agua
cin de regiones para las cuales el kit no fue Bao de agua con agitacin/TwinCubator
diseado, pueden conducir a resultados falsos. Bao de ultrasonidos
Debido a la gran variabilidad existente en los Centrfuga de mesa
genomas bacterianos es posible que ciertos Cronmetro
subtipos puedan no ser detectados. El test re- ADN polimerasa termoestable con tampn
fleja los conocimientos de Hain Life- science. (recomendacin: HotStarTaq DNA Polymerase
La utilizacin de este ensayo est limitada a de Qiagen)
personas cualificadas, bien entrenadas en el Guantes desechables
procedimiento de utilizacin del ensayo y fami- Papel absorbente
liarizadas con mtodos de biologa molecular. Pinzas
La evaluacin de este sistema de anlisis fue Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l
llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime- Plataforma de agitacin/TwinCubator
rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las Probeta graduada
caractersticas de rendimiento de este ensayo Puntas de pipeta desechables con filtro
no han sido validadas para todas las polime- Reactivos para extraccin de DNA, as como
rasas disponibles comercialmente, el usuario equipos necesarios
es el encargado de evaluar la aplicabilidad de Termociclador (rango de calentamiento 3C/
otras polimerasas distintas de las arriba men- seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin
cionadas. +/0,2C)
Termmetro calibrado
9.6. IDENTIFICACIN DEL COMPLE- Tubos para PCR, libres de DNasa y
JO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS RNasa
Pg. 104
dad y utilice directamente 5 L del sobrenadan-
te para la PCR. En caso de que la solucin de
PREPARACIN DE LA MUESTRA ADN haya de almacenarse por perodos prolon-
Las muestras para extraccin son a partir de gados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas un tubo nuevo.
en 300 l agua ultrapura libre de DNasa y RNa-
sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. AMPLIFICACIN
Las muestras tambin pueden extraerse a partir Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en
de cultivos positivos en medio lquido, se trasla- una habitacin libre de ADN. La muestra debe
da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de aadirse en un rea separada.
DNasa y RNasa.
Mezcle por tubo:
PROCEDIMIENTO 35 L de AM B suministrado
10 L de AM A- suministrado
EXTRACCIN DE ADN Aada 5 L de solucin de ADN (20-100 ng de
Puede usarse un crecimiento bacteriano en ADN) para obtener un volumen final de 50 L
placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi- (sin considerar el volumen de enzima).
ddlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC,
MB-Check). Este test no puede usarse para Determine el nmero de muestras a amplificar
detectar micobacterias directamente de mues- (nmero de muestras a analizar ms las mues-
tras de pacientes. La zona de trabajo ha de estras de control). Por ejemplo, un control de con-
tar libre de ADN amplificado. Es crucial el ca- taminacin contiene 5 L de agua en lugar de
lentamiento de las muestras a 95C durante, solucin de ADN. Prepare una mezcla que con-
al menos, 20 minutos con objeto de inactivar tenga todos los reactivos excepto la solucin de
bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la
quier procedimiento de extraccin de ADN que mezcla madre en volmenes de 45 l en tubos
produzca ADN de bacterias amplificable. El si- preparados de PCR.
guiente protocolo rpido normalmente produce
ADN adecuado para amplificacin: 2) Perfil de amplificacin *)
1a. Cuando use crecimiento bacteriano en me-

dio slido, recoja las colonias de bacterias con
Molecular).
1b. Cuando use crecimiento bacteriano proce-
dente de medio lquido, aplique directamente 1
mL. Concentre las bacterias mediante centrifu-
gacin 15 min en una centrfuga de sobremesa
en un rotor con contenedor de aerosoles y en
una cabina de seguridad de clase II a 10000 x
g aproximadamente. Deseche el sobrenadante Los productos para amplificacin pueden al-
y resuspenda las bacterias en 100-300 L de macenarse entre 20C y 8C.
agua (ver ms arriba) con un vrtex. Para comprobar la reaccin de amplificacin,
2. Incube las bacterias procedentes del aparta- aplique directamente 5 L de cada muestra
do 1a o 1b durante 20 min a 95C en un bao a un gel de agarosa al 2% sin la adicin de
de agua. tampn de carga. Los amplicones tienen una
3 Incube durante 15 min en un bao de ultra- longitud aproximada de 230 pb (Control de G-
sonidos. nero) y 200 pb (Control Universal/amplicon es-
4 Centrifugue durante 5 min a mxima veloci- pecie-especfico).
Pg. 105
para evitar contaminacin. Ello, es tambin de
aplicacin en los pasos siguientes.
HIBRIDACIN 5. Ponga la bandeja en el bao de agua con
Preparacin agitacin o en el TwinCubator durante 30 minu-
Precaliente en bao de agua con agitacin o tos a 45C.
TwinCubator a 45C; la mxima desviacin to- Ajuste la frecuencia de agitacin del bao de
lerada en la temperatura idnea es de +/1C. agua para que realice una mezcla completa
Precaliente las soluciones HYB y STR a 37- y constante de la solucin. Para obtener una
45C antes de usar. adecuada transferencia de calor, la bandeja
Los reactivos han de estar libres de precipitado debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3
(tenga en cuenta, no obstante que la solucin de su altura.
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. 6. Aspire completamente el Tampn de Hibri-
Caliente a temperatura ambiente los restan- dacin.
tes reactivos, con la excepcin del CON-C y Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada
el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el a una bomba de vaco.
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el 7. Aada 1 mL de Solucin de Lavado Astrin-
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 gente (STR, roja) a cada tira e incube durante
con sus tampones respectivos (CON-C con 15 minutos a 45C en un bao con agitacin o
CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades TwinCubator.
necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera- Desde este paso, en adelante, trabaje a tem-
tura ambiente. Para cada tira aada 10 L de peratura ambiente. Elimine completamente la
concentrado a 1 mL de los respectivos tampo- Solucin de Lavado Astringente.
nes. Diluya el CON- C antes de cada uso. El Deseche la Solucin de Lavado en un contene-
SUB-C diludo es estable durante 4 semanas dor y elimine todo el lquido restante volcando
si se almacena a temperatura ambiente y se la bandeja y golpendola suavemente sobre un
protege de la luz. papel absorbente. Ello es tambin de aplica-
cin a todos los dems pasos de lavado.
1. Dispense 20 L de la Solucin de Desnatu- 8. Lave una vez cada tira con 1 mL de Solucin
ralizacin (DEN, azul) en una esquina de cada de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agita-
uno de los pocillos usados. do del TwinCubator (elimine el RIN despus de
2. Aada a la solucin 20 L de muestra am- la incubacin).
plificada, pipetee arriba y abajo para mezclar 9. Aada 1 mL de Conjugado diludo (ver ms
bien e incube a temperatura ambiente durante arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tu- sobre la plataforma de agitado del TwinCuba-
bos usando pinzas e identifquelas marcando tor.
bajo el marcador coloreado con un lpiz. Lleve 10. Elimine la solucin y lave cada tira dos ve-
siempre guantes cuando manipule tiras. ces durante 1 minuto con 1 ml de Solucin de
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) pre- aproximada- mente con 1 ml de agua destilada
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de
que la solucin tenga un color homogneo. agitacin del TwinCubator (deseche la solucin
Tenga la precaucin de no derramar solucin cada vez).
en los pocillos cercanos. Asegrese de eliminar cualquier resto de agua
4. Ponga una tira en cada pocillo. despus del lavado anterior.
Las tiras tienen que quedar completamente cu- 11. Aada 1 mL de sustrato diludo (ver ms
biertas por la solucin y el lado con la sonda arriba) a cada tira e incube sin agitacin y pro-
hacia arriba (identificable por el marcador co- tegindolas de la luz.
loreado prximo al extremo inferior). Usando Dependiendo de las condiciones del test (por
pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha- ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in-
berse girado durante su inmersin. Limpie cui- cubacin del sustrato puede variar entre 3 y 20
dadosamente las pinzas despus de cada uso minutos.
Pg. 106
Si esta zona y el Control de Conjugado se tien
como positivas, pero el restante esquema de
Tiempos prolongados de incubacin del sustra- bandas no puede ser asignado a una micobac-
to pueden conducir a una tincin incrementada teria especfica, se deben aplicar mtodos adi-
del fondo y podra dificultar la interpretacin de cionales para identificar la especie bacteriana
los resultados. correspondiente.
12. Detenga la reaccin aclarando brevemente Solamente han de considerarse aquellas ban-
por dos veces con agua destilada. das cuyas intensidades sean tan fuertes, o ms
13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande- fuertes, que la intensidad del Control Universal.
ja y squelas entre dos capas de papel absor-
bente. MTBC
Esta zona hibrida, como es conocido, con ampli-
RESULTADOS E INTERPRETACIN cones generados de todos los miembros cono-
Pegue las tiras y almacnelas protegidas de la cidos de Mycobacterium tuberculosis complex.
luz. Con cada kit se proporciona un formulario Otras bandas
de evaluacin. Cuando se utilice este formulario Sondas Especficas; para la evaluacin ver la
de evaluacin, pegue las tiras reveladas en los tabla de interpretacin.
campos marcados, alineando las bandas CC
y UC con las respectivas lneas del formulario. No todas las bandas de una tira han de mostrar
Anote el nmero de las bandas positivas en la la misma intensidad.
penltima columna y determine la especie con Si fue usada una gran cantidad de amplicn,
la ayuda de la tabla de interpretacin y registre pueden aparecer bandas adicionales.
el nombre de las especies identificadas en la
ltima columna. La plantilla suministrada tam- TABLA DE INTERPRETACIN
bin sirve como ayuda para evaluacin y ha de
ser alineada con las bandas UC y CC de la tira.
Cada tira tiene un total de 13 zonas de reaccin
(ver esquema).
PRECAUCIONES
Almacene la Mezcla del Primer/Nucletido
Control de Conjugado (CC) (PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cual-
Debe aparecer una lnea en esta zona, docu- quier fuente potencial de ADN contaminante. Si
mentando la eficacia del conjugado unido y la se requiere almacenar durante ms de 4 sema-
reaccin del sustrato. nas, almacene a 20C. A fin de evitar conge-
laciones y descongelaciones repetidas, alicuote
Control Universal (UC) el PNM. Almacene el resto de los componentes
Esta zona detecta, como es conocido, todas las del kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus
micobacterias y miembros del grupo de bacte- de su fecha de caducidad.
Pg. 107
secuencias potenciales permanece reservado
para la reanudacin de investigaciones.
Los especmenes de los pacientes y los culti- La presencia de mltiples especies de bacte-
vos realizados a partir de especmenes de pa- rias en la muestra a analizar puede dificultar la
cientes deben ser considerados siempre como interpretacin de resultados.
potencialmente infecciosos. Las muestras de Como cualquier sistema de deteccin basado
pacientes de riesgo (infectados por microorga- en la hibridacin, este sistema contempla la
nismos patgenos incluyendo Hepatitis B y Vi- posibilidad de que variaciones de las secuen-
rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cias en las regiones genmicas que fueron
cultivos realizados a partir de esas muestras elegidas para los primers y sondas, y la detec-
deben ser etiquetados y manejados siempre cin de regiones para las cuales el kit no fue
bajo las condiciones de seguridad adecuadas, diseado, pueden conducir a resultados falsos.
de acuerdo con las guas institucionales. Ob- Debido a la gran variabilidad existente en los
serve todas las normas medioambientales y de genomas bacterianos es posible que ciertos
seguridad, tanto federales, estatales como lo- subtipos puedan no ser detectados. El test re-
cales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. fleja los conocimientos de Hain Life- science.
El tratamiento y preparacin de la muestra, in- La utilizacin de este ensayo est limitada a
cluyendo el paso de inactivacin por calor, de- personas cualificadas, bien entrenadas en el
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu- procedimiento de utilizacin del ensayo y fami-
ridad de clase II. Antes del paso de inactivacin liarizadas con mtodos de biologa molecular.
por calor las muestras deben ser centrifugadas La evaluacin de este sistema de anlisis fue
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime-
el rotor con contenedor de aerosoles solamente rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
en la cabina de seguridad. Despus de la in- caractersticas de rendimiento de este ensayo
activacin por calor se puede utilizar un rotor no han sido validadas para todas las polime-
standard para centrifugar las muestras fuera de rasas disponibles comercialmente, el usuario
la cabina de seguridad. es el encargado de evaluar la aplicabilidad de
Observe las precauciones normales para pre- otras polimerasas distintas de las arriba men-
parar la amplificacin. Es esencial que todos los cionadas.
de ADN y amplificacin estn libres de DNasas. 9.5. IDENTIFICACIN DE ESPECIES
ADICIONALES (GenoType Mycobacte-
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- rium AS)
guridad: PRINCIPIO
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) con-
tiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y El kit GenoType Mycobacterium AS (Additi-
piel. nonal Species) est basado en la tecnologa
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- DNASTRIP y permite la identificacin de las
metil Sulfxido y es irritante. siguientes especies de micobacterias:
LIMITACIONES M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M.

celatum, M. smegmatis, M. genavense, M.
Antes de la amplificacin, el ADN ha de ser ais- lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M.
lado de cultivo bacteriano realizado por un m- intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M.
todo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum,
la muestra de ADN ha sido amplificada eficien- y M. shimoidei.
temente durante la reaccin de amplificacin.
El test slo funciona dentro de los lmites de
las regiones genmicas para las que los pri-
mers y sondas han sido elegidos. El anlisis de
Pg. 108
da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
El procedimiento completo se divide en tres pa- DNasa y RNasa.
sos: aislamiento de ADN procedente de cultivo
(placas de cultivo/medio lquido; los reactivos PROCEDIMIENTO
necesarios no se suministran), una amplifica- EXTRACCIN DE ADN
cin mltiplex con primers marcados con biotina Puede usarse un crecimiento bacteriano en pla-
(la ADN polimerasa termoestable no se incluye), cas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Midd-
y una hibridacin reversa. lebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC, MB-
La hibridacin incluye los siguientes pasos: des- Check). Este test no puede usarse para detectar
naturalizacin qumica del producto a amplificar; micobacterias directamente de muestras de pa-
hibridacin de amplicones de una sola cadena, cientes. La zona de trabajo ha de estar libre de
marcados con biotina, a sondas unidas a mem- ADN amplificado. Es crucial el calentamiento
brana; lavado astringente; adicin de conjugado de las muestras a 95C durante, al menos, 20
de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una minutos con objeto de inactivar bacterias vege-
reaccin de tincin mediada por AP. Una planti- tativas. Se puede seguir cualquier procedimien-
lla asegura la interpretacin sencilla y rpida del to de extraccin de ADN que produzca ADN de
esquema de bandas obtenido. bacterias amplificable. El siguiente protocolo r-
pido normalmente produce ADN adecuado para
MATERIALES amplificacin:
Agua destilada (para uso en biologa molecu- Cuando use crecimiento bacteriano en medio
lar) slido, recoja las colonias de bacterias con un
Bao de agua asa de inoculacin y suspndalas en aproxima-
Bao de agua con agitacin/TwinCubator damente 300 l de agua (grado Biologa Mole-
Bao de ultrasonidos cular).
Centrfuga de mesa 1b. Cuando use crecimiento bacteriano proce-
Cronmetro dente de medio lquido, aplique directamente 1
ADN polimerasa termoestable con tampn ml. Concentre las bacterias mediante centrifu-
(recomendacin: HotStarTaq DNA Polymerase gacin 15 min en una centrfuga de sobremesa
de Qiagen) en un rotor con contenedor de aerosoles y en
Guantes desechables una cabina de seguridad de clase II a 10000 x
Papel absorbente g aproximadamente. Deseche el sobrenadante
Pinzas y resuspenda las bacterias en 100-300 L de
Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l agua (ver ms arriba) con un vrtex.
Plataforma de agitacin/TwinCubator 2. Incube las bacterias procedentes del aparta-
Probeta graduada do 1a o 1b durante 20 min a 95C en un bao
Puntas de pipeta desechables con filtro de agua.
Reactivos para extraccin de ADN, as como 3 Incube durante 15 min en un bao de ultraso-
equipos necesarios nidos.
Termociclador (rango de calentamiento 3C/ 4 Centrifugue durante 5 min a mxima veloci-
seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin dad y utilice directamente 5 l del sobrenadan-
+/0,2C) te para la PCR. En caso de que la solucin de
Termmetro calibrado ADN haya de almacenarse por perodos prolon-
Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa gados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
un tubo nuevo.
PREPARACIN DE LA MUESTRA
Las muestras para extraccin son a partir de AMPLIFICACIN
colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en
en 300 l agua ultrapura libre de DNasa y RNa- una habitacin libre de ADN. La muestra debe
sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. aadirse en un rea separada.
Las muestras tambin pueden extraerse a partir
Pg. 109
2) Perfil de amplificacin *)
Mezcle por tubo:

35 L de PNM suministrado
merasa no suministrado.
x L de solucin MgCl 1) no suministrado
1-2 unidades de DNA polimerasa termoesta-
ble (consulte el manual) no suministrado
y L de agua para obtener un volumen de 45
l (sin considerar el volumen de enzima) no
suministrado.
Aada 5 L de solucin de ADN (20-100 ng de
ADN) para obtener un volumen final de 50 L
(sin considerar el volumen de enzima).
1) Dependiendo del sistema enzima/tampn

usado, la concentracin ptima de MgCl puede
variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que
algunos tampones para incubacin ya contie-
nen MgCl . Los productos para amplificacin pueden alma-
cenarse entre20CY 8 C
La evaluacin del rendimiento del ensayo Ge- Para comprobar la reaccin de amplificacin,
noType Mycobacterium AS fue realizada uti- aplique directamente 5 l de cada muestra a un
lizando la Polimerasa HotStarTaq DNA de Qia- gel de agarosa al 2% sin la adicin de tampn
gen. Las cantidades necesarias por muestra de carga. Los amplicones tienen una longitud
cuando utilice esta enzima son las siguientes: aproximada de 230 pb (Control de Gnero) y
200 pb (Control Universal/amplicon espe-
35 L de PNM suministrado cie-especfico).
5 L 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (contie-
ne 15 mM de MgCl2) no suministrado HIBRIDACIN
2 L25 mM de solucin MgCl2 no suminis- Preparacin
trado Precaliente en bao de agua con agitacin o
0,2 L (1 U) de HotStarTaq no suministrado TwinCubator a 45C; la mxima desviacin to-
3 L de agua (para uso en biologa molecular) lerada en la temperatura idnea es de +/1C.
no suministrado Precaliente las soluciones HYB y STR a 37-
5 L de solucin de DNA (aada el DNA en 45C antes de usar.
una zona distinta) Los reactivos han de estar libres de precipitado
La concentracin final de MgCL2 en la mezcla (tenga en cuenta, no obstante que la solucin
de amplificacin ser de 2,5 mM. CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
Caliente a temperatura ambiente los restan-
Determine el nmero de muestras a amplificar tes reactivos, con la excepcin del CON-C y
(nmero de muestras a analizar ms las mues- el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
tras de control). Por ejemplo, un control de con- Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
taminacin contiene 5 L de agua en lugar de Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
solucin de ADN. Prepare una mezcla que con- con sus tampones respectivos (CON-C con
tenga todos los reactivos excepto la solucin de CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera-
mezcla madre en volmenes de 45 L en tubos tura ambiente. Para cada tira aada 10 L de
preparados de PCR. concentrado a 1 mlL de los respectivos tampo-
nes. Diluya el CON- C antes de cada uso.
Pg. 110
Solucin de Lavado Astringente.
Deseche la Solucin de Lavado en un contene-
El SUB-C diludo es estable durante 4 sema- dor y elimine todo el lquido restante volcando
nas si se almacena a temperatura ambiente y la bandeja y golpendola suavemente sobre un
se protege de la luz. papel absorbente. Ello es tambin de aplicacin
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
usando pinzas e identifquelas marcando bajo 10. Elimine la solucin y lave cada tira dos ve-
el marcador coloreado con un lpiz. Lleve siem- ces durante 1 minuto con 1 ml de Solucin de
pre guantes cuando manipule tiras. Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL aproximadamente con 1 ml de agua destilada
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) pre- (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta agitacin del TwinCubator (deseche la solucin
que la solucin tenga un color homogneo. cada vez).
Tenga la precaucin de no derramar solucin Asegrese de eliminar cualquier resto de agua
en los pocillos cercanos. despus del lavado anterior.
4. Ponga una tira en cada pocillo. 11. Aada 1 mL de sustrato diludo (ver ms
Las tiras tienen que quedar completamente cu- arriba) a cada tira e incube sin agitacin y pro-
biertas por la solucin y el lado con la sonda tegindolas de la luz.
hacia arriba (identificable por el marcador co- Dependiendo de las condiciones del test (por
loreado prximo al extremo inferior). Usando ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in-
pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha- cubacin del sustrato puede variar entre 3 y 20
berse girado durante su inmersin. Limpie cui- minutos. Tiempos prolongados de incubacin
dadosamente las pinzas despus de cada uso del sustrato pueden conducir a una tincin in-
para evitar contaminacin. Ello, es tambin de crementada del fondo y podra dificultar la inter-
aplicacin en los pasos siguientes. pretacin de los resultados.
5. Ponga la bandeja en el bao de agua con 12. Detenga la reaccin aclarando brevemente
agitacin o en el TwinCubator durante 30 minu- por dos veces con agua destilada.
tos a 45C. 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande-
Ajuste la frecuencia de agitacin del bao de ja y squelas entre dos capas de papel absor-
agua para que realice una mezcla completa y bente.
constante de la solucin. Para obtener una ade-
cuada transferencia de calor, la bandeja debe RESULTADOS E INTERPRETACIN
estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de Pegue las tiras y almacnelas protegidas de la
su altura. luz. Con cada kit se proporciona un formulario
6. Aspire completamente el Tampn de Hibrida- de evaluacin. Cuando se utilice este formulario
cin. de evaluacin, pegue las tiras reveladas en los
Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada campos marcados, alineando las bandas CC
a una bomba de vaco. y UC con las respectivas lneas del formulario.
7. Aada 1 mL de Solucin de Lavado Astrin- Anote el nmero de las bandas positivas en la
gente (STR, roja) a cada tira e incube durante penltima columna y determine la especie con
15 minutos a 45C en un bao con agitacin o la ayuda de la tabla de interpretacin y registre
TwinCubator. el nombre de las especies identificadas en la
Desde este paso, en adelante, trabaje a tem- ltima columna.
peratura ambiente. Elimine completamente la
Pg. 111
especie, la reaccin de amplificacin se llev
acabo correctamente y el resultado del ensayo
La plantilla suministrada tambin sirve como es vlido.
ayuda para evaluacin y ha de ser alineada Cuando no aparece patrn de bandas espec-
con las bandas UC y CC de la tira. Cada tira fico de especie, un patrn que indique la pre-
tiene un total de 17 zonas de reaccin (ver es- sencia de una bacteria gram-positiva con alto
quema). contenido en G+C puede, en casos raros, estar
originado por una Micobacteria que no puede
ser detectada por este kit. Por favor, tenga en
cuenta que puede identificar especias adicio-
nales de micobacterias con el kit GenoType
Mycobacterium AS.
Otras bandas
Sondas Especficas; para la evaluacin ver la
tabla de interpretacin.
No todas las bandas de una tira han de mostrar

la misma intensidad.
Si fue usada una gran cantidad de amplicn,
pueden aparecer bandas adicionales.
Control de Conjugado (CC) TABLA DE INTERPRETACIN

Debe aparecer una lnea en esta zona, docu-
mentando la eficacia del conjugado unido y la
reaccin del sustrato.
Control Universal (UC)

Esta zona detecta, como es conocido, todas las
micobacterias y miembros del grupo de bacte-
Si esta zona y el Control de Conjugado se tien
como positivas, pero el restante esquema de
bandas no puede ser asignado a una micobac-
teria especfica, se deben aplicar mtodos adi-
cionales para identificar la especie bacteriana
correspondiente.
Solamente han de considerarse aquellas ban-
das cuyas intensidades sean tan fuertes, o ms
fuertes, que la intensidad del Control Universal.
Control de Gnero (GC) Cuando utilice bacterias crecidas en medio l-

La coloracin en esta zona documenta, como quido, la contaminacin bacteriana puede posi-
conocida, la presencia de un miembro del g- blemente generar el mismo patrn de bandas.
nero Mycobacterium. La intensidad de esta Este resultado, por tanto, es vlido nicamente
banda vara dependiendo de la especie de Mi- cuando el DNA fue aislado del crecimiento bac-
cobacteria. teriano en medio slido (colonias individuales/
La banda del Control de Gnero puede des- idntica morfologa de colonias).
aparecer a pesar de la presencia de DNA mi-
cobacteriano; sin embargo, siempre que est
presente un patrn de bandeo especfico de
Pg. 112
de acuerdo con las guas institucionales. Ob-
serve todas las normas medioambientales y de
seguridad, tanto federales, estatales como lo-
cales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.
El tratamiento y preparacin de la muestra, in-
cluyendo el paso de inactivacin por calor, de-
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu-
ridad de clase II. Antes del paso de inactivacin
por calor las muestras deben ser centrifugadas
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir
el rotor con contenedor de aerosoles solamente
en la cabina de seguridad. Despus de la in-
activacin por calor se puede utilizar un rotor
standard para centrifugar las muestras fuera de
la cabina de seguridad.
Observe las precauciones normales para pre-
parar la amplificacin. Es esencial que todos los
2) M. nebraskense muestra el mismo patrn de de DNA y amplificacin estn libres de DNasas.
bandas que M. haemophilum.
3) Si se genera este patrn de bandas con el Cuando manipule los reactivos del kit debe to-
kit GenoType Mycobacterium AS, se puede di- mar las siguientes medidas especiales de se-
ferencia entre M. szulgai y M. intermedium utili- guridad:
zando GenoType Mycobacterium CM.. M szul- La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) contie-
gai mostrar bandeo en las bandas 1, 2, 3, 10 ne <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel.
y 11, y M. Intermedium mostrar bandeo en las El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di-
bandas 1, 2, 3 y 10. metil Sulfxido y es irritante.
4) Debido a variaciones de secuencia M. kan-
sasii puede producir 4 patrones diferentes de LIMITACIONES
bandeo. Antes de la amplificacin, el ADN ha de ser ais-
lado de cultivo bacteriano realizado por un m-
PRECAUCIONES todo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que
Almacene la Mezcla del Primer/Nucletido la muestra de ADN ha sido amplificada eficien-
(PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cual- temente durante la reaccin de amplificacin.
quier fuente potencial de DNA contaminante. Si El test slo funciona dentro de los lmites de las
se requiere almacenar durante ms de 4 sema- regiones genmicas para las que los primers
nas, almacene a 20C. A fin de evitar congela- y sondas han sido elegidos. El anlisis de se-
ciones y descongelaciones repetidas, alicuote cuencias potenciales permanece reservado
el PNM. Almacene el resto de los componentes para la reanudacin de investigaciones.
del kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus
de su fecha de caducidad. La presencia de mltiples especies de bacterias
Los especmenes de los pacientes y los culti- en la muestra a analizar puede dificultar la inter-
vos realizados a partir de especmenes de pa- pretacin de resultados.
cientes deben ser considerados siempre como
potencialmente infecciosos. Las muestras de Como cualquier sistema de deteccin basado
pacientes de riesgo (infectados por microorga- en la hibridacin, este sistema contempla la
nismos patgenos incluyendo Hepatitis B y Vi- posibilidad de que variaciones de las secuen-
rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cias en las regiones genmicas que fueron ele-
cultivos realizados a partir de esas muestras gidas para los primers y sondas, y la deteccin
deben ser etiquetados y manejados siempre de regiones para las cuales el kit no fue disea-
bajo las condiciones de seguridad adecuadas, do, pueden conducir a resultados falsos.
Pg. 113
MATERIALES
Agua destilada (para uso en biologa mole-
Debido a la gran variabilidad existente en los cular)
genomas bacterianos es posible que ciertos Bao de agua
subtipos puedan no ser detectados. El test re- Bao de agua con agitacin/TwinCubator
fleja los conocimientos de Hain Life- science. Bao de ultrasonidos
La utilizacin de este ensayo est limitada a Centrfuga de mesa
personas cualificadas, bien entrenadas en el Cronmetro
procedimiento de utilizacin del ensayo y fami- ADN polimerasa termoestable con tampn
liarizadas con mtodos de biologa molecular. (recomendacin: HotStarTaq DNA Polymerase
La evaluacin de este sistema de anlisis fue de Qiagen)
llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime- Guantes desechables
rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las Papel absorbente
caractersticas de rendimiento de este ensayo Pinzas
no han sido validadas para todas las polime- Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l
rasas disponibles comercialmente, el usuario Plataforma de agitacin/TwinCubator
es el encargado de evaluar la aplicabilidad de Probeta graduada
otras polimerasas distintas de las arriba men- Puntas de pipeta desechables con filtro
cionadas. Reactivos para extraccin de DNA, as como
equipos necesarios
9.6. IDENTIFICACIN DEL COMPLE- Termociclador (rango de calentamiento 3C/
JO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin
(GenoType MTBC) +/0,2C)
Termmetro calibrado
PRINCIPIO Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa
El kit GenoType MTBC est basado en la tec-
nologa DNASTRIP que permite en base a los PREPARACIN DE LA MUESTRA
polimorfismos genticos, por los que la ADN Las muestras para extraccin son a partir de
girasa B diferencia genticamete de especies/ colonias aisladas de cultivo slido, suspendi-
cepas pertenecientes al grupo Mycobacterium das en 300 l agua ultrapura libre de DNasa
tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y
BCG, M. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae, RNsa.
M. microti, y M. tuberculosis/M. canettii. Las muestras tambin pueden extraerse a par-
El procedimiento completo se divide en tres pa- tir de cultivos positivos en medio lquido, se
sos: extraccin de ADN procedente de cultivo traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR,
(placas de cultivo/medio lquido; los reactivos libre de DNasa y RNasa.
necesarios no se suministran), una amplifica-
cin mltiplex con primers marcados con bioti- PROCEDIMIENTO
na (la ADN polimerasa termoestable no se in-
cluye), y una hibridacin reversa. EXTRACCIN DE ADN
La hibridacin incluye los siguientes pasos: Puede usarse un crecimiento bacteriano en
desnaturalizacin qumica del producto a am- placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi-
plificar; hibridacin de amplicones de una sola ddlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC,
cadena, marcados con biotina, a sondas uni- MB-Check). Este test no puede usarse para de-
das a membrana; lavado astringente; adicin tectar micobacterias directamente de muestras
de conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidi- de pacientes. La zona de trabajo ha de estar
na (AP), y una reaccin de tincin mediada por libre de ADN amplificado. Es crucial el calen-
AP. Una plantilla asegura la interpretacin sen- tamiento de las muestras a 95C durante, al
cilla y rpida del esquema de bandas obtenido. menos, 20 minutos con objeto de inactivar bac-
terias vegetativas.
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solucin de ADN. Prepare una mezcla que con-
tenga todos los reactivos excepto la solucin de
20 minutos con objeto de inactivar bacterias ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la
vegetativas. Se puede seguir cualquier proce- mezcla madre en volmenes de 45 l en tubos
dimiento de extraccin de ADN que produzca preparados de PCR.
ADN de bacterias amplificable. El siguiente pro-
tocolo rpido normalmente produce ADN ade- 2) Perfil de amplificacin *)
cuado para amplificacin:

dio slido, recoja las colonias de bacterias con
Molecular).
mL. Concentre las bacterias mediante centrifu-
g aproximadamente. Deseche el sobrenadante
y resuspenda las bacterias en 100-300 L de Los productos para amplificacin pueden alma-
agua (ver ms arriba) con un vrtex. cenarse entre 20C y 8C.
2. Incube las bacterias procedentes del aparta- Para comprobar la reaccin de amplificacin,
do 1a o 1b durante 20 min a 95C en un bao aplique directamente 5 L de cada muestra a
de agua. un gel de agarosa al 2% sin la adicin de tam-
3 Incube durante 15 min en un bao de ultra- pn de carga. Los amplicones tienen una longi-
sonidos. tud aproximada de 230 pb (Control de Gnero)
4 Centrifugue durante 5 min a mxima veloci- y 200 pb (Control Universal/amplicon espe-
dad y utilice directamente 5 L del sobrenadan- cie-especfico).
te para la PCR. En caso de que la solucin de
ADN haya de almacenarse por perodos prolon- HIBRIDACIN
gados de tiempo, transfiera el sobrenadante a Preparacin
un tubo nuevo. Precaliente en bao de agua con agitacin o
TwinCubator a 45C; la mxima desviacin to-
AMPLIFICACIN lerada en la temperatura idnea es de +/1C.
Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en Precaliente las soluciones HYB y STR a 37-
una habitacin libre de ADN. La muestra debe 45C antes de usar.
aadirse en un rea separada.
Los reactivos han de estar libres de precipitado
Mezcle por tubo: (tenga en cuenta, no obstante que la solucin
35 L de AM B suministrado CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
10 L de AM A- suministrado Caliente a temperatura ambiente los restan-
Aada 5 L de solucin de ADN (20-100 ng de tes reactivos, con la excepcin del CON-C y
ADN) para obtener un volumen final de 50 L el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
(sin considerar el volumen de enzima). Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
Determine el nmero de muestras a amplificar con sus tampones respectivos (CON-C con
(nmero de muestras a analizar ms las mues- CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
tras de control). Por ejemplo, un control de con- necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera-
taminacin contiene 5 L de agua en lugar de tura ambiente.
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en las cantidades necesarias. Mezcle bien y Desde este paso, en adelante, trabaje a tem-
equilibre a temperatura ambiente. Para cada peratura ambiente. Elimine completamente la
tira aada 10 L de concentrado a 1 mL de los Solucin de Lavado Astringente.
respectivos tampones. Diluya el CON- C antes Deseche la Solucin de Lavado en un contene-
de cada uso. El SUB-C diludo es estable du- dor y elimine todo el lquido restante volcando
rante 4 semanas si se almacena a temperatura la bandeja y golpendola suavemente sobre un
ambiente y se protege de la luz. papel absorbente. Ello es tambin de aplicacin
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
usando pinzas e identifquelas marcando bajo 10. Elimine la solucin y lave cada tira dos ve-
el marcador coloreado con un lpiz. Lleve siem- ces durante 1 minuto con 1 ml de Solucin de
pre guantes cuando manipule tiras. Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL aproximadamente con 1 ml de agua destilada
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) pre- (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta agitacin del TwinCubator (deseche la solucin
que la solucin tenga un color homogneo. cada vez).
Tenga la precaucin de no derramar solucin Asegrese de eliminar cualquier resto de agua
en los pocillos cercanos. despus del lavado anterior.
4. Ponga una tira en cada pocillo. 11. Aada 1 mL de sustrato diludo (ver ms
Las tiras tienen que quedar completamente cu- arriba) a cada tira e incube sin agitacin y pro-
biertas por la solucin y el lado con la sonda tegindolas de la luz.
hacia arriba (identificable por el marcador co- Dependiendo de las condiciones del test (por
loreado prximo al extremo inferior). Usando ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in-
pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha- cubacin del sustrato puede variar entre 3 y 20
berse girado durante su inmersin. Limpie cui- minutos. Tiempos prolongados de incubacin
dadosamente las pinzas despus de cada uso del sustrato pueden conducir a una tincin in-
para evitar contaminacin. Ello, es tambin de crementada del fondo y podra dificultar la inter-
aplicacin en los pasos siguientes. pretacin de los resultados.
5. Ponga la bandeja en el bao de agua con 12. Detenga la reaccin aclarando brevemente
agitacin o en el TwinCubator durante 30 minu- por dos veces con agua destilada.
tos a 45C. 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande-
Ajuste la frecuencia de agitacin del bao de ja y squelas entre dos capas de papel absor-
agua para que realice una mezcla completa y bente.
constante de la solucin. Para obtener una ade-
cuada transferencia de calor, la bandeja debe RESULTADOS E INTERPRETACIN
estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de Pegue las tiras y almacnelas protegidas de la
su altura. luz. Con cada kit se proporciona un formulario
6. Aspire completamente el Tampn de Hibrida- de evaluacin. Cuando se utilice este formulario
cin. de evaluacin, pegue las tiras reveladas en los
Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada campos marcados, alineando las bandas CC y
a una bomba de vaco. UC con las respectivas lneas del formulario.
7. Aada 1 mL de Solucin de Lavado Astrin- Anote el nmero de las bandas positivas en la
gente (STR, roja) a cada tira e incube durante penltima columna y determine la especie con
15 minutos a 45C en un bao con agitacin o la ayuda de la tabla de interpretacin y registre
TwinCubator. el nombre de las especies identificadas en la
Pg. 116
No todas las bandas de una tira han de mostrar
la misma intensidad.
ltima columna. La plantilla suministrada tam- Si fue usada una gran cantidad de amplicn,
bin sirve como ayuda para evaluacin y ha de pueden aparecer bandas adicionales.
ser alineada con las bandas UC y CC de la tira.
Cada tira tiene un total de 13 zonas de reaccin TABLA DE INTERPRETACIN
(ver esquema).
Control de Conjugado (CC)

Debe aparecer una lnea en esta zona, docu-
mentando la eficacia del conjugado unido y la PRECAUCIONES
reaccin del sustrato.
Control Universal (UC) (PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cual-
Esta zona detecta, como es conocido, todas las quier fuente potencial de ADN contaminante. Si
micobacterias y miembros del grupo de bacte- se requiere almacenar durante ms de 4 sema-
rias gram-positivas con alto contenido de G+C. nas, almacene a 20C. A fin de evitar congela-
Si esta zona y el Control de Conjugado se tien ciones y descongelaciones repetidas, alicuote
como positivas, pero el restante esquema de el PNM. Almacene el resto de los componentes
bandas no puede ser asignado a una micobac- del kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus
teria especfica, se deben aplicar mtodos adi- de su fecha de caducidad.
cionales para identificar la especie bacteriana Los especmenes de los pacientes y los culti-
correspondiente. vos realizados a partir de especmenes de pa-
Solamente han de considerarse aquellas ban- cientes deben ser considerados siempre como
das cuyas intensidades sean tan fuertes, o ms potencialmente infecciosos. Las muestras de
fuertes, que la intensidad del Control Universal. pacientes de riesgo (infectados por microorga-
nismos patgenos incluyendo Hepatitis B y Vi-
MTBC rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los
Esta zona hibrida, como es conocido, con am- cultivos realizados a partir de esas muestras
plicones generados de todos los miembros co- deben ser etiquetados y manejados siempre
nocidos de Mycobacterium tuberculosis com- bajo las condiciones de seguridad adecuadas,
plex. de acuerdo con las guas institucionales.
Otras bandas Observe todas las normas medioambientales y
Sondas Especficas; para la evaluacin ver la de seguridad, tanto federales, estatales como
tabla de interpretacin. locales. Lleve siempre guantes y ropa adecua-
da.
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fleja los conocimientos de Hain Life- science.
El tratamiento y preparacin de la muestra, in- La utilizacin de este ensayo est limitada a
cluyendo el paso de inactivacin por calor, de- personas cualificadas, bien entrenadas en el
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu- procedimiento de utilizacin del ensayo y fami-
ridad de clase II. Antes del paso de inactivacin liarizadas con mtodos de biologa molecular.
por calor las muestras deben ser centrifugadas La evaluacin de este sistema de anlisis fue
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime-
el rotor con contenedor de aerosoles solamente rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
en la cabina de seguridad. Despus de la in- caractersticas de rendimiento de este ensayo
activacin por calor se puede utilizar un rotor no han sido validadas para todas las polime-
standard para centrifugar las muestras fuera de rasas disponibles comercialmente, el usuario
la cabina de seguridad. es el encargado de evaluar la aplicabilidad de
Observe las precauciones normales para pre- otras polimerasas distintas de las arriba men-
parar la amplificacin. Es esencial que todos los cionadas.
de ADN y amplificacin estn libres de DNasas.
10. SENSIBILIDAD ANTIBITICA
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- 10.1. INTRODUCCIN
guridad: La tuberculosis (Tb) es una enfermedad ree-
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) contie- mergente causada principalmente por Myco-
ne <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel. bacterium tuberculosis y que infecta a un tercio
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- de la poblacin mundial. Dentro de los princi-
metil Sulfxido y es irritante. pales objetivos en el desarrollo de procedimien-
tos para realizar susceptibilidad antibitica es
LIMITACIONES poder identificar la presencia de cepas resisten-
tes y multiresistentes.
Antes de la amplificacin, el ADN ha de ser ais- Para el tratamiento se utilizan varios medica-
lado de cultivo bacteriano realizado por un m- mentos para evitar la aparicin de resistencias
todo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que por mutaciones naturales en las micobacterias.
la muestra de ADN ha sido amplificada eficien- Las drogas de primera lnea son rifampicina
temente durante la reaccin de amplificacin. (RIF), isoniacida (INH), estreptomicina (SM) y
El test slo funciona dentro de los lmites de las etambutol (EMB); todas tienen cierto grado de
regiones genmicas para las que los primers toxicidad pero son relativamente seguras y cau-
y sondas han sido elegidos. El anlisis de se- san pocos efectos secundarios.
cuencias potenciales permanece reservado Los test de susceptibilidad desempean un pa-
para la reanudacin de investigaciones. pel muy importante en epidemiologa, debido a
La presencia de mltiples especies de bacte- que detectan la aparicin de resistencia provo-
rias en la muestra a analizar puede dificultar la cada por fallas en la administracin o en la su-
interpretacin de resultados. pervisin de un tratamiento adecuado. Tambin
Como cualquier sistema de deteccin basado es importante porque los resultados pueden ser
en la hibridacin, este sistema contempla la utilizados como una gua para iniciar la terapia,
posibilidad de que variaciones de las secuen- para confirmar la resistencia antibitica en un
cias en las regiones genmicas que fueron paciente que demuestra respuesta insatisfacto-
elegidas para los primers y sondas, y la detec- ria al tratamiento y para la evaluar la tendencia
cin de regiones para las cuales el kit no fue de resistencia primaria y adquirida dentro de
diseado, pueden conducir a resultados falsos. una comunidad.
Debido a la gran variabilidad existente en los En Guatemala las pruebas de susceptibilidad a
genomas bacterianos es posible que ciertos frmacos no se llevan a cabo rutinariamente,
subtipos puedan no ser detectados. El test re- lo cual hace surgir la posibilidad de esquemas
inadecuados de tratamiento para pacientes
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miten que las fuentes de infeccin se detengan.
El esquema se divide en dos fases:
con cepas multiresistentes. Fase intensiva: durante la cual se toma el trata-
miento todos los das.
a. Tratamiento. Fase de continuacin: durante la cual los me-
El tratamiento est condicionado al compor- dicamentos se toman dos tres veces por se-
tamiento en el crecimiento del bacilo, a partir mana.
de un bacilo se origina una colonia, luego se
multiplica dependiendo de las caractersticas 10.2. MTODOS DE DETERMINACIN
de cada bacilo el crecimiento puede ser inerte DE SENSIBILIDAD ANTIFMICA
con metabolismo inactivo, lento intermedio;
cuando se alcanza cierto nmero de bacilos se 10.2.1. MTODO DE LAS PROPORCIO-
empiezan a producir mutaciones naturales y NES DE CANETII
espontneas, sta mutacin da lugar a la apa-
ricin de resistencias de tipo cromosmicas y Un mtodo utilizado para la determinacin de la
por ello irreversibles las cules se encuentran susceptibilidad de micobacterias es el mtodo
en relacin con el nmero de bacilos presentes modificado de las proporciones. Los resultados
y el frmaco utilizado, es por ello que el trata- de ste mtodo son reportados como un porcen-
miento debe ser combinado ya que no todos taje del total de la poblacin bacteriana, el cul
los elementos de las colonias poseen el mismo es definido por la cantidad de crecimiento en
comportamiento frente a las drogas. un medio que contiene el medicamento, com-
parada con el crecimiento en un medio control
b. Drogas de primera lnea. libre de medicamento. Cuando ms del 1% de
INH, RIF, SM, EMB y Pirazinamida (PZA) son la poblacin bacilar es resistente a la concen-
los cinco medicamentos clasificados como dro- tracin crtica de la droga, la micobacteria se
gas de primera lnea debido a que poseen baja considera resistente. La concentracin crtica
toxicidad y por la actividad que poseen, la INH del medicamento es aquella a la cual se inhibe
es la droga de mayor utilidad y de mayor uso. el crecimiento de la mayora de bacterias.
Entre las dosis utilizadas de las drogas para el El principio del mtodo se basa en que una sus-
tratamiento del Tb se pueden mencionar: pensin estandarizada del organismo a evaluar
INH 300mg diarios Posee baja toxicidad para se inocula en cajas de agar 7H10 que contiene
el hgado. un agente antimicrobiano, generalmente dro-
RIF 600mg diarios Posee baja toxicidad. gas de primera lnea INH, RIF, SM, EMB com-
SM De uso limitado debido a su forma de admi- parado con un control que no contiene droga.
nistracin (va intramuscular), causa citotoxici- Entre las ventajas de este mtodo se pueden
dad y disfuncin renal. citar que de los mtodos que existen en la ac-
EMB 15mg/kg/da Posee baja toxicidad. tualidad, ste es el ms accesible y aplicable
PZA 25mg/kg/da Es hepatotxica y produ- para la mayora de los laboratorios de salud
ce hiperuricemia. del pas. Entre las desventajas estn, que las
micobacterias algunas veces se agrupan en
c. Drogas de segunda lnea. grumos, o no crecen satisfactoriamente por lo
Este grupo de drogas es poco utilizado, excep- tanto es difcil obtener suspensiones homog-
to en reas en las que existen rangos grandes neas del inculo. Es un mtodo que requiere
de resistencia a las drogas de primera lnea, personal capacitado por ser un mtodo muy la-
ste grupo incluye ofloxacina, cicloserina, ca- borioso en cuanto a tiempo para preparacin de
preomicina, etionamida, tiacetazona, kanamici- medios, adems el procedimiento es minucio-
na/amikacina. so. Utiliza un medio de cultivo muy enriquecido
y si no se tiene el equipo y las condiciones de
d. Esquemas de tratamiento. esterilidad que exige el mtodo, puede conta-
Si los esquemas de tratamiento se siguen de minarse fcilmente.
forma adecuada y con supervisin estricta per-
Pg. 119
- Disolver 106 mg (100,000g) de INH en 10
ml de agua destilada. Esta es una solucin de
PROCEDIMIENTO 10,000g/ml.
- Esterilizar con filtro millipore.
El mtodo modificado de las proporciones fue - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril.
seleccionado por las condiciones de laboratorio Esta es una solucin 1,000g/ml.
con las que se cuenta actualmente, se conside- - Agregar 1ml de 1,000g/ml a 9ml de agua des-
ra reproducible y exacto. El mismo consiste en tilada estril. Esta es una solucin de 100g/ml.
utilizar los antibiticos de primera lnea selec- -Agregar 0.5 ml de 100g/ml a 250ml de medio
cionados a diferentes valores de concentracin. para obtener una concentracin final de 0.2g
Cada antibitico reconstituido se incorpora al INH/ml de medio.
agar Middlebrook 7H10 previamente enriqueci- - Agregar 0.25 mL de 1,000g/ml a 250ml de
do con cido oleico-albmina-dextrosa-catala- medio para obtener una concentracin final de
sa (OADC) y luego se prepara en cajas de Petri 1g INH/ml de medio.
de cuatro cuadrantes, o 15x125 mm. (10 ml.
aprox.) o con 13x100 mm (6 ml aprox). Dilucio- Estreptomicina (SM) en caja
nes estandarizadas de las micobacterias son - 131.4 mg dihidrosulfato de SM = 100mg de
inoculadas en el agar con antibitico. Las cajas SM
de Petri se colocan en una incubadora a 37C - Disolver 131.4 mg de dihidrosulfato de estrep-
y se observan durante 2 a 3 semanas para de- tomicina en 10 ml de agua destilada. Esta es
tectar crecimiento. una solucin de 10,000g/ml.
- Esterilizar con filtro millipore.
Cada erlenmeyer con 225 middlebrook agar a - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril.
esto se le agrega 25 mL de OADC TOTAL: 250 Esta es una solucin 1,000g/ml.
mL - Agregar 0.4ml de solucin 1,000g/ml a 200ml
A. Preparacin de soluciones antimicrobianas de medio para obtener una concentracin final
Preparar 1,000g/ml de soluciones stock de de 2.0g SM/ml de medio.
isoniacida, estreptomicina, rifampicina y etam-
butol de la casa sigma. Estreptomicina (SM) en tubo
Alicuotar la solucin stock en tubos de poli- - 131.4 mg dihidrosulfato de SM = 100mg de
propileno estriles y congelar por no ms de 12 SM
meses a -20C (preferiblemente a -70C). - Disolver 131.4 mg de dihidrosulfato de estrep-
Isoniacida (INH) en caja tomicina en 10 ml de agua destilada. Esta es
- 106mg INH = 100 mg INH una solucin de 10,000g/ml.
- Disolver 106 mg (100,000g) de INH en 10 - Esterilizar con filtro millipore.
ml de agua destilada. Esta es una solucin de - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril.
10,000g/ml. Esta es una solucin 1,000g/ml.
- Esterilizar con filtro millipore. - Agregar 0.5ml de solucin 1,000g/ml a 250ml
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril. de medio para obtener una concentracin final
Esta es una solucin 1,000g/ml. de 2.0 g SM/ml de medio.
- Agregar 1ml de 1,000g/ml a 9ml de agua des-
tilada estril. Esta es una solucin de 100g/ml. Rifampicina (RIF) (Rifampin) en caja
- Agregar 0.4ml de 100g/ml a 200ml de medio - 105 mg rifampicina = 100mg de rifampina.
para obtener una concentracin final de 0.2g - Disolver 105 mg. de rifampicina en 2 ml. de
INH/ml de medio. dimetil sulfxido (DMSO) dimetilformami-
- Agregar 0.2 mL de 1,000g/ml a 200ml de me- da y completar hasta 10 mL con agua destila-
dio para obtener una concentracin final de 1g da (8 mL agua). para hacer una solucin de
INH/ml de medio. 10,000g/ml.
-Esterilizar con filtro millipore
Isoniacida (INH) en tubo - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril.
- 106mg INH = 100 mg INH Esta es una solucin 1,000g/ml.
Pg. 120
- especificada por el fabricante, y lentamente
Agregar 0.2 ml de solucin 1,000g/ml a 200ml agregar al agua. Permitir que el medio se disuel-
de medio para obtener una concentracin final va ligeramente antes de agregar ms. Agregar
de 1.0 g rifampicina/ml de medio. el medio al agua de una sola vez puede causar
grumos que no se disolvern.
Rifampicina (RIF) (Rifampin) en tubo 6. Agregar 10ml de glicerol al baln y continuar
- 105 mg rifampicina = 100mg de rifampina. mezclando por otros 3 a 5 minutos. Continuar
- Disolver 105 mg. de rifampicina en 2 ml. de calentando (con agitacin constante) hasta que
dimetil sulfxido (DMSO) dimetilformamida y el medio se aclare (aproximadamente son 20
completar hasta 10 mL con agua destilada (8 mL minutos)
agua). para hacer una solucin de 10,000g/ml. 7. Remover el baln del calor.
- Esterilizar con filtro millipore. 8. Usar la probeta de 500ml, y alicuotar el agar
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril. derretido dentro de los balones como sigue:
Esta es una solucin 1,000g/ml. - Agregar 180ml de agar a 6 balones de 500ml
- Agregar 0.25ml de solucin 1,000g/ml a - Agregar 540ml de agar a 1 baln de 1 litro
250ml de medio para obtener una concentracin - Agregar un magneto a cada baln
final de 1.0g rifampicina/ml de medio. - Cubrir los balones con tapaderas plsticas de
tapn de rosca, tapones de esponja, o papel
Etambutol (EMB) en caja aluminio, y autoclavear por 15 minutos a 121C.
- 136 mg d-etambutol = 100mg de EMB 9. Despus de autoclavear, colocar los balones
- Disolver 100mg de d-etambutol en 10 ml de en un bao de agua en horno programado a
agua destilada. 50 a 56C para enfriar.
- Esterilizar con filtro millipore. 10. Si se desea, el agar puede dejarse solidificar
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril. a temperatura ambiente y guardado en envases
Esta es una solucin 1,000g/ml. bien tapados protegidos de la luz a 2-8C hasta
- Agregar 1.0 ml de solucin 1,000g/ml a 200ml por 2 semanas. Previo a la preparacin de ca-
de medio para obtener una concentracin final jas, derretir el agar colocando el envase en un
de 5 g etambutol/ml de medio. bao de agua hirviendo.
Etambutol (EMB) en tubo EN TUBO

- 136mg d-etambutol = 100mg de EMB 11. Usar la probeta de 500ml, y alicuotar el agar
- Disolver 100mg de d-etambutol en 10 ml de derretido dentro de los balones como sigue:
agua destilada. - Agregar 225ml de agar a 6 balones de 500ml
- Esterilizar con filtro millipore. (PARA ANTIBIOTICOS)
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril. - Agregar 250ml de agar a 1 baln de 1 litro
Esta es una solucin 1,000g/ml. (PARA CONTROL DE CRECIMIENTO)
- Agregar 1.25ml de solucin 1,000g/ml a - Agregar un magneto a cada baln
250ml de medio para obtener una concentracin Cubrir los balones con tapaderas plsticas de
final de 5 g etambutol/ml de medio. tapn de rosca, tapones de esponja, o papel
aluminio, y autoclavear por 15 minutos a 121C
B. Preparacin de medios. AGREGAR 25 mL de OADC (ESTO ES PARA
1. Calentar el bao de agua a 50-56C. 20 TUBOS MXIMO 25 TUBOS EXACTOS)
2. Preparar el agar base 7H10
3. Agregar 1,800ml de agua destilada a un baln C. Etiquetado de las cajas.
de 2 litros. 1. Preparar 70 cajas cuadriplate en dos colum-
4. Agregar un magneto para agitacin, y agitar nas de 35 cajas cada una.
el agar en una estufa con agitacin magntica 2. Etiquetar todas las cajas de una columna con
a velocidad media y a temperatura media a ele- el nmero 1.
vada. 3. Etiquetar todas las cajas de la segunda co-
5. Pesar la cantidad de agar Middlebrook 7H10 lumna con el nmero 2.
Pg. 121
antimicrobianos.
4. El nmero en la caja es un cdigo para los
antimicrobianos dispensados en esa caja.
Tabla No. 8 Nmero de organismos por cam-

po
NOTA:
- Contar un acumulo como un solo organismo. (g/ml)= microgramos por mililitro
- Utilizar objetivo de aceite de inmersin (para a = la solucin stock de antimicrobianos
conteo de organismos teidos con carbolfucs- (1,000g/ml excepto que se especifique otro)
hina) se agrega a 180ml de agar con 20mL OADC.
- Utilizar objetivo seco fuerte (para conteo de *1=100 ug/ml
organismos teidos con fluorocromo)
8. Retirar un frasco de tapn de rosca conte-
D. Preparacin de cajas. niendo 360ml de agar a 56C.
9. Agregar 40ml de OADC al frasco y agitar len-
1. Permitir que los antimicrobianos se descon- tamente (no aplicar calor)
gelen a temperatura ambiente, y usarlos lo ms 10. Continuar la agitacin por 1 a 2min.
rpido posible. Nunca permitir que se reconge- 11. Utilizando una pipeta estril o un dispensa-
len. dor, dispensar 5ml del agar libre de droga den-
2. Retirar un frasco de 200ml de enriquecedor tro del cuadrante I de las 70 cajas.
OADC del refrigerador, y atemperar. 12. Permitir que el agar se solidifique a tempe-
3. Retirar un frasco de tapn de rosca de 500ml ratura ambiente dentro de una campana de flu-
conteniendo 180ml de agar Middlebrook 7H10 jo laminar.
y agitar en un plato de agitacin para homoge- 13. Cuando el agar est solidificado colocarlo
nizar el medio (sin calor) en bolsas plsticas y guardar a 2-8C en la os-
4. Agregarle 20ml de enriquecedor OADC cuan- curidad.
do el agar tenga una temperatura de 56C y ho- 14. Etiquetar con una fecha de expiracin de 1
mogenizar (no aplicar calor) mes.
5. Agregar la cantidad apropiada de antimicro- . Preparacin del inculo.
biano para obtener una concentracin final de
0.2m de INH y continuar la agitacin por 1 a 2 1.Escoger de 3-5 colonias (representando to-
min (ver tabla No. 9) dos los tipos de colonias si se encuentran mlti-
6. Utilizando una pipeta estril o un dispensa- ples tipos) y emulsificarlas en 4ml de caldo Du-
dor, dispensar 5ml de agar con INH en el cua- bos-Tween-albmina contenido en un tubo de
drante II de las 35 cajas etiquetadas con 1 (ver vidrio (13x100mm) al cual se le han agregado
tabla No. 9) de seis a ocho perlas de vidrio.
7. Repetir los pasos del 1 al 6 para los otros 2. Agitar en vrtex por 1 a 2 min.
antimicrobianos y dispensarlos dentro de los 3. Dejar reposar el tubo por 30 minutos, de
cuadrantes de las cajas 1 y 2 (ver tabla No. 9) modo que las partculas grandes sedimenten.
4. Decantar el sobrenadante y transferirlo a otro
Tabla No 9. Preparacin de cajas con tubo de vidrio estril (13x100).
Pg. 122
absorbido dentro del medio (aproximadamente
por una hora).
5. Ajustar la turbidez de la suspensin del so- 12. Envolver cada caja en una bolsa de polipro-
brenadante con caldo Dubos-Tween-albmina pileno permeable a CO2 y colocar las cajas con
hasta alcanzar el estndar 1.0 de McFarland el agar hacia abajo.
(Conteniendo aproximadamente 107 UFC/ml). 13. Incubar las cajas a 36C en una atmsfera
6. Diluir la suspensin a 10-2 y 10-4 con agua de 5 al 10% de CO2.
destilada estril.
G. Lectura de cajas.
F. Inoculacin e incubacin.
1. Despus de 1 a 2 das de incubacin, exami-
1. Para cada organismo a ser evaluado, llevar a nar el agar sangre y el agar Middlebrook 7H10
temperatura ambiente 2 grupos de cajas cuadri- para evidenciar bacterias contaminantes. Si se
plate con el medio para susceptibilidad (un gru- detecta contaminacin, descartar todas las ca-
po de cajas incluye: una caja etiquetada como jas y repetir la evaluacin con un nuevo inculo.
1 y otra como 2). Asegurar que la superficie (Algunas veces es necesario preparar varios
del agar este seca (secar cualquier gota con un subcultivos para obtener un inculo puro).
hisopo de algodn estril). Incubar y continuar examinando la pureza del
2. Etiquetar estas dos cajas para la evaluacin agar sangre diariamente por 7 das y la pureza
de susceptibilidad con el nmero de cultivo del del agar 7H10 semanalmente mientras dure la
paciente y la dilucin, por ejemplo 10-2. evaluacin.
3. Inocular este primer grupo de cajas para 2. Examinar el cuadrante control (sin antimicro-
evaluar susceptibilidad de dilucin 10-2 con la biano) semanalmente. Cuando se observe cre-
suspensin de la dilucin 10-2 de la siguiente cimiento de 1+ o ms (ver tabla 2), leer todas
manera. las cajas. Si el crecimiento no es suficiente
4. Usando una pipeta estril con algodn en el entre 2 y 3 semanas de incubacin, se repite el
extremo posterior, inocular una gota de la sus- test. Es importante tener en cuenta que:
pensin a evaluar, sin que la pipeta toque la No hay que dar un reporte final de resultados
superficie del medio, en cada esquina de cada de resistencia o susceptibilidad hasta que las
cuadrante (3 gotas por cuadrante). cajas hayan sido incubadas por 3 semanas.
5. Mantener la pipeta perpendicular al agar para 3. Examinar todos los cuadrantes, y estimar
asegurar la uniformidad de las gotas, tener cui- el nmero de colonias creciendo en cada cua-
dado de no tocar la superficie del agar con la drante (contando el nmero total de colonias
punta de la pipeta. creciendo en los tres crculos de crecimiento).
6. Tener cuidado de colocar las gotas de modo 4. Cuantificar el crecimiento como se especifica
que no se corran al borde de la caja de petri (es a continuacin.
difcil contar colonias en el borde de la caja). 5. Se debe notar la presencia de cualquier mi-
7. Repetir el procedimiento anterior para cada crocolonia como las colonias en el medio con-
cuadrante de la caja. teniendo antibitico que son ms pequeas que
8. Etiquetar e inocular el segundo grupo de aquellas en el medio control.
cajas para evaluacin de susceptibilidad con la 6. Cuantificar el crecimiento y registrar el nme-
dilucin 10-4 de la misma manera. ro de colonias.
9. Evaluar una cepa de control de calidad a di- 7. Calcular el porcentaje de resistencia dividien-
luciones 10-2 y 10-4. do el nmero de colonias creciendo en el medio
10. Inocular una caja de agar sangre y una caja con antibitico dentro del nmero de colonias
de agar Middlebrook 7H10 con 1 2 gotas de creciendo en el medio control y multiplicando
la suspensin anterior y estriarlas con asa en por 100.
argolla a manera de aislar colonias.
11. Permitir que las cajas inoculadas permanez- Tabla No.10 Cuantificacin del creci-
can con el agar hacia arriba a temperatura am- miento de colonias de micobacterias
biente (en la campana) hasta que el inculo sea en cajas de agar.
Pg. 123
1 Cantidad exacta de colonias contadas.
H. Resultados.
1. Interpretacin.
Si el control de calidad es aceptable, interpretar como se especifica a continuacin:

1.1. Interpretar los resultados de la dilucin de organismos que presente un nmero contable de
colonias (idealmente de 50 a 100) en el crecimiento del cuadrante control.
1.2. Nunca utilizar la dilucin con recuento de colonias 50.
1.3. Utilizar la dilucin con recuento de colonias de 4+ con precaucin.
1.4. Si ambas diluciones muestran crecimiento 4+ y el organismo es susceptible a todos los anti-
biticos, interpretar los resultados. Si el organismo muestra resistencia a cualquier antibitico, la
resistencia puede deberse a un inculo muy cargado. Repetir completamente la prueba.
Tabla No. 11 Ejemplos de reportes.
1.5. La presencia de microcolonias sugiere que el aislamiento puede ser resistente al antibitico
pero que tiene algn efecto en el organismo y puede ser efectivo en combinacin con otras dro-
gas.
1.6. Interpretar un resultado como resistente cuando la proporcin del crecimiento en el medio
conteniendo antibitico es 1% del crecimiento en el medio libre de antibitico.
1.7. Ejemplos:
Pg. 124
El kit GenoType MTBDRplus est basado en
a. nterpretacin de resistencia. la tecnologa DNASTRIP y permite la identi-
ficacin mediante gentica molecular del com-
Crecimiento control (cuadrante I) 200 colonias plejo Mycobacterium tuberculosis y su resis-
(3+) tencia a rifampicina y/o isonizida, desde cultivo
INH, 0.2 g/ml (cuadrante II) 7 colonias o muestras clnicas pulmonares baciloscopia
7 colonias x 100% = 3.5%, i.e., Resistente. positivas. La identificacin de la resistencia a
200 colonias rifampicina es posible gracias a la deteccin de
las mutaciones ms significativas del gen rpoB
No es necesario realizar un recuento real de las (que codifica por la subunidad de la ARN po-
colonias para aquellas concentraciones cuan- limerasa). Para testar la resistencia de isoniazi-
do el crecimiento es obviamente <1% 1%. da de alto nivel es examinado el gen katG (que
codifica por la catalasa perioxidasa), y para tes-
b. Con un control de calidad aceptable, reportar tar la resistencia a isoniazida de bajo nivel, es
como sigue el siguiente ejemplo. examinada la regin del promotor del gen inhA
(que codifica por la NADH enoil ACP reducta-
Tabla No. 12 Control de calidad sa). El procedimiento completo se divide en
tres pasos: aislamiento de DNA procedente de
cultivo (medio slido/medio lquido) o de mues-
tra clnica (muestras pulmonares baciloscopia
positivas decontaminadas) los reactivos ne-
cesarios no se suministran una amplificacin
mltiplex con primers marcados con biotina (la
DNA polimerasa termoestable no se incluye), y
una hibridacin reversa.
La hibridacin incluye los siguientes pasos:
desnaturalizacin qumica del producto a am-
plificar, hibridacin de amplicones en una sola
cadena, marcados con biotina, a sondas unidas
INH= isoniacida, SM= estreptomicina, RIF= ri- a membrana, lavado astringente, adicin de
fampicina, EMB= etambutol conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina
R= resistente, S= susceptible (AP), y una reaccin de tincin mediada por AP.
(g/ml)= microgramos por mililitro. Una plantilla asegura la interpretacin sencilla y
rpida del esquema de bandas obtenido.
Mdicos experimentados algunas veces utili-
MATERIALES
zan el porcentaje de organismos resistentes al
Agua destilada (para uso en biologa molecu-
agente antimicrobiano como una gua para la
lar)
eficacia de la terapia. Por ello es importante
Bao de agua
calcular y registrar el porcentaje de resistencia
Bao de agua con agitacin/TwinCubator
en una hoja de trabajo, y mantener esta infor-
Bao de ultrasonidos
macin disponible para los mdicos que la re-
quieran. Centrfuga de mesa
Cronmetro
10.2.2. MTODO DE PCR: IDENTIFI- DNA polimerasa termoestable con tampn (re-
CACIN DEL COMPLEJO MYCOBAC- comendacin: HotStarTaq DNA Polymerase de
TERIUM TUBERCULOSIS (GenoType Qiagen)
MTBDRplus) Guantes desechables
Papel absorbente
PRINCIPIO
Pg. 125
Pinzas g aproximadamente. Deseche el sobrenadan-
Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l te y resuspenda las bacterias en 100-300 l de
Plataforma de agitacin/TwinCubator agua (ver ms arriba) con un vortex.
Probeta graduada 2. Incube las bacterias procedentes del aparta-
Puntas de pipeta desechables con filtro do 1a o 1b durante 20 min a 95C en un bao
Reactivos para extraccin de DNA, as como de agua.
equipos necesarios 3 Incube durante 15 min en un bao de ultraso-
Termociclador (rango de calentamiento 3C/ nidos.
seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin 4 Centrifugue durante 5 min a mxima veloci-
+/0,2C) dad y utilice directamente 5 l del sobrenadan-
Termmetro calibrado te para la PCR. En caso de que la solucin de
Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa DNA haya de almacenarse por perodos prolon-
gados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
PREPARACIN DE LA MUESTRA un tubo nuevo.
Las muestras para extraccin son a partir de
colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas AMPLIFICACIN
en 300 l agua ultrapura libre de DNasa y RNa- Prepare la mezcla de amplificacin (45 l) en
sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. una habitacin libre de DNA. La muestra debe
Las muestras tambin pueden extraerse a partir aadirse en un rea separada.
da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de Mezcle por tubo:
DNasa y RNasa. 35 l de AM B suministrado
10 l de AM A- suministrado
PROCEDIMIENTO Aada 10 l de solucin de DNA (20-100 ng
EXTRACCIN DE ADN de DNA) para obtener un volumen final de 55 l
Puede usarse un crecimiento bacteriano en (sin considerar el volumen de enzima).
placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi-
ddlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC, Determine el nmero de muestras a amplificar
MB-Check). Este test no puede usarse para (nmero de muestras a analizar ms las mues-
detectar micobacterias directamente de muestras de control). Por ejemplo, un control de con-
tras de pacientes. La zona de trabajo ha de es- taminacin contiene 5 l de agua en lugar de
tar libre de DNA amplificado. Es crucial el ca- solucin de DNA. Prepare una mezcla que con-
lentamiento de las muestras a 95C durante, tenga todos los reactivos excepto la solucin de
al menos, 20 minutos con objeto de inactivar DNA y mezcle bin. No utilice vortex. Alicuote la
bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- mezcla madre en volmenes de 45 l en tubos
quier procedimiento de extraccin de DNA que preparados de PCR.
produzca DNA de bacterias amplificable. El si-
guiente protocolo rpido normalmente produce 2) Perfil de amplificacin *)
DNA adecuado para amplificacin:

dio slido, recoja bacterias con un asa de ino-
culacin y suspndalas en aproximadamente
300 l de agua (grado Biologa Molecular).
ml. Concentre las bacterias mediante centrifu-
Pg. 126
Los productos para amplificacin pueden alma- en los pocillos cercanos.
cenarse entre +8 y 20C. 4. Ponga una tira en cada pocillo.
Para comprobar la reaccin de amplificacin, Las tiras tienen que quedar completamente cu-
aplique directamente 5 l de cada muestra a un biertas por la solucin y el lado con la sonda
gel de agarosa al 2% sin la adicin de tampn hacia arriba (identificable por el marcador co-
de carga. Los amplicones tienen una longitud loreado prximo al extremo inferior). Usando
aproximada de 230 pb (Control de Gnero) pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha-
y 200 pb (Control Universal/amplicon espe- berse girado durante su inmersin. Limpie cui-
cie-especfico). dadosamente las pinzas despus de cada uso
para evitar contaminacin. Ello, es tambin de
HIBRIDACIN aplicacin en los pasos siguientes.
Preparacin 5. Ponga la bandeja en el bao de agua con
Precaliente en bao de agua con agitacin o agitacin o en el TwinCubator durante 30 minu-
TwinCubator a 45C; la mxima desviacin to- tos a 45C.
lerada en la temperatura idnea es de +/1C. Ajuste la frecuencia de agitacin del bao de
Precaliente las soluciones HYB y STR a 37- agua para que realice una mezcla completa y
45C antes de usar. constante de la solucin. Para obtener una ade-
Los reactivos han de estar libres de precipitado cuada transferencia de calor, la bandeja debe
(tenga en cuenta, no obstante que la solucin estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. su altura.
Caliente a temperatura ambiente los restan- 6. Aspire completamente el Tampn de Hibrida-
tes reactivos, con la excepcin del CON-C y cin.
el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el a una bomba de vaco.
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 7. Aada 1 ml de Solucin de Lavado Astrin-
con sus tampones respectivos (CON-C con gente (STR, roja) a cada tira e incube durante
CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades 15 minutos a 45C en un bao con agitacin o
necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera- TwinCubator.
tura ambiente. Para cada tira aada 10 l de Desde este paso, en adelante, trabaje a tem-
concentrado a 1 ml de los respectivos tampo- peratura ambiente. Elimine completamente la
nes. Diluya el CON- C antes de cada uso. El Solucin de Lavado Astringente.
SUB-C diludo es estable durante 4 semanas si Deseche la Solucin de Lavado en un contene-
se almacena a temperatura ambiente y se pro- dor y elimine todo el lquido restante volcando
tege de la luz. la bandeja y golpendola suavemente sobre un
papel absorbente. Ello es tambin de aplicacin
1. Dispense 20 l de la Solucin de Desnaturali- a todos los dems pasos de lavado.
zacin (DEN, azul) en una esquina de cada uno 8. Lave una vez cada tira con 1 ml de Solucin
de los pocillos usados. de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agita-
2. Aada a la solucin 20 l de muestra am- do del TwinCubator (elimine el RIN despus de
plificada, pipetee arriba y abajo para mezclar la incubacin).
bien e incube a temperatura ambiente durante 9. Aada 1 ml de Conjugado diludo (ver ms
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
usando pinzas e identifquelas marcando bajo sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
el marcador coloreado con un lpiz. Lleve siem- 10. Elimine la solucin y lave cada tira dos ve-
pre guantes cuando manipule tiras. ces durante 1 minuto con 1 ml de Solucin de
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 ml Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) pre- aproximada- mente con 1 ml de agua destilada
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta (ej.: botella de lavado) ) sobre la plataforma de
que la solucin tenga un color homogneo. agitacin del TwinCubator (deseche la solucin
cada vez).
Pg. 127
Control de Conjugado (CC)
Asegrese de eliminar cualquier resto de agua Debe aparecer una lnea en esta zona, docu-
despus del lavado anterior. mentando la eficacia del conjugado unido y la
11. Aada 1 ml de sustrato diludo (ver ms arri- reaccin del sustrato.
ba) a cada tira e incube sin agitacin y prote-
gindolas de la luz. Control Universal (UC)
Dependiendo de las condiciones del test (por Esta zona detecta, como es conocido, todas las
ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in- micobacterias y miembros del grupo de bacte-
cubacin del sustrato puede variar entre 3 y 20 rias gram-positivas con alto contenido de G+C.
minutos. Tiempos prolongados de incubacin Si esta zona y el Control de Conjugado se tien
del sustrato pueden conducir a una tincin in- como positivas, pero el restante esquema de
crementada del fondo y podra dificultar la inter- bandas no puede ser asignado a una micobac-
pretacin de los resultados. teria especfica, se deben aplicar mtodos adi-
12. Detenga la reaccin aclarando brevemente cionales para identificar la especie bacteriana
por dos veces con agua destilada. correspondiente.
13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande- Solamente han de considerarse aquellas ban-
ja y squelas entre dos capas de papel absor- das cuyas intensidades sean tan fuertes, o ms
bente. fuertes, que la intensidad del Control Universal.
RESULTADOS E INTERPRETACIN M. tuberculosis complex (TUB)

Pegue las tiras y almacnelas protegidas de la Esta zona hibrida, como es conocido, con ampli-
luz. Con cada kit se proporciona un formulario cones generados de todos los miembros cono-
de evaluacin. Cuando se utilice este formulario cidos de Mycobacterium tuberculosis complex.
de evaluacin, pegue las tiras reveladas en los Si la zona TUB es negativa, la bacteria testada
campos marcados, alineando las bandas CC no pertenece al complejo M. tuberculosis y no
y AC con las respectivas lneas del formulario. puede ser evaluada mediante este sistema.
Por razones tcnicas, la distancia entre cada
Locus Control (rpoB, katG, y inhA)
sonda de la tira puede variar ligeramente. Por
tanto, para una lectura precisa, por favor utilice Las zonas del Locus Control detectan una re-
la plantilla que encontrar en cada kit, y alinee gin del gen especfica para cada respectivo
separadamente para cada uno de los tres loci locus y siempre han de ser positivas, cuando la
detectados, con su respectivo Locus Control. banda de TUB haya documentado la presencia
Determine el estado de la resistencia y anote de M. tuberculosis.
en las respectivas columnas. Como ayuda para
la interpretacin se dan ejemplos de evaluacio- Sondas Wild type
nes en el siguiente apartado. No todas las ban- Las sondas wild type comprenden las reas de
das de una tira muestran la misma intensidad.
resistencia ms importantes de los genes res-
Cada tira tiene un total de 27 zonas de reaccin
(ver esquema). pectivos (ver figura 1, tabla 1, 2 y 3) Cuando to-
das las sondas Wild type de un gen son positi-
vas, no se detectan mutaciones en las regiones
examinadas. La cepa testada es sensible para
el respectivo antibitico.
En caso de una mutacin, el respectivo ampli-
cn no puede unirse a la correspondiente son-
da Wild type. La ausencia de seal en al menos
una de las sondas Wild type indica, por tanto,
resistencia de la cepa testada al respectivo an-
tibitico.
Solamente sern consideradas como positivas
aquellas bandas cuya intensidad sea igual o
mayor que la banda de Control de Amplifica-
cin.
Pg. 128
Si todas las bandas wild type muestra seal,
este resultado es clasificado como positivo y
Cada patrn que se desve del patrn wild type marcaremos la columna de WT de los respe-
indica resistencia de la cepa testada. El patrn tivos genes con el signo +. Si la menos una
de bandas obtenido con las sondas rpoB permi- de las bandas de Wild type est ausente, este
te dibujar una conclusin sobre la resistencia a resultado es clasificado como negativo y marca-
rifampicina de las cepas testadas, el patrn de remos la columna de WT de los mismos genes
bandas obtenido con las sondas katG permite con .
dibujar una conclusin sobre las resistencias de Las columnas de mutacin solamente se marca-
alto nivel a isoniazida, el patrn de bandas ob- rn con un signo negativo cuando no aparezca
tenido con las sondas inhA permiten dibujar una ninguna de las bandas correspondientes a las
conclusin sobre las resistencias de bajo nivel mutaciones. Si al menos una de las bandas de
a isoniazida de las cepas testadas, respectiva- mutacin aparece positive, este resultado se
mente. clasificar como positivo, y la columna MUT del
respectivo gen se marcar con un +.
Sondas de mutacin
Las sondas de mutacin detectan algunas de Seguidamente se explican dos de los ejemplos
las resistencias ms comunes mediadas por arriba mostrados:
mutaciones (ver 1, 2 y 3). Comparadas con El ejemplo 1 muestra el patrn de bandas del
otras muestras, las seales positivas de las son- wild type. Todas las sondas de Wild type mues-
das de mutacin rpoB MUT2A y MUT2B pueden tran seal, pero ninguna de las sondas de muta-
mostrar una seal ms dbil. cin lo hacen, por tanto, la tarjeta de evaluacin
Solamente deben ser consideradas aquellas muestra un + en las tres columnas del wild
bandas cuya intensidad es de la misma inten- type y un en las tres columnas de las muta-
sidad o mayor que las del Control de Amplifica- ciones. De acuerdo a estos datos, las casillas
cin. RMP sensitive e INH sensitive se marcarn
Cada patrn que se desve del patrn del wild +.
type indica resistencia de la cepa testada. El pa-
trn de bandas obtenido con la sonda rpoB per- Una de las sondas de rpoB y de katG wild type
mite dibujar una conclusin sobre la resistencia estn ausentes en el ejemplo 5; por tanto en las
a rifampicina de la cepa testada, el patrn de casillas de rpoB WT y katG WT se marcar .
bandas del katG sobre un nivel alto y el patrn Ya que ninguna de las sondas de mutacin son
de bandas del inhA sobre una nivel bajo de re- positivas, estas casillas se marcarn tambin
sistencia a isoniazida respectivamente. con . La regin promotora de inhA no se des-
va del patrn wild type. La cepa es evaluada
TABLA DE INTERPRETACIN como RMP e INH resistente. La resistencia a
INH est causada por una mutacin en el gen
katG y es por tanto una resistencia a isoniazida
de alto nivel.
PRECAUCIONES

(PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cual-
quier fuente potencial de DNA contaminante. Si
se requiere almacenar durante ms de 4 sema-
nas, almacene a 20C. A fin de evitar congela-
ciones y descongelaciones repetidas, alicuote el
PNM. Almacene el resto de los componentes del
kit en 2-8C.
Pg. 129
bilidad.
Como en cualquier anlisis basado en DNA,
No utilice los reactivos despus de su fecha de este test slamente analiza la secuencia de
caducidad. cidos nuclicos y no la de aminocidos. Es
Los especmenes de los pacientes y los culti- posible, por tanto, que mutaciones que no cau-
vos realizados a partir de especmenes de pa- san un cambio de aminocido (mutaciones si-
cientes deben ser considerados siempre como lenciosas) podran producir la ausencia de una
potencialmente infecciosos. Las muestras de de las sondas wild type.
pacientes de riesgo (infectados por microorga- Los datos ms recientes indican que a pesar de
nismos patgenos incluyendo Hepatitis B y Vi- aparezca una mutacin L533P en la respectiva
rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cepa, esta puede todava ser sensible a RMP.
cultivos realizados a partir de esas muestras Por tanto, si la banda WT8 est ausente y la
deben ser etiquetados y manejados siempre sonda de la mutacin rpoB MUT3 no se tie,
bajo las condiciones de seguridad adecuadas, deben ser considerados los resultados de la
de acuerdo con las guas institucionales. Ob- resistencia fenotpica.
serve todas las normas medioambientales y de En los ltimos aos han sido publicadas muta-
seguridad, tanto federales, estatales como lo- ciones adicionales dentro de las testadas en la
cales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. regin del gen rpoB causantes de la resisten-
El tratamiento y preparacin de la muestra, in- cia a rifampicina. Ya que estas mutaciones son
cluyendo el paso de inactivacin por calor, de- muy raras, estas no fueron accesibles para la
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu- validacin de este sistema y fueron solamente
ridad de clase II. Antes del paso de inactivacin detectadas in silico. Sin embargo, una detec-
por calor las muestras deben ser centrifugadas cin in silico no excluye la posibilidad de que
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir alguna de las mutaciones no pueda ser detec-
el rotor con contenedor de aerosoles solamen- tada in vitro.
te en la cabina de seguridad. Despus de la El GenoType MTBDRplus solamente detecta
inactivacin por calor se puede utilizar un rotor aquellas resistencias del M. tuberculosis com-
standard para centrifugar las muestras fuera de plex que tienen sus orgenes en la regiones de
la cabina de seguridad. rpoB, katG e inhA examinadas aqu. Resisten-
Observe las precauciones normales para pre- cias que tienen sus orgenes en mutaciones en
parar la amplificacin. Es esencial que todos los otros genes o regiones de genes, as como,
materiales y reactivos usados para extraccin otras resistencias o mecanismos de resistencia
de DNA y amplificacin estn libres de DNasas. rifampicina e isoniazida no sern detectados
por este test.
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- El usuario debe tener o adquirir informacin so-
mar las siguientes medidas especiales de se- bre el patrn de distribucin de las mutaciones
guridad: locales de los genes investigados con este test.
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) con- La presencia de mltiples especies de bacte-
tiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y rias en la muestra a analizar puede dificultar la
piel. interpretacin de resultados.
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- Tericamente, puede existir resistencia a pesar
metil Sulfxido y es irritante. de que aparezca un modelo wild type. Si, en
un ensayo, la muestra contiene una cepa que
LIMITACIONES ha desarrollado una he- teroresistencia y la re-
La declaracin dada en este manual con res- sistencia se debida a una mutacin no cubierta
pecto a la capacidad del mtodo, se refiere a por las sondas, aparecer el patrn de bandas
muestras de cultivos y muestras clnicas pul- de wild type. Del mismo modo, si la muestra
monares baciloscopia positivas. Los datos dis- contie nen ms de una cepa del complejo M.
ponibles sobre muestras clnicas extrapulmo- tuberculosis (debido a un cultivo mixto o una
nares baciloscopia positivas no son suficientes contaminacin) y una de ellas alberga una mu-
para trazar una conclusin acerca de su aplica- tacin que no est cubierta por las sondas
Pg. 130
geno disuelto en caldo por crecimiento de los
microorganismos.
de mutacin, aparecer tambin el patrn de El kit BACTEC MGIT 960 SIRE es un anlisis
cualitativo con duracin de 4 a 13 das. El an-
bandas de wild type. Como en el caso de otras
lisis se basa en la comparacin del crecimien-
pruebas de diagnstico, los resultados de este
to de la cepa aislada de M. tuberculosis en un
ensayo slo pueden interpretarse en conjuncin
tubo que contiene antibitico con el crecimiento
con otros datos clnicos y de laboratorio adicio-
en un tubo sin antibitico (control del crecimien-
nales a disposicin del facultativo responsable.
to). El instrumento BACTEC MGIT controla los
Antes de la amplificacin, el DNA ha de ser ais-
tubos para detectar un aumento de su fluore-
lado de cultivo bacteriano o muestras clnicas
cencia. Utiliza el anlisis de la fluorecencia del
pulmonares baciloscopia positivas, utilizando
tubo con antibitico en comparacin de la fluo-
un mtodo idneo. Ha de tenerse la seguridad
recencia del tubo de control de crecimiento para
de que la muestra de DNA ha sido amplificada
determinar los resultados de sensibilidad.
eficientemente durante la reaccin de amplifica-
cin. El test solo funciona dentro de los lmites
de las regiones genmicas para las que los pri- Materiales
mers y sondas han sido elegidos. El anlisis de Kit SIRE contiene frascos individuales liofiliza-
secuencias potenciales permanece reservado dos de estreptomicina 332 ug, isoniazida 33.2
para la reanudacin de investigaciones. ug, rifampicina 332 ug y etambutol 1,660 ug y 8
Como cualquier sistema de deteccin basado frascos de suplemento SIRE.
en la hibridacin, este sistema contempla la po- Suplemento BACTEC SIRE contienen 20 ml de
sibilidad de que variaciones de las secuencias medio de enriquecimiento Middlebrook OADC.
en las regiones genmicas que fueron elegidas Formula por litro de agua:
para los primers y sondas, y la deteccin de re- Albumina bovina 50 gr. Catalasa 0,03gr.
giones para las cuales el kit no fue diseado, Dextrosa 20 gr.
pueden conducir a resultados falsos. Debido a cido oleico 0,6 gr.
la gran variabilidad existente en los genomas Suminstrados: Kit BACTEC MGIT 90 SIRE con
bacterianos es posible que ciertos sub-tipos un frasco de cada antibitico liofilizado y ocho
puedan no ser detectados. El test refleja los co- frascos de suplemento SIRE (se obtiene apro-
nocimientos de Hain Lifescience. ximadamente 40 anlisis por cada antibitico
La utilizacin de este ensayo est limitada a del kit).No sumisntrados: Tubos de crecimiento
personas cualificadas, bien entrenadas en el MGIT 7 ml, medios de cultivo auxiliares como
procedimiento de utilizacin del ensayo y fami- Middlebrook caldo 7H9, reactivos como solu-
liarizadas con mtodos de biologa molecular. cin salina estril, cepas ATCC para el control
La evaluacin de este sistema de anlisis fue de calidad y equipo de laboratorio para el pro-
llevada acabo utilizando la HotStarTaq polime- ceso como vortex, nefelmetro,etc.
rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
caractersticas de rendimiento de este ensayo Almacenamiento
no han sido validadas para todas las polime- Los antibiticos liofilizados deben estar a 2 -8C.
rasas disponibles comercialmente, el usuario Una vez reconstituidos se puede congelar y al-
es el encargado de evaluar la aplicabilidad de macenar a temperatura igual o menor a -20C
otras polimerasas distintas de las arriba men- durante un mximo de 6 meses siempre que no
cionadas. se pase la fecha de caducidad original. Una vez
descongeladas deben usarse inmediatamente,
10.2.3. MTODO DE SENSIBILIDAD AN- desechar cualquier porcin no utilizada.
TIFMICA POR BACTEC MGIT 960 SIRE Suplemente SIRE debe almacenar en lugar os-
KIT curo de 2 -8 C. Evitar congelacin y sobreca-
lentamiento. Abrir y usar antes de la fecha de
Principio
caducidad. Reducir al mnimo la exposicin a
El tubo MGIT para deteccin de crecimiento mi-
la luz
cobateriano es caldo midlebrook 7H9 con com-
puesto fluorescente el cual es sensible al ox-
Pg. 131
8. Diluir 1 ml de la suspensin ajustada en 4 ml
de solucin salina estril (dilucion 1:5). Conti-
nuar con el proceso de inoculacin para el an-
Procedimiento lisis de sensibilidad.
Preparacin antifimicos: Reconstituir cada fras- A partir de un tuboBACTEC MGIT de 7 ml po-

co de liofilizado del kit SIRE con 4 ml de agua sitivos:
estril destilada/desionizada para preparar so- 1. El primer da en que el instrumento registra
luciones de reserva de estreptomicina de 83 un resultado positivo para un tubo MGIT se
ug/ml, de isoniazida de 8.3 ug/ml, rifampicina considera el das 0.
de 83 ug/ml y de etambutol de 415 ug/ml 2. Para preparacin del inculo de anlisis,
Preparacin del inculo: Todos las preparacio- debe usarse un tubo MGIT de 7 ml positivo el
nes deben realizarse a partir de cultivos puros da despus de que el instrumento BACTEC
de M. tuberculosis. Deben estar previamente MGIT registre el resultado positivo (da 1) hasta
identificadas y aseguras que es de cultivo puro. el quinto da, inclusive (da 5) despus de que
El inoculo puede prepararse a partir de un me- el instrumento registre el resultado positivo. Si
dio slido de un tubo BATEC MGIT 7 ml positi- un tubo permanecido positivo ms de cinco
vo, adems los que crecen en medios lquidos das, se debe hacer un subcultivo en un nuevo
y slidos se pueden utilizar para preparar un tubo MGIR de7 ml que contenga suplemento
tubo MGITi de siembra que sirve para preparar para crecimiento BACTEC MGIT, analizarlo en
el inculo. el instrumento BACTEC MGIT hasta que se re-
gistre positivo y utilizarlo de uno a cinco das
A partir de Medios Slidos: despus de mostrar positividad.
1. Aagregar 4 ml de cald Middlebrook 7H9 o 3. Si el tubo es positivo los das 1 2, utilice
caldo de MGIT a un tubo estril de 16.5 x 128 el caldo de suspensin MGIT para los procedi-
mm con tapon de rosca con 8 a 10 microesfe- mientos de inoculacin. Mezcla bien. Continuar
ras de vidrio. con el proceso de inoculacin para el anlisis
2. Con un asa estril separar el mayor nme- de sesibilidad.
ro de colonias de un cultivo de 14 das como Preparacin de un tubo MGIT de siembra a
mximo, evitando recoger medio slido. Poner partir de medios slidos
en suspensin las colonias en el caldo Middle- 1. Con un asa de inoculacin estril retire el
brook 7H9. crecimiento del agar inclinado y adalo a un
3. Agitar la suspensin en un agitador Vortex tubo MGIT de 7 ml suplementado con 0.8 ml de
durante 2 3 min para dispensar los grumos suplemento para crecimiento BACTEC MGIT.
ms granes. La turbidez de la suspensin debe 2. Cierre bien y mezcle suavemente invistiendo
superar el patrn 1.0 de McFarland. 2 a 3 veces.
4. Dejar que la suspensin repose durante 20 3. Ponga el tubo en el instrumento BACTEC
minutos sin moverla. MGIT y analice hasta obtener un resultado po-
5. Transferir el lquido sobrenadante a otro sitivo. El tiempo para obtener positivo debe ser
tubo estril de 16.5 x 128 mm con tapn (evitar igual o superior a 4 das para su uso como in-
transferir parte del sedimento) y deja reposar culo AST. Si se vuelve positivo antes de los 4
por 15 minutos. das volver al paso 1 y preparar un tubo nuevo
6. Transferir el lquido sobrenadante (debe es- de siembra.
tar homogneo sin grumos) a un tercer tubo 4. Proceda a utilizar el tubo durante el da uno
estril de 16.5 por 128 mm. (en este paso la al cinco despus de la positividad. Continuar
suspensin el microorganismo debe ser supe- con el procedimiento a partir de un tubo BAC-
rior a 0.5 de MacFArland TEC 7 ml positivo.
7. Ajustar la suspensin a un patrn 0.5 de
MacFarlan mediante comparacin visual con Procedimiento de inoculacin para el anlisis
un patrn 0.5 o con u nefelmetro. No ajustar de sensibilidad con el kit BACTEC MGIT 960
por debajo del 0.5 de Mac fArland. SIRE:
Pg. 132
precauciones estndar y las normas operativas
de seguridad.
1. Etiquetar cinco tubos MGIT de 7 ml para cada El trabajo con cultivos de M. tuberculosis re-
cepa aislada analizada. Etiquetar uno como CC quiere prcticas, equipo de contencin e insta-
(control de crecimiento), uno como STR, uno laciones de nivel des eguridad biolgica (BSL)3.
como INH, uno como RIF y uno como EMB. Antes de usar debe revisar los tubos y frascos
Colocar los tubos en la secuencia correcta en en busca de indicios de contaminacin o dao.
el transportador del tamao apropiado para el Desecharse los que no parezcan aptos. No de-
conjunto de AST. ben usarse tubos con daos.
2. Agregar aspticamente 0.8 mL de suplemen- En caso que se rompa un tubo:
to BACTEC MGIT SIRE a cada tubo. Importan- 1. Cierre los cajones del instrumento
te utilizar el suplemento suministrado con el kit. 2. Apagar el instrumento.
3. Con una micropipeta, transferir asptica- 3. Desalojar la zona inmediatamente
mente 100 ul de la solucin MGIT STR de 83 4. Consultar las normar de manejo de manipu-
ug/mL al tubo MGIT que tiene la etiqueta co- lacin de lquidos y materias contaminadas as
rrespondiente. Con una micropipeta, transferir como aerosol de micobacterias descritas.
aspticamente 100 uL de la solucin MGIT INH 4. Preparacin de inculo del tubo de Control de
de 8.3 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta co- Crecimiento: Con una pipeta, transferir aspti-
rrespondiente. Con una micropipeta 100 uL de camente 0.1 mL de la suspensin de microor-
RIF de 83 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta ganismos (Preparacin de inculo) a 10 ml de
correspondiente. solucin salina estril para preparar la suspen-
sin 1:100 de control de crecimiento. Mezclar
Con una micropipeta transferir 100 uL de EMB bien la suspensin de control de crecimiento.
de 415 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta co- Inocular 0.5 mL de la suspensin 1:100 de con-
rrespondiente. Importante agregar el antifmi- trol de crecimiento en el tubo MGIT que tiene la
co apropiad al tubo corresponiente. No agre- etiqueta CC
gar antifmico al tubo de control de crecimiento.
Advertencias y Precauciones
Toda muestra para anlisis debe manejarse
como potencialmente infecciosas y seguirse las
precauciones estndar y las normas operativas
de seguridad.
El trabajo con cultivos de M. tuberculosis re-
quiere prcticas, equipo de contencin e insta-
Los antifmicos se reconstituyen con 4 ml de laciones de nivel des eguridad biolgica (BSL)3.
agua estril/desionizada para lograr la concen- Antes de usar debe revisar los tubos y frascos
tracin adecuada en busca de indicios de contaminacin o dao.
4. Preparacin de inculo del tubo de Control de Desecharse los que no parezcan aptos. No de-
Crecimiento: Con una pipeta, transferir aspti- ben usarse tubos con daos.
camente 0.1 mL de la suspensin de microor- En caso que se rompa un tubo:
ganismos (Preparacin de inculo) a 10 ml de 1. Cierre los cajones del instrumento
solucin salina estril para preparar la suspen- 2. Apagar el instrumento.
sin 1:100 de control de crecimiento. Mezclar 3. Desalojar la zona inmediatamente
bien la suspensin de control de crecimiento. 4. Consultar las normar de manejo de manipu-
Inocular 0.5 mL de la suspensin 1:100 de con- lacin de lquidos y materias contaminadas as
trol de crecimiento en el tubo MGIT que tiene la como aerosol de micobacterias descritas.
etiqueta CC
Advertencias y Precauciones
Toda muestra para anlisis debe manejarse
como potencialmente infecciosas y seguirse las
Pg. 133
for Acid-Fast Microscopy. U.S. Departament of Health,
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cin de Microbiologa, Departamento de laboratorios Cl-
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Smithwick, Ronald W. M.S. (1980). Laboratory Manual
Pg. 134
NORMAS DE PUBLICACIN 2014
La revista de Medicina Interna de Guatemala es el rgano oficial de divulgacin de la Asociacin

de Medicina Interna de Guatemala (AMIG) y tiene como principal objetivo establecer un eje de
comunicacin e integracin entre los mdicos internistas de Guatemala. La publicacin es cua-
trimestral y es distribuida en hospitales, facultades de ciencias de la salud, clnicas, instituciones
educadoras y de investigacin, as como por va electrnica y colocada en la pgina electrnica
de la AMIG. Nuestros principales lectores son especialistas en Medicina Interna y sub-especia-
listas de Medicina Interna. El contenido de la revista puede ser consultado va internet, en el sitio
www.asomigua.org o a travs de Facebook: Asociacin de Medicina Interna de Guatemala.
La revista recibe trabajos en espaol, con resumen en ingls, y est constituida por secciones de
editorial, artculos originales, artculos de revisin (actualizacin), notas previas/cartas al editor,
derecho a respuesta (una sola), fotos clnicas, casos interesantes. Asimismo, la revista ofrece
cobertura e informacin sobre los principales eventos cientficos relacionados a la especialidad.
Los artculos de revisin (actualizacin) sern solicitados por el comit editorial segn las necesi-
dades epidemiolgicas y clnicas para Guatemala.
Los manuscritos en triplicado sern dirigidos al Dr. Carlos Rodolfo Meja Villatoro coordinador
del comit editorial de la revista y recibidos en la sede de la Asociacin de Medicina Interna de
Guatemala en la 12 calle 2-04, zona 9, edificio Plaza del Sol, oficina 319 nivel 3, ciudad de Gua-
temala. Se puede remitir el texto por va electrnica a la direccin revista.asomigua@gmail.com
en formato Word utilizando letra arial 12 a doble espacio en una solo columna.
Los trabajos sern evaluados por el coordinador del comit editorial y por dos especialistas an-
nimos elegidos entre los miembros del comit Editorial y entre los afiliados de la Asociacin de
Medicina Interna de Guatemala con reconocida experiencia en el asunto. El comit Editorial tiene
la facultad de rechazar aquellos trabajos que no juzgue apropiados, as como de proponer modifi-
caciones cuando lo considere necesario. La correspondencia con los autores ser realizada, por
correo electrnico exclusivamente.
Los trabajos deben de seguir la siguiente estructura:
1. Carta de presentacin
Los trabajos debern ser precedidos de una carta de presentacin dirigida al coordinador del
comit editorial, en la que se incluya el ttulo del trabajo, un prrafo destacando la importancia
del artculo y la seccin en la que se solicita la publicacin. Los autores deben explicitar que el
trabajo no ha sido publicado con anterioridad ni ha sido enviado simultneamente a otra revista.
Asimismo, se indicar que todos los autores estn de acuerdo con el contenido del trabajo, que
ceden los derechos de publicacin a la Revista Medicina interna de Guatemala y que no existen
conflicto de intereses.
El formato general para las diversas secciones de la Revista se presenta de la siguiente manera:
Pg. 135

2. Primera pagina
La primera pgina del trabajo incluir obligatoriamente los siguientes puntos:
- Ttulo del trabajo conciso, completo y explicativo sobre el asunto al que se refiere.
- Nombre completo de los autores, sin abreviaciones. Los autores debern indicar la forma en
que deseen ser citados.
- Ttulo acadmico completo de los autores, con el nombre y la direccin de la institucin de tra-
bajo a la que estn afiliados.
- Especificacin de la unidad o departamento de la institucin donde el trabajo fue realizado.
- Nombre, direccin, e-mail y nmero de telfono/fax del autor designado para recibir la corres-
pondencia.
3. Resumen:
El resumen debe presentar los siguientes puntos:
Ser enviado en el idioma original (espaol o ingls). En los casos de artculos en ingls, se deben
enviar el resumen en espaol e ingls.
Extensin mxima de 300 palabras para los artculos originales y revisiones, y de 250 palabras
para las notas previas y relatos de casos.
Ser informativos y no indicativos, explicando de forma clara los objetivos, mtodos, resultados y
conclusiones derivadas del estudio.
En los descriptores deben incluirse por lo menos 3 y hasta un mximo de 10 palabras-clave,
en el idioma original y en ingls, empleadas en el DeCS Descriptores en Ciencias de la Salud,
publicacin de la BIREME (Centro Latino-Americano y del Caribe de informacin en ciencias de
la Salud), disponible en http://decs.bvs.br o en el ndex Medicus (Medical Subject Headings),
disponible en http://www.ncbi.nlm.gov/entrez/meshbrower.cgi
Pg. 136
4. Cuerpo del texto
El trabajo debe de ser dividido en las siguientes partes:
Introduccin: debe de ser sucinta, proporcionando nicamente la informacin necesaria para

comprender el trabajo que ser presentado posteriormente. No se deben incluir datos ni conclu-
siones. El ltimo prrafo deber exponer de forma clara los objetivos del trabajo.
Materiales (o Pacientes) y Mtodos: debe explicar la metodologa utilizada, los criterios de selec-
cin empleado informacin sobre la poblacin, estudiada, datos sobre los anlisis estadsticos e
informacin concerniente a los aspectos ticos del estudio.
Aspectos ticos: los artculos sobre investigaciones con seres humanos deben presentar la au-
torizacin previa del Comit de tica de la institucin en la que se realiz el estudio, as como
mencionar la obtencin de consentimiento por escrito, despus que el paciente, sus familiares o
su representante legal (en el caso de menores o discapacitados) hayan sido informados sobre los
procedimientos o estudios a ser realizados. Los artculos sobre ensayos con modelos biolgicos
deben presentar la aprobacin de los protocolos obtenidos.
Los nombres comerciales de los medicamentos deben ser acompaados del nombre genrico
correspondiente, esclareciendo siempre las dosis y la vas de administracin.
Resultados: deben de exponerse exclusivamente la descripcin y no la interpretacin de los datos

obtenidos con la metodologa utilizada en el trabajo. Deben de resumir las observaciones ms
importantes con cuidado de no repetir las informaciones mostradas en tablas, figuras o grficos.
En caso que se requiera presentar un volumen grande de datos, deber preferirse los grficos en
lugar de las tablas.
Discusin: deben de resaltarse las conclusiones y los aspectos ms importantes del trabajo. De-
ber evitarse repetir las informaciones ya presentadas. Se resaltaran las inferencias de los resul-
tados, las deducciones elaboradas y tambin las limitaciones del estudio. Deber de comparase
los resultados con los de otros estudios y confrontar las observaciones finales con los objetivos
del trabajo.
Agradecimientos: deben ser limitados a los individuos e instituciones que efectivamente contribu-
yeron para la realizacin del estudio.
Financiamientos: informacin detallada sobre la fuente de financiamiento. Si no existe ayuda fi-

nanciera, los autores debern declarar que no existe conflicto de intereses.
5.Material ilustrativo
Cualquier material utilizado para ilustrar el trabajo (tablas, figuras o fotografas) debe ser presen-
tado en hojas aparte, al final del texto, cada una en una pgina diferente.
Tablas: deben ser numeradas conforme el orden de parecimiento en el texto, utilizando nmero
arbigos y deben ser auto explicativas. El ttulo debe ser claro e informativo. Las observaciones
necesarias para esclarecer abreviaturas u otros sern colocadas al pie de la tabla. El formato de
la misma debe de utilizar los comandos de tabulacin (tab) y nueva lnea (enter).
Pg. 137
Figuras: Deben de ser numeradas conforme orden de aparecimiento en el texto, en nmeros ar-
bigos. Todas las explicaciones deben de ser presentadas en las leyendas. Los grficos y figuras
deben de ser enviados en power point. En el caso de figuras y fotografas, se deber colocar
en el dorso una etiqueta adhesiva en la que se indique el nombre del primer autor y una flecha
sealando el margen superior. Las fotografas digitales deben de ser enviadas con buena defi-
nicin (mnimo 300DPI). De ser necesario, utilizar siempre imgenes producidas por impresoras
de alta resolucin y en blanco y negro.
6. Referencias bibliogrficas
Las referencias deben ser numeradas consecutivamente en el orden en que fueron mencionadas
en el texto, debiendo ser identificadas en nmeros arbigos colocados como exponentes. Los
nombres de las revistas deben ser abreviados de acuerdo con el ndex Medicus, disponible en:
http://www.ncbi.nlm.gv/jrbrowser.cgi.
Las citas debern comprobarse sobre los artculos originales y se ordenaran segn las normas
de Vancouver (1997, edicin revisada de Octubre de 2001), disponible en: http://www.icmje.org.
Todos los autores deben ser citados, independientemente de su numero y deber evitarse es-
cribir para nmeros grandes de autores: et al. No se emplearan frases como comunicaciones
personales. Los trabajos aceptados y no publicados en el momento de ser citados pueden ser
incluidos en las referencias, especificando el nombre de la revista, seguido de la expresin en
prensa entre parntesis. A continuacin se citan algunos ejemplos de los principales tipos de
referencias utilizadas.
a) Artculo de revista:
1. Bryan CS, Reynolds Kl. Bacteremic nosocomial pneumonia. Am Respir Dis 1984;129:668-671.
2. Carratala J, Guidol R, Pallares R, Dorca J, Verdaguer R, Ariza J, et al. Risk factors for nosoco-
mial Legionella pneumophila pneumonia.Am Rev Respir 1994; 149:625-629.
b) Trabajo publicado por una institucin o corporacin:

Ministerio de Sanidad y consumo. Liga Espaola para la Lucha Contra la Hipertensin. Sociedad
Espaola de Hipertensin. Control de la hipertensin arterial en Espaa. Rev Esp Salud Pblica
1996; 70:139-210.
OMS. Informe Anual de Mortalidad Materna en las Amricas. Ao: xxxxx. Disponible en: www.
who.org por ejemplo.
Encuesta Nacional de Salud Materno Infantil, Guatemala: Ao: xxxxs
c) Volumen con suplemento:

Vogel F. Sequential Therapy in the hospital management of lower respiratory infections. Am J
Med 1995; 99 (Supl 6B) : 13S-19S
d) Libros, tesis y monograficas:

1. Hawe P, Degeling D, Hall J. evaluacin en promocin de la salud. Gua para trabajadores de
la salud. 1st ed. Barcelona: Masson;1993.
2.World Health Organization. International drug monitoring the role of national centers. Technical
Report Series N 498.Geneva: 1972.
3.Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly`s access and utilization (dissertation).
St. Louis (MO): Washinton Univ.;1995.
Pg. 138
4. Nues L. Aspectos clnicos, hematolgicos e inmunolgicos en la estrongyloidiasis. Tesis Uni-
versidad Central de Venezuela; 1993.
e) Captulo de libro:
Rawlins MD, Thompson JW. Mechanisms of adverse drugs reaction.
En Davies DM, editor. Textbook of Adverse Drug Reaction.4th ed. Oxford University Press; 1991
p 18-45.
f) Resumen de congreso:
Vettorello ML. A influencia de fatores climaticos na incidencia dos acidentes loxoscelicos no
Municipio de Curitiba, no period de 1998 a2001. XXXIX Congresso da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical. 008 TL. Belem, 2003
g) Articulo de fuente o revista electrnica

1. The Counter Bioterrrorism Research Agenda of the National Institute of allergy and Infectious
Diseases for CDC Category A Agents. Washington, DC: National Institute of Allergy and Infec-
tious Diseases; February 202. Disponible en: http://www.nih.gov/dmid/pdf/bioresearchagenda.
pdf.
2. Carucci JA, McGovern TW, Norton SA. Cutaneos anthrax management algorithm. J Am Acad
Dermatol 2001; Nov 21. Disponible en:
http://www.harcourthealth.com/scripts/om.dll/server?arttype=full&article=a121613.
Pg. 139

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ISSN 2415-251X

Clinica de Enfermedades Infecciosas

Revista de microbiologia Volumen No. 1

Enero - Marzo 2016

Clinica de Enfermedades Infecciosas

Revista de microbiologia Volumen No. 1

Enero - Marzo 2016

Licda Maria Remey Gordillo

Dr. Carlos Meja Villatoro

Licda Maria Remey Gordillo

Mellross Elswith Salazar Alvarez

Entre las actividades que se realizaron en el Diplomado se tuvieron:

1. Conferencias tericas donde se presentaron y discutieron temas en aspectos generales y es-

2. Investigacin sobre un tema especfico sobre resistencia antimicrobiana.

3. Elaboracin y presentacin de un manual de procedimientos estndar acorde a las necesi-

El Diplomado se desarroll en el Hospital Roosevelt con el apoyo del Programa de Postgrado y

Los principales objetivos especficos que se deseaba alcanzar fueron:

1. Asistir y fortalecer los conocimientos de los laboratoristas y mdicos de instituciones clnicas

Al Diplomado se inscribieron un total de 67 personas, 42 profesionales, de los cuales 4 eran M-

De los 67 inscritos, completaron el diplomado 58 personas, 52 aprobaron el diplomado lo que

Licda. Maria Remei Gordillo

Normas de seguridad en el laboratorio -1-1-

Tinciones en Microbiologa Clnica -3-3-

Manual de Microbiologia -16-16-

Normas Mnimas de Seguridad en el Laboratorio de Micro-

Normas de Publicacin -135-139-

El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de Microbiologa,

II. GENERALIDADES 9. Conocer el manejo de todos los equipos y

Debido al pequeo tamao de la mayora de a. Muestras slidas

1. Tincin de Azul de Metileno de

El fenol destruye la flora acompaante (algu- 3. Tincin Naranja de Acridina

Figura 4. Tincin de ascosporas.

La tcnica de Ziehl-Neelsen modificado fuerza

Figura 13. Tincin de esporas en Bacillus subtilis, la

8. Tincin de cido Perydico de Schi-

d. Resultados b. Materiales y Reactivos

E. Garca., P. Beltran., C. Guzmn., A. Len., P. M. Pontn., J. Llovo., J. (2007) Diagnstico Mi-

G. Koneman., E. Allen., S. Janda., W. Procop.,

H. Lpez., L. Hernndez., M. Coln., C. Ortega.,

2.4.2.2 Procedimiento de Tincin de

a. Preparacin del frote

2.4.4 Tincin Kinyoun Modificado

3.1.2 Recoleccin de la muestra y

Previo a la toma de muestra el paciente no debe

Es el principal microorganismo patgeno hu-

3.2 Cultivo de Garganta Especial

3.2.3.2 Neisseria meningitidis

3.2.3.3 Bordetella pertussis

3.3.2.1 Toma de muestra

Volumen de muestra: neonatos 0.5 ml Subcultivo

Tabla No. 2 Alteracin del hemocultivo y posible bacteria

3.3.4 Identificacin de principales microorganismos

Staphylococcus coagulasa negativo, corinebacterias y especies de bacillus son contaminantes

3.4 Lquido cefalorraqudeo y otros lquidos estriles

Bacterias Gram Positivo

Entre otros microorganismos esta Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Cryptococcus

3.4.2 Recoleccin de Muestra y Transporte

Caractersticas macroscpicas en los medios

B. LIA Agar Lisina Hierro

3.5.4 Identificacin de principales Mi- Tabla No. 6 Interpretacin TSI y LIA

3.5.4.1 Pruebas Bioqumicas

A. TSI Agar hierro triple azcar

E. MIO (Movilidad, Indol y Orinitina)