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ffiMUNOLOGIA
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EXPERIMENTAL .
M. Se. Mara Cristina Pico Beltrn
M. Se. Isabel G. Giraldino Falero
Dr. Anselmo 9tero Gonzlez
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~/EDITORIAL
VFLIX VARELA
LA HABANA , 1997
Edicin: Lic. Niurka Casanovas Herrero
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Diseo, realizaci6n y emplane: Emilio Garca Viera '' l I' .. .
Diagramacin: Jos A. Bouza Puigdevall . '. \.
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Correccin: Violeta Recarey Fernndez y Niurka Casanovas Herrero , ,_"a ;.;:;:: ~~


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Este libro de texto ha sido evaluado por la Comisin de ca rrera de Bioquimica,


basado en el informe de los oponentes: Dr. Juan Flix Amador y Dr. Anselmo
A
Otero Gonzlez, quien pas a ser autor del libro por sus valiosos aportes, y Yanul, Natacha y Pedro Pablo,
autorizado por la Direccin de Formacin Profesional del Ministerio J e Edu-
cacin Superior.
Aurora , Anabel y Juan Carlos,
nuestros hijos.

Mara Cristina Pico Beltrn, 1997


Sobre la presente edicin:
Editorial Flix Varela, 1997

EDITORIAL FLIX VARELA


San Miguel No. 1111
e/ Mazn y Basarrate, El Vedado
Ciudad de La Habana, Cuba.
ISBN: 959-07-0130-2
PREFACIO

Inmunologia experimental fue concebido como libro de texto para


estudiantes de las carreras Biologa, Bioqumica y Microbiologa, que se
imparten en la Facultad de Biologa. Va tambin dirigido a estudiantes de
otras carreras universitarias y a tcnicos y profesionales que trabajan en la
produccin de anticuerpos, as como en la deteccin y cuantificacin de
antgenos y anticuerpos. El libro est organizado en nueve captulos. El pri-
mero, dedicado a la produccin convencional de anticuerpos; los captulos
del 11 al VIII, a las tcnicas serolgicas e inrnunoensayos; y el ltimo, a la
produccin de anticuerpos monoclonales.
Debemos agradecer muy especialmente al Dr. Juan Flix Amador por
la revisin minuciosa que hizo del manuscrito y sus aeertadas sugerencias;
tambin a un grupo de colegas que con sus experiencias y recomendaciones
contribuyeron a esta obra. Ellos son: Lic. Sonia Lpez, Dra. Mayra Lpez,
M.C . Mara Esther Fajardo, Dr. Mario lvarez y los licenciados Antonio
Bencomo, Roberto Alegre, Ana Maria Barral, Celeste Arranz, Pedro Estvez,
Mximo Daz y Julio Machado.
Un reconocimiento para Jorge Luis Santiesteban, quien con paciencia
infinita confeccion los dibujos.

Los autores.
1
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1 .,..

5
CAPTULO 1
PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
POLICLONALES

La produccin de anticuerpos es una prctica frecuente en los laboratorios


docentes, de investigaciones biomdicas y en los centros de obtencin de
biopreparados . La diversa utilidad de estos reactivos justifica su produccin
y los estudios acerca de la potenciacin y modelacin de antgenos, de los
mecanismos y regulacin de la respuesta inmune y de la obtencin de
anticuerpos por diferentes procedimientos, como los biotecnolgicos y de
ingeniera gentica, y la inmunizacin in vitro.
El mtodo convencional para obtener anticuerpos policlonales (AcP) con-
siste en la inoculacin del inmungeno a animales inmunocompetentes (Fi-
gura l). Este procedimiento, llamado inmunizacin, se fundamenta en la
respuesta de anticuerpos, la cual conlleva una serie compleja de mecanis-
mos internos del animal, que el experimentador intenta manipular a travs
de la potenciacin de! inmungeno, las dosis, el intervalo entre ellas, la va y
el modo de administrarlas.
A travs de diferentes vas el inmungeno inyectado llega a los rganos
linfoides secundarios (bazo, ganglios linfticos y otros). Se utilizan las rutas
subcutnea (s .c.), intradrmica (i.d.), intramuscular (i.m.), intraperitoneal
(i.p.), intravenosa (i .v. ), intracardaca (i.c.) y retroocular (r.o .), esta ltima
en el caso del ratn . En ocasiones el inmungeno puede ser inyectado direc-
tamente en el bazo (va intraesplnica) o en los ganglios (va intralinftica).
En los rganos linfoides secundarios el inmungeno es retenido e interacta

~~
con diferentes clulas, teniendo lugar la respuesta inmune. Los anticuerpos Pa ra identificar al antisuero y al anticuerpo se acompaan con el nombre-
producidos en estos sitios son liberados a la sangre (Figura 1) y se localiz.an del antgeno para el que son especficos . Por ejemplo, un suero que conten-
fundamentalmente en la fraccin gamma-globulnica del suero (Figura 2) . ga ant icuerpos contra mioglobina se denomina suero anti-mioglobina o
antisuero anti-mioglobina; y los anticuerpos, anticuerpos anti-mioglobina. En
ta prctica se pueden abreviar sustituyendo la palabra antisuero o anticuer-
po por la letra alpha (a) o un signo menos(-), y queda en este caso: a-mioglo-
bina o -mioglobina.
Los anticuerpos policlonales son de nat!.!_raleza hetero~ea y esto tiene
.. gran importancia prc~ca . A diferencia de los anticuerpos monoclonales
~ i!I) (AcM) son producidos por clulas plasmticas (CP) provenientes de dife-
rentes clOnes de clulas B, de ah su carcter policlonal La heterogeneidad
_' w. 6
de los antisueros policlonales se manifiesta en la naturaleza de los anticuerpos

~ { sangre - Incubacin
centrifuqacin
~ .Suer0 inmune

WJ 1
Celulas
sintetizados. Estos anticueipos estn dirigidos contra sitios (epitopos) dife-
~ntes de la molcula de antgeno y reaccionan con distintos grados de afini-
dad en la medida n que ajusten con el q>itopo Figura 3). Los AcP pertene-
cen -a diferetes isotipos inmunoglobulnicos de la especie animal en que se
Figura 1. Obtencin de anticuerpos policlonales por el mtodo convencional.
producen. A todo esto hay que agregar la historia inmunolgica del animal
en cuestin, que se manifi esta en una adicional diversidad de anticuerpos
Albmina Albmina
que acompaan al anticuerpo de inters en el suero sanguneo.
A
j
o o (-
l-) El fundamento de la produccin de anticuerpos policlonales es la respuesta
e o
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e ....o a. E ....o .e de anticuerpos y la memoria inmunolgica que durante ella se establece
O
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o
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Q)
-<t
Q,
para el antgeno en cuestin. Cuando un individuo inrnunocompetente se
pone por vez primera en contacto con el antgeno, pasan varios das (7 a 1O)
antes de que puedan detectarse anticuerpos en la sangre (perodo de latencia),
alcanzando un mximo para luego descender (Figura 4). ~1..a duracin del
Descendente
NORMAL
. Oescenden te
HIPERINMUNE ....
perodo de latencia depende, entre otros factores, del lmite de deteccin de
la tcnica empleada para detectar los anticuerpos. Si despus de un interva-
lo de tiempo se administra al animal una segunda inyeccin, en los pocos
fi gura 2. Grficas electroforticas correspondientes tt un suero normal y a un suero das siguientes el nivel de anticuerpos en sangre aumenta bruscamente (dis-
hiperirunune.
minuye el perodo de latencia con respecto a la respuesta primaria) hasta

Se denomina suero inmune, inmunosuero o antisuero al suero de un ani-
alcanzar valores mucho ms altos que los observados en la primera res-
puesta. La respuesta secundaria se caracteriza por una produccin ms
mal que ha sido sometido a un proceso de inmunizacin y contiene anticuerpos rpida, abundante y sostenida de anticuerpos y es resultado de la puesta a
especficos contra el inrnungeno inoculado. El suero inmune puede, en oca- punto del sistema fonnador de anticuerpos, como consecuencia del primer
siones, ser consecuencia de una infeccin natural . El calificativo hiperinmune contacto con el antgeno que dio lugar a una poblacin amplificada de clu-
se refiere al suero de un animal que ha sido inmunizado repetidamente y las, las llamadas clulas memoria (Roitt, 1978). Este tipo de respuesta es
contiene altas concentraciones de anticuerpos especficos . propia de los antgenos timodependientes (TD).
8 9
r-

Se acostumbra denominar dosis sensibilizonte de antgeno a la primera.

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inoculacin en el animal virgen; y dosis desencadenante, secundaria o

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de o 1ta .. booster" al estmulo anti gnico para inducir una respuesta secundaria das,
/~afinidad meses o af\os despus del estmulo primario.

BAQE :>.c;;;:l
En la produccin convencional de anticuerpos generalmente se practican
inoculaciones seriadas del inmungeno con el propsito de incrementar la
concentracin de anticuerpos. La cintica de su produccin sigue el patrn
de la respuesta secundaria (Figura 4), es decir, el ttulo de anticuerpos circu-

~ =7:j de baja lantes aumenta despus de cada reinmunizacin hasta alcanzar un nivel
mximo, ms all del cual inyecciones adicionales no lo afectan. Despus
afinidad
de ese mximo el ttulo se mantiene durante meses y, en ocasiones, aos,
observndose un plato en la curva.
Figura 3. Heterogeneidad de los anticuerpos sintetizados contra wt antgeno. Tras cad inyeccin de antgeno hay una rpida cada de los anticuerpos
circulantes (fase negativa) . Esto se debe a la neutralizacin de anticuerpos
circulantes durante el perodo en que hay exceso de antgeno.
Cuando se emplean antgenos con adyuvantes del tipo Freud o compuestos
de aluminio por las vas i.m. o s.c., se ha observado que la respuesta de
anticuerpos puede crecer muy lentamente hasta alcanzar un mximo a los
Respuesta primaria Respuesto secundario 2-3 meses y entonces tiende a persistir como un plato. En este momento es
Copcentra- que se debe poner la segunda dosis, preferiblemente sin adyuvante (Dresser,
cion de Ac
en el suero 1986).
1
Primera inyeccin se11undo ipyeccin
11 de inmungeno de inmunogeno Los sueros inmunes en general contienen menos de 5 mg de anticuerpo por
mililitro de suero, lo que equivale a menos del 1O % de su proteina total,
1
valorada en aproximadamente 70 mg/mL . En sueros de ttulos muy eleva-
dos la cantidad de anticuerpos en la fraccin ganuna-globulnica (Figura 2)
1
suele ser menor del 50 %.
1 A las diferencias de carcter cuantitativo de las respuestas primaria y se-
cundaria se suman otras, como los isotipos de los anticuerpos y sus afinida-
fi ~', des . En la respuesta primaria predomina el isotipo lgM y en la secundaria, el
IgG . Con el tiempo, la afinidad de los anticuerpos aumenta, mientras que su
o 10 20 30 40 ' 60 70 ao 90 01'as especificidad puede disminuir.

Figura 4. Respuestas primaria y secwtdaria de anticuerpos.


Virgen: Se aplica este calificativo al animal o a Ja clula que no ha tenido contactoant~
con el antgeno. En ingls se utiliza el tnniI101111p1imed. ',7,
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una misma lnea gentica, se inmunicen de la misma forma y se mantengan
Algunos antgenos no producen respuestas secundarias . Son los denomina- en condiciones similares de vida.
dos antgenos timoindependientes (TI) porque no involucran la participacin
de clulas T en la respuesta. Generalmente son polmeros que presentan En muchas ocru;iones es posible disponer de programas evaluados por otros
mltiples copias de un epitopo, como es el caso de polisacridos de origen investigadores, que pueden ser oJ)ciones o puntos de partida para obtener
bacteriano (Figura 5). La unin del antgeno polimrico a mltiples molcu- anticuerpos de una calidad determinada. No obstante, aun cuando se repro-
las de anticuerpo sobre clulas B (lgm) es suficiente para estimularla .a duzcan esquemas, los resultados pueden ser diferentes. En la prctica casi
proliferar y secretar anticuerpos. Los antgenos TI al parecer no generan siempre se introducen modificaciones que responden a las condiciones pro-
memoria inmunolgica ni anticuerpos de alta afinidad y el isotipo predomi- pias y al comportamiento del animal de experimentacin, de ah que la pro-
duccin de anticuerpos tenga un cierto carcter emprico.
nante es lgM. En animales malos respondedores, los antgenos TO pueden
tambin dar slo respuestas primarias. Los anticuerpos tienen mltiples aplicaciones:

Entrecruzamiento de receptores (lgm) - En la clnica se utilizan con fines teraputicos y profilcticos en diversos
estados infecciosos y txicos, lo mismo en el hombre que en los anima-
les; as como en el trasplante de rganos y tejidos, y en las enfermedades

~
autoinmunes en humanos.
I
En el diagnstico y seguimiento mdicos; en estudios epidemiolgicos
) ( .; <I para la identificacin y cuantificacin de antgenos bacterianos, virales y
de otros tipos, en el hombre y en animales .
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... En la identificacin de microorganismos aislados de procesos infecciosos . .


En la tipifica~in de grupos sanguneos y en las pruebas de histocompa-
tibilidad para determinar molculas HLA (antgenos de leucocitos huma-
Figura 5. Activacin de clula B por Ag timoindependiente. nos) con vista al trasplante de rganos y tejidos. -,

Cuando es necesario obtener anticuerpos con determinadas caractersticas - En la clasificacin taxonmi.ca de microorganismos, plantas y animales.
de especificidad, isotipo o grado de afinidad, el protocolo de trabajo para su En trabajos bioqumicos y de ingeniera gentica, para la purificacin,
produccin se disear de acuerdo con el fin deseado. caracterizacin y cuantificacin de protenas recombinantes .
Con un tratamiento adecuado del inmungeo o una forma de administrarlo En la cuantificacin de hormonas de origen humano, animal y vegetal.
es posible obtener anticuerpos contra prcticamente cualquier sustancia,
con la calidad requerida o en cantidades de 1-5 mg/mL de suero (superiores - En estudios inmunoqumicos y en muchos otros .
a las fisiolgicas), que podran llegar en algunas ocasiones a valores notables
de 50 mg/mL (Dresser, 1986). RESPUESTA INMUNE HUMORAL
No es posible establecer reglas para la produccin de anticuerpos en anima- El conocimiento de los principios bsicos de la biologa de la respuesta inmu-
les de experimentacin. En esto influyen numerosos factores como las par- ne y su regulacin es un prerrequisito para la produccin exitosa de
ticularidades del antgeno, la complejidad' de la respuesta inmune y lo varia- anticuerpos. Esto capacita al investigador para inducir una respuesta vigo-
da que puede ser en cada uno de los individuos, aun cuando pertenezcan a
13
12

....
rosa de anticuerpos en vez de resultados impredecibles, CQmo la tolerancia
(Ttjssen, 1985).
Las dos ltimas son esenciales para la mayora de los antgenos (protenas;
Una respuesta inmune humoral es consecuencia de una serie compleja de polipptidos y sus conjugados), los llamados antgenos TD.
eventos que involucran al antgeno y, al menos, cuatro tipos de clulas (Figu-
ra 6). Fagocitosis del antgeno
l . La clula B, precursora de la clula que produce los anticuerpos . Como primer paso en la respuesta de anticuerpos, los antgenos son
2. La clula plasmtica, linfocito B terminalmente diferenciado, que sinteti- endocitados inespecficamente por macrfagos u otras clulas del SRE.*
za y secreta los anticuerpos. Entre estas ult imas se incluyen, adems de los macrfagos, las clulas de
Langerhans (CL) en la piel y las clulas dendrticas (CD) en el bazo y
3. La clula T auxiliadora (Th).
ganglios linfticos . Como todas estas clulas procesan antgeno se denomi-
1
4. La clula accesoria llamada clula presentadora de antgeno (APC : nan colectivamente clulas presentadoras de antgeno. Para los antgenos
1
1 antigen presenting cell) . TO esta degradacin no especfica es esencial para que se inicie una res-
puesta efectiva .
Muchas de las tcnicas comunes para optimizar el trabajo de inmunizacin
111
tratan de incrementar la eficiencia de la fagocitosis . Ellas incluyen la selec-
cin de un sitio de inyeccin apropiado, alteracin de la forma del antgeno y

IP~
el empleo de adyuvantes . No todos los sitios de inyeccin son igualmente
11
buenos para servir de blanco en la fagocitosis . Los sitios ptimos tienen alto
contenido de APC y ritmos bajos de degradacin de antgeno. Las rutas de
inyeccin comnmente empleadas son la s.c ., i.d., i.m., i.p . e i.v. La eficien-
cia de la fagocitosis tambin depende del tamao y forma del antgeno. Los

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antgenos particulados son fcilmente fagocitados, mientras que las molcu-
las pequeas solubles lo son menos . Por esta razn, convertir las molculas
pequea.s solubles en agregados particulados usualmente es una forma efec-

V - ~~
1 tiva de incrementar su inmunogenicidad. El tercer mtodo usado con fre-

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cuencia para incrementar la fagocitosis es mezclar el antgeno con
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111
1
y ont icuerpo "'~:.:-- r{ Despus que el antgeno es endocitado por una APC, la vescula fagoctica
se fusiona con un lisosoma y el antgeno es parcialmente degradado. Apare-
l!l Figura 6 . Clulas que participmi en la respuesta de w11icuc11xis SRE: Sistema retculo-endotelial. Conj unto de clulas capaces de atrapar colorantes vi tales
' Y partculas. Originalmente el tnnin<> se emple para incluir las clulas con acti vidad
14 fagoc tica. Su principal funcin es eliminar partculas de la sangre. Incluye las APC .

15
cen entonces sobre la superficie de la APC fragmentos peptdicos del antgeno
presentados por protenas clase 11 del CPH . Aunque una molcula El oaso siguiente es la proliferacin y diferenciacin de la clula Th, que
clase 11 es capaz de unir un amplio rango de estructuras, algunos fragmen- inv~lucra un segundo factor polipeptdico, la interleuquina 2 (IL-2), secretada
tos antignicos pueden no ser unidos . Si ninguno de los fragmentos del par las propias clulas Th en respuesta a la estimulacin combinada de
antgeno se une a protenas clase 11, este puede evadir la vigi lancia del siste- antgeno e IL-1 . Este estimulo combinado tambin induce a la clula Th a
ma inmune. Los animales con molculas clase II que no unen fragmentos sintetizar receptores para lL-2 (RIL-2). En presencia de IL-2 estas clulas
de un antgeno determinado se conocen como no respondedores a ese se dividen exponencialmente. Esta proliferacin requiere la continuada
antgeno (Figura 7) . estimulacin del factor de crecimiento IL-2 y, en ausencia de l, se detiene
la divisin celular. El sistema es controlado por el nivel de expresin de RIL-2
sobre la superficie de clulas T proliferantes. En ausencia de estimulacin
Activacin de clulas Th. Interaccin APC-Th
antignica el nmero de RIL-2 declina rpidamente. Las clulas T en repo-
En el paso siguiente de la respuesta inmune la clula Th se une a la APC. so no pueden responder al factor de crecimiento porque carecen del RIL-2
Esta interaccin es mediada por la unin del complejo pptido antignico- (Figura 7).
protena clase 11 sobre la APC y el receptor especfico para antgeno sobre
la clula Th (RCT). Este RCT reconoee al pptido antignico para el cual Ni Ja IL-1 ni la IL-2 son especficas de antgeno y cualquier clula T que
es especfico presentado por una molcula clase 11 del MHC sobre la APC . porte el receptor correspondiente responder consecuentemente al unir el
De esta forma, las clulas Th no responden a antgeno libre ni a protenas ligando. La especificidad de la respuesta viene dada por el requerimiento de
clase II no ocupadas . que se reconozca el antgeno por el RCT para inducir y mantener la expre-
sin del RIL-2 . Este sistema de regulacin permite una amplificacin rpida
La unin de una APC a una clula Th da inicio a una cascada de eventos de la respuesta de clulas Th especficas y hace posible su control cuando
que conducen a la proliferacin y diferenciacin de la clula Th. cesa la estimulacin antignica.
El primer paso es la activacin de la clula Th, que requiere dos seales . La
primera es la unin del complejo pptido antignico-molcula clase 11 al Activacin de clula B. Interaccin Th-B
RCT, lo cual garantiza que slo las clulas Th capaces de reconocer ese
antgeno sean estimuladas. La segunda seal es mediada por la unin de un Mientras que las clulas Th especficas para el antgeno estn proliferando,
polipptido soluble, la interleuquina 1 (IL-1) producida por la APC . La pro- eventos similares conducen a la divisin de clulas B especficas para el
duccin de IL-1 no es especfica, pero dentro de la poblacin de clulas Th antgeno. Los antgenos son procesados por la clula Ben forma muy simi-
slo responden aquellas que estn unidas. a una APC portadora del pptido lar a las APC, con la diferencia de que en la primera este procedimiento es
antignico para el que son especficas. especfico, ya que se intemaliza el antgeno unido al anticuerpo de superficie
que acta como receptor para antgeno en la clula B. Los complejos antigeno-
Protenas clase II: Glicoprotenas de superficie celular codificadas por el CPH, que actan anticuerpo se intcmalizan, se procesan y los pptidos antignicos asociados
como receptores de pptidos. a molculas clase II del MHC aparecen en la superficie de la clula B.
CPH: Complejo principal de histocompatibilidad. En ingls: majar histocompatibility Estos complejos son anlogos a los de la APC, de tal forma que las mismas
complex (MHC). Conjwito de genes los cuales codifican para glicoprotenas de superficie Th que fueron estimuladas a proliferar despus de unirse a las APC, pueden
celular (molculas clase I y clase II) que regulan interacciones entre clulas del sistema ahora interaccionar con la clula B.
inmwie, y otras protenas no superficiales como componentes del sistema complemento
(C2, C4, factor u), el factor de necrosis tumoral (1NF) y linfotoxina. Estos genes son muy Como podr apreciarse, la interaccin Th-B es un factor principal en la
polimrficos y estn presentes en anfibios, pjaros y mamferos. regulacin de la respuesta de anticuerpos .

16
17
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La unin de la clula Th activada a la clula B que porta en su superficie el
complejo fragmento antignico-molcula clase 11 hace que la clula B sinteti-
ce progresivamente receptores para diferentes factores sintetizados por la
u ~.,.'?')' clula Th activada, los llamados BSF (B cell stimulation factor), conocidos
e ~ r-c ""'t'
}- ':' ~\-e ~ ~ actualmente como interleuquinas 4; 5 y 6 (IL-4, IL-5, IL-6) . De acuerdo con

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estos factores los procesos de la respuesta de la clula B pueden clasificarse
en tres etapas : activacin, proliferacin y diferenciacin (Figura 8).
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g cin con otras seales, induce la diferenciacin de la clula B en divisin a
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inmunoglobulinas . El 40 % o ms del total de su sntesis proteica est dedi-
cada a la produccin de anticuerpos . Ellas estn terminalmente diferencia-

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das y viven alrededor de 3-4 das, sobre todo en los rganos linfoides secun-
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inmunoglobulinas, pero retienen anticuerpos en su superficie (lgm) como
receptores especficos para antgeno. Estas clulas permanecen en circula-
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~ Qtca cin y estn informadas (en ingls, primed) para responder a una subse-
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cuente exposicin al antgeno. Los eventos celulares y moleculares como

19
consecuencia de las interacciones de las clulas B memoria con el antge
son similares a los de las clulas B vrgenes (Figura 7).
anticuerpos circulantes (Dresser, 1986), lo que sugiere que existen meca-
nismos para su control.
Diferenciacin de la clula 8, cambio de clase y anticuerpos
de mayor afinidad La respuesta inmune es un proceso complejo altamente regulado. En ese
control intervienen el antgeno, el sistema inmune y los sistemas nervioso y
Dos procesos de carcter gentico acompaan la diferenciacin de la clu endocrino. La interconexin de estos sistemas permite hablar hoy da de un
la B . El primero es la mutacin somtica de las regiones y de las cadenas p sistema inmunoneuroendocrino que participa, a travs de sus interacciones,
y L de Jos anticuerpos funcionales . El segundo es el proceso de cambio en Ja induccin, desarrollo y duracin de las respuestas inmunes.
clase (en ingls, switch).
En la seccin anterior se habl de factores genticos que condicionan la
Las mutaciones somticas ocurren al azar en las regiones V y dan lugar induccin de una respuesta inmune. Ellos codifican para gl icoprotenas de
anticuerpos con afinidades diferentes a la de los anticuerpos producidos por superficie que tienen a su cargo el reconocimiento del antgeno y las
la clula B original. Las clulas con lgm de mayor afinidad son selecciona- interacciones celulares que hacen posible la activacin y diferenciacin de
das preferentemente sobre las que tienen receptores de menor afinidad y la clula B, precursora de las clulas productoras de anticuerpos .
proli~eran debido a que sus anticuerpos de superficie se unen ms
eficientemente al antgeno. Las clulas con receptores de mayor afinidad Esta seccin slo tratar aquellos aspectos de la regulacin no vistos ante-
siguien la misma va de diferenciacin de otras clulas B, dando lugar a riormente y que el experimentador debe tener en cuenta para una inmuniza-
clulas plasmticas y clulas memoria. cin exitosa .

El segundo evento gentico que acompaa la dtvisin y diferenciacin de la Si la respuesta inmune est dirigida por la presencia del antgeno, su des-
clula B es el cambio de clase. Las cadenas P producidas durante los estados truccin catablica por ciertos tipos de macrfagos puede constituir, adems
primarios de estimulacin de la clula B son de la clase . Por recombinacin de la primera lnea de defensa, uno de los ms efectivos controles de la
del ADN cromosomal que codifica el polipptido cadena P, una unidad funcio- respuesta. En consecuencia con esto, el experimentador inyecta el antgeno
nal VDJ se mueve de una regin C a otra; esto hace que la misma regin V se en lugares donde pueda ser fcilmente fagocitado y en una forma que favo-
e
exprese con diferentes regiones y conduce a la produccin de anticuerpos rezca este proceso, por ejemplo, agregado o mezclado el inmungeno con
que son ms eficientes para ciertos propsitos. Por ejemplo, slo algunas cla- adyuvante .
ses de anticuerpos pueden atravesar la placenta, son liberados a las secreciones Sin embargo, est claro desde los primeros das de la Inmunologa que, aun-
mucosas o fijan complemento. Durante la ma~uracin de una respuesta hu- que inyecciones repetidas del inmungeno pueden incrementar los niveles
moral tpica, los anticuerpos lgM, que son caractersticos de la respuesta pri- de anticuerpos, en algunos casos, de manera notable, se alcanza un punto a
maria, son remplazados por anticuerpos IgG. Debido a la maduracin de la partir del cual ninguna cantidad de inmungeno puede conducir a incremen-
afinidad expuesta con anterioridad, las molculas IgG normalmente tienen tos mayores . Esto puede estar controlado por mecanismos como el feed-
mayor afinidad para el antgeno que las de IgM . back del anticuerpo, la supresin celular (Ts) y la tolerancia inmunolgica
~dquirida . Cada uno de ellos puede ser relevante para el desarrollo de
CONTROL DE LA RESPUESTA INMUNE inmunizaciones exitosas.

En la prctica est bien demostrado que, con muy pocas excepciones, las ~e ha demostrado que la inoculacin de anticuerpos especficos previa a la
respuestas inmunes estn limitadas a niveles relativamente bajos de inyeccin del inmungeno inhibe tanto la respuesta primaria como la secun-
daria. No obstante. en ciertas circunstancias, los complt:jos antgeno-anti-
20 cuerpo pueden potenciar la respuesta. Las grandes cantidades de anticuerpo

21
presentes pueden actuar reduciendo la concentracin efectiva del
inrnungeno, acelerando su eliminacin, quiz por competir con los recepto- que tenga lugar la tolerancia o la inmunidad tras la administracin del
res de la clula B dentro de los rganos linfoides . Cualquiera que sea el antgeno depende de un nmero de factores : la dosis, forma del antgeno,
mecanismo, lo cierto es que cuando a un animal que tiene un elevado ttulo ruta de administracin y estado inmunolgico del individuo. Las
de anticuerpos se le da un booster del mismo inmungeno, este casi siem- inmunoglobulinas heterlogas agregadas son usualmente inmungenos
pre resulta inefectivo. Por esto se aconseja tener paciencia y esperar que el potentes, pero son a menudo tolerognicas s1 se inyectan en forma
nivel de anticuerpos haya descendido antes de una nueva inoculacin. lo que monomrica por la ruta i.v.
constituye regla sumarsima de la inmunizacin . 2. Inmadurez del animal. El feto tiene poca o ninguna capacidad para
Los anticuerpos de una clase (IgG) pueden influi1 sobre la produccin de sintetizar sus propios anticuerpos, aunque esta capacidad es rpidamente
anticuerpos de otra clase (lgM) contra el mismo antgeno. En contraste con adquirida en las semanas inmediatas despus del nacimiento; no obstan-
esto, el control feedback del anticuerpo puede estar mediado por anticuerpos te, est claro que el mecanismo inmune del recin nacido es altamente
especficos para determinadas partes de la molcula inmunoglobulnica: por susceptible a la induccin de tolerancia.
ejemplo, a travs de determinantes isotpicos, alotpicos e idiotpicos . En los 3. Tratamiento inmunosupresor La respuesta inmune en los adultos pue-
ltimos aos la hiptesis 'de la red" (trama idiotipo-antiidiotipo) ha enfocado de ser inespecficamente reducida por el tratamiento con radiacin
la ateqcin sobre el ltimo tipo, tantv desde el punto de vista del control de ionizante, drogas, inmunosupresores o sueros antilinfocticos. La combi-
los anticuerpos individuales, como del desarrollo y mantenimiento del reper- nacin de tratamiento supresor e inyeccin de antgeno puede conducir a
torio de clulas B (Dresser, 1986). una tolerancia parcial.

La induccin de tolerancia, que es la anttesis de la produccin de anticuerpos, En l.i Figura 9 estn esquematizados en un modelo bastante simplificado los
debe evitarse. Es importante, por tal motivo, conocer algunas de las condi- f:-icwrcs que participan en el control de la respuesta de anticuerpos y sus
" . ~.1 cc ioncs (Roitt, 1985).
ciones que favorecen una u otra respuesta.
A nivel celular la tolerancia puede deberse a uno o ambos de dos posibles
mecanismos: la eliminacin o inactivacin de clulas 8 o Th con especifici- .\ l..\N IPULACIN DE LAS INTERACCIONES APC-Th-B
dad para los determinantes del antgeno en cuestin y la induccin de una E\ LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
supresin especfica mediada por clulas Ts que actan contra el antgeno o
Las consecuen~ias de las interacciones APC-Th-B explican por qu algu-
posiblemente contra el idiotipo del anticuerpo, controlando la diferenciacin
nos compuestos constituyen buenos inmungenos y otros no.
o la eliminacin de precursores de clulas B.
Para que un compuesto induzca una respuesta primaria y una fuerte respues-
Cualquiera que sea el mecanismo de induccin de tolerancia, resulta nece-
ta secundaria, debe contener un epitopo que pueda unirse al anticuerpo de
sario conocer las circunstancias que pueden favorecerla y que son adversas
superficie celular de uria clula B virgen . Esta unin es un requerimiento
a la produccin de anticuerpos:
absoluto para una respuesta de anticuerpos y determina la especificidad
1. La dosis de antgeno. En individuos adultos la tolerancia puede ser de los anticuerpos resultantes, ya que el sitio de unin para el antgeno
inducida contra antgenos potentes tanto con dosis pequeas repetidas o sobre la Igm es idntico al sitio de combinacin de los anticuerpos
con grandes cantidades (tolerancia de zona baja y de zona alta, respec- secretados . Un animal inmunocompetente puede producir al menos
7
tivamente). En general los tolergenos* son tambin inmungenos . El 10 anticuerpos diferentes con sitios de combinacin para un nmero
similar de antgenos y la mayora de Jos compuestos, aun los ms peque-
*Tolergeno: Sustancia capaz de inducir tolerancia. os, pueden unirse firmemente como mnimo a uno de esos anticuerpos
de superficie .
22
23
tizan en un animal inmunoompetente la cooperacin Th-B, esencial como
ya se vio para la proliferacin y diferenciacin de la clula Ben CP.
1n h i b i e 1o'n d e 1<?
retroallmentac1on I Antgeno Catabo 1is mo En cuanto al repertorio de molculas clase 11 del MHC, aunque es mucho
' menos amplio que el de los receptores de las clulas B y T, ya que en
cualquier animal normal existen aproximadamente 40 protenas clase 11 dis-
tintas, cada una de ellas es capaz de unir un nmero relativamente alto de
pptidos diferentes .

.,
res1on
La no respuesta de anticuerpos a un antgeno TD podra resolverse aten-
diendo a la naturaleza de los factores que impidan interacciones APC-Th-B
adecuadas .

/
,,.
"l.\~
'-----1 Anticuerpo

lnteraccion
1 1. La molcula de inmungeno carece de uno o ms sitios de unin apropia-
dos pqra las molculas clase 11 y el RCT. Frecuentemente esto ocurre con
molculas pequeas que portan buenos epitopos para unir clulas B, pero
son incapaces de inducir una respuesta porque no contienen los determi-
nantes necesarios para estimular la unin con protenas clase 11 y RCT.
. .....;::;
. '0'> - ) idiotpica
Tales molculas son conocidas como haptenos. Para que puedan inducir
-~ ,,.. una buena respuesta de anticuerpos deben ser acoplados a otras molcu-
'/'.7 . Figura 9. Regulacin de la respuesta de anticuerpos.
~ las que, al ser procesadas, provean de sitios adecuados para la unin del
"-' ;J,?(;l T '
~ \..
La segunda propiedad de una molcula que le permite ser un buen inmungeno ~ RCT. Tales molculas son llamadas transportadores o carriers .
es que promueva la comunicacin entre clulas Th y R Para ello debe c 1

disponer al menos de un sitio que pueda ser reconocido simultneamente '


~
-
El animal carece de protenas clase 11 para unir los fragmentos peptdicos
del antgeno. El fallo para inducir una respuesta inmune debido a la au-
por protenas clase 11 del MHC y el RCT, ya que slo un buen sitio de unin ~ sencia de protenas clase 11 apropi~das es raro y es ms comn en ani-
para el RCT por molcula es suficiente para activar todas las clulas B males inbred tales como lineas de ratones, que en animales outbred,
disponibles para el antgeno. Esta segunda condicin impone una tercera y como los conejos. La mayora de los antgenos tienen al menos un frag-
es que el compuesto antignico sea degradable, ya que este sitio debe ser mento que pueda unirse a una protena clase 11, y un fragmento por
portado por un fragmento peptdico. molcula inmunizante es todo lo que se necesita para permitir que todos
El sitio antignico para la unin del RCT no tiene que estar estructuralmente los epitopos sobre el inmungeno sean reconocidos . Esta situacin pue-
relacionado con el epitopo que se une al anticuerpo de superficie de la clula B, de ser superada modificando el antgeno para adicionarle nuevos sitios
pero los dos sitios deben estar sobre la misma molcula o complejo fisico. La para unir molculas clase 11. A menudo puede ser resuelta inmunizando
unin entre ellos puede ser covalente o no covalente, pero s lo suficientemen- una raza o especie animal diferente.
te fuerte como para que permanezcan unidos hasta que el inmungeno entra 3. La tolerancia de clulas T. Debido a que los RCT se generan al azar
en la clula B. durante la diferenciacin de las clulas Ten el ambiente del timo, las
El amplio repertorio de especificidades de clulas T, al igual que el de las . clulas que conducen receptores que reaccionan con compuestos pro-
clulas B, y su amplificacin consecuente a la interaccin APC-Th garan- pios, son destruidas . El resultado de estas eliminaciones,,clonales es la .
..,,....\ i
\',

24 25 /~"'.'
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_.. ,
,.., C
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/
t. Antgeno/Inmungeno
tolerancia a lo propio. La ausencia de tales clones de clulas T hace
que sea dificil levantar anticuerpos contra componentes propios. Las cuando se va a producir anticuerpos lo primero que hay que conocer es de
inmunizaciones con antgenos que estn estrechamente relacionados o qu anticuerpo se trata. Para ello se debe saber contra qu deber reaccio-
imitan componentes propios a menudc fallan para inducir una buena nar, es decir, cul es su especificidad. Por ejemplo, si hay que obtener
respuesta de anticuerpos. Mientras ms difiera el antgeno de los com- anticuerpos anti-IgG humana, los anticuerpos debern reaccionar con ella,
ponentes propios del individuo respondedor, mayor probabilidad existe Por tanto, la lgG humana es el antgeno y a la vez el inmungeno que se
de inducir una buena respuesta . Dos procedimientos pueden emplear- inocular al animal de experimentacin.
se para resolver la tolerancia por clulas T. La solucin ms fcil es _ La inmunogenicidad es la cualidad ms importante que debe tener el antgeno
inmunizar animales de otra espec ie . La segunda es mod ificar y se refiere a su capacidad para inducir una respuesta inmune, en este caso,
estructuralmente el antgeno, crendole nuevos sitios para el reconoci- humoral, de ah el trmino inmungeno. Esta propiedad no slo depende de
.._.)
miento por clulas T. hs caractersticas intrnsecas del inmungeno, como su masa molecular y
4. La tolerancia de clulas B. Si la tolerancia es debida a la carencia de su complejidad estructural, sino del organismo receptor, en particular, de su
clulas especficas para el antgeno de inters no hay, por el momento, constitucin gentica.
artimaa para resolver esta deficiencia. Un antgeno podra no ser inmunognico porque es tolerado, debido a su
exposicin previa y apropiada a los mecanismos inmunesJ como se vio ante-
FACfORESQUEDEBENTENERSEENCUENTA riormente, o por otras causas (Dresser, 1986). _..,
EN LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS POLICLONALES En general, las clulas, las protenas agregadas y las molculas de alta masa
molecular son buenos inmungenos; mientras que las molculas solubles,
Estos factores se han ordenacio a manera de algoritmo para desarrollar la
mo~omricas y(o) de baja masa molecular son inmungenos dbiles o nu
ta rea de producir AcP:
los. La inmunopotenciacin de tales antgenos puede lograrse por diferentes
1. Antgeno/lnmungeno mtodos. como se ver ms adelante.
- Purificacin
- Potenciacin Aislamiento y purificacin del antgeno
2. Animal de experimentacin Los antgenos que se utilizan en la inmunizacin de animales son muy diver-
- Seleccin sos y tienen diferentes orgenes. Pueden ser molculas; como las protenas
- Mantenimiento y cuidados del suero sanguneo y las toxinas microbianas; componentes celulares, como
protenas flagelares y lipopolisacridos de las paredes bacterianas ;
3. Programa de inmunizacin
macromolculas y virus o clulas, como bacterias y linfocitos. En estos lti-
- Dosis e intervalo entre ellas
mos casos se trata de un mosaico de antgenos .
- Va y modo de administracin del Ag
- Desangrados La preparacin de algunos inmungenos puede ser muy simple, tal como
la obtencin y estandarizacin de glbulos rojos sanguneos . En otros ca-
4. Titulacin de anticuerpos
sos puede ser muy compleja, por ejemplo, si se debe purificar una hom10-
5. Purificacin de anticuerpos na peptdica que se encuentra a niveles de trazas en um macla biolgica
6. Conservacin de anticuerpos compleja . En ocasiones el inmungeno, despus de purificado, debe ser .
UES BIBLIOTECA DE MEDICINA
27
26
1111111111111111111111
jNVENT ARIO: 1100800~
racin del inmungeno que se emplear en las inmunizaciones y en la titula-
fragmentado o t rans fo rmado, Jo que involucra nuevas etapas de purifica- ci cfe~ticuerpos .
c in .
Aplicacin de los preparados antignicos
El grado de pureza de un inmungeno no est necesariamente relacionado
con la especificidad del anticuerpo producido, ya que trazas de impurezas Los preparados antignicos tienen mltiples aplicaciones, entre las que se
muy inmunognicas pueden debilitar la respuesta al inmungeno principal . encuentran:
Por otra parte, la facilidad con que los anticuerpos se producen contra impu- - La inmunizacin de animales para la obtencin de anticuerpos policlonales
rezas altamente inmunognicas puede ser til para su remocin . La pureza y en la primera etapa de la produccin de anticuerpos monoclonales.
del inmungeno es menos importante en la inmunizacin con vista a la pro-
- La titulacin y valoracin de anticuerpos .
duccin de AcM, ya que cada clon de linfocitos produce un tipo particular
de anticuerpos. - La purificacin de anticuerpos por cromatografa de afinidad.
La expresin pureza bioqumica debe ser bien analizada . Una protena - El d iagnstico de enfermedades infecciosas en el hombre y los animales,
separada por PAG E y teida con azul Coomassie, que muestra una banda a travs de la deteccin de anticuerpos en el suero de los pacientes, as
nica, sometida subsecuentemente a la tincin con plata ( 100 veces ms como en estudios epidemiolgicos y en el seguimiento de enfermedades
sensible que la primera) puede revelar muchas bandas adicionales . Es posi- o vacunaciones.
ble utilizar en las inoculaciones bandas proteicas cortadas directamente de - La vacunacin de personas y animales, ya que las vacunas son prepara-
geles de poliacrilamida, aun cuando contengan dodecil sulfato de sodio (SOS) . dos antignicos inocuos.
Los inrnunoprecipitados obtenidos en geles de agarosa constituyen tambin - El estudio inmunoqumico de los antgenos para lo que se requiere prepa-
excelentes inmungenos. Se cortan los fragmentos del gel que contienen los rados de gran pureza.
inmunoprecipitados, se lavan en salina fisiolgica y se inyectan al animal.
Estos mtodos son una alternativa cuando los procedimientos de purifica- Antgenos bacterianos (Margni, 1983)
cin son difciles.
Cuando una bacteria se inocula a un animal se forma ms de un tipo de
as preparaciones,.._inmunognicasdeben mantenerse libres de contaminacin anticuerpo, y esto se debe a que un microorganismo es un mosaico antignico
microbiana, ya que tales- contaminantes pueden daauil anima~r en el que se encuentran antg'enos diferentes, cada uno con capacidad inmuno-
des_n~tur~i~n o cambio~tructurales i!n el ant~no . En los casos que gnica. Estos antgenos pueden ser protenas, frecuentemente situadas en
sea posible deben esterilizarse y(o) cons~jlrse con un preservativo inocuo

--- - - ----
emplear aziaa sooica (NaN), pu~s_u1t.Yeneno muy potente.
--..
--
al animal, como el timerosarilla concentracin final de _Q,_Ol %. Nunca se
la membrana celular y el espacio periplasmtico; carbohidratos que consti-
tuyen, sobre todo, antgenos de superficie; y en algunos casos, como el de
las enterobacterias, complejos glicofosfolipdicos que son verdaderas
En la purificacin de antgenos proteicos, as ~modelos ant~se endotoxinas y forman parte de la pared celular~No todos los constituyentes
e~s__co.!locid~ puri~_cacin de protenas : precipitacin
antignicos de una bacteria tienen la misma capacidad inmunognica; hay
coqal~s in_orgnicas o solventes orgnicos, cromatografa de diferentes
algunos que originan anticuerpos con suma facilidad, mientras que otros
tipos, ultrafiltracin y ultracentrifugacin, entre otros . slo estimulan cai,:itidades pequesimas . Las bacterias, por su tamao y
complejidad, son inmungenos potentes .
El aislamiento y purificacipjle antge11os conlleva su valoracin cualitativa
A los antgenos bacterianos ubicados en el soma se les denomina antgenos O;
y-crr___@fitativa. La electroforesis en gele.s de poliacnlamida, la focalizacin
a los de la envoltura o capsulares, antgenos K1 y a los flagelares, antgenos H. .
isoelctrica y la inmunoelectroforesis en el primer caso, y los mtodos de
Lowry, Coomassie y espectrofotomtricos en el segundo. permiten la valo- 29
. 28
Algunos microorganismos producen y liberan al medio sustancias con mar- organismo, y puede hallarse en otras Salmonellas e, incluso, en otras
cado poder toxignico para los animales y el hombre. Estas sustancias, co- enterobacterias no pertenecientes a este gnero.
nocidas como exotoxinas, son antgenos eficaces a pequeas dosis y pue-
den ser neutralizados totalmente por los anticuerpos que originan . Como f Los antgenos O y H fueron descritos en un inicio como termoestable y
muchas bacterias son productoras de enzimas, la inoculacin de un caldo de termolbil, respectivamente. El antgeno O es un complejo formado por un
cultivo a un animal puede originar anticuerpos para las exotoxinas e incluso polisacrido, una protena y un fosfolpido . Su especificidad inmunoqurnica
para tales enzimas . est determinada por el oligosacrido. Forma parte de la pared celular de la
cnterobacteria y es la cnterotoxina de Salmonella . Es resistente a tempera-
El hecho de que un microorganismo sea un complejo antignico capaz de
turas de l 00 C durante tiempos prolongados y no se destruye con alcohol ni
inducir anticuerpos para sus diferentes componentes, hace que en ocasio-
.;on cidos diluidos. Los estudios qumicos han demostrado que el antgeno
nes no se interpreten correctamente las reacciones serolgicas, sobre todo,
Hes una protena fibrosa, del tipo de la queratina. La protena flagelar puri-
las reacciones cruzadas que ocurren cuando se enfrentan sueros inmunes
ficada, llamada flagelina, de masa molecular 41 000 Da, no contiene fsforo
con antgenos heterlogos . Estas reacciones pueden ocurrir entre
microorganismos que posean cierto grado de parentesco, pero se observan
y s trazas de lpidos y carbohidratos. Es lbil a temperaturas mayores de 60 C
y al tratamiento con alcohol y .cidos . El antgeno Vi es de naturaleza
a veces en especies de ubicaciones taxonmicas totalmente diferentes .
glicolipdica y difiere qumicamente del antgeno O. Cuando est presente
El grupo de las enterobacterias incluye un gran nmero de especies de ba- recubre totalmente al antgeno somtico, impidiendo la aglutinacin con el
cilos cortos, gramnegativos, no esporulados, cuyo habitat natural es el tracto antisuero correspondiente. 6
intestinal del hombre y otros animales. Algunas bacterias de este grupo son
patgenos para el hombre y causan varios tipos de enfermedades Preparacin de antgeno O de Sa/monella -~
gastrointestinales. Otras, como la Escherichia co/i, son microorganismos
saprofiticos en el tracto intestinal, aunque pueden causar enfermedades en Mate rial
el tracto genitourinario o en el respiratorio.
- Cepa de Salmonella - Tubos con caldo agar
La diferenciacin de las enterobacterias no es fcil, y su clasificacin se
- Frasco Roux - Tubo estril vaco
basa en caractersticas morfolgicas, reacciones bioqumicas y propiedades
antignicas. - Pipetas - Tubos de centrfuga
De acuerdo con los criterios de clasificacin, las bacterias entricas fonnan - Frascos para envasar - Asa
grupos dentro de los cuales se encuentra uno de gran importancia mdica - Bao de agua - Nefelmetro de Me Farland
que incluye a especies del gnero Sa/mone/la. Entre los microorganismos
de este gnero se encuentran los agentes causales de la fiebre tifoidea, la - Salina fisiolgica (SF)
paratifoidea, gastroenteritis y varios tipos de infecciones septicmicas .
M todo
Las diferentes especies del gnero Salmonella estn antignican1ente rela-
cionadas y este es el criterio bsico para su clasificacin. Por las similitudes 1. Sembrar la cepa de Salmonella en tubos con agar nutriente e incubar a
en el antgeno somtico se clasifican en grupos, y las especies dentro de un 37 C durante 18-24 horas .
mismo grupo se diferencian por su antgeno flagelar. 2. Cosechar el crecimiento obtenido agregando 2 mL de solucin salina
En la Salmonella typhi se ha identificado, adems, un antgeno superficial estril y agitando vigorosamente hasta obtener una suspensin homog-
termolbil, denominado Vi. No es un componente exclusivo de este micro- nea .

30 31
\nticuerpos como antgenos (Jaske and Capra, 1986)
3. Sembrar boca a boca utilizando dicha suspensin en frasco de Kollc o
Roux . Incubar 24-48 horas a 37 '( {.,os anticuerpos son molculas glicoproteicas complejas (inmunoglobulinas,
Figura 1O) que pueden actuar como inmungenos y antgenos. A partir de
4. Agregar a cada frasco Roux 10 mL de SF estril. Agitar y colectar la ellos es posible obtener antisueros que permjten distinguir serolgicamente
suspensin en tubos estriles . Repetir este paso. variantes de estas molculas. Estos antisueros han conducido a la definicin
5. Colocar los tubos en bao de agua a ebullicin durante 120 minutos . de al menos tres tipos de detenninantes antignicos en las inmunoglobulinas,
que se emplean para clasificar los anticuerpos en isotipos, alotipos e idiotipos
6. Enfriar y centrifugar a 3 000 rpm durante 20 minutos. Desechar . el (Figura 11). (Ver Tabla l.)
sobrenadante.
7. Resuspender el sedimento bacteriano en SF con fonnaldehdo al 0,3 %
Antgeno
hasta igualar su turbidez con el tubo# 3 del nefelmetro de Me Farland .
8. Hacer la prueba de esterilidad de la suspensin e incubar los tubos a
37 C durante 48 horas. Observar si hay crecimjento.
9. Envasar la suspensin en un frasco o mpula estril, tapar aspticamcnte
con tapn de goma y retapa de aluminio. Etiquetear y guardar en refrige-
racin. ~
Fab

Extraccin de un antgeno soluble de Escherichia coli


Materia/

- Cepa de Escherichia coli.


- Los mismos de la preparacin de antgeno de Salmonel/a .

Mtodo
1. Sembrar la cepa de E. coli en agar nutriente.
2. Recoger el crecimiento en SF procurando que quede bien concentrado.
3. Centrifugar a 3 000 rpm durante 20 minuto!' para lavar las clulas . Rcpe- 1 Fe
tir tres veces.
4. Colocar el tubo en bao de agua a 100 C durante 60 minutos .
5. Centrifugar a 12 000 rpm durante l hora.
6. Recoger el sobrenadante, que es do.nde est el antgeno, y envasarlo
aspticamente. Guardarlo en fro. Figura 1O. Estructura de la molcula de lgG .

33
32
~ll~U'%1/ 5' ~
Genes de regiones consto ntes

3'
~
~~ ,,. '.. ;,;;~:: 5' ~ 3'

~<~:<
. (o\'<-_.,,.;...
Genes de regiones constantes

,....,,/
}.
~ (
u Figura 12. Genes de regiones constantes. Arriba: ratn. Abajo: hwnano.
,J:JJ
~'~'li\?
.,< .y
1sot (pica Alotpica 1dio t i'p1co
Para hacer antisueros especficos contra un isotipo determinado es nece-
Figura 11 . Variantes de las imnunoglobuli.nas.
sario inmunizar animales de diferentes especies (xenoantisuero), ya que
Los isotipos por lo general definen determinantes de la regin constante (C) los individuos normales de la misma especie no reconocen esos determi-
que distinguen los productos de cada uno de los genes de las regiones de e nantes como extraos. Se debe inmunizar preferentemente con la cadena
las cadenas pesadas (P) y ligeras (L) . Se han distinguido cinco clases de que porta el isotipo de inters y(o) absorber con posterioridad el antisuero
cadenas pesadas que se identifican con los smbolos griegos : alpha (a), resultante para garantizar su especificidad. Las similitudes que existen
gamma (y), my () , psilon (E) y delta(&) . Dos de estas clases tienen varios entre las regiones e de las inmunoglobulinas de diferentes especies ani-
miembros relacionados y se dividen: y en cuatro subclases en el humano (y 1, males trae como consecuencia reactividades cruzadas de los anticuerpos
y2, y3, y4) y en el ratn ( yl , y2a, y2b, y3 ); y a en dos subclases en el
anti -isotpicos . De acuerdo con el uso que se les vaya a dar a estos
humano (al y a2) . Las molculas de inmunoglobulina se nombran de acuerdo
anticuerpos a veces es necesario absorberlos frente a inmunoglobulinas
con las cadenas P que poseen, por ejemplo, si tienen cadenas se denomi-
nan molculas IgM . Cada una de las di ferentes regiones C de las cadenas P heterlogas.
o isotipos (entindase clases y subclases) est representada por un gen El alotipo se refiere a determinantes codificados por un alelo de un gen
separado en el genoma haploide (Figur(l 12). Atendiendo slo al aspecto inmunoglobulinico dado. Mientris que los isotipos estn presentes en todos
gentico se podra hablar nicamente de clases de inrnunoglobulinas, aun- los miembros de una especie, los alotipos lo estn slo en algunos de ellos .
que desde el punto de vista serolgico es posible referirse a clases y subclases . Por consiguiente, no todos los individuos poseen todos los alotipos y el.
.Para una descripcin completa de una molcula de anticuerpo la cadena antisuero contra estos determinantes puede fabricarse dentro de la especie,
ligera tipo kappa (K) o lambda p. ) debe especificarse, por ejemplo, IgM (K) . inyectando protenas de un alotipo (aloantgeno) en un individuo de la misma
Tanto en el hombre como en el ratn hay un solo gen para la regin C de K especie cuyas protenas son de un alotipo diferente. Xenoantisueros con
en el genoma haploide, pero las cadenas A. estn codificadas por cualquiera especificidad para un alotipo pueden tambin producirse.
de varios genes de regin C, existiendo por tanto en varias formas isotpieas.
Los genes para las cadenas P, K. A. estn en cromosomas separados . En el Los determinantes idiotipicos estn localizados en las regiones variables (V)
hombre los genes P estn en el cromosoma 14, los genes K sobre el de la molcula anticuerpo. Estos determinantes definen la individualidad o
cromosoma 2 y los genes A. sobre el cromosoma 22 . Todos los genes C de exclusividad de cada inmunoglobulina. El antisuero anti-idiotipo se obtiene
las cadenas P y L se expresan normalmente, de ah que todos los isotipos inmunizando un animal con una poblacin homognea de molculas de
estn presentes en el suero de un individuo normal.
35
34
inmunoglobulinas, tales como una protena de mi e loma* o anticuerpos mono-
e
clonales . Los anticuerpos que se generan son absorbidos exhaustivamente o
Vl
con inmunoglobulina normal hasta que el antisuero es especfico slo para la ro
e
protena inmunizante. En este caso pueden emplearse animales de la misma .! Col
:::i

especie o line:a gentica y animales de otra especie a la que pertenece el e


Col ~1 ..o
o
Co
~ rs o
anticuerpo inmunizante. Tambin pueden obtenerse anticuerpos monoclonales
~ = :>< :>< e
.
anti-idiotpicos mediante la biotecnologa del hibridoma. ** = ~ ~
:-a
:::i
E

- .~ .S:
e E
Potenciacin de inmungenos "
~
Q.
u -o
"'
Q)
e

- ro
Q)

:::i
La potenciacin de inmungenos puede lograrse por diferentes mc;todos.
que se basan fundamentalmente en:
~
~
.so B
-o
00
Q)
....
~
-
u
o
E
=
C.I
.:::
Col
"O .S:! ~ ~~ "'
~ ~
- La manipulacin del mecanismo de cooperacin T-B (efecto carrier ). e~ :>< :>< e e

j
Q) Q)

- El empleo de adyuvante. B 3 :g~ rs


'<11
-
Q)
~
...J
>
:5
La potenciacin puede lograrse tambin por agregacin de las molcu-
las de antgeno, utilizando reactivos de unin cruzada, como el glutaralde-
hdo, o el calor. Tambin pueden ser absorbidos sobre clulas como eritro-
=
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Esta metodologa se emplea cuando se desea obtener anticuerpos contra


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moleculares menores de l O kDa, y consiste en la conjugacin de esta mol-
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de replicarse indefinidamente de la clula de mielorna. 8. . ~ 0 0 .S
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Conjugacin con BSA empleando carbodiimida
El fenmeno que se producira sera el siguiente: el car ricr , despus del Materia/
procesamiento del conjugado hapteno-transportador por la APC, aporta los
sitios para el reconocimiento de la clu la Th por su RCT en el conte:-..10 de - Hapteno purificado - Soluciones de NaOH y HCL 1 mol/L
~~~
las molculas MHC propias. Esta clula, una vez activada, ayuda a la clula B - N-hidroxisucci.nimida (NHS) - Pipetas -'6~'>.
(cooperacin Th-B) que reconoci el determinante haptnico, como ya se '"~< ~, 1' .. "

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- Carbodiimida - Membrana de dilisis g


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vio anteriormente, producin9ose la respuesta de anticuerpos contra el
hapteno (Mitchison, 197 l ). - BSA - Agitador magntico (
.'
Tamb in se producen anticuerpos contra el carrier proteico. al ser reco- \.;<':-.
nocidos sus epitopos en el complejo nativo por clulas B con lgm especi-
ficas . Estos anticuerpos pueden ser irrelevantes, pero en ocasiones deben
ser eliminados, absorbiendo el antisuero frente a l carn er o ligando el
Mtodo
l . Mezclar 30 mg de hapteno en l 00 L del disolvente con l O mg de
N-hidroxisuccinimida disuelto en 1 mL de agua destilada y con 32, 7 mg
//1)

- - fjS,\\\1 \

hapteno o un conjugado hapteno-transportador diferente a una matriz de de carbodiimida disuelta en 1 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 5,5 .
afinidad.
2. Aadir gota a gota una solucin que contenga 60 mg de BSA en 8 mL de
agua con agitacin suave, ajustando el pH todo el tiempo a 5,5 .
Conjugacin con hemocianina empleando glutaraldehdo (GA)
3. Dejar en agitacin 4 horas a TA y guardar toda la noche en fro .
Ma terial
4 . Dializar contra SF exhaustivamente para eliminar los excesos de reac-
- Inmungeno - Frasco mbar tivos .
- Hemocianina - Pipetas 5 Dispensar en alcuotas y liofilizar. Conservar en refrigeracin.
- Glutaraldehdo - Membrana de dilisis
1nmunopotenciacin. Empleo de adyuvante
- Salina fisiolgica - Agitador magntico
El adyuvante es una sustancia o preparado que facilita inespecficamente la
M todo respuesta inmune a un antgeno . Con su empleo se ahorra tiempo e
inmungeno y se obtiene un mayor nivel de anticuerpos especficos. Es
l . Mezclar 5 mg de la protena disuelta en 1 mL de SF con 2 rng de hemo-
cianina en 1 mL de SF. usualmente administrado con el inmungeno, pero puede darse antes o des-
pus de l. Generalmente todos los i.nmungenos solubles y los conjugados
.2 . Echarle a la mezcla 100 L de glutaraldehdo al 2,5 % gota a gota con proteina-hapteno son mezclados con adyuvante. En el caso de i.nmungenos
agitacin suave en frasco mbar. celulares puede obviarse su empleo.J-os adyuvantes se utilizan en la inmu-
nizacin de animales para obtener antisueros y en las vacunas de uso huma-
3. Dejar en reposo en la oscu ridad a temperatu ra ambiente (TA) durante
4 horas. no y animal. Los ms empleados son el completo (ACF) e incompleto (AIF)
de Freund, el alumbre y el gel de hidrxido de aluminio.
4. Dializar contra salina fisiolgica o PBS para eliminar el exceso de
glutaraldehdo. El AIF es una emulsin de agua en aceite de parafina con un estabilizador. El
ACF contiene adems micobacterias muertas, las que inducen fonnacin de
5. Conservar el conjugado en alcuotas congeladas o liofilizadas .
39
38
granuloma en el sitio de inyeccin. Ambos adyuvantes, al ser mezclados con Otras lneas de investigacin prometen el empleo en animales y quiz evert-
el antgeno en solucin o suspensin acuosa rinden una emulsin muy espesa tualmcnte en el hombre, de sustancias naturales con preferencia por dife-
que al ser inyectada se deposita en el sitio de inoculacin. El AIF, por carecer rentes compartimientos celulares, por ejemplo, lipopolisacridos (LPS), que
de micobacterias, es menos efectivo que el ACF. Actualmente se ha tratado posi blemente afectan de modo directo las clula$ B o en fonna indirecta
de remplazar por un producto ms refinado: el adyuvante 65 . Las emulsiones potenciando el efecto cooperativo de las clulas Th . Lcntinan, un 1-6 glucano
de antgeno con adyuvantes de Freund no pueden administrarse por va i.v. y natural originado por el basidiomiceto lentinos edades , se piensa estimula
son inaceptables para uso humano por su tendencia a desarrollar abscesos clulas Th . Saponin parece ser otra sustancia que puede convertirse en un
estriles y desrdenes autoinmunes. Se recomienda emplear el ACF slo una adyuvante de eleccin. tanto mezclado con el antgeno como incorporado a
vez en la primera inoculacin y continuar con el AfF. liposomas . Los liposomas, hechos de vesculas de membranas artificiales,
El alumbre es una mezcla de sulfato de aluminio y potasio. Las protenas pueden ser preparados para que contengan antgenos solubles en agua y, en
precipitan con el aluminio, pennaneciendo insolubles. El antgeno absorbido ,irtud de su tamao y propiedades superficiales, ser eficientemente captu -
sobre alumbre con Bordetel/a pertussis (Bp) es una poderosa mezcla rados por los macrfagos. La incorporacin del lipido A (c:xtrado d~~ LPS) a
adyuvante cuando se inyecta i.p . en ratas y ratones . El gel de hidrxido de membra.ryas artificiales puede incrementar grandemente la efi cacia de los
aluminio est fonnado aproximadamente por un 2 % de Al(OH) en una liposoms (Dresser, 1986).
3
forma gelatinosa muy hidratada que absorbe fuertemente los antgenos El modo de accin de los ad)U\antes ha sido objeto de numerosos estudios
proteicos . Convenientemente diluidas, las preparaciones antignicas con y es poco probable que todos acten de la misma foll}a . Veamos un. resu-
alumbre o gel de hidrxido de ah.~minio pueden administrarse por va i.v. sin men de algunos de los modos de accin que se proponen:
provocar trombosis fatales . Por su baja toxicidad los adyuvantes de alumi-
nio se emplean en humanos. 1. El antgeno libre nom1almente se difunde muy rpido desde los tejidos
locales que rodean el sitio de inyeccin, y una importante funcin de
El estudio de la naturaleza de los adyuvantes, comenzando con un anlisis algunos adyu,antes es contrarrestar esto, provocando un reservorio o
de las fracciones activas del mycobacterium, ha conducido a la disponibili- depsito del antgeno de larga vida. Los adyuvantes ms corrientes de
dad de adyuvantes sintticos. El muramil dipptido (MDP), cuando se adi- este tipo son los compuestos de aluminio y el AIF. El efecto depsito que
ciona al AIF, eleva las respuestas inmunes a niveles muy cercanos a los se logra cuando un antgeno es liberado lentamente de una emulsin de
obtenidos con ACF. El desarrollo de adyuvantes bien definidos y caracteri- agua en aceite en un adyuvante tipo Freund, puede imitar la liberacin
zados que no posean efectos colaterales indeseados tiene amplias perspec- continua de antigeno durante la etapa temprana de una infeccin natural.
tivas . Sin embargo, los estudios realizados para alcanzar ttulos altos de
2. Se sabe que algunos adyuvantes. principalmente el ACF, es un potente
anticuerpos han demostrado que ningn adyuvante ha podido exceder la
estimulador de clulas T, By reticuloendoteliales. Entre estos ad}uvantes
eficacia del ACF. Algunos pueden ser tan buenos o ms convenientes (alum-
tenemos, adems, el levamisol , el !entinan, el sulfato de dextrano y los
bre con Bp) por presentar menos efectos colaterales en los individuos in-
yectados (Dresser, 1986). lipopolisacridos bacterianos . Algunos ad)uvantes pueden actuar como
estimuladores diferencialt:s o seales que inducen a los precursores de
las clulas B a entrar en una va que conduce a la inmunidad ms que a
Granuloma: Acumulacin compacta de macrfagos formada en el sitio de inoculacin. Los la tolerancia, por lo cual se crea una situacin que convierte al antgeno
granulomas que rodean al antgeno se digieren con dificultad. Ellos se forman cuando las soluble en inmunognico. En el caso de estas clulas tambin se ha ob-
clulas T reconocen el antgeno en Ja superficie del macrfago. Las clulas T activadas
segregan linfoquinas que atraen macrfagos adi.cionales y los activan. Cuando los granuloma<; servado un efecto estimulante del ad)uvante que facilita su proliferacin
crecen, pueden desarrollar necrosis. cuando ellas han contactado con el antgeno. Algunos adyuvantes pue~

40 41
den alterar la relacin 111/Ts en una pol)lacin dada, incrementando o
disminuyendo la respuesta a antgenos TO. respuesta de IgM contra el mismo antgeno. La exposicin superficial pue-
3. Los adyuvantes pueden provocar el secuestro temporal de las clulas de ser llevada a cabo por la unin covalente del antgeno a uno de los
linfoides circulantes (>80 % de clulas T) en los ndulos linfticos que fosfolipidos usados en la preparacin del liposoma.
drenan el sitio de inyeccin de la mezcla ad)'1JVante-inmungeno, y se Adems de servir como transportador a los haptenos, los liposomas pueden
incrementa la probabilidad de una interaccin fa vorable entre cl ulas B, actuar com adyuvante para haptenos y antgenos proteicos . Ellos son cap-
T, APC y el inmungeno. A este fenmeno se le denomina 'trampa de turados con rapidez por los macrfagos, por lo que la respuesta a detenni-
linfocitos". Esto puede estar relacionado con la formacin de gran u lomas. nados antgenos puede ser mejorada notablemente cuando se administran
El grado de respuesta humoral en un sistema experimental mostr estar asociados a estas estructuras.
directan1ente relacionado con la presencia de granulomas como respuesta
Una de las ventajas de los liposomas como adyuvante es su biodegradabilidad.
a la micobacteria en ACF (Dresser, 1986).
Al ser ingeridos por los macrfagos son consecuentemente digeridos por
4. Los estudios realizados han demostrado que virtualmente todos los sus fosfolipasas lisosomales . Otra ventaja importante de los liposomas es
adyuvantes estimulan los macrfagos. Los macrfagos activados se cree que pueden estar constituidos por fosfolpi dos (por ejemplo. fosfatidilcolina)
que actan mejorando la respuesta inmune por un incremento en la can- que no son txicos a las dosis empleadas y que adems no son inmunognicos
tidad de antgeno de superficie y en la eficiencia de su presentacin a los
por s mismos.
linfocitos . El macrfago activado segrega factores solubles estimulantes
La adyuvanticidad de los liposomas puede ser mejorada mediante la adi-
que amplifican la proliferacin de los linfocitos .
cin de otros compuestos adyuvantes como el lipopolisacrido (LPS) o el
l pido A derivado del LPS o sustancias inmunoestimulantes como
Liposomas como carrier y adyuvante
interleuquinas.
Los liposomas son vesculas lipdicas sintticas, que consisten de bicapas
Las ventajas que presentan los liposomas como transportador y adyuvante
concntricas fosfolipdicas separadas por compartimientos acuosos . Ellos
los convierten en un candidato para la preparacin de vacunas . Las posibi-
se forman cuando los fosfolpidos se enfrentan al agua. Las molculas de
lidades que ofrecen estas estructuras son muchas y es por eso que constitu-
fosfolpido se organizan preferentemente en una conformacin en la que
yen un tema de investigacin muy actual .
sus cadenas hidrofbicas de cidos grasos previenen el cvntacto con el
agua, quedando los grupos hidrofilicos en las superficies (externa e interna)
P reparacin de liposomas mult ilaminares (MLV, mu/ti/aminar vesicle)
de la bicapa en contacto con el medio acuoso.
por d ispersin simple y po r congelacin-descongelacin (FAT -MLV,
Los antgenos pueden ser asociados con los liposomas en diferentes fo r- free ze and thawy-M LV)
mas. Ellos pueden ser atrapados en las vesculas disolvindolos en ia solucin
acuosa usada para la preparacin de los liposomas . Con este procedimiento Ma terial
simple los antgenos quedan atrapados en los compartimientos acuosos y
- Factor de crecimiento epidm1ico (EGF, epidermic growing fac tor)
expuestos en la superficie externa. La relacin antgeno encapsulado y
antgeno expuesto puede variar con la estructura del antgeno, por ejemplo, - Dipalmitoilfosfutidikolina (DPPC)
presencia de grupos hidrfobos . Existen evidencias experimentales que
- Colesterol
muestran que los antgenos encapsulados en liposomas tienden a estimular
respuesta de IgG, mientras que la exposicin superficial tiende a estimular - Neogticolpido

42 PBSpH 7,2 ,./ :r. .. '-: ~


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Preparacin de la mezcla inmungeno-adyuvante de Freund
Nitrgeno lquido
Ma terial
- Vortex
- lnmungeno en SF estril - Jeringuillas de 2 mL
- Contador gamma
- ACF o AIF - Agujas
- Retroevaporador
- Viales o bulbos pequeos - Guantes
- Bao de ultrasonido

Mtodo M todo
1. Diluir convenientemente el inmungeno en SF estril de acuerdo con la
l . Aadir a un tubo cnico la DPPC y el colesterol en las cantidades reque- cantidad y el volumen que se suministrar al animal. Es conveniente
ridas . Estas cantidades dependen de las concentraciones de ambos lpidos
preparar un volumen un poco mayor de mezcla.
y de la relacin DPPC :colesterol que se desea evaluar. Por ejemplo,
l DPPC: 1,4 colesterol para l O mg totales de lpidos . 2. Tomr porciones iguales de la fase acuosa (SF) que contiene el
inmungeno y de la fase oleosa (ACF o AIF) . En algunas circunstancias
2. Rotoevaporar hasta lograr una pelcula fina y desecar hasta completar
puede emplearse un volumen ms pequeo de la fase acuosa.
un tiempo de 40 minutos.
3. Mezclar los dos volmenes Puede hacerse inyectando vigorosamente
3. Aadir 500 L de la mezcla EGF no marcado-EGF marcado preparada
con una jeringuilla de 2 mL y una aguja de calibre fino (0,5 mL) peque-
convenientemente.
as porciones de la solucin de inmungeno al adyuvante. La fase acuo-
4 . Dejar reposar durante 30 :ninutos y despus agitar vigorosamente en sa que aparece en el fondo del vial es reinyectada de nuevo en el aceite.
vortex hasta resuspender la pelcula. Repetir esta operacin hasta que haya adicionado todo el inmungeno.
5. Sonicar los liposomas 2 minutos y dejarlos eposar l minuto. Repetir este Continuar la emulsifcacin con una aguja ms larga, ya que con el au-
ciclo cuatro veces ms. mento de la dispersin se incrementa la viscosidad de la mezcla .

6. Pasar la suspensin obtenida a un vial Eppendorf con tapa de seguridad Cuando se preparan volmenes pequeos puede utilizarse el mtodo de
y comprobar que el tubo qued bien tapado. las dos jeringuillas interconectadas por un tramo de manguera fina (Figu-
ra 13).
7. Congelar la suspensin en nitrgeno lquido y descongelarla a 40 C.
Repetir este ciclo cuatro veces ms . Las jeringuillas deben llenarse un poco menos de la mitad de su volumen:
una con el inmungeno y la otra con el adyuvante. Primeramente se
8. Para purificar los liposomas, centrifugarlos a 15 000 rpm durante impulsa el inmungeno dentro del aceite y viceversa, de manera que el
30 minutos. Transferir el sobrenadante (SNl) a otro vial. fluido expulsado de una jeringuilla entre ~n la otra, repitindose hasta que
9. Resuspender el sedimento en 500 L de PBS y repetir la centrifugacin. se alcance la viscosidad adecuaca.
Transferir el segundo sobrenadante (SN2) al mismo vial con SN 1. Re- 4. Para comprobar si la mezcla est lista para ser inyectada se deja caer
petir el lavado con PBS dos veces ms y mezclar los cuatro sobrena- una gota en agua fra . La gota debe mantenerse ntegra. Si se dispersa,
dantes .
la emulsin es de aceite en agua y no puede esperarse de ella una buena
10. Contar la radioactividad del sedimento final y del vial con los cuatro accin adyuvante.
sobrenadantes .
45
44

i
Preparacin de un antgeno proteico con alumbre

Material
a) - Beaker de 25 o 50 mL
- Protena purificada (inmungeno)
- Solucin de bicarbonato de sodio l mol/L - Tubo de centrfuga
- Solucin de alumbre 0,2 mol/L - Pipetas
- Solucin SF -Timerosal

m:--~~--~~) ~l l - Centrfuga - Espectrofotmetro


b) -
M todo
1. MezcJar 1O mL de la solucin proteica que contiene 10-20 mg/mL con
4,5 mL de la solucin de bicarbonato de sodio l mol/L .
2. Adicionarle lentamente con agitacin 1O mL de la solucin de alumbre
e)~ l.~ ,<---~~-l - 0,2 mol/L .
3. Dejar en reposo 15 minutos a TA.
4. Centrifugar la suspensin durante 1Ominutos a 3 000 g .
Figura 13. Jeringuillas intcrcooectadas para mez.clar irunungeno y ACF/AIF.
5. Lavar el sedimento tres veces con SF.
5. Una vez comprobada la calidad de la emulsin se puede proceder a su 6. Conservar en SF con timerosal a una concentracin final del 0,01 % en fro.
inoculacin, preferiblemente por las vas i.m., s.c. o i.d.
Observacin Obse rvacin

Toda la manipulacin debe realiz.arse con guantes. Si la persona se pincha La diferencia entre la lectura a 280 nm de la solucin proteica original y la del
debe retirrsele inmediatamente todo vestigio de emulsin. El inmungeno sobrenadante despus de la adsorcin, permite hacer un estimado de la pro-
no debe exceder la concentracin 75 mg/mL para obtener emulsiones esta- tena absorbida. Con este dato se calcula el volumen de SF en que deber
bles. El suero total debe diluirse al menos 50 veces. Siempre el inmungeno suspenderse el sedimento de acuerdo con la concentracin que se deba pre-
debe aadirse al ACF/AIF y nunca al revs. Las emulsiones de Freund parar.
inyectadas i.m. o i.d. pueden causar irritacin y hasta malestar al animal.
Cuando esto sucede, el animal debe ser eliminado. La inyeccin de Adsorcin de un antgeno proteico al gd de Al(OH) 3
emulsiones de Freund en los cojines de las patas es un modo satisfactorio de Ma terial
estimular ndulos linfoides locales (popliteales), pero a menudo causa abs-
- Protena purificada (inmungeno) - Beaker
cesos y molestias en el animal .
- Gel de hidrxico de aluminio - Pipetas
46
47
- Salina fisiolgica 2. Mezclar bien en un tubo0,4 mLde la protena en SF (10-20mg)con 0,4 mL
- Centrfuga del sedimento celular.
- Espectrofotmetro
J Aadir gota a gota con agitacin 0,5 mL de GA al 2,5 % en PBS fro,
Mtodo protegiendo la mezcla de la luz.
4. Incubarla con movimiento en la oscuridad durante 1-2 horas a TA.
1. Mezclar el irunungeno y el gel de Al(OH)3 en la proporcin 70-100 g
de gel por cada microgramo del inmungeno proteico. Agitar la mezcla 5. Lavar las clulas exhaustivamente para eliminar el exceso de
unos minutos . glutaraldehdo.
2. Incubarla 1 hora a 37 C o toda la noche en fro . 6. r Resuspender en PBS o SF de acuerdo con la concentracin requerida y
3. Inyectarla al animal preferiblemente por va i.m. o s.c . aadir timerosal hasta una concentracin final del 0,01 %. Se pueden
conservar en fro por espacio de 40 das.
Observacin
Observacin
Para preparar la mezcla se debe conoc<'.r la concentracin del gel de Al(OH).,
para calcular el volumen que se tomar de acuerdo con la qosis de inmungeno Emplear eritrocitos de la misma especie animal que utilizar en la inmuniza-
a administrar. El grado de adsorcin puede calcularse, como en el caso cin.
anterior, con las lecturas a 280 nm de la solucin proteica original y el
sobrenadante resultante de la adsorcin. Recomendacin

Adsorcin de un antgeno proteico a eritrocitos con GA Inyectar al ratn 0,5 mL de una suspensin al 3 % y al conejo 1 rnL de una
suspensin al 5 %, en ambos casos i.p.
La inmunizacin con antgenos proteicos adsorbidos sobre clulas o partcu-
las sintticas como la bentonita (Alp 3 4Si0~ H~O) y el ltex de 2. Animal de experimentacin
poliestireno, es utilizada con bastante frecuc:ncia. Esta \ariante puede resul-
tar til con inmungenos de alta y baja masa molecular. Para seleccionar el animal de experimentacin se deben tener en cuenta
cuatro aspectos : la especie animal a que pertenece el inmungeno, el volu-
Material
men de suero que se necesta, la cantidad de antgeno de que se dispone y si
- Irunungeno proteico se producirn ~ticuerpos monoclonales...
- PBS
- Sangre con anticoagulante De acuerdo con el carcter ajeno que debe poseer el inmungeno para
-Timerosal
ser reconocido por el sistema inmune del receptor, si se quieren obtener
- Glutaraldehdo (GA) para M.E. - Tubos de centrfuga anticuerpos contra la albmina o la IgG de ratn no se pueden utilizar
- Salina fisiolgica ratones, pero s conejos o carneros. En la prctica, las inmunizaciones
- Centrfuga
Mtodo deben efectuarse en animales que estn lo ms alejados posible en la
evolucin del animal al que pertenece el inmungeno. En el caso de pro-
tenas de mamferos altamente conservadas y, por tanto, dbilmente
l. Lavar los eritrocitos con abundante SF tres veces . Centrifugarlos
inmunognicas, una alternativa es la inmunizacin en pollos . Sin embargo,
10 minutos 1 2 500 rpm en los dos primeros favados y a 3 500 rpm en el
ltimo para que las clulas sedimenten en forma compacta. cuando se desea obtener anticuerpos contra alotipos o idiotipos

48 49
inmunoglobulnicos s es conveniente utilizar animales de la misma especie \.A..
a la que pertenece el inmungeno. -o
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Un amplio nmero de especies de vertebrados se utilizan para la produccin
de antisueros. Los ms empleados a nivel de laboratorio son conejos, rato- =-
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animales rinde aproximadamente 25 mL de suero en el conejO, 100-200 L (.)
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~n y 1-~ mL en ~ters y curie!~. ~do se requieren Q
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~hivos, cabaJos~rdo1._y asnos. (Yer._Tubla 11.)
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por las orejas. y se les debe evitar el "estrs", manipulndolos con cuidado y
afecto. Este animal, en condiciones de vida y de manjpulacin correctas,
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puede dar hasta 500 mL de suero durante el rgimen de inmunizacin . La
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La produccin de anticuerpos en el ratn puede incrementarse notabl emen- ~
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te induciendo en l la formacin de ascitis. Este procedimiento permite "'
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obtener en un animal volmtmes de 1OmL de ascitis con ttulos casi siempre
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nos que reciben de forma pasiva a travs d~I calostro o la leche, pueden
interferir los procesos de inmunizacin activa. Los animales de especies
diferentes alcanzan la maduracin inmune a tiempos distintos despus del
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las 6-8 semanas y los conejos a los 3-4 meses despl!s del nacimiento,' co- ~ :a ~
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rrespondindole a estos ltimos un peso aproximado de 3-4 kg . "' fil, E,
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*Ascitis: Acumulacin de lquido en la cavidad del peritoneo. < .,,


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por sus caractersticas genticas e individuales los animales se comportan
La constitucin gentica del animal es un factor determinante en la respues-
como respondedores buenos, malos o nulos . Esto hace necesario, para ase-
ta inmune. Como ya se vio anteriormente, la habilidad para responder a un
gurar un resultado satisfactorio, adems de seleccionar el ms conveniente,
inrnungeno est bajo el control de loci que forman parte del MHC . Existen
otras fuentes de variacin, ya que en animales con la misma constitucin disponer de un grupo de animales y evitar e11 Io posible trabajar con uno
gentica y sometidos a un proceso de inmunizacin similar, se han observa- solo. ~ el caso de los conejos, dos animales d~~n utilizarse como mnimo;
do considerables diferencias en la respuesta de anticuerpos (Dresser, 1986). y en el de los ~temes y dems roedores, de tres a seis . Cada uno de los
animales debe evaluarse individualmente.
Finalment~ e! estado general de_salud del aninaj_g~ va a ser utilii.ado para
producir el antisuero puede tener un significativo efecto sob re los iveles de Todc el personal que trabaja de forma regular con animales (cuidadores,
anticuerpos. Una mala nutricin, aniiales enfermos, malas condiciones hi- tcnicos, i'VeSt1gaCiOres, estudiantes) debe estar vacunado contra algunas
ginicas y otras situaciones de "estrs", pueden verse reflejadas en res- enfermedades . En el caso del conejo y del ratn, contra la leptospirosis.
puestas pobres de anticu~s . Otra medida de bioproteccin es el empleo de guantes y boquera durante
toda la manipulac~n .
Los animales sometidos a un proceso de inmunizacin deben recibir una
dieta refori.ada y s~entada-oon -oomplejo B-y cido ascrbi~ . Si es Para inyectar y desangrar animales se re_suiere habilidad, paciencia y entre-
posble se les debe dar alimento verde. Deben ser vigilados durante todo el namiento. En la mayora de los pases estos procedimientos y el cuidado y
experimento Pl'3: detectar cualquer anomala como falta de-J!Ctito, diarrea mantenimiento de los animales de laboratorio estn regulados por leyes .
o malestar. En estos ~os debe suspenderse el trabajo con el animal y Estas regulaciones tienen el propsito de asegurar el .bi_enestar de los anima-
consu ltar al mdico veterinario. les, que el operador est entrenado y que la manipulacin est justificada. El
uso de los animalese st gobernado adems por consideraciones ticas y es
Los animales que van a ser desangrados deben mantenerse en ayuno, slo
objeto, en estos momentos, de intenso debate por las organizaciones que
con agua, 12 horas antes de la operacin, para evitar la obtencin de sueros
tienen a su cargo la proteccin de los mismos (Harlow and Lane, 1988) . .t
< lipmicos. El sangrado debe realizarse en un cuarto relativamente caliente
para tener un buen flujo de sangre.
En el conejo, la sangre se colecta de la~6~ margi~ o d,<! la arteria central
*
3. Programa de inmunizacin
Las formas en que el experimentador puede manipular la respuesta a un
~e ~ En el primer~ se puede o tener de una vez hasta 50 mL y en
el segundo,_hasta 100 mL . La puncin carg393 generalme11te se utiliza antgeno determinado pueden dividirse en dos grandes categoras : la modifi-
p a - 1 y debe ser practicada por una persomi experta. cacin del antgeno, de la que ya se trat en el punto 1; y las condiciones de
C,2!! !~ayuga de u~ bomba de vaco puede ~esangrarse en su to~lidad el inocu lacin del antgeno que incluyen al animal de experimentacin (punto 2),
~mal (aproximadamente 250 mL de sangre). Si la manipulacin ha sido la dosis y ruta de administracin del inmungeno, el nmero de inyecciones
correcta y la sangre no fluye es muy probable ~ue el animal est 'estresado". y el intervalo entre ellas. De esto trataremos eri este epgrafe.
En ese csoTs recomeaable "iio insisti~ y dejar al animal en "iibiente El programa de inmunizacin recoge el plan de actividades que se desarrolla
tranquilo hasta el da siguiente. con vista a la produccin de los anticuerpos, y est relacionado fundamen-
''
El sangrado no siempre es necesario para obtener anticuerpos . La gallina talmente con el trabajo que se realiza en el animal de experimentacin, in-
provee grandes cantidades de anticuerpos en sus huevos . El contenido de cluyendo la titulacin de anticuerpos en el suero sanguneo.
IgY (contrapartida de la IgG de los mamferos) de una yema( 100 mg!) es Es necesario que el experimentador anote en su cuaderno los siguientes
equivalente a ms de 15 mL de suero; adems de lo fcil que resulta la
datos : tipo de animal, raza, sexo, edad, peso, estado de salud, nmero de la
colecta de los huevos en comparacin con la de la sangre de los animales.

52 53
chapilla que lo identifica y de la jaula; as como cada una de las incidencias La cantidad mnima d.e inrnungeno capaz de inducir una respuesta depen-
del trabajo: fecha de las inoculaciones y desangrados, tipo de antgeno y der de la naturaleza del antgeno y del hospedero. Para los conejos, la dosis
modo de preparacin, vol umen, dosis y va de administ racin, tipo de mnima est en el rango de l O g por inyeccin, aunque 100 g por inyec-
adyuvante, va y modo de sangramiento, afectaciones que se presenten en cin se recomienda frecuentemente . Si no se requiere respuesta de
el animal (enfermedad, prdida de peso, ''estrs"), resultado de las titulaciones anticuerpos detectable despus de la inoculacin primaria, las dosis iniciales
y cualquier otro dato que pueda resultar de inters. pueden ser ~ueas . Las inyecciones secundarias y los boosters finales
es posible darlas con cantidades similares a las de la inyeccin primaria.
Dosis de l inmungeno Estas recomendaciones son en cierta forma contradictorias. Tradicional-
Un aspecto de primer orden en el programa de irununizacin es la dosis , ya mente se ha propuesto que las inoculaciones primarias sean dos o tres veces
que cantidades muy pequeas o grandes del inmungeno es posible que mayores que los boosters. Sin embargo, la mayora de estas recomendacio-
resulten improductivag Las dosis muy pequeas pueden ser insuficientes nes son vlidas para inrnungenos potentes. Para inrnungenos desconoci-
para estimular el mecanismo de la irununidad. Las muy altas son factibles dos una o dos inyecciones con una dosis baja para sensibilizar al animal
de inducir tolerancia. Por ejemplo, 5 mg de IgG de ratn inyectada a un seguidas por un booster mayor, han resultado efectivas para producir
curie! puede hacerlo tolerante a esta protena de fonna tal que si se le anticuerpos. Si no hay informacin acerca de la inrnunogcnicidad de un
administra al da siguiente una segunda dosis inmunognica de la IgG murina, antgeno, el mejor consejo es inyectarlo y ver los resultados .
el animal no responder. La mayora de las preparaciones antignicas estn contaminadas con com-
Dos criterios diferentes deben ser considerados para determinar la dosis ponentes menores. La Figura 14 ilustra una dosis-respuesta a una prepa-
apropiada: primero, la dosis ptima de inmungeno para lograr la respuesta racin antignica, la cual contiene un 1 % de un contaminante de similar
ms efectiva; y, segundo, la dosis mnima para inducir la produccin de un mmunogenicidad que el componente principal. Puede observarse que, a
antisuero policlonal til. Se ha demostrado que existe una relacin sigmoidal muy bajas dosis, la respuesta est enteramente d irigida al componente
entre la respuesta y la dosis administrada, existiendo una dosis ptima que principal; y, a dosis mayores, la respuesta a l componente menor puede
se corresponde con una respuesta mxuna. Es posible suponer que con esa exceder la del principal. La economa del inrnungeno por lo visto refuerza
dosis el inmungeno pueda alcanzar las partes apropiadas del organismo. la especificidad para el componente antignico principal. Sin embargo, a
La mayora de los materiales que se inyectan deben ser catabolizados antes veces se requiere que el sistema inmune del animal descubra los compo-
de alcanzar las clulas apropiadas. La eficiencia de este proceso depender nentes menores, por ejemplo, cuando se desea producir un antisuero hu-
de varios factores del husped, la ruta de inyeccin, el uso de adyuvante y la mano total (a-SHT), es decir, un antisuero que contenga anticuerpos contra
naturaleza intrnseca del antgeno. As, la dosis efectiva puede tener poca la mayora de los componentes del suero sanguneo. En este caso resulta
relacin con la dosis administrada. La detenninacin de la dosis ptima de necesaria la inmunizacin repetida con grandes dosis de la mezcla de
inmungeno no se realiza rutinariamente, por lo que en la prctica la dosis inmungenos .
tiene un cierto carcter emprico. Para los conejos un antgeno proteico Otro aspecto relacionado con la dosis es la afinidad de los anticuerpos.
mezclado con adyuvante es recomendable administrarlo en dosis de 0,5-1 mg Siskind ( 1969) demostr que la afinidad de los anticuerpos sintetizados en
en cada inmunizacin. Para los ratones puede ser reducida a 50- l 00 g . una respuesta decae cuando la dosis de inmungeno se incrementa. A bajas
Una regla general bastante aceptable para determinar la cantidad de concentraciones solamente las clulas B con receptores de afinidad eleva-
inmungeno que se necesita para producir una respuesta fuerte en ratn es da pueden unir antgeno suficiente para ser estimuladas. Como ya vimos, los
utilizar dosis l 00 veces menores que las empleadas en conejo.
receptores inmunoglobulnicos del linfocito B son una muestra precisa de las

54 55
molculas de anticuerpo que esa clula y sus descendientes directos sinteti- TABLA 111. Comparacin entre una dosis nica de inmungeno
zarn, de ah que el reconocimiento por receptores de afinidad elevada con- y la misma dosis dividida en 4
duce a una respuesta de anticuerpos de alta afinidad.
Respuesta de CFA"' ( 10')
en ratones CBA

Eritrocitos de camero i.p. lgM lgG

Respuesta ContomiMnte 4 lo clulas el da o 15 6

~ 1'10' clulas los das O: 2: 4; 6 77


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/'~' '>. .
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CFA: Clulas fonnadoras de anticuerpos.
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Ests valores corresponden a la media aritmtica del niunero de CFA entre los 5 y 21 das,
.,,,".')\, .:,.....-
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~ empleando cuatro animales en cada conteo.
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Loo C de inmunoeno principal .f Vas de administracin del inmungeno
La seleccin de la via de inyeccin debe tener en cuenta: el volumen a
Figura 14. Curva dosis-respuesta correspondiente a un inmungeno y su contaminante.
inyectar, el tampn y otros componentes que se administrarn con el
inmungeno y la velocidad con que este deber ser liberado a los linfticos
Para que el reconocimiento del inmungeno tenga lugar, se requiere una o a la circulacin sangunea.
concentracin adecuada del antgeno que se mantenga durante un tiempo
suficiente. El secuestro del inmungeno en sitios irrelevantes para las clu- En conejos, los volmenes grandes de inyeccin normalmente se adminis-
las de la inmunidad y su ruptura catablica son ejemplos de mecanismos tran por va s.c. en mltiples sitios. En ratones estos slo pueden darse por
naturales que tienden a reducir la concentracin efectiva del inmungeno. va i.p. Se debe tener en cuenta que los volmenes grandes pueden causarle
La Tabla III muestra cmo una dosis de antgeno, aparentemente demasia- dolor al animal, de ah que deban evitarse. Si se utilizan adyuvantes de Freund,
do pequea para estimular una respuesta. secundaria, puede ser mu y el inmungeno no debe inyectarse i.v. Si se desea una liberacin lenta del
inmunognica simplemente dividiendo la dosis y distribuyendo las inyeccio- inmungeno, las inyecciones deben hacerse i.m. o i.d. Para liberacin inme-
nes entre viarios das. Mantener' la concentracin del inmungeno en un diata se usa la via i.v.
determinado umbral durante largo tiempo es la base de la accin de los El mtodo de Vaitukaitis, utilizado por muchos colegas, usa inyecciones ml-
adyuvantes de depsito, ya mencionados aqu, as como del xito de los tiples i.d. de muy pequeos volmenes de ACF que contienen 1-10 g del
protocolos de inmunizacin con inyecciones repetidas a intervalos cortos de inmungeno en el lomo del animal. La ventaja de este procedimiento es la
pequeas dosis de antgeno. formacin de una costra sobre el granuloma-absceso en el sitio de la inyec-
cin, que es seguida de la externalizacin de la mezcla aceitosa y la cura
Cuando se trabaja con inmungenos .celulares comnmente se utilizan dosis
en el orden de 104-10 6 clulas. eventual de la lesin. Este procedimiento reduce la posibilidad de poliartritis
y otros efectos colaterales de los adyuvantes de Freund.

56 57
A continuacin se presenta un resumen de las principales vas utilizadas en Cojines de las patas
la inmuniz.acin de animales: con AC F prcxiuce inflamacin severa, ulceracin y necrosis. Se emplea
cuando es absolutamente necesaria. Otros adyuvantes no causan reaccio-
Vfa intramuscular
nes tan severas, pero es preferible inocular una sola pata del animal.
Es la ruta de preferencia cuando se utiliz.an adyuvantes de depsito. Permi-
te un rpido acceso a la circulacin sangunea y linftica. pero en ausencia Boosters e intervalo entre las dosis
de adyuvante los inmungenos solubles se diluyen y se pierden, por lo que Se debe esperar un tiempo antes de reintrcxiucir antgeno en un animal sen-
resultan poco efectivos . Es una buena regla cuando no se dispone de pro- sibilizado (en ingls, primed). Un mnimo de 2 o 3 semanas es recomenda-
gramas de inmuniz.acin ya probados ensayar primero inyecciones i.m. y ble, pero este intervalo puede ser mayor. Conejos y ratones permanecen
-si el animal no responde- utiliz.ar la s.c. o la i.p. sensibilizados hasta 1 ao despus de recibir la primera inyeccin.

Vfa subcutdnea Los intervalos entre las inoculaciones secundaria, terciaria y subsecuentes
pueden variar, pero usualmente deben demorarse hasta que el nivel de
El inmungeno se asimila lentamente. Es til para boosters porque se mini- anticuerpos circulantes descienda para prevenir la rpida desaparicin del
miz.a la posibilidad de choque anafiltico. Se recomienda cuando se em- inmungeno inyectado (efecto feedback del anticuerpo) . Tener paciencia
plea adyuvante. es ms importante que una nueva inyeccin. En conejos las inoculaciones
se dan normalmente entre 4-6 semanas . En ratones los boosters deben
Va intradrmica
espaciarse al mertos 21 das .
Provee un rpido acceso a los linfticos y puede ser til cuando se emplean
irunungenos caros, ya que se inoculan volmenes muy pequeos. Se utiliz.a Desangrados
con adyuvante o sin l. Cuando se emplea ACF se forma una lcera en Despus de una inoculacin de inmungeno las muestras de suero permiten
2-3 das. El conocido mtcxio de Vaitukaitis usa esta va. monitorear la respuesta de anticuerpos. A menudo se hace un primer san-
grado antes de comenz.ar las inmuniz.aciones para disponer de un control
Va intravenosa negativo en las titulaciones . Aunque pueden colectarse muestras de suero
Es la ruta preferencial para inmungenos celulares y adsorbidos sobre alum- despus de la inyeccin primaria ellas no contienen, por lo general,
bre, aunque en este caso se aconseja junto con una inoculacin s.c. La anticuerpos tiles, ya que estos usualmente poseen afinidades bajas .
respuesta es rpida pero no sostenida. Tiene el riesgo de reacciones Las muestras de suero deben tomarse 7-14 das despus de una inocula-
anafilcticas. Nunca se emplea con adyuvantes de Freund. Es la va por cin . Este tiempo corresponde, por Jo comn, con el pico de ttulo de
excelencia para inducir tolerancia. anticuerpos para la mayora de las rutas de administracin.
Vfa intraperitoneal En conejos estos sangrados se hacen normalmente de la vena marginal y en
ratones, de la vena del rabo. Estos sitios se utilizan porque son de fcil
Se utiliz.a fundamentalmente en ratones por su fcil ejecucin.
accesibilidad y no poseen muchas terminales nerviosas . En los conejos pue-
den colectarse 2-3 mL de sangre (o ms) y en los ratones, 200-400 L,
cantidades que resultan suficientes para los ensayos de anticuerpo.
Choque anafilctico: Reaccin generaliz.ada ysevera, que puede ser mortal, en un individuo Si el antisuero tiene la calidad requerida, el animal debe ser desangrado lo
sensibilizado. ms pronto posible y tcxio lo ms que se pueda, ya que el antisuero va .

58 59
cambiando de un da para otro. Despus de un desangrado grande el animal
deber descansar durante un tiempo antes de ser inoculado de nuevo . En 5. Introducir la aguja con el bisel hacia arriba en la vena. Verificar su canar
lizacin (entrada de una pequea cantidad de sangre a la jeringuilla y(o)
conejos los boosters pueden espaciarse 6 semanas y cantidades de 50 mL
no resistencia al desplazamiento hacia delante del mbolo) . Introducir el
de sangre o mayores es posible colectar 1O das despus de cada booster.
inmungeno lentamepte hasta completar la dosis inrnunizante. Presionar
Otra alternati va puede ser el desangrado terminal que conlleva la muerte
del animal. con un algodn seco y estril el sitio de inoculacin. unos segundos antes
y despus de extraer la aguja. para evitar prdida de inmungeno.
A manera de conclusin podemos decir que el programa de inmunizacin es
6. Asegurarse que no sale ya la sangre para retirar el algodn. De lo con-
dinmico y se establece en la prctica de acuerdo con el comportamiento
trario, mantener la presin sobre la vena.
del animal de experimentacin, reflejado en las titulaciones de los sueros, de
ah su carcter emprico. 7. Limpiar bien con agua corriente la oreja del animal para eliminar todo el
xilol.
' Utilizacin de las v as de inoculacin en el conejo
l!. Retirar el animal del cepo y observarlo durante 15 minutos. El cuidador
Materia/ de animales debe conocer que el conejo est bajo un rgimen de inmuni-
zacin, debiendo suplementar su dieta y avisar de inmediato sobre cual-
- Guantes quirrgicos - Tijera quier afectacin que detecte en el mismo.
- Inmungeno -Xilol
Observacin
- Conejo - Etanol al 70 %
- Cepo Recordar que al colocar y retirar el conejo del cepo debe agarrarse por la
- Algodn estril
piel del lomo y jams por las orejas . Si debe intentar de nuevo la inyeccin,
- Jeringuillas y agujas estriles hacerse un poco ms arriba del pinchazo original o cambiar de oreja.

Va intravenosa (o endovenosa). Vena marginal de la oreja Va intramuscular


Mtodo Mra do
1. Ponerse los guantes y mantenerlos puestos durante toda la manipulacin. 1. Colocarse los guantes.
2. Colocar el animal en el cepo. Desinfectar la zona de inoculacin con 2. El ayudante debe inmovilizar el animal tomndole con una mano las ore-
etanol al 70 %. Estimular la circulacin sangunea pasando un algodn jas y con la otra la piel del lomo, y presionndolo contra la mesa.
humedecido en xilol por encima y por debajo de la vena marginal y( o)
3. Comprobar que el mbolo de la jeringuilla se desplace con fluidez y lle-
dando unos golpecitos sobre ella con el dedo.
narla con el inmungeno; eliminar el aire residual y enrasar hasta el
3. Comprobar que el mbolo de la jeringuilla se desplace con fluidez y lle- volumen apropiado. Emplear aguja nmero 18 (o 20) de Y2 pulgada de
narla con el inmungeno; eliminar el aire residual y enrasar hasta el vo- longitud.
lumen apropiado. Emplear aguja nmero 21 y de lf. pulgada de longitud. 4. El inoculador debe agarrar y estirar una pata trasera del animal, desin-
4. Agarrar la oreja de modo que descarise sobre los dedos ndice, del medio fectando su parte interna (donde hay mayor masa muscular) con un
y anular. Sostenerla firme con el pulgar. algodn embebido en alcohol.

60
61
7. Si se emplea ACF o AIF se debe lavar inmediatamente la jeringuilla y la .
aguja, primero con alcohol y despus con detergente, hasta que queden
5. Introducir la aguja perpendiculannente a la piel con el bisel hacia arriba
bien limpias.
Administrar la dosis inmuniz.ante y presionar con un algodn seco y estril
el sitio de inoculacin unos segundos antes y despus de extraer la aguja . Observacin
6. Observar el animal durante 15 minutos . El cuidador de animales debe
La inoculacin s.c. puede efectuarse tambin en la zona a\'.ilar de las patas,
conocer que el conejo est bajo un rgimen de inmunizacin, debiendo
pudiendo esta forma resultar molesta para el animal.
suplementar su dieta y avisar cualquier afectacin que observe en el
conejo. No debe alarmarse por la inmovilidad del animal durante las pri-
meras 24 horas despus de la inyeccin.
Vio intradrmica (dentro de la piel). Mtodo de Vaitukaitis, 1972

7. Si emplea ACF o AIF debe lavar inmediatamente la jeringuilla y la aguja, M todo


primero con alcohol y despus con detergente, hasta que queden bien 1 Colocarse los guantes.
limpias.
2. Eliminar el pelo de la zona de inoculacin (lomo del animal cerca de las
patas delanteras) por depilacin o mediante tijera o mquina de pelar.
Va subcutnea
3 lnmoviliz.ar el animal como en el caso de la inoculacin s.c.
Mtodo
4. Comprobar que el mbolo de la jeringuilla se desplace con fluidez y enra-
1. Colocarse los guantes. sar con el volumen adecuado. Emplear jeringuillas de tuberculina y agu-
2. El ayudante debe inmovilizar el animal tomndole con una mano las ore- jas finas (nmero 26 o 27) de Y2 pulgada de longitud.
jas y con la otra las patas traseras (por las articulaciones), estirndolas, y 5. Desinfectar la zona. Levantar la piel del sitio de inoculacin con los de-
presionndolo contra la mesa. dos pulgar e ndice. Introducir la aguja con el bisel hacia arriba en la zona
3. Eliminar el pelo del lomo del anin1al cerca de las patas delanteras con media del pliegue (dentro de la piel), manteniendo todo el tiempo y aun
tijera o mquina de pelar. despus de cada inoculacin, la presin en la base de la aguja. Adminis-
trar en cada inyeccin volmenes pequeos de 50-100 L , debiendo for-
4. Comprobar que el mbolo de la jeringuilla se desplace con fluidez y lle- marse una pequea roncha (habn). Mantener la aguja dentro de la piel
narla con el inmungeno; eliminar el aire residual y enrasar hasta el vo- unos segundos, para evitar la prdida de inmungeno . Repetir en mlti-
lumen apropiado. Emplear aguja nmero 18 (o 20) de 3/4 o l pulgada de ples sitios convenientemente alejados, hasta completar la dosis total.
longitud.
6. Observar el animal durante 15 minutos. Poner en conocimiento del cui-
5. Desinfectar la zona con un algodn embebido en alcohol. Levantar la dador de animales que el conejo est bajo un rgimen de inmunizacin.
piel del sitio de inoculacin con los dedos pulgar e ndice. Introducir la 7. Si se emplea ACF o AIF lavar inmediatamente la jeringuilla y la aguja,
aguja con el bisel hacia arriba por la zona inferior del pliegue hasta que la hasta que queden bien limpias.
punta de la aguja se mueva libremente. Presionar con los dedos pulgar e
ndice la piel que rod~ la base de la aguja y administrar el inmungeno. Observacin
Presionar con un algodn seco y estril el sitio de inoculacin unos se-
gundos antes y despus de extraer la aguja. La formacin del habn indica que el inmungeno qued dentro de la piel.
De lo contrario, la inoculacin fue subcutnea. Debe tenerse mucho cmdado
6. Observar el animal durante 15 minutos. Poner en conocimiento del cui-
dador de animales que el conejo est bajo un rgimen de inmunizacin . 63
62
cuando el animal vuelva a ser manipulado, debido a las lesiones que apar1
cern en su piel. A continuacin se explica la preparacin y aplicacin de 1 Vio intraperitonea/
crema depilatoria. Mtodo
l . Colocarse los guantes.
Depilacin
2. El ayudante debe agarrar al animal por las articulaciones de las patas
Material traseras y por la piel del lomo, y colocarlo con la cabeza hacia abajo para
Frmula I Frmula JI que los intestinos se desplacen y quede libre la cavidad abdominal.

Sulfuro de bario 6g Sulfuro de Na o K 4 g 3. Comprobar que el mbolo de la jeringuilla se desplace con fluidez y lle-
xido de zinc 6g Hidrxido de Ca 4g narla con el inmungeno. Emplear aguja nmero 18 (o 20) de% pulgada
Almidn comercial 12 g Glicina l mL de longitud .
Agua corriente hasta Kaoln 32 g 4. Limpiar la zona abdominal entre las patas traseras con un algodn embe-
consistencia de pasta Agua corriente hasta bido en alcohol. Introducir la aguja perpendicularmente (la aguja debe
consistencia de pasta moverse con libertad) y administrar la dosis en la cavidad peritoneal.
Retirar la aguja.

Frmula /JI 5. Vigilar el animal durante 15 minutos y comunicar al cuidador de animales


que el conejo est bajo un rgimen de inmunizacin.
Sulfuro de Na o K 90 g
xido de zinc 1Og 6. Si emple ACF o AIF proceder en seguida a la limpieza de la jeringuilla
Harina de trigo 4g y la aguja.
Maicena 3g
Petrolato lquido o Sangrado por la vena marginal del conejo .-
cualquier grasa liquida 1 cucharada Materia/
Agua corriente hasta 100 mL
- Guantes quirrgicos - Alcohol al 70 %
Mtodo - Conejo -Xilol
1. Eliminar pelo de la zona a depilar con tijera o mquina de pelar (lo ms - Cepo - Petrolato
que se pueda). -Tijera - Tubo de centrfuga
2. Con guantes de goma aplicar suavemente la pasta a "contrapelo". - SF estril - Algodn estril
3. Dejar actuar por 5 minutos y eliminar con agua tibia. No friccionar! - Bistur - Gasa estril

Observacin Mtodo
1. Colocarse los guantes.
La depilacin debe hacerse l o 2 ho:as antes de las inyecciones.
2. Poner el conejo en el cepo. Eliminar el pelo sobre la ven marginal con
tijera y desinfectar el lado posterior y el borde de la oreja con alcohol.
64
65
3. Estimular la circulacin sangunea pasando por encima y por debajo de
la vena marginal un algodn humedecido en xilol. Se pueden dar, ade- - Cepo -Xilol
ms, algunos golpes sobre la vena. Inmediatamente untar petrolato en la
- Tijera - Tubo de centrfuga
zona de la vena marginal hasta formar una fina capa con vista a prevenir
la coagulacin e impedir que la sangre se riegue por la oreja. - Jennguilla y aguja estriles - Algodn estril
4. Agarrar firmemente la oreja de modo que descanse sobre los dedos Mtodo
ndice, del medio y anular, y sostenerla con el pulgar
1. Ponerse los guantes .
5. Con la punta del bistur hacer un pequeo corte diagonal o incisin (no
muy severos) sobre la vena marginal, e inmediatamente colocar debajo 2. Colocar el animal en el cepo. Si es necesario, eliminar el pelo sobre la
de ella el tubo de centrfuga humedecido en SF. Comprimir la base de la arteria central con la tijera. Desinfectar la parte posterior de la oreja con
oreja para prevenir el retomo venoso. En los primeros momentos el flujo alcohol.
de sangre puede ser pobre, por lo que se esperarn unos segundos. Re- 3. Estimuar la circulacin sangunea pasando por encima y por debajo de
tirar los cogulos que se formen con un pedazo de gasa estril . la arteria un algodn humedecido en xilol . Se pueden dar, adems, unos
6. Terminada la recoleccin, colocM un algodn sobre el corte y apretar la golpecitos sobre la vena.
vena hasta que cese la salida de sangre. Si no se detuviera. fijar el algo- 4. Agarrar firmemente la oreja de modo que descanse sobre los dedos
dn con esparadrapo y buscar al veterinario. indice, del medio y anular, y sostenerla con el pulgar.
7. Lavar con agua abundante la oreja para eliminar todo el xilol y retirar el 5. Verificar si el mbolo de la jeringuilla se desplaza con fluidez y humede-
animal del cepo. cerla en SF estril. Emplear aguja nmero 21 (o 20) de Y. pulgada de
8. Colocar la sangre a 37 C. Ver obtencin del suero. longitud.
6 . Introducir la aguja en la arteria central con el bisel hacia arriba y el
Observacin mbolo en el tope. Desplazarlo lentamente hasta colectar el volumen
Si lo que se desea es titular anticuerpos, una muestra pequea de sang re requerido de sangre. Presionar la arteria con un algodn estril unos
(1-2 mL) es suficiente. Si el flujo no se hace regular, se puede aplicar nue- segundos antes y despus de extraer la aguja.
vamente xilol lejos de la incisin, ya que este causa hemlisis . Una nueva 7. Quitarle la aguja a la jeringuilla y verter la sangre por la pared del tubo
incisin debe hacerse ms arriba de la original o en la otra oreja. Dejar caer de centrfuga humedecido en SF estril.
la sangre sobre la pared del tubo para prevenir la hemlisis . Con este proce-
dimiento se puede colectar hasta 50 mL de sangre. Recordar que el animal 8. Retirar el algodn cuando ya no salga sangre. Si no se contuviera, man-
debe mantenerse 12 horas antes del sangrado slo con agua. tener el algodn con esparadrapo y buscar al veterinario.
9 . Lavar con abundante agua corriente la oreja para eliminar el xilol y
Sangrado del conejo por la arteria central de la oreja retirar el animal del cepo. Darle agua y comida abundante.
Material 10. Poner la sangre a 37 C. Ver obtencin del suero.
- Guantes - SF estril Observacin
- Conejo - Alcohol al 70 % El sangrado puede tambin realizarse insertando la aguja dentro de la ar-
66 teria y recolectando la sangre directamente en el recipiente. Un nuevo

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intento de introducir Ja aguja debe hacerse por debajo del pinchazo original <:.J

o en Ja otra oreja. Por esta va puede colectarse hasta 100 mL de sangre, Obtencin de plasma y clulas san2uineas
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aunque debe comenzarse por una cantidad menor, por ejemplo, 40 mL . El El plasma es el lquido procedente de la sangre no coagulada, despus aeE~-:
intervalo entre las extracciones debe ser de al menos 1 mes . Recordar rar las clulas. Su aspecto y composicin es p(cticamente similar al suero, a
que el animal debe mantenerse 12 horas antes del sangrado alimentndo- diferencia de que este no contiene el fibringen': Aunque para la mayora de los
se slo de agua.
proccd.imientos inmunolgicos se emplea el suero, puede ser conveniente en
Obtencin del suero SAnguineo ocasiones utilizar el plasma, por ejemplo, cuando se van a realizar adems ensa-
yos con las clulas. Otras veces se necesita obtener las clulas sanguneas, o
Materia/ ,..... ,.(
sea, eritrocitos para soporte de los antgenos o en las tcnicas de
- Sangre sin anticoagulante
- Incubadora o bao de agua
- Aplicador
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inmunoaglutinaci11'.' En todos estos casos se debe prevenir la coagulacin, aa-
diendo a la sangre un anticoagulant.Q El ms recomendable es la heparina, sin
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embargo es caraf.-El empleo de soluciones anticoagulantes tiene como inconve-
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- Refrigerador - Tubos Eppendorf
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niente en las determinaciones serolgicas y de otros tipos, el error volumtrico
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que introducen.. En esos casos es ms provechoso aadir un anticoagulante en
- Centrfuga
polvo o una solucin que se seca dentro del mismo recipiente. v
Mtodo A continuacin se describen varios reactivos y soluciones que pueden em-
plearse para evitar la coagulacin de la sangre y obtener plasma y(o) clu-
l. Dejar coagular Ja sangre en bao de agua (o incubadora) a 37 Coa TA
durante 2 horas. las sanguneas. -1..

2. Dejar retraer el cogulo incubndolo 12 horas (toda la noche) a 4 C. Materia/

3. Desprender el cogulo cuidadosamente con una varilla o aplicador (si Hepa rina
qued pegado a la pared del tubo) y centrifugar la sangre a l O 000 g Emplear 0,5 mg o 50 unidades de heparina por mililitro de sangre, que se
durante l Ominutos.
coloca en el recipiente donde se colectar la sangre. Se pueden heparinizar
4. Tomar con pipeta el sobrenadante y distribuirlo en alcuotas, conservn- los capilares, tubos y otros recipientes empleando la cantidad correspon-
dolo a -20 o -70 C. Puede mantenerse por unos pocos das a 4 C sin diente a la relacin ya indicada de heparina y secndola a l 00 C durante
preservativo o un tiempo mayor con preservativo (azida sxlica o timerosal unos minutos . Muchas veces es suficiente endulzar el frasco limpio con la
a una concentracin final de 0,01 %). solucin comercial de este producto.
Observacin Solucin de A/sever
Frmula: 4, 7 g de cido ctrico; 16,0 g de citrato trisdico; 15,0 g de glucosa
Cuando slo necesitamos una pequea muestra de suero, si la separacin y agua destilada hasta completar l L . Mezclar l volumen de solucin de
del cogulo es satisfactoria, se puede obviar la centrifugacin. La cantidad
Alsever por 4 volmenes de sangre.
mxima de suero que se obtiene corresponde aproximadamente a la mitad
del volumen de sangre total. Volmenes menores pueden obtenerse, si el Citrato sdico
tiempo apremia, dejando coagular la sangre 15 minutos a 37 C o a TA, Emplear 4-5 mg de citrato sdico por 1 mL de sangre o l volumen de una
mantenindola en fro 30 minutos y(o) centrifugndola.
solucin de 3,8 g de citrato sdico 2 Hp / l 00 mL de agua por 9 volme-
nes de sangre.
68
69
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Oxalato de sodio nmero 18 con una jeringuilla de 5 mL y extraer de una vez todo el
lquido que sea posible. Cada ratn puede producir 2 o 3 ascitis que se
Utilizar 1-2 mg de oxalato sdico por mililitro de sangre o 1 volumen de una extraern cada 3-7 das .
s<>lucin que contenga O, 75 g de oxalato de sodio/! 00 mL de agua por 9 vol-
menes de sangre. 4. Incubar el fluido 1 hora a 37 C y toda la noche a 4 C . Centrifugarlo a
3 000 g durante IO minutos . Si aparece una capa de aceite removerla y
EDTA (cido etilendiaminotetraactico)
desecharla. Tomar el sobrenadante y centrifugarlo de nuevo si fuera
Utilizar 1 mg de EDTA-Na 2 por mililitro de sangre Se puede haCt"r el necesano .
ptetratamiento de los recipientes de fonna similar a la heparinizacton. con
5. Aadirle azida sdica a una concentracin final del 0,02 % y un inhibidor
una solucin de l g de EDTA-Na/JOO mL de agua destilada
de proteasa como el PMCF a una concentracin final de 0,01 mol/L .
Mtodo Dispensar el lquido y conservarlo a - 20 C.

1. Recoger el volumen requerido de sangre en el recipiente que contenga el Observacin


anti coagulante.
Un simple ratn puede rendir hasta 1O mL de lquido asctico en cada extrac-
2. Agitar suavemente la mezcla. cin y la concentracin puede ser tan alta como 1O rng de anticuerpos/mL .
3. Centrifugar la sangre a l O 000 g durante 1O minutos .
4. Titulacin de anticuerpos
4 Separar el plasma (sobrenadante) de las clulas sedimentadas ."
,. Durante el programa de inmunizaciones las muestras de suero permiten
Induccin de ascitis con adyuvante de Freund monitorear y saber en qu cuanta ha tenido lugar la respuesta de anticuerpos.
Los sueros son chequeados frente al propio inmungeno por una o varias de
Material
las tcnicas que se describirn en los captulos subsiguientes . En contrapo-
- Inmungeno en ACF sicin con la propiedad inmunognica, la propiedad antignica del inmungeno
es su capacidad para reaccionar especficamente con los anticuerpos indu-
- Ratones ~
cidos por l. Una reaccin positiva indica que ha tenido lugar la respuesta de
- Jeringuillas y agujas anticuerpos .
Mtodo El incremento de las clulas B que conducen Igm especficas para el
inmungeno (las llamadas clulas fonnadoras de anticuerpos, CFA), se de-
l . Preparar el inmungeno en ACF usando la relacin 1 volumen de ant- tectan a los 5-6 das de la inoculacin primaria. Los anticuerpos se detectan
geno/9 volmenes de adyuvante.
usualmente en el suero a los 1O das despus de la inyeccin y persisten a un
2. Inyectar 0,2 mL de la emulsin los das O; 14: 21: 28 y 35 por la va nivel bajo por unos pocos das, alcanzando un pico alrededor de los 20 das
intraperitoneal. El hinchamiento del abdomen es usual que ocurra des- (Figura 4) . Las respuestas primarias a menudo son muy dbiles, particular-
pus de la tercera o cuarta inyeccin. Si no se desarrolla ascitis, se debe mente para antgenos solubles que se catabolizan con rapidez. En muchas
repetir la inyeccin semanalmente. ocasiones una sensibilizacin fuerte puede tener lugar en ausencia de
anticuerpos detectables, por lo que en la prctica no es de gran valor
3. Colectar la ascitis cuando el abdomen alcance un tamao notable pero
monitorear esta respuesta .
antes de que el animal tenga dificultad para caminar. Utilizar una aguja

70 71
'

La respuesta a la segunda y subsecuentes inoculaciones del mismo en medio lquido, la tcnica de Farr y el ELISA. Tambin en estos casos s<>- .
inmungeno es muy diferente. El nmero de clulas B con lgm especficas utiliza el trmino titulacin para expresar la concentracin de anticuerpos
para el antgeno se incrementa exponencialmente despus de la segunda Por mililitro de suero. '
inyeccin, alcanzando un pico entre los 3 y 4 das. Los anticuerpos en el
suero tambin se detectan en este tiempo, pero con frecuencia se observan Cuando la titulacin se realiz.a por diferentes mtodos, los resultados no siem-
a los I0-14 das. Es tpico que los niveles altos persistan durante 2-4 sema- pre resultan coincidentes. En la Tabla IV se presentan los ttulos de anticuerpos
nas (Figura 4). anti-IgG humana obtenidos en conejo, utilizando cuatro mtodos.
Normalmente las muestras de suero se toman 7-14 das despus de una Resulta obvio que la titulacin est relacionada con el mtodo empleado
inoculacin. Cuando se estudia la cintica de la produccin de anticuerpos para detectar los anticuerpos y, en particular, se debe destacar ei 'lmite de
se desangra el animal en intervalos de 2-3 das. deteccin, pues tcnicas como la inmunodifusin convencional requieren
mayores cantidades de antgeno y anticuerpo para su exteriorizacin que el
La titulacin de anticuerpos se refiere a la valoracin cuantitativa o RIA o el ELISA. Estas ltimas permiten detectar cantidades de anticuerpos
semicuantitativa de los anticuerpos producidos por el animal de experimen- en el orden de los nanogramos o aun menores.
tacin.
TABLA IV. Ttulo de anticuerpos anti-lgG humana
La pa.labra ttulo se aplica de ordinario para indicar la cantidad relativa de
anticuerpos o la potencia inmunolgica de un antisuero. A veces el ttulo se
expresa en funcin de la dilucin lmite, por ejemplo, un titulo l / l O000 signi- Ttulo Nmero
Mtodo de titulacin
fica que el antisuero aglutin o precipit el antgeno homlogo cuando se (g/mL) de es:perimentos
disolvi en la proporcin 1 rnL de antisuero: 1O000 mL de diluyente. El ttulo Precipitaci n cuantitativa 250-300 6
se emplea tambin en abstracto: suero de alto o bajo ttulo, sin ningn valor
numrico. A veces el trmino puede conducir a confusiones, pero es real-
Titu lacin de Sewell 260-280 4
mente til y, si no se empleara, sera necesario aplicar otro igualmente am-
biguo, tal como potencia o avidez.
lnmunodifusin radial 1 138 2,8 6
En la titulacin por el mtodo de dilucin lmite,de antgenos solubles es muy
empleada la inmunoprecipitacin en gel (inmunodifusin) y, en el caso de lnmunoelectroforesis
1 127 2,7 6
antgenos celulares, la inmunoaglutinacin. Los antgenos moleculares pue- de Rocket
den ser adsorbidos sobre clulas o partcuJas inertes como el ltex de
poliestireno, lo que permite titular los anticuerpos por inmunoaglutinacin. La titulacin es uno de los componentes de la caracterizacin del anticuerpo
Esta tiene la ventaja sobre la inmunodfusin de ser ms rpida y detectar y a veces resulta suficiente para el fin que se le va a dar. No siempre el
cantidades menores de anticuerpo. suero con mayor contenido de anticuerpos es el mejor. Para determinados
trabajos se deben valorar otras propiedades del anticuerpo, como el isotipo,
Esta forma de titulacin, a pesar de ser una valoracin arbitraria, en muchas
la afinidad o la capacidad de reaccionar cruzadamente con otros antgenos
ocasiones resulta suficiente para el trabajo que se desarrollar. Si se nece-
(antgeno heterlogo). De acuerdo con las caractersticas del anticuerpo
sitan valoraciones absolutas pueden emplearse la precipitacin cuantitativa
que se desea obtener, se trazar la estrategia de trabajo.
Antgeno heterlogo: Antgeno diferente al que indujo la fonnacin de los anticuerpos, pero
Antgeno homlogo: El que se emple en la irummizacin, o sea, el irunungeno.
que reacciona con ellos.

72 73
Es importante que el experimentador tenga en cuenta que no debe mezclar
el suero de diferentes animales ni el de un mismo animal si corresponden a
momentos distintos de la inmunizacin.
~P.<flco

/~ ~ontom:n~ GJ/- )--


5. Purificacin de anticuerpos
-
Los anticuerpos pueden ser purificados a partir del suero inmune, del lquido
asctico o de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma. Para ello se
Soporte
emplean los mtodos inespecficos y los especficos. o motriz

\~~ -7~@>- >-


Con los mtodos inespecficos se obtiene una fraccin enriquecida en IgG
especfica. Entre ellos son muy utilizados en los laboratorios: la precipitacin
con sales inorgnicas (sulfatos de amonio y de sodio), polietilenglicol (PEG),
cido caprlico y otros ; la cromatografia de intercambio inico y la
cromatografia de afinidad con protena A (SpA) o protena G . Con estas '
. mismas tcnicas se puede purificar la fgG normal a partir de un suero o una Co - contaminante
mezcla (poof) de sueros normales. f 1gura 15 . Absorcin reversible. Amba. absorcin del Ac de. inters con el Ag como ligando.
Con los mtodos especficos se obtiene el anticuerpo de inters purificado, [)eha_10. absorcin del Ac contaminante.
libre de otros anticuerpos . Ellos se basan en la absorcin reversible de
anticuerpos o de los contaminantes que lo acompaan (Figura 15). Aisl amiento de IgG del suero sanguneo
por precipitacin con sulfato de amonio
Con este fin se emplea la cromatografia de afinidad con soporte de Sepharosa
y los llamados inmunoabsorbentes constituidos por geles de protenas Este mtodo se basa en el fenmeno precipitacin por salado (salting out)
polimerzadas con glutaraldehdo. que se produce cuando las molculas de agua qm: solvatan a la protena en
la solucin, son eliminadas por la sal que se adiciona. De esta fonna se
El mtodo de eleccin depender enteramente de los requisitos que deba
incrementa la interaccin protena-protena y esta precipita en su fonna
tener el preparado final. En la prctica son aconsejables los mtodos
inespecficos, en tanto que los especficos deben emplearse cuando se re- nativa .
quieren preparados de anticuerpo de alto grado de pureza. Las tcnicas de precipitacin salina se utilizan en el aislamiento y concen-
tracin de protenas, y constituyen con frecuencia la primera etapa del pro-
Protena A: Constituyente de la pared celular dcSraphylococcus aureus. MM= 42 000 Da . ceso de purificacin. Son econmicas, sencillas y no afectan las propieda-
Se une a la regin Fe de la IgG de la mayoria de las especies de mamferos, incluyendo tres
subclases de la hwnana (excepto IgG3) y todas las subclases del ratn. Puede tambin des biolgicas de las protenas, por lo cual pueden constituir incluso un
unirse a otras clases de Ig (lgM e lgA) de una forma ms dbil, al parecer por sus regiones medio para su conservacin.
Fab. La protena A se une ampliamente para identificar y aislar IgG y complejos Ag-Ac.
Se emplea con frecuencia en ensayos irummoenzirnticos.
Para los sueros de mamferos se obtienen rernltados buenos con el 33 % de
concentracin final del sulfato de amonio, aunque el rendimiento (y tambin
Protena G: Constituyente de la pared celular de estreptococos del grupo
C. MM= 30 000 Da. Se une a la regin Fe de la mayora de las lgG, incluyendo la lgG3 la contaminacin) puede aumentarse con saturaciones mayores . La mayo-
humana. Comparada con la SpA, la protena G reacciona ms fuertemente y con un rango ra de los anticuerpos de conejo pueden precipitarse con una saturacin del
ms wnplio de Ig de diferentes especies de"marnferos. No se une a otras clases de lg y es, 40 %, mientras que los de ratn necesitan una concentracin final de la sal
por tanto, un reactivo ms verstil y especfico para formar compkjos con las IgG.
del 45-5"0 % . (Ver Tabla V)
74 75
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Cuando se trabaja con pequeos volmenes de suero se precipita con la,
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Debe emplearse siempre un reactivo de la mayor calidad.
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La fraccin que se precipita corresponde a la fraccin gammaglobulinica
del suero (Figura 2), que contiene fundamentalmente todas las clases de
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- SAS pH 7. Ver anexos
- Agua destilada
- Beaker pequeo
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...., - Solucin de sulfato de amonio al 33 % (Tabla V) - Tubos de centrfuga
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tivo celular) a 3 000 g durante 30 minutos. Medir el volumen requerido,
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(suero diluido+ SAS) a la concentracin final requerida. Aplicar la fr-
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3. Adicionar el volumen de SAS gota a gota con agitacin suave. Dejar
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N - 00 N .... -ro ro
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recomiendan agitar durante 1 hora en vez del reposo.

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..,. - ....: e 4 . Centrifugar la mezcla a 3 000 g durante 30 minutos.
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lavado puede repetirse una o dos veces ms. Efectuar las centrifugaciones
como en el punto 4. La concentracin de la solucin de lavado ser la
misma o ligeramente superior que la concentracin a la que se realiza la
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Pur~ficacin de lgG mediante cromatografa de intercambio inico , .
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precipitacin. Si se precipita al 33 % se lava con una solucin al 33 %~ si Un intercambiador inico es un material insoluble (por ejemplo, celulosa)
se precipita al 40 % se utiliza una solucin al 40 % para lavar el precipi- con grupos carga.dos unidos covalentemente (como dietilaminoetil, DEAE o
tado. carbox..imetil, CM) y contraiones mviles . Estos contraiones pueden ser sus-
6. Restituir el precipitado en un volumen similar al del precipitado de agua tituidos de forma reversible por otros iones de la misma carga, sin cambio en
destilada o un volumen suficiente para su disolucin total. la matriz insoluble (Figura 16).

a
7 . Para obtener preparaciones de mayor pureza se recomienda reprecipitar.
En ese caso el precipitado se restituye al volumen original de suero y se / CH2 CH3
procede nuevamente como indican los puntos 1-6. O-CH2-CH2N'CH2C~
Contrain
8. Poner a dializar con agitacin. primero contra agua destilada (tres cam-
bios en 6 horas) y despus contra el tampn o solucin apropiados (12 ho- Partcula de OEAE-celulosa (_intercombiodor oninico) ,..,
ras). El volumen de lquido contra el que se dializa debe ser 500 veces el
volumen de la muestra. Comprobar la remocin de toda la sal de amonio
con la solucin de BaCl 2 . Si se observa un precipitado al mezclar 1 mL de
O-C H -e
2 11
/o-
@
esta solucin con 1 mL del lquido de dilisis, debe continuar el proceso. O Contrain
Partcula de CM-celulosa (intercambiador catinico)
9. Extraer el contenido del saco de dilisis y centrifugarlo para eliminar
cualquier precipitado. Figura 16. Materiales de celulosa para intercambio inico.
10. Determinar su concentracin y pureza, y conservarlo conveniente-
Si la matriz posee grupos pos1t1vos , el contrain ser negativo ; tal
mente . Puede adicionarle azida sdica a una concentracin final del
intercambiador recibe el nombre de aninico . Si posee grupos negativos, el
0,02%.
contrain ser positivo y el intercambiador, catinico.
Observacin En este tipo de cromatografia la separacin de las protenas se basa en sus
Si la dilisis se realiza a TA puede aadirse NaN 3 al agua destilada y al caractersticas de carga, lo que les pennite interactuar reversiblemente con
tampn, para evitar la contaminacin de la muestra. Si la fraccin gamma- el intercambiador, bajo condiciones fijadas . Por tanto, la cantidad y distribu-
globulnica va a ser purificada por cromatografia, el ltimo paso de dilisis cin de las cargas, as como el tamao molecular, desempean un papel
debe realizarse contra el tampn de corrida, al menos durante 2 horas . La importante.
eliminacioo de las sales puede tambin realizarse por filtracin en Sephadex G-25. Tratndose de una absorcin reversible, la cromatografia de intercambio
Las membranas de dilisis deben llenarse previamente con agua, para ase- inico se realiza en dos etapas : 1) Ja adicin y fijacin de las protenas de la
gurar su buen estado y no lamentar prdidas de la preparacin. Despus de matriz y 2) la elucin de cada una de las protenas. mediante gradiente de
utilizadas deben lavarse bien y conservarse sumergidas en agua destilada fuerza inica o pH.
con NaN 3 en fro . Deben rotularse para ser siempre utilizadas con el mismo
A diferencia del mtodo general, la purificacin de IgG se d 'cta en una
tipo de preparacin. Cuando el (NH 4 ) 2 S04 no es de buena calidad, puede
sola etapa, ya que en las condiciones de baja fuerza inica y pH en que se
aadrsele EDTA (5 mmol/L) a su solucin. Recordar que esta tcnica per-
realiza la tcnica, quedan retenidas las otras protenas del suero sang uneo
mite aislar la fraccin gammaglobulnica normal si se parte de un suero o de
un pool de suero normal.
79
78
Material
mientras que la JgG eluye, y se obtiene en las primeras fracciones prcti
mente pura (Figura 17). _ Suero sanguneo o fraccin gammaglobulnica dializados contra el tam-
pn de corrida
/ - Columna 1,5-2 x 20-25 cm ~~
1V .:..111;:~.r'"".
,, ~"' .'<:,~...., IS
Suero sanguneo o
DEAE-52 '-0'?'.
1,
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~"-..
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~ .,,.
Y-gtobul i na - Agitador de vidrio ( -! , .. ;~ ~~!

- Tampn fosfato 17,5 mmol/L (de baja f.i.*); pH 6,5


Frasco Mariotte ..
't> DEAE-
celulosa
~'""r.'. ,..,

~ 'f Q-0~ - Tampn fosfato 17,5 mmol/L; NaCI 0,2 mol/L; pH 6,5 (de alta f.i .)
~ J Protenas - Pipetas
6- r; sricas
. ( "
.11' ~
Y lgG - Tubos de ensayo
- Colector de fracciones
f y lgG - Espectrofotmetro

Mtodo
Figura 17. Purificacin de IgG porcromatografia en DEAE-celulosa (Wla sola etapa).
1. Pesar la cantidad necesaria de DEAE-52 conociendo que l g de la resi-
El pl de Ja IgG humana (5,8-7,3) es una consecuencia de la heterogeneidad na hinchada alcanza un volumen aproximado de 12 mL y admite l mL de
de estas molculas . Las protenas por encima de su pl se cargan negativa- suero sanguneo total. Un mililitro de SHT contiene aproximadamente
mente y, por debajo de l, positivamente. 70 mg de protenas totales y 12 mg de lgG .
A pH 6,5 una gran parte de las molculas de IgG (con pi ~ 6,5) se encuen- 2. Suspender el DEAE-52 (1 g) en 50 mL del tampn de corrida, taparlo y
tran neutras o positivamente cargadas, por lo que no pueden fijarse al dejarlo en fro toda la noche. Eliminar el sobrenadante por decantacin o
intercambiador aninico y eluyen con el tampn de corrida. Las que estn filtracin a vaco y lavar el gel cuatro o cinco veces con 50 mL del
por encima de su pi (pi < 6,5) tendrn una ligera carga positiva y podrn mismo tampn.
fij a rse al intercambiador, aunque tienen que competir con las otras protenas 3. Con la ayuda de un agitador de vidrio colocar en la parte inferior de la
del suero con mejores o similares condiciones para la absorcin. Es la IgG3, columna (sostenida en posicin vertical) una finsima capa de lana de
que representa aproximadamente el 7-8 % de la IgG srica total, la que en vidrio.
parte queda retenida en el intercambiador.
4. Aadir 2 o 3 mL del tampn de corrida y segudan1ente, y en fonna
El pi de las IgG de conejo, ratn y otras especies de mamferos se comporta continua , la suspensin de DEAE-celulosa, hasta obsen ar el
de manera similar al de la IgG humana, lo que posibilita que se purifiquen empaquetamiento de la columna de gel (cuando se mantenga estable su
por el mtodo que aqu se describe. altura). Esto se hace con el extremo de la columna abierto . Mantener
Corrientemente se emplean en la c_romatografia de intercambio inico la
DEAE-celu losa, el DEAE-Sephadex A-50 y el DEAE-Sephacel, y pueden f.i.: Fuerza inica.
realizarse en columna o en batch.
81
80
siempre una cantidad de tampn sobre la superficie del gel para evitar~
su desecacin.
5 . Dejar correr el tampn de baja fuerza inica (al menos dos veces el
volumen ,de gel) para que se estabil ice y equilibre el intercambiador.
Medir e pH del eluato. Si no es 6,5 debe contin uarse la adicin de
tampn hasta que se alcance este valor.
6 . Cerrar el extremo de la columna y retirar con cuidado la columna de
lquido . Colocar gentilmente la muestra sobre la superfici e del
intercambiador y abrir la salida.
7. En seguida que haya penetrado toda la muestra, aadir con precaucin Tompn
un poco de tampn y conectar el frasco Mariotte as como el colector de Papel
fracciones . En su defecto, recoger manualmente fracciones de 2 mL (o - d e filtro
mayores, dependiendo del tamao de las cubetas del espectrofotmetro).
Ajustar el flujo a 0,2 mL por minuto, variando la altura del frasco Mariotte
(Figura 18).
8 . Leer la absorbancia a 280 nm de cada una de las fracciones contra el
tampn de corrida en el espectrofotmetro.
Coleccin de
9 . Cuando haya salido un pico, lavar la columna con el tampn de alta f.i . 1 1 11 las fracciones
hasta que la lectura a 280 nm sea menor que 0,03 . Volver a equilibrar la
columna con el tampn de baja f. i. !Jara su reutilizacin.
10. Seleccionar las fracciones con las mayores lecturas, mezclarlas y leer la
DO de la mezcla a 280 nm para determinar su concentracin proteica,
Figura 18. Representacin esquemtica de la cromatografia en colwnna.
conociendo que una solucin de lgG humana de 1O mg/mL tiene una
absorbancia a 280 nm de 13,6. Separacin batch sobre intercambiadores aninicos
lJ . Evaluar la pureza de la IgG. Conservarla.en alcuotas congeladas a -20 Aunque los procedimientos batch son menos eficientes que las tcnicas de
o - 70 C con preservativo o sin l. columna, tienen ciertas ventajas, especialmente en los procesos a gran es-
Observacin cala. La separacin en batch es muy rpida y no la afectan los cambios
(hinchamiento o contraccin) del intercambiador.
Puede colocarse en la superficie del gel un anillo de papel de filtro para
aplicar la muestra. Al finalizar la corrida debe lavarse el intercambiador con Este tipo de separacin se lleva a cabo mezclando el intercarnbiador, previa-
el tampn de alta molaridad para desprender toda la protena absorbida. La mente equilibrado con el tampn apropiado, con la muestra que va a ser
resina limpia puede conservarse durante varios meses a 4 C con sales absorbida; tambin dializada con antelacin contra el mismo tampn. La
fenilmercricas al 0,00 l % en solucin dbilmente alcalina. mezcla se mantiene, por lo general, l hora en agitacin suave a temperatura
ambiente.
82
83

./
,,
gel (una molcula de protena A une dos molculas de anticuerpo). El
El gel se separa por filtracin al vaco o centrifugacin, las protenas absor- suero contiene alrededor de 12 mg/mL de IgG total ; la ascitis, entre
bidas se desprenden resuspendiendo el intercambiador en soluciones de alta 1-1 O mg/mL; y los sobrenadantes de hibridoma, de 2-50 g/mL de anti-
molaridad o con un pH diferente. cuerpo monoclonal.
Segn Harlow and Lane ( 1988) la mayora de las matrices de DEAE admi- 3. Lavar la columna al menos con 10 volmenes de Tris 100 mmol/L, pH 8
ten 1 mL de suero total por cada 2 mL de matriz hinchada, bajo las condicio- hasta que la lectura del eluato a 280 nm sea menor que 0,03.
nes de fuerza inica y pH descritas en la tcnica anterior.
4. Eluir la IgG de la columna con glicina 100 mmol/L, pH 3,0.
Cromatografia de afinidad con protena A (Ey et al. , 1978) 5. Colectar las fracciones en tubos cnicos que contienen 50 L de Tris
1 mol/L, pH 8. Mezclar gentilmente para neutralizar el pH de los eluatos
La cromatografa de soluciones de anticuerpo sobre una columna de prote-
que oomprenden la lgG.
na A es uno de los mtodos ms efectivos y ampliamente utilizados para
purificar AcP humanos, de conejo, de ratn, equinos, de vaca, de asno, de 6. Leer las fracciones a 280 nm para identificar aquellas que contienen los
perro, de cerdo y de curie!. Los AcM de ratn IgG2a e IgG2b st: unen bien anticuerpos . Mezclarlas y dializ.arlas convenientemente; cuantificar y eva-
a la SpA. Los anticuerpos de la subclase IgG3 tienen afinidades interme- luar la pureza de los anticuerpos y conservarlos de forma adecuada.
dias, pero las molculas IgGI se unen con afinidad baja. La mayora de los
Observacin
AcM de rata no pueden ser purificados por este mtodo
Cuando una misma columna se utiliza para purificar anticuerpos diferentes,
Con anticuerpos de alta afinidad un simple paso de purificacin es suficiente
puede contaminarse un lote con los residuos de la corrida anterior. Para
para obtener preparaciones adecuadas para la mayora de las aplicaciones .
evitarlo se debe lavar la columna con urea 2 mol/L, LiCl 1 mol/L y glicina
Material 100 mmol/L, pH 2,5 . Pueden emplearse otros tampones como glicina
- Solucin de Ac (suero, ascitis o sobrenadante del cultivo celular) 1,5 mol/L, NaCI 3 moliL, pH 8,9 para la dilucin o la dilisis de la muestra y
la fijacin de los anticuerpos a la matriz, y tampn citrato O, l mol/L, pH 3
- Tris 1,0 mol/L, pH 8 para la deabsorcin.
- Tris 100 mmol/L, pH 8
- Tampn glicina 100 mmol/L, pH 3 Purificacin de anticuerpos por cromatografa de afinidad
- Columna de Sepharosa-protena A con antgeno como ligando (inmunoafinidad)
- Tubos cnicos La purificacin por inmunoafinidad no es un mtodo comnmente empleado
- Espectrofotmetro para aislar anticuerpos. Esta tcnica es compleja y debe ser utilizada princi-
palmente para aplicaciones especiales de los anticuerpos.
Mtodo
Material
1. Ajustar el pH a 8 de la preparacin cruda previamente centrifugada
(suero, ascitis o sobrenadante de hibridoma), adicionndole 1/10 de volu- - Sepharosa 48 activada con CNBr
men de Tris 1 mol/L, pH 8. - HCI 1 mmol/L
2. Pasar la solucin a travs de la columna de Sepharosa-protena A. Estas - Antgeno (5-10 mg/mL de gel de acoplamiento)
columnas unen aproximadamente 10-20 mg de anticuerpo por mililitro de - NaHC0 3 O, 1 mol/L, NaCI 0,5 mol/L, pH 8,3

85
84
- Antisuero especfico en tampn borato, pH 8,3
JO. Despus que la muestra haya penetrado por completo, restituir el flujo
- Tris-HCI O, 1 mol/L, pH 8 (tampn de bloqueo)
del tampn borato y dejar pasar una cantidad igual a 2 volmenes de gel.
- Filtro-de vidrio aglomerado, porosidad G-3 La velocidad de flujo no deber ser mayor de 1O mL cm2 b-1 .
- NaAc O, l mol/L, NaCI 0,5 mol/L, pH 4
11 . Lavar la columna con glucosa 1 mmol/L debiendo pasar una cantidad
- -'tolumna cromatogrfica l x 8 cm igual a 10 volmenes de gel. Tomar una muestra del eluato y leer su
- Tampn borato O, 1 mol/L, pH 8,3 absorbancia a 280 nm . Si la lectura excede a 0,03 continuar lavando
- Frasco Mariotte con la solucin de glucosa. Este paso es muy importante, ya que se
- Glicina 0,2 mol/L, pH 2,8 eliminan los posibles contaminantes que se encuentran unidos
inespecficamente a la matriz.
- Glucosa l mmol/L
12. Eluir los anticuerpos retenidos en la matriz con tampn glicina pH 2,8.
Mtodo
Durante esta operacin continuar el monitoreo de las fracciones a
l. Pesar 1 g de Sepharosa 4B activada con CNBr, suspenderla en 10 mL 280 nm .
de HCl l mmol/L y dejarla en reposo durante 15 minutos. Tener en
13. Mezclar las fracciones que contienen los anticuerpos y neutralizar la
cuenta que l g de esta resina rinde 3,5 mL de gel.
solucin rpidamente con Tris slido, por dilisis o por filtracin sobre
2. Lavarla con 200 mL de la misma solucin y 50 mL del tampn de aco- Sephadex G-25 .
plamiento a travs de filtro G-3 .
14. Equilibrar de nuevo la matriz de Sepharosa con tampn borato pH 8,3 y
3. Aadir el gel sobre la solucin de antgeno y agitar de forma mecruca guardarla a 4 C con timerosal a una concentracin final del 0,02 % .
(no se puede usar agitador magntico) durante 2 horas a TA o 4 C toda
la noche. Observacin

4. Recuperar el lquido y leer su absorbancia para comprobar si tuvo lugar Si los anticuerpos son de alta afinidad, la elucin puede realizarse con HAc
la unin del ligando (antgeno en este caso) y en qu cuanta. 0,5 mol/L. Esta tcnica puede emplearse para purificar antgeno, ligando el
anticuerpo especfico a la matriz.
5. Aadir 50 mL de Tris-HCl 0, 1 mol/L, pH 8 y dejar reposar 2 ha TA o
mejor toda la noche a 4 C para bloquear posibles grupos residuales en la
Preparacin de un inmunoadsorbente con GA. Inmunoabsorcin
matriz.
6. Lavar el gel en forma alterna cinco veces con el tampn de acoplamien- Materia l
to (pH 8,3) y el tampn acetato (pH 4). - 250 rng del antgeno - Agua destilada
7. Equilibrar la matriz finalmente con tampn borato pH 8,3. - Antisuero a purificar - Tris saturado o en polvo
8. Prepa rar la columna cromatogrfica, procediendo como en la Glutaraldehdo (GA) - Beaker pequeo
cromatografia de intercambio inico (Figura 18).
Tampn fosfato O, l mol/L, pH 7 - Pipetas
9. Aplicar la muestra que contiene los anticuerpos de inters. previamente
- Tampn borato O, l mol/L, pH 8,3 - Agitador magntico
dializada contra el tampn borato.
- Glucosa l mmol/L - Centrfuga
86
87
- Glicina 0,2 moVL, pH 2,8 - Espectrofotmetro Purificacin de lgY a partir de la yema del huevo (Kurstak, 1986)
- Agitador magntico Material
Mtodo - Huevo de g~llina inmunizada - Solucin de N~S0 4 (para los lavados)
l . Pesar 250 mg del antgeno y disolverlos en 5 mL del tampn fosfato - NaOH O, 1 moVL - Freezer
0,1 moVL, pH 7.
- N~SO 4 slido - Centrfuga
2. Aadirles gota a gota y con agitacin suave 1 mL de GA al 2,5 % .
Mtodo
3. El gel formado se deja reposar durante 3 h a TA.
1. Separar la yema del huevo, romper su membrana y diluirla con 9 vol-
4. Lavarlo exhaustivamente con agua destilada hasta que a 280 nm d una menes de agua destilada. Ajustar el pH a 7 con NaOH O, 1 moVL .
lectura menor que 0,03. Las centrifugaciones se realizan a 5 000 rpm y a
2. Congelar y descongelar la preparacin.
4 <>C durante l O minutos .
3. Remover los lpidos por centrifugacin 3 000 g a 4 C dur~te l hora.
5. Equilibrar el gel lavndolo dos veces con tampn borato pH 8,3 .
4. Recuperar la solucin de anticuerpos filtrndola a travs de lana de vi-
6. Aadirle 20 mL del antisuero al antgeno polimerizado y dejar la mezcla drio o pipeteando a travs de la capa de lpidos.
en agitacin durante 2 ha TA o toda la noche a 4 <>C .
5. Purificar la lgY por precipitacin con sulfato de sodio al 17 % de satura-
7. Centrifugar para recuperar el suero absorbido y lavar el gel con glucosa cin final, procediendo como en la precipitacin de la fraccin
1 mmoVL hasta que la absorbancia a 280 nm sea menor que 0,03 . gammaglobulnica con SAS .
8. Eluir los anticuerpos adsorbidos con glicina 0,2 moVL, pH 2,8 (o cido Observacin
actico 0,5 moVL), recogiendo fracciones de 5 mL cada una. Neutrali-
zarlas inmediatamente con Tris saturado. Mezclarlas y detenninar su La precipitacin de la lgY puede hacerse tambin con un volumen igual de
concentracin y pureza. una solucin de sulfato de amonio al 34 % .

9. Equilibrar nuevamente el gel con tampn borato pH 8,3 para ser Absorcin de antisueros frente a antgenos particulados heterlogos
reutilizado. Conservarlo a 4 C con azida sdica a una concentracin
final del 0,01 %. A menudo los antisueros antibacterianos manifiestan _reactividades cruza-
das con bacterias relacionadas (antgenos heterlogos) . En estos y otros
Observacin casos resulta conveniente la absorcin del antisuero para eliminar los
anticuerpos que reaccionan cruzadamente con antgenos o epitopos que son
Este mtodo es ms econmico que la cromatografia de afinidad con
compartidos por la bacteria homloga y la heterloga (Figura 20) . Para ello
Sepharosa activada y es til en la purificacin de anticuerpos a gran escala.
es suficiente mezclar el antisuero con las bacterias heterlogas, previamen-
Se recomienda el empleo de los inmunoadsorbentes para la eliminacin de
te lavadas varias veces con SF y sedimentadas por centrifugacin, en la
los contaminantes, tanto del antgeno como del anticuerpo. Cuando se puri-
relacin 1 volumen de antisuero/ 1-2 volmenes de clulas.
fican antgenos se polimerizan los anticu~rpos especficos.
Las clulas se resuspenden suavemente en el antisuero y se deja reposar la
a
mezcla TA o a 37 C durante 15-30 minutos. AJ cabo de este tiempo se ~
~)l\D~
~<:_,S . '11' .-(
'"' ... ,._,, l:I)
88 89 { ,...
%'.te:-'
l)na relacin de absorbancia a 278 y 251 run mayor que 2,5-3 puede dar una, .
centrifuga y se recoge el suero absorbido (Figura 19). Si aJ ser ensayado
idea bastante_aproximada de la pureza de la IgG cuando esta se purifica por
nuevamente frente a la bacteria heterloga se observa an reaccin positi-
va, se repite la absorcin. algunos de los mtodos anteriormente propuestos (ljssen, 1990).

Con este procedimiento disminuye el ttulo original de anticuerpos contra el TABLA VI. Coeficientes de estincin
antgeno homlogo, pero el antisuero gana en especificidad. La absorcin de inmunoglobulinu G ( A1! ) a 280 nm
puede realiz.arse con diferentes bacterias o una mezcla de ellas y tambin
puede llevarse a cabo con antgenos solubles~ as se obtiene un precipitado Especie Coef. de extincin
que se elimina por centrifugacin.
Humano 13,6

Suero anti A + bact. A - +++ Conejo 13,8


Suero anti A + bact. B - +
Bovino 13,8

Ratn 14,0
Aq homlogo Ag heterlogo

Camero 14,0
J:~o
..o

-
Caballo 12,6
~Yo
Bacteria
:./-'')1
~;.61
B -
o~ Mtodo de Lowry

---
~~ 0~Centri
C1dn
fugo - ... Este mtodo colorimtrico es uno de los ms utilizados en la cuantificacin
de protenas y se basa en la accin reductora de los aminocidos aromticos
Figura 19. Absorcin de antisuero frente aAg celular. (tirosina y triptfano) sobre el reactivo Folin-Ciocalteau, la cual da como
resultado una coloracin azul. El mtodo de Lowl)' permite detectar con-
Cuantificacin de anticuerpos centraciones de protenas en un rango de 0.05-0,5 mg .
Mtodo espectrofotomtrico
Matehai
Los anticuerpos purificados pueden cuantificarse espectrofotomtricamente, - Anticuerpos o fraccin irununoglu lnica - Reactivo Folin-Ciocalteau
utilizando el valor del coeficiente de extincin (E) determinado para los isotipos a cuantificar
inmunoglobulnicos de las diferentes especies animales (Tabla VI).
- Estndar de IgG 1 mg/mL en SF - Tubos de ensayo
Cuando se utilizan diluciones de la prep!faein de anticuerpos, se debe mul-
tiplicar el valor obtenido por el factor de dilucin, por ejemplo, si se emplea - Salina fisiolgica - Gradilla
una dilucin 1/100 se multiplicar por l 00.
91
90
- Reactivo A - PipetaS
vos reactivos. Mientras se utilizan los mismos, puede trabajarse slo con las , .
- Reactivo B - Espectrofotmetro o fotocolormetro 111 ucstras y el blanco, y realizar los clculos con la cotangente ya calculada.
Para establecer las diluciones apropiadas de la muestra se puede hacer una
Mtodo
lectura previa a 280 nrn y estimar aproximadamente su concentracin, te-
l . Preparar en SF una solucin de IgG estndar a la concentracin 1 mg/ml . niendo en cuenta que una unidad de DO corresponde aproximadamente a
Leer su absorbancia a 280 nrn y corregir la concentracin empicando el 0,8 mg de lgG/mL .
coeficiente de extincin (Tabla VI).
Micromtodo de Lowry
2 . Para hacer la curva patrn aadir en una serie de tubos las siguientes
cantidades de la solucin de IgG estndar: l O; 20; 40; 60; 80; 100; 200; Material
300; 400 y 500 L . Completar el volumen a 600 L con SF. - Solucin de BSA l mg/mL
3 . Hacer djluciones apropiadas de la muestra a cuantificar (al menos dos) - Solucin de NaOH 1 mol/L
y aadir 0,6 mL en cada tubo.
- Na2C0 3 al 2 %
4 . Preparar el blanco con 0,6 mL de -SF.
- Solucin de tartrato de sodio al 1 %
5 . Preparar la cantidad necesaria de reactivo C mezclando 60 mL del reactivo
A por cada mililitro del reactivo B. Desecharlo despus de 24 horas . - Solucin de Cu SO 4 al 1 %

6 . Aadir 3 mL a cada uno de los tubos del reactivo C, agitar y dejar en - Reactivo de Folin-Ciocalteau 1 mol/L (si est ms concentrado, diluirlo
reposo durante l O minutos con agua destilada)

7. Aadir 0,3 mL del reactivo Folin-Ciocaltcau previamente diluido al do- M todo


ble con agua destilada, mezclar y dejar en 1eposo 30 minutos . Aadir a tubos plsticos 20: 40: 60: 80 y 100 L de la solucin de BSA.
8 . Determinar la absorbancia a 650 nm contra el blanco.
2 Completar a l 00 L con agua destilada y hacer un blanco con 100 L de
9 . Para realizar los clculos, sumar y promediar las concentraciones de agua destilada .
IgG (corregidas) en cada uno de los tubos de la curva patrn e igual- 3. Aadir a cada tubo l mL de la mez.cla siguiente: N~C0 3 19,6 mL + 0,2 mL
mente sus absorbancias correspondientes . Dividir el promedio de las de tartrato de Na + Cu SO 4 0,2 mL . Esperar 15 minutos
concentraciones entre el promedio de las absorbancias para determinar
la cotangente (j) de la curva. 4. Adicionar a cada tubo 100 L del reactivo Folin-Ciocalteau y esperar
45 minutos.
10. Para calcular la concentracin de la muestra, multiplicar la absorbancia
por la cotangente y el factor de dilucin correspondiente. Promediar las 5. Leer la absorbancia a 730 nrn contra el blanco.
concentraciones determinadas para cada dilucin. Eliminar aquellas lec-
turas que no caigan en el rango de la curva patrn. Evaluacin de la pureza de los anticuerpos

Observacin La pureza de la preparacin de anticuerpos puede realizarse por tcnicas


in munolgicas. que se estudiarn en los captulos posteriores ; por
Es conveniente hacer todos los tubos por duplicado y promediar sus electroforesis en acetato de celulosa y en geles de poliacrilamida, y por
absorbancias . La curva patrn debe hacerse cada vez que se preparan ne- otros mtodos, aunque los aqu mencionados son los ms empleados .
92
93
macroglobulinemia de Waldestrm. l.Jna intensa disminucin en la concentra-,
Electroforesis de zona de las protenas del suero sanuneo cin de la y~obulina srica, como ocurre en la hipogamrnaglobulinemia, tam-
',
La electroforesis es la migracin de partculas cargadas bajo la influencia bin puede ser descubierta con esta tcnica. Las cadenas ligeras libres (pro-
de un campo elctrico. Entre los factores que gobiernan la migracin se tenas de Bence Jones) son identificadas con facilidad en la orina, cuando se
encuentran la densidad de carga, el pH del solvente, la fuerza inica y el encuentran en concentraciones aumentadas como en el mieloma mltiple .
carcter e intensidad del campo elctrico. Tambin influyen el tamao y la
fonna de las partculas, la temperatura, las propiedades de adsorcin del A B
medio soporte y la electroendoosmosis. o o o
+ e e e
Las protenas son separadas en la electroforesis de zona casi exclusiva- =:::> -:::> -:::>

1111 1
.D
mente sobre la base de su carga elctrica superficial. El medio soporte es, .e .D o
o o
OI
en teoria, inerte y no impide ni estimula el flujo de las molculas en el campo OI
'
elctrico. Por lo general se emplean tiras de papel o de acetato de celulosa
como soporte. Sin embargo, el acetato de celulosa ofrece la ventaja de una
-OI
1

tS
1
CIJ
tS
1
1
,.....

migracin rpida (60-90 minutos) . Adems, sobre l pueden aplicarse


microcantidades de protena, se adapta a los procedimientos de tincin y
puede transparentarse, facilitndose as el anlisis de los resultados (Stites y 1gura 20 Electroforesis de zona de las protenas del suero. A, visualizacin de las bandas
por tmcin. B, conversin de las bandas en picos en el densitmetro.
col., l 985) .
En la electroforesis, las muestras de suero o de otro lquido biolgico se Mate na/
colocan en el origen y se separan sometiendo la tira a un campo elctrico
- Muestras de SHT
alrededor de 90 minutos, empleando una solucin tampn alcalina. A este
pH la mayora de las protenas se cargan negativamente y migran hacia el Akohol etlico al 95 %
nodo en virtud de su carga. Despus las tiras se tien para visualizar las - Tiras de acetato de celulosa
bandas proteicas y se leen en el densitmetro. La absorcin variable debido - Solucin transparentadora
a las concentraciones proteicas diferentes es descubierta por una celda fo-
toelctrica y reproducida por un registrador. Las bandas se convierten en - Tampn Veronal 0,025 mol/L, pH 8.6
picos (Figura 20), y pueden ser cuantificadas las principales fracciones . El - Papeles de filtro
suero humano normal se separa por este mtodo en cinco principales ban- - Colorante rojo Ponceau al 0,2 %
das : albmina, a.1-globulina: a.2-globulina, ~-globulina y y-globulina. En las
- Cristal.es de azul de bromofenol o soluc. saturada en etanol
preparaciones puras de IgG slo se observa la banda correspondiente a la
y-globulina. - Solucin decolorante
La electroforesis de zona es un mtodo extraordinariamente valioso para el - Aplicadores o pipetas de 10 A. (P.. = 1 L)
diagnstico de paraprotenas humanas, como el mieloma mltiple y la - Equipo de electroforesis (cubeta con su tapa y fuente de poder)
- Estufa
Paraprotena: Protena de miel orna, irummoglobulna homognea (monoclonal) derivada de - Densitmetro
un clon neoplsico de clula plasmtica y no relacionada con una estimulacin antignica
conocida.
95
94
Mtodo Preparacin de fragmentos Fab (Kursta~ 1986)
1. Vert'r el tampn Veronal en los dos compartimientos de la cub En algunas ocasiones los fragmentos Fab son ms adecuados (cuando no
electrofortica (diluido previamente tres veces). ~senciales ) que la inmunoglobulina completa en los inmunoensayos. Los
fragmentos Fab prcxiucen un menor background (color de fondo) en los
2. Trazar una lnea con lpiz en la tira de acetato de celulosa a una distan-
ensayos 1nmunoenz1ma r:cos po sandwich ; disminuyen la absorc in
cia de 1/3 del extremo catdico.
inespecfica de factores reurr.atoideos (FR) y restringen la especificidad
3. Dejar flotar la tira sobre el tampn por unos segundos y slo despus de los anticuerpos . Ellos penetran ms fcilmente los tejidos y son, por tan-
que se haya impregnado bien sumergirla unos segundos en el tanlpn. ro. a menudo empleados en lo5 ensayos inmunohistoqumicos; teniendo, ade-
Secarla entre dos papeles de filtro . ln<iS. la vntaja de que eliminan la absorcin inespecfica por receptores

4 . Colocar adecuadamente la tira de forma que sus extremos descansen para Fe, si estos est.1 presentes en el tejido.
sobre los dos puentes de papel de filtro que se encuentran sumergidos Las inmunoglobulinas son escindidas en fragmentos Fab y Fe debido a la
en el tampn de la cubeta. :;-:nstbihdad de su region bisagra al ataque proteoltico. Las enzimas ms
5. Equilibrar el sistema con la corriente o el voltaje apropiado (punto 7) cmpieadas son pepsina y papana (Figura 21) . Estos reactivos deben ser de
durante l Ominutos. la meJOr calidad.
Fd

~(
6 . Aplicar 1,5-2 A. de cada muestra en la lnea traz.ada, habindoseles aa-
dido previamente como indicador de la corrida un cristal de azul de .
Fo~ . b Reducc i n ~adeno
'/1igera
t~si --B---
bromofenol. Guardar una distancia de 0,5 cm entre cada una de las Po of.n - Fe
muestras y entre las muestras y los bordes de la -tira.
7 . Tapar el equipo y efectuar la electroforesis empleando corriente cons-
Papan a
--~--- -llFc'

tante (2 mA por tira) o voltaje constante (LSO V).


8 . Terminada la corrida, sumergir la tira, tan pronto como sea posible, en la Fa~~
solucin colorante. Despus de 3-5 minutos escurrirla y hacerle varios
lavados con cido actico al 5 % (solucin decolorante).
9 . Para transparentarla, sumergirla en alcohol al 95 % e inmediatamente
- Fabc.

en la solucin transparentadora, mantenindola en ella 5 minutos. Colo-


car adecuadamente la tira sobre una lmina de vidrio y guardarla en la
.':.
~..~ ~
estufa a 60 C durante 20 minutos. f:bl) ..
Reduce ion ~
10. Realizar la lectura en el densitmetro. Fob 1
; : Ppt idos
Observacin
=1=r==
pH 4%G
11 Fe ( P)
l~vitartocar las tiras con los dedos, empleando para ello una pinza. Recupe- Figura 21 . Fragmentos de la IgG de conejo obtenidos por digestin enzimtica.
rar las soluciones de lavado que contienen colorante hacindolas pasar por
FR : Autoanticuerpo contra la IgG o lgA, usualmente de la clase IgM, que se presenta con
carbn activado.
mayor frecuencia en el suero de pacientes con artritis reumatoidea.

96 97
Varias inmunoglobulinas e igualmente sus subclases difieren bastante ...:n su Digestin con papa/na
sensibilidad a Ja digestin proteoltica. Los periodos de incubacion de dife-
,\falena/
rentes inn1u~oglobulinas con diversas proteasas se dan en Ja Tabla VIL
- Papama (dos veces recnstaJiuuia de la sigma)
TABLA VII. Perodos de incubacin (en horas) req u erido~ - lgG en el tampn fosfato
para la digestin de IgG (Tijssen, 1990)
- Tampn fosfato 200 mmol/L ; EDTA 2 mmol/L ; cistena 10 mmol/L,
pH7,4
IgG Papana Pepsina Tri psi na
.. Acido iodoactilA) (previamente recristalizado) 10 mmol/L
Humana - Incubadora
IgGl 4 24 48-72 Mtodo
IgG2 48a 6 48-72 1. Disolver la pann.~ en el tampn fosfato a 10 mglmL . La IgG (2~30 mglmL)
lgG3 4 1 48-72 debe haber sido previamente dial izada contra este tampn y llevada a
37 C.
IgG4 24a 2 48-72
2. Adicionar la papa na a la IgG en la relacin l mg de enzima por 100 mg
Conejo 24b 20 - de lgG.

Ratn 3. Parar la reaccin por a..;;cin de cido iodoac.tico.


4. Dializar el digerido contra el tampn apropiado.
IgGl 27 12c -
Observacin
IgG2a 4 4-8c -
Para la digestin de Ja lgG monoclonal de ratn deben hacerse experimen-
IgG2b 4 e - tos pilotos, ya que puede reaccionar l!n forma ~iferente a la policlonal.
.s IgG3 ~ --
- 15 mine - o
Digestin con pepsina
Bovina 48a - - Materia/
Carnero 48a 48a 1 ~~.

~
- Pepsina (dos veces recristalizada, de Warthington) ',vn~ 1.(1/~ C.'// ;,
. ,- ~.1;..-1'.
~ <_

(.;i~ iaift--Tfc11-- ~<8\0


Caballo 48a - - - IgG en el tampn acetato
.;:;' .

-.....
- Tampn acetato 200 mmol/L, pH 4,7 -;t..\ H !;
~ !? i> 1
a: Ms resistente. - Tris-HCl 1 mol/L . .,,.4,, ;;;,.. . /
MEll\C\~
b: Subpoblaciones igualmente resistentes. ~../
Mtodo
c: IgGI debe ser digerida a pH 4,2; IgG de otras subclases a pH mayor (4,5), sin embargo,
algunos F(ab ') 2 sern digeridos; lgG2b es completamente degradada a 15-30 minutos l . Disolver lapesinaenel tampn acetato a 10 mg/mL . La IgG (2~30 mg/mL)
(pierde actividad inmunolgica). debe haber sido dializada previamente contra el mismo tampn y llevada
a 37 C.
98 99
2. Adicionar la pepsina a la tgG en la relacin 1 mg de enzima por J O mg Observacin
de IgG . La tripsma rinde el mismo tipo de fragmentos que la papana. Estos frag-
3. Incubar a 37 "C durante 1-48 horas (Tabla VII) . mentos son denominados f ab(t) y Fc(t). La tripsina es mejor proteasa para
la lgG de camero, siendo suficiente l hora de incubacin para la digestin
4. Parar la reaccin subiendo el pH a 7.5-8.0 con Tris . completa Para la lgG humana se requiere una concentracin doble de la
5. Dializar la preparacin contra el tampn apropiado. enzima y la adicin de tripsina fresca a varios mtervalos durante 2 horas de
incubacin . La lgM humana requiere unas 18 horas de incubacin . La lgM
Observacin de raton debe ser digerida bajo condiciones ligeramente diferentes .
A veces se requiere mayor concentracin de enzima (~jemplo, con la IgG2a
de ratn) o un pH menor (con la IgGI de raton) La digestin de lg(J d Purificacin de fragmentos Fab y Fab '
ratn, de conejo y humana con pepsina nndc F(ab ). que puede ser reducido
Estos fragmeutos pueden ser purificados por varios mtodos. Las tcnicas
a Fab' con 2-mercaptoetanol Para ello diahz.ar el dgcndo contra Tns-HCl
550 mmol/L, pH 7,8 y deaerearlo al vac10 Adicionarle l-m.!rcaptoetanol
mas popula-es son la cromacograf1a sobre CM- o DEAE-celulosa, la filtra-
cin en gel y la crom.uografia de afinidad con SpA o protena G.
1O mmol/L e incubar la mezcla a 3 7 "C dur"11te l hora. Seguidamente bajar
el pH a 6,.5 y adicionar N-etilendiami.u 1O-nmol/L para alquilar los grupos Los intercambiadores i:nicos de DEAE en tampn fosfuto de sodio 5 mmol/L,
tioles: La temperatura se baja a O C ) se dializ.a la preparacin contra el pH 8 permiten el paso del Fab o lo retienen ligeramente, pudiendo ser
tampn apropiado. deabsorbido incrementando de fonna tenue la concentracin de NaCI.

.Digestin con tripsina La purificacin puede re-af:arse con SephJd.ex G -200 empleando PBS .
La pureza de los fragmentos debe ser comprobada por electroforesis en
Material
S DS- PAG E.
- Tripsina {cristalizada, tipo IX, sigma)
- IgG en el mismo tampn 6. Conservacin de los antkuerpos
Para conservar los sueros inmunes o los anticuerpos purificados por algu-
- Tris HCl O, 1 mol/L; CaC1 2 20 mmol/L, pH 7,8
nos das (menos de l semana) pueden mantenerse en fro a 4 C .
- Fenilmetilsulfonil fluoruro l mmol/L o inhibidor de tripsina del frijol de
Si no se desea congelarlos, se pueden mantener durante l mes o ms aa-
soya, O, 1 mg/mL
dindoles un preservativo como azida sdica o timerosal al 0,01-0,02 %. La
Mtodo fraccin garnmaglobulnica puede conservarse precipitada o restituida con
la sal de amonio, lo que impide su contaminacin y la conserva en fo rma
l . Disolver la tripsina en el tampn Tris-HCI a 2 mg/mL . La IgG debe haber
activa durante mucho tiempo.
sido previamente dializada contra el mismo tampn y llevada a 3 7 C .
Los sueros inmunes y los anticuerpos punficados (estos ltimos preferi-
2. Adicionar la tripsina a la lgG en la relacin 1 mg de enzima por 200 mg
blemente concentrados) pueden congelarse en pequeas alcuotas a -20 o
de lgG (de carnero, en este caso).
- 70 "C. Para conservarlos durante periodos muy prolongados se recomien-
3. Incubar 1 hora a 37 C (Tabla VII). da aiiadirles preservativo, un inhibidor de proteasa como PMCF a una con-
4. Parar la reaccin con el fenilmetilsulfo_nil fluoruro o el inhibidor de tripsina. centracin final de 0,01 mmol/L, y reducirles el pH a 6,0-6,5 con un tampn
acetato. Tambin pueden conservarse liofilizados (en fo1ma de polvo seco)
5. Dializar el digerido contra el tampn apropiado. hermticamente cerrados a 4 "C.
100 10 1
CAPlTULO 11
LA REACCIN ANTGENO-ANTICUERPO

La reacc in que tiene lugar entre un ant1geno y su anticuerpo especfico, los


llamados mmunorreactantes, recibt: el nombre de reaccin serolgica. La
serologa es la ciencia que estudia estas reacciones .
La interaccin entre el antgeno y el anticuerpo puede representarse como
una reaccin bimolecular reversible:
Ag + Ac ~AgAc

Esta interaccin tiene lugar en vim1d de las mismas fuerzas de corto alcan-
ce que gobiernan cualquier interacc ion protena-protena . Sin embargo, la
interaccin especfica antgeno-anticuerpo es cuantitativamente mayor de-
bido a la complementariedad entre el sitio de combinacin del anticuerpo
(paratopo) y el determinante antignico o epi topo, lo que hace que las mol-
culas interaccionen estrechamente sobre un rea tridimensional relativa-
mente extensa. No obstante, por la naturaleza de esas fuerzas pueden ser
revertidas cambiando el pH o la fuerza inica del medio, lo que resulta de
gran utilidad en la purificacin de antgenos y anticuerpos, como ya se vio en
el captulo anterior.
La reaccin antgeno-anticuerpo transcurre en dos etapas :
Primera etapa. interaccin primaria entre el antgeno y el anticuerpo, que
viene dada por el reconocimiento especfico y la combinacin de un deter-
minante antignico con el sitio de unin del anticuerpo correspondiente.

103
Segunda etapa. Interaccin secundaria, en la que se manifiesta la interaccin
primaria ant.geno-anticuerpo. Puede ser, por ejemplo, la lisis provocada por
el sistema complemento, la fagocitosis o simplemente la precipitacin y la

~
..
aglutinacin. Es esta manifestacin secundaria la que a menudo observa-
mos en el laboratorio y fue precisamente la que dio lugar al descubrimiento . I A
de los anticuerpos.
La reaccin antgeno-anticuerpo se manifiesta de muy diversos modos, e
teniendo cada reaccin su peculiar significacin y valor. La reaccin entre
un antgeno soluble y su antisuero especfico se llama inmunoprecipilacin~
y la que tiene lugar entre angenos celulares o particulados y el antisuero
correspondiente, inmunoaglutinac1n. En ambos casos el mecanismo b-
~ o
B
sico es similar y slo existen diferencias en cuanto al tamao de las par- E::- E
tculas antignicas . Esta reaccin ha sido explicada por la teora dd en-
rejado. 9 Anticuerpo Antgeno
f 1gura 22. Complejos Ag-Ac. A, en la equivalencia. B, en exceso de! Ac. C, en exceso de Ag.
TEORA DEL ENREJA.DO (Fasquelle et al , 1970) D y E, complejos solubles en exceso de Ag.

Esta teora, propuesta por Marrack (lQ38) y desarrollada por Heidelberger, La constitucin de la red varia segn las ooncentraciones relativas de antgeno
Pauling y Goldberg, se fundamenta en Ja multivalencia del antgeno y el ,. anticuerpo:
anticuerpo. Segn ella, la multivalencia del antgeno y la bivalencia del - Cuando el antgeno es limitante en Ja reaccin, el complejo contiene una
anticuerpo conducen a la constitucin de una red en la que alternan regu- gran proporcin de anticuerpos que saturan el mximo de determinantes
larmente las molculas de antgeno y anticuerpo. Por ~jemplo, si tres o antignicos, pero que conservan en su periferia numerosas estructuras
ms molculas de anticuerpo se unen a una molcula de antgeno (Figura 22), complementarias an disponibles.
se forman puntos ramales que, al incorporarse nuevas molculas de
antgeno y anticuerpo, dan lugar a un producto ramificado cada vez ms - Existe una relacin ptima (RO) para cada sistema antgeno-anticuerpo
grande. De este modo se constituyen progresivamente masas de volumen que favorece la furmacin de una red muy densa y, por tanto, la precipita-
creciente. Una vez alcanzado el volumen c~tico de solubilidad, la masa cin. A esta RO precipita prcticamente todo el antgeno y el anticuerpo.
del complejo desborda las fuerzas que lo mant.ienen en solucin y aparece - Cuando el antgeno est en exceso (anticuerpo limitante), el precipitado
el precipitado. es rico en antgeno y los anticuerpos no son lo suficientemente numero-
sos como para reunir todas las molcu las de antgeno en la malla de la
red. Los precipitados se aproximan a cadenas lineales con relacin mo-
lar 1/1 . A concentraciones mayores de antgeno muchas molculas de
antgeno permanecen libres o con un solo anticuerpo unido. En este mo-
Manifestacin secundaria: El efecto secundario es consecuencia de la interaccin antgeno-
anticuerpo y no se corresponde exactamente con ella, en especial con antgenos que tienen mento los complejos son tan pequeos que pueden permanecer solubles .
pocos epi topos. Con haptenos, por ejemplo, aunque la interaccin primaria ocurre, no hay En la zona de gran exceso de antgeno no existen complejos precipita-
precipitacin o lij:icin del complemento. dos.

104 105
La teoria de la oclusin de Boyd ( 1956) completa la teoria del enrejado. En lugar la reaccin . La formacin de un complejo que termina por observarse.
el momento de la formacin del complejo la combinacin recproca de los a simple vista depende, en parte, de factores fsicos y qumicos inespecficos
grupos polares de las estructuras del antgeno y del anticuerpo conducen a ~ secundarios con respecto a la combinacin especfica primaria antgeno-

la prdida de su poder hidrfilo. Adems, en el interior de la red se encuen- a.nticuerpo. Los cambios consecutivos que se producen influyen sobre la
tra un cierto nmero de grupos polares an libres, excluidos de su contacto estabilidad de los complejos pequeos iniciales a medida que estos crecen y
con las molculas de agua debido al desorden molecular, a causa de lo cual forman agregados.
pierden su poder hidrfilo. Esta dob le prdida de grupos hidrfilos eficaces Los sistemas serolgicos, como todos los coloidales, suelen estar en equili-
disminuye la solubilidad del complejo y produce su precipitacin. En efecto: brio delicado en Jo que respecta a su estabilidad fisiCCKiumica, por lo que
- En exceso de antgeno persisten los suficientes grupos polares Libres para <;On influidos por aquellos factores que alteran las propiedades superficiales
mantener una mayor o menor cantidad de los complejos en solucioo. de las grandes molculas o que afectan el ritmo de contacto entre ellas.
Algunos de los factores que corrientemente influyen sobre las reacciones
- En la relacin ptima de antgeno y anticuerpo la formacin de una red serolgicas son los electrlitos, el pH, la asociacin con otras sustancias
muy densa disminuye el mximo de la eficacia de los grupos hidrfilos, incspeccas que existan en el medio (iones, protenas y otras), temperatu-
precipitando todos los complejos . . ra, tiempo, agitacin y volumen.
- En exceso de anticuerpo, los complejos estn constituidos en gran parte
La presencia de c.1erta cantidad de electrlitos es necesaria para la solubilidad
por molculas de anticuerpo y la solubilidad de los complejos es funcin de los anticuerpos y para la formacin de los inmunocomplejos. Las reac-
fundamentalmente del nmero de grupos polares eficaces a nivel del
ciones de precipitacin y de aglutinacin ordinariamente se realizan en solu-
anticuerpo. Si antes de la fonnacin del complejo los anticuerpos slo ciones de NaCL al 0,85 % (0, 15 moVL) (salina fisiolgica) o en soluciones
implicaban un nmero bastante limitado de grupos hidrfilos, despus de
tamponadas, con una concentracin aproximada de O, 15 moVL . Un aumen-
la formacin del complejo persiste una cantidad an ms reducida, preci-
to de la concentracin salina tiende a modificar el equilibrio antgeno-anti-
. pitando los complejos. Este es el caso de los anticuerpos de conejo y de
cuerpo y a provocar cambios en la relacin molecular del precipitado. Las
la mayora de los mamferos, estando compuestos estos anticuerpos en
concentraciones salinas al 15 % hacen que parte del anticuerpo combinado
gran parte por euglobulinas. Por el contrario, si los anticuerpos implican
~n los complejos polisacridos del neumococo-anticuerpo se disocie, lo que
una gran proporcin de grupos hidrfilos, los complejos formados per-
permite la obtencin del anticuerpo puro. La reduccin de la concentracin
manecen en solucin. Esto es lo que sucede con los inmunosueros de
salina generalmente da lugar a un aumento moderado en la cantidad de
caballo antiproteicos.
precipitado.

CONDICIONES PARA LA REACCIN SEROLGICA El pH de los sistemas serolgicos est, por lo general, en tomo a la neutra-
(Cushing and Campbell, 1960) lidad, pero puede oscilar entre 5-9 sin que haya cambios notables, a menos
que el antgeno sea inestable a esa condicin de pH Fuera de esos pH las
En todas las reacciones serolgicas, especialmente en las que se produce la cantidades de antgeno y anticuerpo que se combinan para fom1ar el com-
agregacin, debe tenerse en cuenta las condiciones del medio en que tiene plejo se reducen, a causa de la disociacin no slo de los grandes complejos,
sino tambin de las combinaciones primarias antgeno-anticuerpo.
Euglobulina Trmino en desuso utilizado para identificar Ja frsccin de globulins sricas Muchos de los antgenos y Ja mayora de las protenas sricas pueden combi-
que precipita en agua destilada o a bajas concentraciones salinas. Esta fraccin contiene Ja
narse, has.ta cierto punto, con otras sustancias en solucin. La carga elctrica
mayor parte de las inmunoglobulinas. Se Je denomina seudoglobulina a la fraccin del suero
ms soluble que la euglobulina, pero menos que la albmina. de las pFe>tenas del suero es negativa en soluciones con pH superior a 7 ._

106 107
En consecuencia, si se aaden sustancias de carga elctrica positiva, se ~ anticuerpo existente en el sistema. sino de las cantidades relativas de cada,
produce cierto grado de asociacin incspccifica, simplemente como resulta- componente. La relacin de irununorreactantes para el tiempo ms corto de
do de la atraccin de las partculas de cargas opuestas. No obstante. hay precipitacin corresponde a RO (relacin ptima) . Con un exceso de antgeno
factores menos evidentes y, en ciertas cpndicones, los antgenos y anticuerpos el tiempo de reaccin se incrementa y la formacin del precipitado es par-
pueden combinarse con otras protenas sncas. cualquiera que sea su car- cial o totalmente inhibida. Esto tiene importancia prctica, ya que el exceso
ga. Esto puede alterar la reaccin especifica y, en algunos casos..., pueden de antgeno puede ser la causa de que no se observe reaccin . Teniendo en
ser arrastradas con el inmunoprecipitado. Los agentes desnaturaliUites cuenta los principios de la teora del enrejado en la irununoprecipitacin,
cidos, bases, el calor, alcoholes y detergentes, tienden a provocar la aso- podra esperarse que se fornlaran tambin complejos solubles en la regin
ciacin de molculas proteicas y pueden reforzar o inhibir las reacciones de exceso de anticuerpo, pero salvo con los antisueros de caballo contra
serolgicas, dependiendo una u otra conducta del grado de asociacin antgenos proteicos, no se forman; y si no se produce la precipitacin a
inespecfica con otra protena y de la intensidad de la desnaturalizacin. Los concentraciones antignicas bajas, se debe simplemente a la insuficiencia
complejos antgeno-anticuerpo suelen ser "pegajosos" y tienden a adherirse del antgeno para producir un precipitado apreciable (ver floculacin ). Debe
a las superficies . Esta propiedad se refleja tambin en la tendencia de 1 agr~arse a todo lo anterior, que la influencia del exceso de antgeno o anti-
flculos a adsorber componentes no especficos del sistema. De al que, cuerpo no se limita a la formacin de precipitado, sino que tan1bin puede
cuando se realizan anlisis cuantitativos, debe tenerse cuidado en eli producir cambios en los precipitados ya formados . Esta reversibilidad es
estas sustancias, lavando el precipitado. posible que conduzca a una disolucin parcial o total de los precipitados
. -:stablec1dos cuando se ex ponen a un exceso de uno de los dos
La temperatura y el tiempo son factores importantes en las r?cciones mmunorreactantes Los agregados de nueva formacin son ms sensibles a
serolgicas. En general, su velocidad es proporcional a la temperatura, por este efecto disolvente que los precipitados bien establecidos, en los que el
lo que es prctica corriente real izar los ensayos a 37-40 "C para acelerarlas. antgeno y el anticuerpo estn unidos ms firmemente.
Sin embargo, la temperatura tambin influye sobre la solubilidad de los com-
plejos y su equilibrio final, de tal manera que, para obtener cantidades mxi- La relacin de concentraciones antgeno/anticuerpo no es de tanta impor-
mas de precipitados y aglutinados, se conservan los sistemas de reaccin tancia en las reacciones de aglutinacin, pero en ocasiones es necesario
durante algn tiempo a O o 4 "C. Algunas reacciones, como aquellas en las diluir el antisuero para obtener aglutinados fuertes . Esto ocurre cuando la
que intervienen las llamadas "aglutininas fras", no son posi~le si no se man- concentracin de anticuerpo es tan elevada que las clulas completamente
tienen los inmunorreactantes a baja temperatura durante varias horas. La cubiertas, no permiten que las molcu las anticuerpo ligadas a una clula
puedan hallar sitios con qu combinarse sobre otra clula.
combinacin inicial del antgeno y el anticuerpo es rpida y, en la mayora de
los sistemas, se completa en unos pocos minutos. Sin embargo, las reaccio- La forma ms sencilla de controlar la ex-tensin de la formacin de los
nes secundarias que llevan a la insolubilidad requieren un plazo relativarnen inmunocomplejos es variar la concentracin de antgeno o de anticuerpo.
te largo y pueden no alcanzar un mximo hasta pasados 6-8 das, en algunos Con tal de que ninguno de los dos componentes est saturado, aadiendo
sistemas precipitantes. La agitacin de la ~ezcla de los inmunorreactant1 ms anticuerpo o antgeno a un volumen constante se incrementar la can-
incrementa la velocidad de la reaccin. De igual forma la centrifugacin tidad de antgeno o anticuerpo unido. respectivamente Con anticuerpos de
acelera la rapidez de la reaccin y permite la consolidacin de la un ' alta afinidad el exceso de anticuerpo puede emplearse para unir el antgeno
antgeno-anticuerpo. : disponible . No suceder as con anticuerpos de baJa afinidad . En este caso
una fraccin significativa del antgeno permanecer libre.
Un factor de importancia principal para la velocidad y extensin de la'
inmunoprecipitacin es la proporci de antgeno y anticuerpo en la mezcla. Incrementando el volumen de reaccin dismi nuye la concentraci n de
La cantidad de precipitado depender no slo de la cantidad total de antgeno antgeno y a nticuerpo, y en consecuencia decrecer la cantidad de.

108 109
inmunocomplejo formado cuando ninguno de los dos componentes est sa- funcionan mejor en todas las tcnicas inmunoquimicas. Esto se debe no slo ,
turado. En el caso de anticuerpos de baja afinidad el volumen de reaccin a su mayor capacidad, sino a la estabilidad de los inmunocomplejos. Por
influir notablemente sobre la cantidad de complejos formados . ejemplo, el tiempo medio para la disociacin de un anticuerpo de alta afini-
dad unido a un antgeno proteico pequeo es de 30 minutos o ms, mientras
La mayora de los procedimientos inrriunoqumicos involucran interacciones
que para un anticuerpo de baja afinidad este tiempo puede ser de unos
multivalentes (Figura 22) que estabilizan sobre manera los irununocomplejos,
pocos minutos o aun menos.
rindiendo reacciones prcticamente irreversibles .
El rango de valores de la constante de afinidad (Ka) para complejos Ag-Ac
Las interacciones multivaJentes permiten la formacin de uniones Ag-Ac
es enorme y se extiende desde valores menores de 105 mol1 hasta vaJores
finnes an con anticuerpos de baja afinidad . Debido a que algunas tcnicas
mayores de 10 1:! mo11 .
favorecen las interacciones multivalentes, los anticuerpos de ba3a afinidad
pueden operar bien en estas tcnicas, pero no en todas . Cuando los Como todas las reacciones de equilibrio, Ka se afecta por la temperatura, el
anticuerpos muestran comportamientos distintos en tcnicas diferentes a oH y el solvente. Las variaciones que se producen pueden tanto dirigir la
menudo es debido a diferencias en la umon multi\'alente y, por tanto, a 1eaccin hacia la unin completa o a la liberacin del antgeno unido.
anticuerpos de afinidad baja. Similarmente, una reaccin cruzada inaparente Otra fo~a de medir la unin entre un antgeno y su anticuerpo especfico
en una tcnica, puede dominar los resultados en otro tipo de ensayo. es el empleo de la constante de disociacin (Kd) :

AFINIDAD Y AVIDEZ Kd = [Ag] [Ac]


[Ag -Ac ]
La unin del anticuerpo y del antgeno sigue los principios tennodinmicos
bsicos de una interaccin bimolecular reversible. Si [Ag] es la concentra- Para anticuerpos de alta afinidad los valores de Kd sern proporcionalmen-
cin molar de sitios de unin del Ag no ocupados, [Ac] la concentracin te bajos, y viceversa.
molar de sitios de combinacin del anticuerpo no ocupados y [Ag - Ac] la
concentracin molar del inmunocomplejo, la constante de afinidad Ka pue- Las constan.tes de afinidad o de disociacin de los anticuerpos monoclonales
de representarse: pueden determinarse con exactitud, pero no as las de los anticuerpos
policlonales, porque constituyen mezdclS complejas de anticuerpos de afini-
dades diferentes.
Ka= [Ag-Ac]
[Ag] fAcJ El trmino avidez es ms descriptivo y se refiere a la estabilidad de los
complejos Ag-Ac. En cc>ntraste con la afinidad, la avidez no se define en
En trminos prcticos, la afinidad describe la cantidad de complejos Ag-Ac trminos tennodinmicos, sino por el ensayo particular empicado para me-
que se encuentran en equilibrio. dir la interaccin antgeno-anticuerpo.
El tiempo para alcanzar este equilibrio depende del ritmo de difusin de los Los antgenos inmovilizados sobre fase slida a altas concentraciones pro-
inmunorreactantes y de la afinidad de los anticuerpos. Los anticuerpos de mueven una alta avidez. Cuando un anticuerpo (o un antgeno) se une a un
aJta afinidad unirn grandes cantidades de antgeno en un tiempo ms corto antgeno (o a un anticuerpo) sobre una fase slida, la interaccin es bifsica
que los anti .:uerpos de baja afinidad. y dos factores , adems de la afinidad intrnseca, controlan la fuerza de la
En la prctica esto significa que interacciones de alta afinidad se comple- interaccin. Estos son: la elevada concentracin local del antgeno (o del
tan bien antes que las de baja afinidad. Los anticuerpos de alta afmidad anticuerpo) y la posibilidad de unin bivalente (Figura 23) . La unin inicial

11 o 111
adicin de un volumen igual de SAS prec1p1ta los inmunocomplejos, mien-
del antgeno (o del anticuerpo) al antgeno (o anticuerpo) inmovilizado est
tras que el Ag* libre pemianece en d sobrenadante. Los precipitados se
limitada por la difusin, pero despus que la primera interaccin Ac-ep1topo
lavan con sulfato de amonio al 50 % para remover el Ag* libre. La propor-
ocurre, la formacin del segundo enlace puede ser una conversin
cin de Ag unido a! anticuerpo y Ag* libre, previa a la adicin de la sal de
intramolecular, si es estricamente posible. Adems, la alta concentracin amonio, no se altera apreciablemente debido a que el SAS inhibe ("conge-
local de antgeno (o de anticuerpo) incrementa la probabilidad de que cual- la.') la formacin y disociacin de los complejos. Finalmente se lee la radio-
quier anticuerpo (o antgeno) que se disocie se una a otro antgeno (o anti- actividad del precipitado en un contador de radiaciones. La cantidad de
cuerpo) de la vecindad. En esencia. la difusin tiene lugar, pero la elevada radioactividad en el prr..cipitado es proporcional a la cantidad de Ag* unido
concentracin de antgeno (o anticuerpo) fijado a la fase slida acta como al anticuerpo y los resultados se expresan en trminos de la capacidad de
una trampa para unir el otro mmunorreactante a la fase slida. Estos facto- unir Ag/mL del antisuero.
res contribuyen a una mayor avidez. Cuando se ensayan varios antisueros de la misma especificidad, los resulta-
dos deben calcularse para el mismo grado de exceso de antgeno. De acuerdo
con el ensayo original de Farr, una cantidad constante de Ag se adiciona a

"~et
una serie de diluciones del antisuero y la capacidad de unir Ag se determina
a cada dilucin. Asi'!lismo los resultados se expresan por la dilucin del
antisuero que une el 33 % del Ag* (Figura 24).

o o O. Resulta obvio que mientras mayor sea la dilucin del antisuero que una el
33 % del Ag, mayor ser su capacidad de unin. Esto significa que tiene una
avidez ms elevada y, es de esperar, que func_ionar mejor en los
Alto avidez Bojo av i dez
mmunoensa yos.
Figura 23 . La min bivalente a antgenos irunovihzados sobre una fase slida incrementa la Existe una variante ms simple en la que se emplea un gran exceso del Ag
avidez. marcado y una dilucin nica del antism.. .:> (Hudson and Hay, 1988).

TCNICA DE FARR PARA MEDIR LA CAPACIDAD


DE UNIN DE ANTGENO DE UN ANTISUERO
La tcnica de Farr (1958) o del sulfato de amonio es un radioinmunoensayo .g 80
(emplea Ag marcado con istopo radioactivo) y se utiliza para medir canti- -
s::
::1
dades absolutas de antgeno unido al anticuerpo. Se basa en la capacidad OV -

del anticuerpo para combinarse con el antgeno y no en efectos secundarios g


Q)
.2' '~
como la inmunoprecipitacin. Esta tcnica tiene como limitante que slo e 33 - ------------
puede utilizarse con antgenos que son solubles en soluciones de sulfato de Q) 20 - . 1
amonio saturadas al 50 % (por ejemplo, la albmina). "C '1
;!. 1
En la prctica una cantidad constante de Ag radiomarcado (Ag*) se adicio- Dilu c in de l suero
na a una serie de diluciones del antisuero, y se alcanza el punto en la zona de
exceso de antgeno en que la precipitacin espontnea de los inmunocomplejos Figura 24 . Capacidad de unir Ag de un antisuero determinada por la tcnica del sulfato de
no puede ocurrir y se establece un equilibrio Ag* + Ac .c..._ Ag* Ac . La amonio (de Farr).

112 11 3
TCNICA DE PRECIPITACI N CUANT ITATIVA
EN ME DIO LQUIDO PARA MEDIR LA CANT IDAD +++++ ..... + - -
----- - -+++
- - - - + Ac
DE ANTICUERPOS EN UN SUERO + + + + Ag

----~:~.:L"
E
e:
De Jos numerosos mtodos pa ra estimar la cantidad de anticuerpos en el oIX) ;p
suero u otros fluidos (o de antgeno). la reaccin de precip1tac1n cuantitati- C\I
va en medio lquido es uno de los ms populares . A diferencia de la rcnica o
de Farr, se basa en el efecto secundario de la inmunoprecipitac1n y pcnn1tc o Oy65
"U
en algunos sistemas, cuando se trabaja rigurosamente. una medicin exacta .....
del contenido de anticuerpos (o de antgeno) Esta tecnica fue dcsarrol lada 'O. 0,5
por Heidelberger y Kendall en 1935 y se basa en la adicin de cantidades
-
<..>

crecientes de un antgeno soluble a una serie de tubos que contienen un ....


111
Q

volumen constante de antisuero. El precipitado se obtiene por centnfugac1n, Qi


"O
se lava y se estima su contenido proteico. El p recipitado formad o se
o
incrementa hasta un mximo)' despus decrece. Las tres zonas pnnc1palcs o
de la reaccin se determ inan ensa yando ios sobrenadantes de las 100 150 200 300 400
centrifugaciones frente al ant!geno ~ al anticuerpo De este modo. c:1 lo:; g de HSA a ad i do
sobrenadantes contienen anticuerpo libre. ciaran reaccin positiva c1 wdo
se aada antgeno, y reaccionaran con el anticuerp0 s1 cont1,;nen anugc110 Figura 25 . Curva de prec1pitac1"n cuantllativa de albmina de suero hwnana (HSA ) con
libre (Figura 25). anticuerpos anti-HSA Se adicionaron cantidades incrementadas de Ag a una misma cantidad
de antisuero y Ja 00 del precipitado (disuelto t.'11 NaOH) se determin. Se ensayaron Jos
Las tres z.onas de la reaccin de prec1pitac1n son: la de exceso de anticuerpo sobrenadan tes para detectar Ja presencia de Ag o . ,c libre
o proz.ona, la de equivalencia u ptima y la de exceso de antgeno (Figura 25)
En un suero hiperinmune la mayor propon:.in de anticuerpos es de la clase
Como generalmente se precipita todo el antgeno en las dos primeras zonas,
lgG, a la que corresponde una masa molecular (MM) aproximada de 150 000 Da .
es sencillo calcular la cantidad de anticuerpo en el precipitado, restndole al
precipitado total la cantidad de antgeno aadido. Para obtener el mejor estimado de la valencia antignica se debe plotear la
La cantidad de anticuerpos en el suero se determina en el punto de equiva- relacin # de molculas de Ac/# de molculas de Ag contra la cantidad de
lencia, donde todo el Ag y el Ac han interaccionado y precipitan en forma antgeno adicionada (Figura 26). El intercepto dar la valencia mxima del
de inmunocomplejos, restndole :i la cantidad de precipitado el antgeno aa- antgeno.
dido. En este caso hay una elevada correspondencia entre la interaccin A continuacin se presenta la composicin molecular para el sistema IgG
Ag-Ac y el efecto secundario de p recipitacin. humana-anti IgG humana fabricada en conejo (Williams and Chase, 1971):
Con los valores de Ag y Ac precipitados en las zonas de exceso de anti-
Relacin molecular JgG humana-anti JgG humana
cuerpo y de equi valencia, se puede calcular la composicin moiecular de los
inmunocomplejos precipitados, empleando la fnnula : Extremo de la Zona de equivalencia
zona de exce- Ligero exceso Ligero exceso
# de molculas de Ac
= Masa de Ac . MM del Ag so de Ac de Ac de Ag
# de molculas de Ag MM del Ac Masa de Ag 7 4,5 3,5

11 4 115
Las primeras tcnicas serolgicas se basaron en los efectos secundarios de
la interaccin Ag-Ac. Entr~ ~llas se encuentran la inmunoaglutinacin, la
inmunoprec1pitacion )' la fijacin del complemento (Tabla VIII) .
OI 5
.,o
~
Con el empleo de sustancias radioactivas y el desarrollo de los
:J
radiommunocns:Jyos (RIA) comenz una nueva era en la tecnologa serolgica:
.g 4 cl\iso <le marcadores para amplificar la seal de la interaccin Ag-Ac .
o
E De igual fom1a, el marcaje con enzimas admite la deteccin y cuantificacin
......
u de- ancigenos y anticuerpos con la utilizacin de conjugados enzimticos que
~ 3
., rmdcn, al reaccionar con su sustrato, un producto coloreado .
o
:J
u
Estos inm1moensayos con marcadores (Tabla VIII) permiten detectar y
'..! 2 estimar cantidades muy pequeas del analito (antgeno o anticuerpo que
o se anal iza). Las mediciones pueden efectuarse con gran exactitud y pre-
E
e cisin .
~g
u Las concentraciones que se utilizan 1e los inmur.orreactantes son bajas, por
..2
41 lo que el efecto secundario de la precipitaci:-i debe potenciarse conVagentes
a:
J 10 20 30 40 s'o s'o io ao 9o
O de HSA adicionada
100 precipitantes como e:poliet1lenghcol o anticuerpos anti-inmWloglobulinas .
Las rna~rotcnicas serolg1cas requieren ms de 0,5 mL de muestra; las
Figura 26. Detenninacin de la valencia antignica. En este caso cinco epi topos fueron rcco- microtcn i ca~ -que son las ms comw1es- . entre 0,5 y 0,05 mL; y las
n<>eidos por el antisucro. ultrarnicrotcmca::. requieren menos de C,05 mL . Los microensayos gastan
menos reactivos, lo que constitu) e un factor econmico importante. En los
La reaccin antgeno-anticuerpo puede tener lugar en solucin o sobre una
micro y ultramicroensayos es menester prestar especial atencin a la~ure
fase slida. En este ltimo caso es posible que se trate de las paredes pls-
za de los reactivos, incluyendo el agua, as como a I<flimpieza de la cristale-
ticas de tubos o de pozos de una placa de microtitulacin. La reaccin sobre
ra y dems accesorios.
fase slida puede resultar ms efecti va y permite detectar, por lo general,
cantidades menores de antgeno y anticuerpo que ei ensayo en solucin. La gran diversidad de tcnicas serolgicas que existen actualmente, y las
que devendrn, obliga al experimentador a hacer una seleccin racional,
TCNICAS SEROLGICAS O INMuNOENSAYOS . teniendo en cuenta los objetivos del trabajo y la disponibilidad de recursos .
Es importante sealar que a veces un simple ensayo de aglutinacin o pre-
Estas tcnicas se fundamentan en la reaccin antgeno-anticuerpo y consti- cipitacin puede brindar la informacin que se neces ita.
tuyen una parte importante de la Inmunoqumica. Tienen una gran aplica-
Es lgico que, entre varios mtodos, se elija aquel que presenta la mayor
cin en la medicina humana y veterinaria, la fitopatologa, la biologa, la
sencillez de manipulacin. El mtodo ms sencillo por lo general es el ms
bioqumica, la microbiologa y en otros campos.
rpido, no necesariamente por el tiempo total hasta la obtencin del resulta-
Los inmunoensayos permiten detectar y cuantificar antgenos y anticuerpos, do, sino por el tiempo laboral invertido en su ejecucin. Un mtodo sencillo
debiendo disponerse para ello del anticoerpo o del antgeno especfico, res- y rpido es muchas veces tambin econmico. Por lo menos lo es en cuanto
pecti vamente. al tiempo de trabajo invertido en el ensayo. A_qu hay que considerar tam-

116 117
bin los precios nacionales ~ extranjeros de reactivos y su a.;ccsib1l idad. SENSIBILIDAD, DET ECTABILIDAD, EXACTIT UD,
inversiones en eq:.iipos, su mantenimiento y amorti zacin La disponibilidad PRECISIN Y F:SPECIFIC lD -\ D
de reactivos y equipos nacionales puede ser un factor importante a la hora
de tomar decisiones . En todo esto se fundamenta la tendencia actual en el Scnsib1i1dad, lmite de detecc1on o detectabilidad, exactitud y precisin son
tcrrnmos que con frecuencia ~~utilizan indiscriminadamente y que es nece-
mundo con relacin a las llamadas tecnologas apropiadas .
sano distinguir con cland.1d p:ua poder interpretar correctamente los resul-
T ABLA VIII. Tcn icas se ro lgicas de frecuen te u til izacin tados experimentales.
en n uestro med io _ La sensibi/Idad se define por la curva dosis-respuesta (Figura 27), y se
a) BASADAS EN EFECTOS SECUNDARIOS corresponde con el cambio en la respuesta (dR) por unidad de reactante
De aglutinacin: (d<.. '), por lo que se expresa como dR..dC (no necesariamente constante) .
Esto :.1gmfka que aquel:a tecnica capaz de responder con una diferencia
Aglutinacin directa de bacterias, eritrocitos, espermatozoides u otras celulas
mayor a un~ pequea \.ariacin del reactante es la ms sensible. Corriente-
Hemaglutinacin pasiva meme cuando se hab 1a de sens1bil1dad no se refiere a esto, sino a la cantidad
Aglutinacin de partculas de ltex de poliest1reno menor de reactante qut: puede dete.;:tar la tcnica. Esta propiedad corres-
po nde a l lmite de d f! tecc1ri o d 0 1ectab ili1,.'ad. Por defini cin, la
De precipitacin:
detectabilidad de un mtodo es igual a dos .:iesviaciones estndar (2 OS),
Inm unodifusin doble o tcnica de Ouchterlony determinada OS de n:.,estras rcpetid'is. Por lo tanto, un valor igual a 2 SOS
Inmunodifusin radial es detectable, o sea. se pul"de distinguir de cero con una probabilidad del
Contrainmunoelectroforesis 95 ~o . Cuando se hab la de mejor o mayor dctectabilidad se est refiriendo a
que la tcnica es capaz de denotar cantidades menores de analito. En la
Inm unoelec troforesis
Tabla IX aparecen ios limites de deteccion de .ilgunas tcnicas serolgicas .
De neutralizacin :
Toda tcnica serologica, para un sistema experimental dado, tiene un limite
Neutralizacin de virus o toxinas de deteccin. La sensibilidad es caracterstica de tcnicas como el RIA, el
Lisis celular: ELISA o la precipitacin cuantitativa, en las que es posible medir con obje-
Fijacin del complemento tividad la reaccin antgeno-anticuerpo y, por lo tanto, dR!dC. Esto no suce-
de con tcnicas como la inmunoaglutinacin o inmunodifusin convencional,
b) QUE UTILIZAN MARCADORES
por el carcter subjetivo de la valoracin, aunque se evidencian diferencias
Marcador en la intensidad de los aglutinados y lneas de precipitado que se correspon-
Radioinmunoensayos (RIA) Istopo radioactivo den con variaciones en las concentraciones de los inmunorreactantes .
Inmunofluore scencia Fluorgeno Una cierta confusin existe con respecto a los trminos exactitud y preci-
Ensayos inmunoenzimticos sobre fase slida Enzima sin. La exactitud es el grado de correspondencia entre el valor obtenido
(ELISA) con cierto mtodo y el valor real o un valor estndar aceptado. La misma
est influida por errores sistemticos: buena exactitud significa que no hay
Ensayos inmunoenzimahistolgicos (EIH) Enzima
errores sistemticos . Estos (efectos de la conservacin de los reactivos,
Inmunomicroscopa electrnica (IME) . Compuestos electrn mala calibracin de las pipetas y otros) pueden minimizarse por evaluacin
densos
sistemtica de los reactivos, las pipetas y otros instrumentos de medicin .

118 11 9
La exactitud depende del principio de la rc:accin y del material problema .

-
a::
_..
R1/R / 3 ,'///2
Tienen influenctas sobre ella la"espccific1dad del mtodo y reacciones o
interferencias secunda.ras sobre la reaccin indicadora. Por lo tanto, no se
puede determinar la exactitud de un mtodo para la distincin de cierta
sustancia en agua. cuando en la practica se va a dosificar en suero.
_La precisin de un mtodo se define como la dispersin de los datos obte-
o
.....
(/) nidos para una muestra procesada varias veces, y est limitada por errores
QI
::>
a.
accidentales . Estos pueden deberse a pequeas fluctuaciones en las medi-
(/)
QI
ciones, variaciones en la 'temperatura, 'composicin inica de la muestra y
a: otros; adems, pueden minimizarse con el empleo de estndares, aunque no
es posible evitarlos completamente . Los mtodos automatizados, al eliminar
:' 4 /( 5
Concentracin ( C)
e -- ---e a lgunos de estos factores , tienen generalmente mejor precisin que los m-
todos manuales.
'
En la prctica. el estudio de la precisin incluye:
Figura 27. Los concepto.;; de scn~ibilic.iud (.:R dC) y detectabihclad lmite de d.:tecc16n) se
presentan en el cuadro 1 El sistema A tiene detcctab1lidad mavor (habilidad para detectl!I
pequeas cantidades) que el sistema B, mil!Tltras que este: es ms sensible (respuesta mayor - Repetibilidad, que es la precisin en serie, o sea, ta precisin cuando se
a cambios ligeros de concentracin). Los conceptos de precisin y exactitud se ilustran en los procesan muestras iguales una tras otra en condiciones idnticas el mis-
cuidros 2-5 , en los que las lneas interrumpidas muestrar, Ja rel~ci n 1.oorica, y las lnc::iH mo da.
slidas c.on los puntos, Jos resultados expenmentales El cuadro 2 muestra mayor precisin
(desviacin estndar peque\a) pero baja exactitud:. 3. prL-cisin y exacutud altas; 4. prec.i sin
y exactitud bajas; y 5, muestra baa p1ecisin pero exactitud alta. - Reproducibilidad, que es la precisin cuando muestras iguales se proce-
san una cada da, es deci r, la pre.cisin de da a da.
TABLA IX. Lmites de deteccin para la determinacin de
antgenos y anticuerpos por 1 mL Para defin ir la precisi n, en trminos g enerales , se recomienda la
reproducibilidad; cuando no se puede determinar, se utiliza la repetibilidad.
Tcnica Limite de deteccin La reproducibilidad y la repetibihdad se determinan con DS, o mejor con ei
Inmunodifusin doble en agar coeficiente de variacin CV = DS. 100/X.
50- 100 g
(Ouchterlony)
La diferencia entre exactitud y precisin es evidente. Un mtodo puede ser
lnmunodifusin rdial < 10 g
altamente exacto pero de poca precisin, y viceversa. Los conceptos de
Contrainmunoelectroforesis < 1 g exactitud y precisin se pueden representar. segn Bttner ( 1970), en forma
Electroforesis en cohete < s g de tiros sobre un blanco (Figura 28).
Fijacin del complemento 10 ng Aquellas tcnicas, como la inmunod.ifusin radial (CV> JO%). cuyos resul-
Inmunoaglutinacin 10 ng tados presentan altas desviaciones estndar son poco precisas . Lo mismo
Ensayo inmunoenzimtico < 10 ng sucede con las tcnicas que emplean dj)uciones seriadas del reactante. El
Inmunoluorescencia < 0,0 1 pg
ttulo en funcin de la dilucin lmite en tcnicas como la inrnunoaglutinacin
y la inrnunofluorescencia, debido a la subjetividad de las determinaciones,
Radioinmunoensayo < 0,0 1 pg
puede fcilmente ser dos veces mayor o menor que el observado, siendo el
Tomado de: Behrmg Diagnostic Ma1111a/ 011 Proteinology a11d lmm1moassays. 2da edicin, ttulo preciso totalmente inexacto.
B<::hnng Diagnosti;,.s (N~w .Jcrse", 1977).
12
Errores No hoy Accidenta les Sistemticos Casos + por El isa . 100
Detectabibdad comparada = Casos + por tcnica de referencia

Precisin
Exactitud
@@Buena
Bueno
Molo
Buena
Bueno
Malo
Especificidad comparada
=
96
100
. 100 =96 %

Casos - por El isa


= Casos _ por tcnica de referencia
. 00
1

98
Figura 28. ExactauJ y prec1s1n = 100 =98%
100
La especificidad, otro trmino con frecuencia mal empleado, debe referir-
se al grado de discriminacin del ensayo entre muestras pos'itivas y negati- En este _caso la tcnica es confiable porque tiene un alto por ciento de
vas . detcctabilidad y especificidad (> 95 %). Es capaz de detectar el 96 % de los
casos infectados con el virus, aunque el 4 % de ellos no son registrados
CONFIABILIDAD DE LA TCNICA (falsos negativos), posiblemente debido al lmite de deteccin del ELISA.
En cuanto a la especificidad, slo fue capaz de registrar dos casos falsa-
~ menudo Ja delimitacin de antgenos o anticuerpos se utiliza como mto- mente positivos .
do indirecto para diagnostica:- una determinada enfermedad o reconocer
Es posible aumentar la detectabilidad en una tcnica en detrimento de la
la presencia de un agente patgeno\En ese caso es imprescindible conocer
especificidad. modificando las condiciones experimentales. Este cambio debe
la confiabilidad o seguridad de la tcnica. Para ello se deben calcular la
ser valorado Si se trata de un ELISA para pesquisaje de SIDA, es ms
detectabilidad y especificidad comparadas, tomando como referencia un
importante no perder nmgn caso positivo. aun cuando la tcnica tenga un
mtodo bien establecido y seguro.
menor por ciento de especificidad comparada, ya que los falsos positivos
Un ejemplo seria el de un ELISA para determinar la presencia de anticuerpos sern esclarecidos con las pruebas confirmatorias.
en personas infectadas con el virus X, al emplear como tcnica la referen-
cia del aislamiento del virus . El estudio se realiza con 200 personas :
PREPARACIN DE DILUCIONES DOBLES
l 00 infectadas con el agente (casos +) y 100 supuestamente sanas en las
que no se registr la presencia del virus (casos-). En las 200 personas se Material
ensay la presencia de anticuerpos anti-X en el suero mediante el ELISA.
Los resultados fueron los siguientes: - Antisuero o solucin de antgeno

Casos+ Casos - - Salina fisiolgica u otro diluente

Resultados + 96 2 Tubos de ensayo, tubos Eppendorf o placa de microtitulacin

del ELISA - 4 98 - Pipetas bien calibradas


--
100 100

122 123
Mtodo Ley de la volumetra . V,C, = 1
v:
, donde i significa inicial y f, final ; y los

1. Calcular previamente el volumen X que se va a preparar de cada dilu- dos volmenes i-: y VI' y las concentraciones C, y C deben estar expresa-
dos en las mismas unidades. 1
cin. Este volumen debe ser, por precaucin, mayor que el que se re-
quiere para los ensayos. Mrodo
2. Aadir en cada uno de los tubos o en los pozos de la placa de 1. Determinar previamente el volumen que se va a preparar de la solucin
microtitulacin un volumen X del diluente Se requieren tantos tubos o final (V).
pozos como diluciones a preparar.
2. Calcular el volumen que se necesita de la solucin injcial <i-:> para prepa-
3. Aadir al primero de ellos un volumen X del antgeno o del anticuerpo rar V, a una concentracin determinada (C/ Despejar V, de la frmula :
que se va a diluir. Homogeneizar bien, cargando y descargando cinco
veces la pipeta. y evitar la formacin de espuma. Esta mezcla corres- V - V C
ponde a la dilucin 1/2 (o 1:2) . 1 - --

e,
4 . Pasar un volumen X de la dilucin l/2 al rubo o pozo siguiente. Homoge-
neizar bien y cuidadosamente, as como prevenir la fomiacin de espu- 3. Calcular el volumen de diluente (Vdil) que se requiere para hacer la dilu-
cin:
ma. Esta dilucin es la 1/4 .
5. Continuar en la misma forma hasta completar las diluciones requeridas vd.i = V, - i-:
(1/8 ; l / 16; 1/32 ... ). 4. Medir con exactitud el volumen de diluente, verterlo en el recipiente
6. Utilizarlas en un corto periodo De lo contrario, cubrir bien el recipiente adecuado y aadirle la cantidad previamente calculada (V) de la solu-
que las. contiene. Desecharlas una vez que hayan sido usadas . cin original. Cuando se preparan volmenes mayores, utilizar balones
aforados Homogeneizar bien y cuidadosamente.
Observacin
5. Si no se utiliza la dilucin al momento. cubrirla bien para evitar la evapo-
Recuerde que a la solucin original (sin diluir o diluida) le corresponde dilu- racin de lquido. Desecharla una vez que haya sido utilizada.
cin l/l . Para montar el ensayo puede utilizarse una misma pipeta o punta
Cuando i-: no es medfle porque es muy pequeo o no tenemos pipeta de
para todas las diluciones, si comienza por la dilucin mayor (menor concen- ese volumen :
tracin) y va progresivamente hasta la menor (mayor concentracin), des-
cargando bien la punta antes de tornar la siguiente endulzndola con la Mtodo
nueva dilucin.
1 y 2. Esto deriva del clculo anterior. Por ejemplo, ~ = 2,5 L y la pipeta de
menor capacidad disponible es de 5 L .
PREPARACIN DE DILUCIONES APLICANDO
3 . Aplicar la ley de la volumetra para cakular V,. y darle a ~ el volumen
LALEYDELAVOLUMETRA
ms pequeo que se pueda medir, en este ejemplo, 5 L . Despejar V, :
Material
Vf
ve
__ ,_,
El mismo que en el mtodo anterior, adems de probetas y balones afo- -
rados .
c.r
124 125
4. Calcular el volumen de diluente que se requiere para la dilucin
(Vd~ = V1 - V).
5. Medir exactamente el volumen de diluente, verterlo en el recipiente ade-
cuado y aadirle el V, de la solucin original. Homogene1z.ar bien y cuida-
dosamente. Si los volmenes son mayores, emplear balones aforados.

Observacin
Cuando se utiliza como expresin de la concentracin 1/2: 1/ 100: 1/6 400 .. , CAPTULO III
recuerde que a la solucin original le corresponde C, = l/l = 1. Ejemplo:
Qu volumen de antisuero (V,) se debe tomar para preparar 250 mL (V) REACCIONES Y TCNICAS
de una dilucin l/20 (C )? Clculo : V, 1 = 250 l/20 , despej ando
1
V,= 250 1/20 = 12,5 mL . Cuando V, es demasiado pequeo (menos del DE INMUNOPRECIPITACIN
l % del V), no es necesario restarle al volumen total (V) el V, para calcular
la cantidad de diluente necesaria. En se caso VcW = Vf . ""
Cuando una solucin de antgeno multivalente y soluble se mezcla con su
antisuero correspondiente. el antgeno se combina muy rpidamente con el
anticuerpo y, si las cond1c1ones son adecuadas para los inmunorreactantes,
forman agregados prec1p1tantes o floculantes . Se suele llamar a estos
antgenos prec1p11gcnns ) a los anticuerpos, prec1p1tinas. La reaccin
puede efectuarse en mecho liquido~ sem1slido (gelificado). Esta ltima se
conoce como inmunodifusin .
La inmunoprecipita~el mtodo ms simple y directo para la demostra-
cin de reaccione~n el laboratorio.

INMUNOPRECIPITACIN EN MEDIO LQUIDO


La precipitacin en medio lquido puede ser semicuantitativa o cuantitativa .
En la primera, la cantidad de precipitado fonnado dentro de capilares se

Se refiere a Ja reac.cin de tloculacin, en Ja q~ el antgeno solubley el anticuerpo prepitan


solamente en w1 rango muy estrecho de relaciones de concentracin Ag/Ac, debido a la
solubilidad de Jos complejos fonnados, tanto en exceso de Ac como en exceso de Ag. Estas
reaccion':!s se obtienen solamente con ciertos antisueros: ejemplo: antisuero de caballo
contra Ja toxina diftrica.

127
126
mide en milmetros: y en la segunda, al precipitado formado en tubos cni- precipitado El mximo de precipitado se encuentra en el tubo con la
cos se le determiria la concentracin proteica por los mtodos convenciona- relacin anticuerpo/antgeno ptima.
les de determinacin de protenas . 5. Conociendo RO preparar el rango de antgeno para la precipitacin cuanti-
Para efectuar la precipitacin cuantitativa resulta ventajoso conocer preVla- tativa, de la siguiente forma: cuatro tubos que contengan el 20; 40; 60 y
mente la relacin aproximada anticuerpo-antgeno ptima (RO) con vista a 80 % de la cantidad equivalente de antgeno (zona de exceso de anticuer-
seleccionar el rango de cantidades de antgeno ~ convenieme. RO puede po); un tubo para la equivalencia (RO), y tres tubos que contengan respec-
determinarse por el mtodo de preci pitacin rpida en medio lquido, con el tivamente l ,5 ; 2,0 y 2,5 veces la cantidad equivalente de antgeno (zona de
ejemplo de diferentes relaciones anticuerpo/antgeno. RO corresponde a exceso de antgeno). Debe prepararse un tubo que slo contenga tampn
aquella relacin donde aparezca ms rpidamente el inmunoprecipitado. Esta (sin Ag), el cual siga todo el experimento (el blanco). Puede utilizarse un
relacin tambin puede determinarse por inmunodifysin semicuantitativa. segund0 control con antgeno y suero normal (Williams and Chase, 1971).
Observacin
Precipitacin rpida semicuantitativa en medio lquido
Puede prepararse, en vez de un solo tubo para la equivalencia, dos o tres
para determinar RO
tubos que contengan rangos estrechos de antgeno alrededor de la cantidad
Material equivalente de Ag, para hacer ms exacta la medicin del contenido de
anticuerpos en el inmunosuero. El rango de antgeno variar de acuerdo con
- Antisuero
el contenido de anticuerpos en el antisuero.
- Tubos de ensayo
- Antgeno Precipitacin cuantitativa en medio lquido (Hudson and Hay, 1980)
Gradilla Materia/
- Medidor de tiempo - Antisuero, en este caso, anti-albmina de suero humano
- Salina tamponada en fosfato (PBS) (KHl0 4 3,63 g; NafiP0 4 l2 H,0 - Albmina de suero humano (HSA) 1 mg/mL
14,3 g; NaCl 50 g, para l L de 8i0 destilada. (Diluir l/10 para utilizar.)
- Salina tamponada con fgsfato (PBS) (la misma que en la tcnica anterior)
Mtodo
- Hidrxido de sodio O, l m@l/L
l . Adicionar a una serie de nueve tubos las siguientes cantidades de
antgenos: O; 20; 50; l 00; 150; 200; 250; 350 y 450 g . - Tubos adecuados para centrifugacin, preferiblemente cnicos, en este
caso, con capacidad para 3 mL
2. Aadir PBS a cada tubo hasta un volumen de 0,45 mL .
- Pipetas
3. Adicionar O, l mL del antisuero ( sin diluir) al primer tubo, mezclar inme-
diatamente y medir el tiempo que demora en aparecer el precipitado. - Agitador mecnico
Proceder de la misma forma con cada tubo. Determinar RO, que co- - Incubadora
rresponde al tubo donde aparezca ms rpido el inmunoprecipitado.
- Centrfuga refrigerada con rotor de ngulo mvil
4. Si es necesario, incubar primero 30 minutos a 37 C y despus 30 minu-
tos a 4 C. Centrifugar a 2 500 rpm durante media hora. Observar el - Espectrofotmetro

128 129
12. Calcular el nmero de determinantes ant1gnicos disponibles sobre cada
Mtodo
molcula de HSA (valencia antignica), si sabemos que la masa molecular
l. Se determin previamente la relacin Ac/Ag ptima (RO) y se selec- de la IgG es 150 000 Da y la de Ja HSA, 68 000 Da .
cion el rango conveniente de Ag.-
' Observacin
2. Adicionar a una serie de tubos los siguientes microgramos de antgeno
O; 10; 20; 50; 100; 150; 200 ; 250~ 350 y 450. El contenido proteico del inmunoprecipitado puede estimarse por otras
tcnicas, como el mtodo de Lowry o el de Kjeldahl .
3. Aadir PBS a cada tubo hasta un volumen de 0.45 mL .
4 . Adicionar O, 1 mL del anti suero (sin dilu ir) a cada tubo y mezclar los INMUNODIFUSIN (Ouchterlony y Nilsson, 1973)
reactantes con un agitador mecnico.
La difusin de un soluto en medio lquido es un proceso en el cual la sustan-
5 . Incubar a 37 C durante 1 hora o a 4 C toda la noche. En la investiga-
cia es transportada de una parte a otra del fluido como resultado del movi -
cin estas incubaciones pueden e~tenderse hasta 1O das a 4 C, pero en
miento catico de las molculas, con una tendencia a igualar la concentra-
las prcticas docentes es posible obtener buenos resultados con 30 mi-
nutos de incubacin a 3 7 C y 30 minutos a 4 C.
cin del soluto en el medio. ~ :- ~ :
La velocidad de migracin de Ja sustancia es proporcional al gradiente de
6 . Centrifugar a 2 500 rpm durante 30 minutos. remover y conservar los
concentracin por el coeficiente de difusin de la sustancia, de acuerdo con
sobrenadantes. Debe emplearse un rotor de ngulo libre para que el
la ley de Fick:
precipitado se fonne al costado del tubo. Drenar los precipitados duran-
te 2 minutos. . dQ!dt = - DA dC/dx
7 . Ensayar cada sobrenadante para determinar antgeno o anticuerpo li- donde Q es la cantidad de sustancia que difunde a travs del rea A en un
bre. Puede.utilizarse Ja inmunodifusin radial simple. tiempo t; D es el coeficiente de difusin, que depende del tamao de la
8. Lavar el precipitado dos veces por centrifugacin con PBS fro . Para molcula; y dC!dx es el gradiente de concentracin.
ello aadirle 0,2 mL de PBS y resuspenderlo con agitacin mecnica. Debe tenerse en cuenta las siguientes caractersticas del proceso de difu-
despus verter 0,8 mL del diluente frio por las paredes del tubo y volver sin: 1) Un incremento de la concentracin inicial de la sustancia que difun-
a agitar. Centrifugar 15 minutos. de tiende a incrementar el ritmo de difusin. 2) Un aumento de la tempera-
9 . Redisolver el precipitado con hidrxido de sodio 0.1 mol/L (el volumen tura incrementa el valor de D. 3) D varia inversamente con la raz cbica
depende de las cubetas disponibles para leer en el espectrofotmetro) . del volumen de la molcula en solucin. 4) La distancia recorrida por cual-
quier cantidad de soluto varia directamente con la raz cuadrada del tiempo
JO. Leer la extincin a 280 nm y plotear un grfico de DO del de difusin.
inmunoprecipitado contra la cantidad de antgeno adicionada.
En la difusin en medio fluido a menudo es dificil evitar disturbios inducidos
11 . Calcular el contenido de anticuerpos por mililitro de suero conociendo por corrientes mecnicas y .trmicas . Una fonna de resolver esta dificultad
que: es emplear un medio gelificado, por ejemplo, gel de agar o gelatina. El gel
la DO a 280 nm de una solucin de IgG de 1 mg/mL = 1,439 forma una estructura parecida a una red que estabiliza el lquido por largos
perodos y previene las corrientes convectivas . Si el tamao de los poros de
la DO a 280 nm de una solucin de HSA de 1 mg/mL = 0.530
la red es mucho mayor que el de las partculas de la sustancia que _9.ifunde..y.. . ._
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130 131 : ~ ':. '-'</~;.~


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no hay reaccin quimica o fisica con el agente gclificante, puede asumirse Para un espesor de 2,0 mm
que se cumple la ley de la difusin libre. Se ha observado que, si la concen-
tracin del agente gelificante es suficientemente baja, el ritmo de difusin X mL de agar = 2,0 rea de la lmina
para muchas sustancias de pequeo tamao es muy similar en un fluido y en Para aumentar la adhesin del agar se aplica a la lmina una fina capa de
el correspondiente medio gelificado. Sin embargo, la difusin de molculas agar y se seca a 80 "C en una estufa antes del recubrimiento.
mayores puede ser impedida o retardada si la concentracin del agente
gelificante es muy elevada. Por ejemplo, el dimetro promedio del poro de Las reacciones serolgicas en med io gelificado o reacciones de
un gel de agar al 2 % ha sido estimado alrededor de 3 m . inmunodifusin, pueden clasificarse como simples o dobles. En la inmunodi-
fimn simple se establece un solo gradiente de concentracin para uno de
En la prctica serolgica se utiliz.a gel de agar* o de agarc>Sa al 0,3-1 ,5 % que los inmunorreactantes, mientras el otro permanece fijo. El medio de difusin
permite la migracin libre de la mayora de los inmunorreactantes (antgenos y
anticuerpos). La formacin de gradientes de concentracin admite el estable-
lo contiene a una concentracin relativamente baja; mientras el correspon- llr
diente reacrante, a una concentracin mayor, difunde de una fuente externa
cimiento de zonas ms o menos estrechas en el medio donde la relacin de (pozo cortado en el gel) a travs del medio semislido. En la inmunodifasin
reactantes es favorable para la precipitacin; fuera de ellas la agregacin no dob le se establecen gradientes de concentracin para los dos
tiene lugar debido al exceso o carencia de reactante. Cuando se fonnan los inmunorreactantes. El antgeno y el anticuerpo difunden libremente el uno
inmunoprecipitados en un gel de agar a las concentraciones antes menciona- hacia el otro desde fuentes externas y separadas (pozos separados) en un
das, el tamao de los agregados rpidamente excede el dimetro de los poros, gel serolgicamente neutro.
lo que impide su difusin, y aparece una lnea opaca visible de color blanco
correspondiente al inmunoprecipitado. Si el material de ensayo contiene dos o Los mtodos simples y dobles pueden estar adems caracterizados por la
dimensin empleada. Existen tcnicas unidimensionales (inmunodifusin en
ms sistemas precipitantes, se induce la formacin de un espectro de lneas de
tubos) y bidimensional (difusin radial, en placas). Otras tcnicas ms com-
precipitado donde cada una corresponde a un par antgeno-anticuerpo. Sin
plejas, como aquellas en que interaccionan varios sistemas de precipitacin,
embargo, no siempre pueden evidenciarse todos los sistemas Ag-Ac cuando reciben el nombre de sistemas combinados.
se trabaja con mezcla5 complejas, y es por esto que se habla del nmero
mnimo de pares Ag-Ac . Variando las concentraciones de los Aunque la formacinde complejos Ag-Ac en un medio semislido depende
inmunorreactantes, es posible visualizar algunos de esos sistemas. de la presencia de electrlitos en el medio, del pH y de la temperatura, el
factor ms importante de la reaccin son las concentraciones relativas de
Por lo general se trabaja la inmunodifusincon una capade agarde 1,5-2,0 mm
antgeno y anticuerpo. Los fenmenos de zona a menudo nos conducen a
de espesor. Para calcular la cantidad de agar necesaria slo se necesita interpretaciones errneas de los resultados .
conocer el rea de la lmina o caja que servir de soporte al gel y aplicar la
frmula: Ajustando cuidadosamente las concentraciones de antgeno y anticuerpo,
las tcnicas de inmunodifusin pueden brindar informacin acerca de las
Para un espesor de 1,5 mm
relaciones entre los antgenos, la complejidad de los sistemas antignicos, la
X mL de agar = 1,5 rea de la lmina especificidad de los anticuerpos y las concentraciones de los
inmunorreactantes, entre otras .
El agar est compuesto de dos polisacridos: agarosa y agaropectina. Los grupos sulfato y
carboxilo del agar nativo estn acumulados en la porcin de agaropectina, mit:ntras que Ja Existen numerosas variantes de las tcnicas de inmunodifusin. En esta
agarosa es un polisacrido neutro. La agarosa muestra escasa propiedad electrrendoosmtica obra se explican la inmunodifusin radial, algunas variantes de la inmunodi-
y posee una baja capacidad de absorcin para sustancias bsicas, lo que la hace el medio de
seleccin para trabajos de electroforesis e inmunodifusin. fusin doble, la inmunoelectroforesis, la contrainmunoelectroforesis y la
inmunoelectroforesis en cohete. Por la aplicacin prctica en este campo
132
133
de trabajo se presenta, adems, la electroforesis de zona de protenas que a menudo require 48-72 horas de difusin . De modo alterno el mtodo
sricas . de Fahey permite la medicin de los anillos antes del desarrollo completo
(menos de 24 horas) . En esta modificacin el logaritmo de la concentracin
Inmunodifusin radial simple o cuantitativa (mtodo de Mancini) del antgeno es proporcional al dimetro del anillo.
En 1965 Mancini introdujo esta tcnica al emplear la irununodifusin simple Con los dimetros correspondientes a los estndares de concentracin co-
para la determinacin cuantitativa exacta de antgenos mediante la incorpo- nc>eida se traza la curva patrn que sirve para determinar la concentracin
racin de anticuerpos especficos en el agar. La inmunodifusin radial (IDR) del antgeno (Figura 30).
est basada en el principio de que existe una relacin cuantitativa entre la o
'O
cantidad de antgeno colocada en un pozo horadado en la placa de agar-
anticuerpo y el anillo de precipitado resultante (Figura 29).
.,,o...a
:::> 111
c.> o
y.~
El antgeno a cuantificar y varias diluciones del antgeno estndar (o mejor o=
varios estndares) son colocados en pozos sucesivos . El antgeno difunde a o'c
partir del pozo, formando un gradiente de concentracin. Al comienzo est
!: o
presente en una concentracin relati van1ente alta y crea complejos solu- eo111
Q)

o-
bles; onforme el antgeno difunda ms, la concentracin va disminuyendo o
- Q>
"O L.-----.___d___
de forma continua hasta que se alcanza un punto en el que los
e del Ag est ndar
inmunorreactantes estn prximos a sus concentraciones ptimas y se pro- Figura 30. Inmunodifusin radial. Curva de calibracin.
duce un anillo de precipitado (Figura 29) . La aplicacin clnica ms importante de la IDR es la cuantificacin de
protenas sricas, por ejemplo, inmunoglobulinas, componentes del comple-

~~
mento y albmina. En el caso de las inmunoglobulinas, anticuerpos dirigidos
slo contra los determinantes isotipicos Fe o de la cadena pesada (P) de la
molcula de inmunoglobulina, deben utiliz.arse, ya que los determinantes
isotipicos de las cadenas ligeras (L) se comparten entre todas las clases de
Ig. Debido a las concentraciones relativamente bajas de IgD e IgE en el
suero humano, esta tcnica se emplea para determinar las tres clases abun-

~Jlg ~ qj
dantes : IgG, IgA e IgM (Tabla X). No obstante, disminuyendo la cantidad
de anticuerpos en el agar se puede incrementar I~ detectabilidad de la tcni-
ca, por lo que es posible detectar menos de l O g de antgeno por mililitro, lo
cual permite determinar valores reducidos de inmunoglobulinas sricas (IgG,
Figura 29. Inmunodifusin radial. A, el agar contiene el ~c y los pozos se llenan con una IgA, IgM e IgD) y de otras protenas . Sin embargo, con diluciones demasia-
cantidad exacta de Ag (E). B , el Ag difunde. C, se forma el anillo de precipitado. D , por do altas no es factible la formacin de los inmunocomplejos precipitantes .
dilucin seriada del Ag estndar se forman anillos de tamao decreciente.
La IDR puede emplearse tambin para la estimacin de anticuerpos, mez-
Segn el mtodo originalmente descrito por Mancini. el rea circunscripta clando el antgeno correspondiente con el agar.
por el anillo de precipitado es proporcional a la concentracin de antgeno. Uno de los factores que ms afecta la interpretacin de los resultados en la
Este mtodo requiere que los anillos alcancen el mayor tamao posible, lo IDR es la presencia de protenas disociadas o polimerizadas . En algunos
134 135
casos es posible minimizarlo utilizando muestras frescas o convenientemen- - Controles de calidad. - Erlenmeyer Pyrex
te conservadas .
- Perforador
- Bao de agua
TABLA X. Valores nonnaJes de las inmunoglobulinas G, M y A - Azida sdica al 1O %
en el suero (mg/mL) (Biopreparados, Cuba) - Aguja
- Salina fisiolgica pH 7,2 - Papel milimctrado
Edad IgG IgM lgA - Regla para IDR o pie de rey - Mechero
Recin nacidos 8,30-12.30 0,05-0.15 0.00-0.05
- Lminas de vidrio o cajas plsticas de fondo plano - Probeta
1-3 meses 3,10- 5,50 - 0,19-0,41 0.08-0,3 4
Supt:rficie horizontal (comprobada con nivel - Termmetro
4-6 meses 2,45- 6.15 0,26-0,60 0,10-0Ati de burbuja)
7-12 meses 4,40- 8,80 0.13-0.55 0.19-0.55 - Agitador de vidno
13-24 meses 5,50- 9,70 0.35-0,81 U.l -U. 74
Mtodo ,
25-36 meses 7,05-10,75 0,42-0,80 0,34-1.08
3-5 .aos 7,00-11.60 0.38-0.74 0.70-1 ,20 1. Calcular el volumen de agar necesario empleando la frmula : 0 ,2 x rea
de la lmina. Preparar una solucin de agar al l % en SF pH 7,2 . Calen-
6-8 aos 6,70-11 ,80 0,40-0,90 0.80-1.70
tar con cuidado hasta que se lice perfectamente el agar (se observa el
9-11 aos 8,90-13 ,80 0.-'7-1 ,13 0,70-1.90 lquido transparente y claro). Aadir azida sdica al 10 % hasta una
12-16 aos 8,20-10,70 0.40-0.RO 1,00-2.00 concentracin final de 0, 1 % -(l mL por cada 100 mL de agar).
Adultos 8,55-14.65 0.75-1 ,25 1,40-2.60 2. Poner el agar licuado medido en el bao de agua a 56 C y mantenerlo en
agitacin el tiempo suficiente (aproximadamente 30 minutos) . Compro-
Esta tcnica no es muy precisa, ya que las desviaciones estndar (DS) son bar que su temperatura es 56 C . Adicionarle entonces la cantidad con-
relativamente altas, y operan,por lo general, con coeficientes de variacin veniente del antisuero (recomendada por el fabricante en el prospecto) .
(CV=DS/X IOO)mayoresdel 10%. Mezclar con la varilla cuidadosamente 2-3 minutos para que los
Los controles de calidad son imprescindibles y tanto ellos como las mues- anticuerpos se distribuyan con uniformidad en el agar. Pueden practicarse
tras y los estndares deben aplicarse por duplicado o triplicado. Las pipetas otros mtodos para homogeneizar la mezcla.
que se utilizan en el llenado de los pozos deben estar bien calibradas, pues
3 _ Colocar las lminas o cajas bien limpias. desgrasadas con alcohol y se-
una importante fuente de error es la no uniformidad en el llenado de los
cas sobre una superficie perfectamente horizontal para que el grosor de
pozos . Las mediciones deben hacerse con reglas especiales o pie de rey. la capa sea homogneo.
Material 4 . Aadir con una pipeta de punta ancha la cantidad de agar necesaria.
- Sueros problemas - Pipetas automticas Poner la pipeta en el centro de la lmina en posicin vertical, contactando
la punta ligeramente con ella _ Verter de forma ininterrumpida el volu-
- Anticuerpos monoespecficos - Cmara hmeda
men requerido. Dejar solidificar el agar a temperatura ambiente unos
- Estndares de C conocida ...: Plantilla para los pozos minutos.

136 137
5. Colocar la lmina en la cmara hmeda. Si es una caja redonda, colocar
de la columna de lquido y entonces complete el volumen requerido. Si es
en el interior de la tapa un papel de filtro hmedo. Guardar en fro al
necesario haga una marca a la placa para reconocer la disposicin de los
menos 2 horas.
reactantes Se puede hacer un pequeo corte en el agar en el extremo
6. Preparar los estndares, las mueStras y los controles de calidad. Esta superior derecho de la placa. Es importante tener en cuenta que la curva de
preparacin puede consistir en hacer diluciones del estndar o de las calibracin NO parte del origen (Figura 30). La concentracin de los con-
muestras, en este ltimo caso cuando se presume que su contenido de troles de calidad no debe variar con respecto a la reportada por el fabricante
~-:;! ~,.-.{~
~ tgeno es superior al estndar de mayor concentracin. Emplear SF. en un 10 % .
,;" "' \ . U,; '-V
0> ......7. ~ momento de montar el experimento hacer las perforaciones en el
~ :;\:\~ gel ycolocar la placa sobre la plantilla. Introducir el perforador vertical- Jnmunodifusin doble bidimensional o tcnica de Ouchterlony
./~:., mente de una sola vez hasta el fondo, retirarlo y remover el cilindro de En la inmunodifusin doble (IDD) bidimensional el antgeno y el anticuerpo,
~'~ .. . ,,--agar con la punta de una aguja, sin romper los bordes del pocillo. depositados en pocillos separados, difunden el uno hacia el otro y precipitan,
' '-'l./n ~

8. Llenar cuidadosamente los pozos con una pipeta bien calibrada (usual- formando una lnea opaca de color blanco en la regin donde se encuentran
mente 5 o 1OL) , asegurando que todos se llenen con el mismo volumen en concentraciones equivalentes . . Una preparacin que contenga varios
antgenos dar lugar a mltiples lineas de precipitado.
de inmunorreactante sin que se desborde el lquido. Ponerlos todos por
duplicado en posiciones diferentes de la placa. Se recomienda hacer un Cuando el anticuerpo y el antgeno difunden en forma radial se forma un
pozo control llenndolo con SF. Anotar la disposicin de los reactantes arco que se aproxima a la lnea recta . Los tipos de patrones producidos en
en la placa. una difusitfdobl~uestran en la Figu ra 31 .
-.
9. Poner la lmina dentro de la cmara hmeda y asegurar que esta quede Una de las aplicaciones ms tiles de la tcnica de Ouchterlony es el estu-
en posicin horizontal durante 24- 72 horas a temperatura ambiente. En dio de identidad entre dos ru;igenos . Para ello ambos antgenos. (Agl y Ag2
el caso de las placas es ms convenieme ret.irarles el papel hmedo de o Agl y Ag3) se colocan en pozos adyacentes y los Ac (aAgl y aAg2) en
la tapa y ponerlas sobre un recipiente con agua (cuidar que no les entre un tercer pozo equidistante y situado por debajo de los dos primeros. Cada
lquido). reaccin antgeno-anticuerpo forma su propia lnea de precipitado entre los
10. Medir con el mayor rigor posible los dimetros de los halos de precipita- pozos . Como se muestra en la Figura 32, esta podr extenderse a una mis-
do y promediarlos (si se mont el experimento por duplicado). ma distancia a ambos lados de los pozos . Esto se refiere a sistemas combi-
nados y los patrones que se describirn corresponden, adems, a sistemas
11 . Si la medicin se efecta a las 24 horas o en un tiempo menor, trazar el balanceados .
grfico dimetro al cuadrado (d") contra log 10 de la concentracin de
los estndares . Si se efecta a las 72 horas (tamao mxuno de los La comparacin est principalmente basada en el registro de la presencia o
ausencia de interaccin entre las dos lneas de precipitado. Este fenmeno
halos), traz.arlo contra la concentracin de los estndares . Interpolar en
esa curva el d 2 de los controles de calidad y de las muestras para calcu- puede caracterizarse por desviacin, fusin o inhibicin de las lneas de pre-
cipitado (Figura 32).
lar su concentracin.
Tres tipos principales de reaccin pueden ser diferenciados:
Observacin
Tipo l. Las lneas de precipitado de cada lado se desvan y fusionan comple-
Vigile el agar mientras se funde para evitar su derramamiento. Para que no
tamente en el rea central. Por tratarse de un sistema halanceado, el arco
se desborden los pozos espere unos segundos hasta que descienda el nivel
formado por las dos lneas fusionadas es simtrico. La reaccin indica la.
138 139
presencia de determinantes antignicos idnticos en los reactantes compa-
rados . La reaccin de identidad entre un patrn y una proteina purificada es
una forma de identificar esa proteina . Se debe sealar que las lneas l II 111
confluyentes indican identidad inmunoqumica en trnunos del antisuero uti-
lizado y no identidad molecular. Por ejemplo, anticuerpos purificados contra
el hapteno dinitrobenceno dan una lnea de confluencia cuando se enfren-
e 8
fe'\
tan, en la forma descrita, a los conjugados dinitrobencen~voalbmina y
dinitrobenceno-albmina de suero bovina.
~
~ 8
Figura 32 . Relaciones de identidad entre dos antgenos investigadas por inmunodifusin

e G
doble <Ouchterlony).
l. Reaccii de identidad.
Il. Reaccin de no identidad.
111 Reacx:in de identidad parcial.

Tipo J/. La ausencia de interferencia es lo ms evidente cuando las dos


lneas de precipitado se cortan extendindose ms all del rea central don-
de ocurre el cruzamiento. Este patrn de reaccin indica que no hay rela- .
2
G 8 cin inmunoqumica entre ambos antigenos.
Tipo 111. Muy similar al tipo 1 con la excepcin de que la fusin de las lneas
es incompleta, por lo cual se forma un saliente o espoln sobre el arco de
interferencia. Esta reaccin indica una relacin inmunoqumica pero no iden-
tidad de los antgenos comparados, aunque a veces se le denomina identi-
dacI parcial. Este es el caso de los antgenos que presentan epitopos comu-

3
e e nes . Mientras menos relacionados estn los antgenos, el espoln es ms
pronunciado y muestra menos desviacin . Cuando dos sistemas heterlogos
son comparados por medio del mismo antisuero, el espoln se extiende
hacia la fuente del antgeno menos relacionado con el anticuerpo.
Variaciones de estos tipos de patrones pueden observarse en sistemas no
Figura 31 . Patrones de reaccin en la irununodifusin doble. 1, el Ag y el Ac reaccionan en balanceados (Ouchterlony y Nilsson. 197'3). Cuando la concentracin de
forma equidistante y gran intensidad (equivalencia). 2. el antgeno est presente en concentra-
uno de los inmunorreactantes comparados est por debajo del valor umbral
cin reducida o no ha difundido con tanta rapidez debido a su mayor tarnax1o. por lo que se
fonna una lnea de precipitado ms cercana al pozo con el antgeno. La lnea estara ms para la formacin de un precipitado visible, su presencia puede revelarse
cercana al pozo del anticuerpo si este est a menor concentracin o tiene masa molecular por la desviacin inducida en el patrn del lado opuesto. Sistemas altamente
mayor que el Ag. 3, existe ms de un sistema de reaccin Ag-Ac. Si se estuviera investigando desbalanceados no slo inducen bandas migratorias (mviles), sino que cau-
la pureza de un Ag, este patrn implica que tiene un contaminante o impureza. san, con eventualidad, duplicacin de lneas y la formacin de falsos espalo-.
140 141
)

nes . Tales espolones se van disolviendo gradualmente, mientras que los ver-
daderos ganan en longitud con el tiempo.
6,4 3,2 1,6 o,a 0,4 0,2 O;I mg/mL
La inmunodifusin doble bidimensional tambin puede empicarse para
scmicuantificar antgenos y antcuerpos . Este ensayo se efecta colocando .i:;
~
O O O o O O O .
el antgeno en un pozo central (por lo general a 0.1 mg/mL) rodeado
circunferencialmente por pozos que contienen diferentes diluciones del
C\I
O O O O O
antisuero . Esta forma es muy til para titular anticuerpos . De modo alterna- 5 L o n ti - H SA
tivo puede efectuarse con el antisuero en el pozo central y diluciones del
antgeno a su alrededor para medir de una manera burda la concentracin .i:;

C\I
del antgeno (Figura 33). ,.....

@ (0 Figura 31 . Titulacin de Ac mediante el mtodo de anchura y movilidad de la banda de

@~
precipitado.

@\@
@ @ La IDO semicuantitativa, efectuada previamente a la precipitacin cuanti-
tativa en medio lquido, permite establecer el intervalo de concentraciones

9@ @Q
~
de antgeno adecuado para dctem1inar con exactitud el punto de equivalen-
cia y consecuentemente el contenido de anticuerpos en el suero.
La Figura 35 ilustra un mtodo basado en el principio de que la posicin de
Figura 33 . Semicuantificacin de Ag y Ac por IDD. El Ag o el Ac se diluyen y se colocan en
la lnea de precipitado en la equivalencia est determinada por los ritmos de
pozos que rodean al pozo central.
difusin relativos del antgeno y, el anticuerpo . La posicin puede determi-
La titulacin de anticuerpos tambin puede llevarse a cabo por el mtodo de narse sobre una base emprica para cualquier antgeno soluble. La IgG hu-
la anchura y movilidad de la banda de precipitado, utiliz.ando antgeno de mana y anticuerpos contra ella obtenidos en conejo se empican para ilustrar
concentracin conocida. Este mtodo (Williarns and Chase. l 971) se funda- el mtodo.
menta en que, en la equivalencia, la lnea de precipitado es aguda, estrecha
y estacionaria. El principal requerimiento es que todos los pozos reciban la
misma cantidad de lquido una vez que hayan sido preparadas cuidadosa-
mente las diluciones del antgeno (Figura 34).
A las 24 horas el estimado de la equivalencia en la Figura 34 parece ser
ligeramente menor que 0,8 mg de HSA/mL de antisuero. A las 72 horas, sin
--
JO
~)
.~
5
o.
.
~ ...
o. -
-- .
() o
-o

embargo, la reaccin parece ocurrir entre 0,8 y 0,4 mg/mL; est claro que
0,8 mg corresponde a un ligero exceso de antgeno y 0,4, de anticuerpo. El
o O o o
verdadero punto de equivalencia de este sistema se determin a 0,55 mg/mL I OL anti-lgG
por la tcnica de precipitacin cuantitativa en medio lquido descrita con
Figura 35 . Titulacin de un anti suero co1;tra la igG htunana por el mc::todo de la posicin de Ja
anterioridad.
handa. En la equivalencia el precipitado es equidistante a los dos pozos.
142
143
Debido a que puede asumirse que la lgG humana y el anticuerpo lgG de 3. Aadir con una pipeta de punta ancha la cantidad de agar necesaria.
conejo tienen el mismo coeficiente de difusin en el agar, el precipitado en la Poner la pipeta en el centro de la lmina o portaobjetos en posicin ver-
equivalencia, adems de irunvil y agudo, debe aparecer equidistante entre tical, haciendo contactar la punta ligeramente con ella. Verter ininte-
los dos pozos. Ya que slo se considera la posicin de los precipitados rrumpidamente el volumen requerido. Dejar solidificar el agar unos mi-
tempranos, la reaccin puede acelerarse incubando la placa a 37 C . De nutos a temperatura ambiente.
esta forma los resultados se obtienen en poco tiempo (aproximadamente 4. Colocar las lminas en cmara hmeda y ponerlas en fro al menos
6 horas) y no se requiere empleo de preservativo. 2 horas.
Asumiendo que hay aproximadamente. cuatro molculas de anti-IgG hu- 5. Preparar los reactantes que se vertern en los pozos de la lmina. Hacer
mana por molcula de lgG humana en la equivalencia (Williams and Chase, las diluciones requeridas con SF.
1971) y considerando que las masas moleculares del antgeno (lgG huma-
na) y del anticuerpo (lgG de conejo) son similares, se puede obtener de 6. En el momento de montar el experimento hacer las perforaciones en el
fonna rpida un estimado de la concentracin de anticuerpos en el suero. gel utilizando el perforador, colocando la lmina sobre la plantilla. Intro-
En este ejemplo (Figura 35), al considerar la equivalencia en 5 mg de lgG/mL, ducir el perforador verticalmente de una sola vez hasta el fondo, retirarlo
la concentracin aproximada de anti-lgG es de (5 x 4) 20 mg/mL de y remover el cilindro de agar con la punta de una aguja sin romper los
bordes del pocillo.
suero .
7. Llenar cuidadosamente los pozos con pipeta Pasteur, capilar o pipeta
Material automtica (usualmente alrededor de 10 L) , asegurando que todos se
- Antisuero(s) - Pipetas llenen con el mismo volumen y que no se desborden los pozos. Se reco-
- Agar purificado o agarosa mienda hacer un pozo control con SF. Anotar la disposicin de los
- Antgeno(s)
reactantes en la lmina.
- Azida sdica al l O % - Salina fisiolgica pH 7,2
8 . Poner la lmina en cmara hmeda a temperatura ambiente du-
- Plantilla para los pozos - Superficie horizontal rante 24-48 horas.
- Lminas de vidrio o portaobjetos - Perforador 9. Observar los resultados y anotarlos cuidadosamente.
- Erlenmeyer Pyrex - Aguja Observacin
- Cmara hmeda (caja de petri con papel de filtro hmedo en el fondo)
Es recomendable acondicionar las lminas o portaobjetos cubrindolas pre-
Mtodo viamente con una fina capa de agar y cuando est bien seca aadirles el
volumen requerido de agar para hacer la capa. El agar fundido sobrante
l . Calcular el volumen de agar necesario empleando la fnnula : 0,2 x rea
puede guardarse dentro del erlenmeyer bien tapado en fro durante varias
de la lmina o portaobjetos . Preparar una solucin de agar al l % en SF
semanas. Las lminas ya recubiertas es posible conservarlas tambin du-
pH 7,2 . Calentarla con cuidado hasta que se lice perfectamente el agar
rante ese tiempo, siempre que se mantenga la humedad dentro de la cma-
(se observa el lquido transparente y claro) . Aadir azida sdica al 10 %
ra. Es conveniente hacer alguna marca o indicacin en la lmina para reco-
hasta una concentracin final de O, l % ( l mL por cada l 00 mL de agar) .
nocer la disposicin de los reactantes. Puede hacerse un pequeo corte en
2. Colocar las lminas o portaobjetosbien limpios, desgrasados con alcohol el agar en el extremo superior derecho de la placa. La reaccin se acelera
y secos sobre una superficie horizontal. notablemente (6- 10 horas suele ser suficiente) incubando la lmina a 37 C .

144 145
El mtodo aqu descrito es bsico para todas las variantes de inmunodifusin cin tampn alcalina. A este pH lamayora de las protenas se cargan nega-
bidimensional y para las inmunodifusiones en general . tivamente y migran hacia el nodo en virtud de su carga. Despus las tiras
se tien para visualizar las bandas proteicas y se leen en un densitmetro.
La absorcin variable debido a las concentraciones proteicas diferentes es
ELECTROFORESIS
descubierta por una celda fotoelctrica y reproducida por un registrador.
La electroforesis es la migracin de partculas cargadas bajo la influencia Las bandas se convierten en picos (Figura 36), y pueden ser cuantificadas
de un campo elctrico. Entre los factores que gobiernan la migracin se las principales fracciones . El suero sanguneo se separa en cinco principales
encuentran la densidad de carga, el pH del solvente, la fuerza inica y el bandas: albmina, a 1-globulina, a2-globulina, f3-globulina y y-globulina.
carcter e intensidad del campo elctrico. Tambin influyen el tamao y la La electroforesis de rona es un mtodo extraordinariamente valioso para el
forma de las partculas, la temperatura, las propiedades de adsorcin del diagnstico de trastornos con paraproteinas* humanas, como el mieloma
medio soporte y la electroendosmosis. Las diferencias en el ritmo de mi- mltiple y la macroglobulinemia de Waldestrm. Una intensa disminucin en
gracin de los componentes de una mezcla (ejemplo, suero sanguneo) con- la concentracin de la gammaglobulina srica, como ocurre en la
ducen a su separacin. hipogammaglobulinemia, tambin puede ser descubierta con esta tcnica.
Por ello, el anlisis de la heterogeneidad de las protenas individuales se Las cadenas ligeras libres (protenas de Bence Jones) se identifican con
lleva a cabo frecuentemente por electroforesis . La separacin de protenas facilidad en la orina, cuando se encuentran en concentraciones aumentadas
en un campo elctrico fue perfeccionada en 1937 por Tiselius, quien emple como en el caso de mieloma mltiple.
la electroforesis libre o de frente mvil. No obstante, debido a la relativa
Material
complejidad de este mtodo, la electroforesis de zona en un medio estabili-
zador como el papel o el acetato de celulosa ha remplazado a la electroforesis - Muestra de suero humano total (SHT)
1
libre (Stites et al., 1985). - Tiras de acetato de celulosa

Electroforesis de zona de las protenas del suero sanguneo humano - Tampn veronal 0,025 mol/L, pH 8,6 (tampn veronal 0,075 mol/L,
pH 8,6 : cido dietilbarbitrico 2,76 g: dietilbarbiturato de sodio 15,4 g;
Las protenas se separan en la electroforesis de rona casi exclusivamente agua destilada hasta l L, dilucin de trabajo l/3)
por su carga superficial . El medio soporte es, en teora, inerte y no impide ni
estimula el flujo de las molculas en e! campo elctrico. Por lo general, se - Colorante rojo Ponceau al 0,2 % (rojo Ponceau S l g; cido tricloroactico
emplean tiras de papel o de acetato de celulosa como soporte. Una ventaja 37,5 g; cido sulfosaliclico 37,5 g; agua destilada hasta 500 mL)
que ofrece el acetato de celulosa es la rapidez con que se logra la migracin - Solucin decolorante cido actico al 5 % (50 mL de cido actico gla-
electrofortica (30-60 minutos). Sobre l pueden aplicarse microcantidades cial, agua destilada hasta l L)
de protena, se adapta bien a los procedimientos de tincin y puede transpa-
- Alcohol etlico al 95 %
rentarse, lo que facilita el anlisis de los resultados . Por todas estas razones
el acetato de celulosa se emplea comnmente como medio de sostn en la - Solucin transparentadora (30 % de cido actico, 68 % de etanol y 2 %
electroforesis de zona (Stites et al. , 1985). de glicerina)
En la tcnica electrofortica las muestras de suero o de otro lquido biolgi-
Paraprotena: Protena de mieloma, irununoglobulina homognea (monoclonal) derivada de
co se colocan en el origen y se separan sometiendo la tira a un campo un clon neoplsico de clula plasmtica y en muchas ocasiones no relacionada con una
elctrico durante aproximadamente 30 minutos. con el empleo de una solu- estimulacin antignica conocida .

146 147
3. Dejar flotar la tira sobre el tampn por unos segundos y slo despus que
se haya impregnado bien sumergirla unos segundos . Secarla entre dos
papeles de filtro.
4. Colocar la tira de forma que sus extremos descansen sobre los dos puentes
A de papel que se encuentran sumergidos en el tampn.
5. Equilibrar el sistema durante 10 minutos con la corriente o el voltaje
apropiado (punto 7).

a 6. Aplicar 1,5-2 A. (1 A.= 1 L) de cada muestra en la lnea trazada, habin-


doles aadido previamente como indicador de la corrida un cristal de
azul de bromofenol. Debe guardarse una distancia de 0,5 cm entre cada
una de las muestras y entre las muestras y los bordes de la tira.
7. Tapar el equipo y efectuar la corrida electrofortica empleando corrien-
te constante (2 mA por tira) o voltaje constante (250 V).
8. Terminada la corrida, sumergir la tira -tan pronto como sea posible-
en la solucin colorante. Despus de 3-5 minutos escurrirla y hacerle
varios lavados con cido actico al 5 %.
9. Para transparentarla, sumergirla en etanol al 95 % e inmediatamente en
Figura 36. Electroforesis de zona en acetato de celulosa. A, Wla pequea cantidad de suero o la solucin transparentadora; mantenerla 5 minutos . Colocar la tira sobre
de alguna otra muestra lquida se aplica a tiras de acetato de celulosa. B, se efecta la una lmina de vidrio y guardarla en la estufa a 60 C durante 20 minutos.
electroforesis en Wl tampn adecuado.
1O. Realizar la lectura en el densitmetro.
- Papeles de filtro
Observacin
- Cristales de azul de bromofenol o solucin saturada en etanol
Evitar tocar la tira con los dedos, emplear una pinza. Recuperar las soluciones
- Aplicadores o pipetas de 1O A. de lavado que contienen colorante hacindolas pasar por carbn activado.
- Equipo para electroforesis (cubeta con su tapa y fuente de poder)
- Estufa INMUNOELECTROFORESIS (IEF)
- Densitmetro La inmunoelectroforesis combina la separacin electrofortica de sus-
Mtodo tancias de diferente carga elctrica y su posterior separacin e identifi-
cacin por inmunodifusin doble, lo que conlleva a una elevada resolu-
l . Verter el tampn en las dos cubetas electroforticas . cin de los constituyentes de una mezcla de protenas . Los dos pasos de
2 Trazar una lnea con lpiz en la tira a una distancia de 1/3 del extremo la tcnica se efectan en una placa de agar. El procedimiento se ilustra
catdico. en la Figura 37 .

148 149
En la placa de agar se perfora un pozo y, a uno de sus lados, un canal o
ranura. La mezcla de antgenos se coloca en el pozo y se separa en un
campo elctrico. Luego se sita el antisuero en el canal y se dejan difundir
antgenos y anticuerpos durante 18-24 horas . Las lneas de precipitado apa-

A 1 O - -l recen en forma de arcos.


En la inmunoelectroforesis, el gel se prepara de la forma ya descrita para
las placas de IDO, con la diferencia de que se emplea una solucin salina
tamponada en vez de salina fisiolgica. El uso de agarosa en lugar de agar
se recomienda si la electroendosmosis debe ser evitada. Generalmente se

~~
utiliza una CC1ncentracin de agar o agaroS(1. al 1-2 % y tampn veronal o
borato a pH alcalino (8,2-8,6) de baja fuerza inica (0,02-0, 1) para evitar el
. 1 calentamiento y deshidratacin del gel que se produce a altas concentracio-
nes salinas.

-j
En el anlisis de suero sanguneo humano (SITT) usualmente se emplea
tampn veronal pH 8,6 a una concentracin 0,075 mol/L con la adicin de
e1
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~~~~
~~"~o~~~
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v, ~'"~~-~-~
~--~-~ preservativo. En la cubeta electrofortica se utiliza el mismo tampn diluido
tres veces (0,025 mol/L) .
La electroforesis de protenas en agar est afectada por el flujo
.... <!

;;lfil.
electroendoosmtico. Este se produce porque el agar, al pH utilizado, se
carga negativamente por la ionizacin de grupos inorgnicos cidos. Esta
carga fija se equilibra con grupos ~o+ del solvente, el cual se mueve hacia
o1 ~" 1 el ctodo junto con sus solutos. Como consecuencia de este movimiento se
produce un aplastamiento de la capa de agar. El flujo electroendoosmtico
retrasa la migracin electrofortica de todas las protenas y provoca la apa-
ricin de arcos de precipitado, incluso detrs del punto de aplicacin, que
corresponden a las protenas de menor carga elctrica. Este fenmeno faci-
lita la identificacin de las inmunoglobulinas en el electroforetograma y, en
particular, de la IgG, pues es la protena srica que menor carga elctrica
presenta. La IgG se caracteriza por la longitud y fonna de su arco de preci-
pitado (Figura 38).
Se acostumbra aadir al SITT azul de bromofenol, que migra junto con la
Figura 37. Inmunoelectroforesis. A, el suero humano se coloca en el pozo peorado en el agar. albmina, la protena que va delante, lo que permite visualizar la migracin
B, separacin de las protenas por electroforesis. C, llenado del canal con anti-SHT.
electrofortica y parar a tiempo la corrida.
D, difusin. E, arcos de precipitado.
Frente a un anti suero humano total (aSITT) de calidad y bajo condiciones
determinadas de trabajo, es posible distinguir hasta 30 arcos de precipitado

151
~

diferentes. La posicin y la forma de estos arcos permite la identificacin y sricas. si disponemos de anticuerpos especficos para cada uno de los com-
aun la estimacin cuantitativa de las protenas sricas, aunque se debe se- ponentes del suero humano. Adems, la reaccin con el anti-SHT permite
alar que el anlisis de un patrn inmunoelectrofortico de una muestra de conocer el nmero total de arcos en la preparacin, y da un criterio acerca
suero no es una cuestin sencilla y slo puede hacerlo una persona experi- de la pureza de esa preparacin. Por tales motivos, la IEF se utiliza para
mentada. Los arcos de precipitado de cada zona deben enumerarse e iden- valorar las preparaciones de inmunoglobulinas sricas.
tificarse y su aspecto debe compararse con un suero normal de referencia.
Es necesario estudiar cada arco de modo individual; la modificacin en la
La IEF, junto con la electroforesis zonal, es corrientemente empleada para
detectar protenas de mieloma en suero humano. De manera adicional, las
apariencia puede sugerir cambios cuantitativos con respecto a la normali-
inmunoglobulinas disminuidas o ausentes que se presentan en diversas
dad. Un aumento en la concentracin de un constituyen~ srico puede cam-
inmw1odeficiencias, pueden ser analizadas por esta tcnica. No obstante, se
biar la forma del arco de precipitado de muchas maneras . La linea puede
debe practicar un anlisis cuantitativo como la inmunodifusin radial simple,
ser ms larga y diferente, o ser ms gruesa o parcialmente (o totalmente)
la nefelometra o el radioinmunoensayo para la medicin exacta de los nive-
disuelta debido a exceso de antgeno (Fig\ ra 25). En algunos casos puede
les de inmunoglobulinas.
haber una divisin secundaria, por lo que se fomlan dos arcos de prec1p1tado
que permanecen unidos en sus extremos. Una disminucin en la concentra- Aunque 1a IEF es una tcnica esencialmente cualitativa, se ha intentado
cin de un componente srico se traduce en una lnea menos intensa, que es desarrollar variantes cuantitativas {Ouchterlony y Nilsson, 1973). Se han
ms c0rta y ms delgada. Puede tambin estar completamente ausente. La hecho modificaciones que han resultado particu larmente t iles, como la
ausencia de un arco de precipitado, por lo tanto, puede deberse a un gran contrainmunoelectroforesis y la inmunoelectroforesis en cohete, esta ltima
exceso o a una gran disminucin de un componente. Para determinar cul de carcter cuantitativo .
de las condiciones est presente, se deben efectuar anlisis repetidos va-
Material
riando la concentracin de la muestra (Nerenberg, 1968).
- Suero humano total (SITT)
Seromucoide - lgG (u otra protena srica purificada)
a1-glicoproteno p1~1ipoprotena
cxl-lipopro- - IgG (u otra proteina srica) patrn
tena p1.:.yrotena
cx2- g licoproteina - Antisuero humano total (a.SITT)
- Agar o agarosa
- Tampn veronal 0,075 mol/L, pH 8,6 (ver electroforesis de zona)
- Azul de bromofenol (solucin saturada en etanol)
- Azida sdica al 1O %
Figuri: 38. Separacin irununoelectrofortica de un suero hmnano normal. - Lmina de vidrio o portaobjetos
- Perforador
El mtodo ms comn y simple para identificar un arco de precipitado es
aquel que emplea un antisuero monoespecfico. De esta forma es posible - Aguja
identificar los constituyentes desconocidos en una preparacin de protenas - Plantilla

152 153
1O. Colocar la placa dentro de la cmara hmeda en posicin horizontal e
- Papel de filtro
incubarla a temperatura ambiente durante 12-24 horas.
- Pipetas 11. Observar y anotar los resultados.
- Cmara hmeda
- Equipo de electroforesis (cubeta con su tapa y fuente de poder) ELECTROINMUNODIFUSIN

Mtodo En las tcnicas de inmunodifusin el antgeno y el anticuerpo se ponen en


contacto y precipitan en agar exclusivamente por difusin. Sin embargo, la
1. Preparar el agar al 1,5 % utilizando el tampn veronal y las placas de probabilidad de que ambos inmunorreactantes se encuentren, se puede au-
agar, b la forma ya descrita para IDO . mentar en forma notable si se impulsan mediante corriente elctrica, lo que
2. Colocar la placa sobre la plantilla y perforar los pozos y los canales . conlleva a una aparicin ms rpida de la linea de precipitado. Reciente-
Extraer cuidadosamente el agar de los pozos pero NO el de las ranuras. mente hay un inters renovado en las tcnicas de electroinmunodifusin,
sobre todo en el diagnstico serolgico de enfermedades infecciosas identi-
3. Verter en la cubeta de electroforesis el volumen necesario de tampn
ficando t antgeno en el suero. Aunque se han descrito numerosas varian-
veronal 0,025 mol/L y col~ la placa de agar entre los dos reservorios
tes acoplando la electroforesis con la difusin, slo dos han logrado un grado
de tampn con la polaridad mdicada. Conectar los extremos de la placa
apreciable de aplicacin clnica . Estas son : la electroinmunodifusin
al tampn por medio de tiras de papel de filtro de aproximadamente
unidimensional doble o contrainmunoelectroforesis y la electroinmunodifusin
3-4 cm humedecidas en el tampn. Cada tira debe cubrir a los lados de la
lmina alrededor de 0,5 cm de la capa de agar y sumergirse casi 3 cm simple unidimensional o electroforesis en cohete (Stites et al., 1985 ).
dentro del tampn.
Contrainmunoelectroforesis (CIE)
4. Colocar los electrodos y con~tar la fuente de corriente directa. Aplicar
8-1 Ovolt por cada centmetro de ancho de la placa. Cubrir la cubeta con Esta electroinmunodifusin unidimensional doble tambin se conoce como
la tapa. Ambientar la cmara durante 10 minutos . inmunoelectroforesis por contracorriente, electroprecipitacin e inmuno-
electroosmoforesis .
5. Preparar las muestras y aadir a 1 mL de SHT una gota de azul de
bromofenol. Esta ingeniosa tcnica se basa en la migracin diferencial de antgenos y
anticuerpos en la electroforesis en agar a pH alcalinos . Mientras la mayora
6. Desconectar la fuente de corriente pasados los 1O minutos y llenar cui-
de los antgenos tienen una movilidad anxlica, las gammaglobulinas migran
dadosamente los pozos con las muestras, de acuerdo con el esquema
hacia el ctodo en virtud del flujo endoosmtico. As, colocando el anticuer-
seleccionado . Anotarlo en el cuaderno de trabajo.
po hacia el lado andico y el antgeno hacia el lado catxlico, separados una
7. Cubrir Ja cubeta electrofortica y conectar Ja fuente de corriente, apli- distancia de 5-1 Omm, los inmunorreactantes se mueven uno hacia el otro y
cando el mismo voltaje. Chequearlo a intervalos de 30 minutos y ajustar- forman una lnea de precipitado cuando se encuentran en proporciones equi-
lo si fuera necesario. valentes (Figura 39).
8. Parar Ja corrida cuando la mancha azul del bromofenol est aproximada- Las desventajas principales de la inmunodifusin doble sin corriente es su
mente a 1 cm del extremo del canal. Con estas condiciones la corrida relativa baja detectabilidad y el tiempo requerido para la precipitacin
debe demorar 1-2 horas. (24 horas). La CIE puede producir lneas visibles de precipitado en 30 minutos
9. Retirar la placa, remover el agar de las canales y llenarlos con un mismo y tiene una detectabilidad 1O veces mayor que las tcnicas estndar de difu-
volumen de antisuero, en este caso, a.SHT. sin doble.
155
154
....

Las condiciones de la tcnica son similares a las de la IEF. La CIB' se aplica


2. Colocar la placa sobre la plantilla y perforar los pozos. Extraerles cuida-
en la deteccin de antgenos de importancia clnica, as como de
dosamente el agar.
autoanticuerpos en enfennedades autoinmunes.
3. Llenar los reservorios de la cubeta elcctrofortica con el tampn veronal
( 1/3) y colocar la placa de agar entre los reservorios con la polaridad
adecuada . Poner los puentes de papel de filtro y proceder a la

e - =- .e
8 "" ambientacin como en la IEF.
' 4. Preparar los inmunorreactantes.

5. Desconectar la fuente de corriente y llenar cuidadosamente los pozos


con los inmunorreactantes de acuerdo con el esquema seleccionado.
r ,
j ' '
6. Cubrir la cubeta ele 'ortica y dejar pasar la corriente, chequeando a
Figura 39. Contrainmunoelectroforesis. Se colocan el Ag y el Ac en sendos pozos y se 1 intervalos de 30 minutos y ajustndola si fuera necesario.
impulsan por una corriente elctrica. Se forma una linea de precipitado cuando se encuentran.
J ..7. Parar, la corrida cuando se hayan obtenido las lneas de precipitado
Materia/ (0,5-1 hora).
- Antgenos
'\ Electroforesis en cohete o tcnica de Laurell
- Anticuerpos
En la electroinmunodifusin simple unidimensional, el antisuero especfico
- Agar purificado o agarosa para el antgeno que se desea medir se incorpora al agar. La muestra que
- Tampn veronal 0,075 mol/L, pH 8,6 (ver electroforesis de zona) contiene una cantidad desconocida de antgeno se coloca en el interior de un
pozo. En pozos sucesivos se colocan los estndares de concentracin cono-
- Azida sdica al 1O % cida. Se efecta la electroforesis del antgeno hacia el agar que contiene el
- Lminas de vidrio o portaobjetos anticuerpo. El patrn de precipitacin resultante se asemeja a la estela de
un cohete, de donde se deriva el nombre electroforesis en cohete (Figura 40).
- Perforador
Este patrn se debe a que la precipitacin se produce a lo largo de los
- Aguja mrgenes laterales del antgeno limtrofe, a medida que el antgeno es impul-
- Plantilla sado hacia el agar que contiene el anticuerpo. Gradualmente, a medida que
se pierde antgeno debido a la precipitacin, disminuye su concentracin en
- . Papel de filtro el frente de onda y los mrgenes laterales convergen para formar un punto
- Pipetas preciso. La distancia total de migracin del antgeno para una concentracin
detenninada de antisuero es linealmente proporcional a la concentracin del
- Equipo de electroforesis antgeno. La detectabilidad de esta tcnica es cerca de 0,5 glmL para las
Mtodo protenas. Desafortunadamente, la carga elctrica negativa de las inmuno-
globulinas impide su movilidad electrofortica en este sistema, a menos que
' '
l . Preparar el agar con el tampn veroval y las lminas, tal como se descri- se empleen electrlitos y agar especiales. Recin se han introducido varios
bi en la IEF. sistema<; para la cuantificacin de inmunoglobulinas sricas y de los compo-
nentes del complemento con esta tcnica.
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- Muestras de antgeno -1,,
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- Antgenos estndar
- Antisuero monoespccfico
- Agar purificado o agarosa
- Tampn veronal 0,075 mol/L, pH i,6(ver electrof. de zona)
........:.. _

81 k1) - Azida sdica al 1O %


- Lminas de vidrio

a=== =: ~
11
Perforador
- Aguj
Plantilla
" . - Pipetas

0=== == - - Equipo de electroforesis


- Regla o pie de rey
M e todo

~ Agorcon anticuerpos
i nconora dos
1. Preparar el agar con el tampn ''eronaJ, proceder a la mezcla con el
antisuero y preparar la placa tal C-Omose describi para la IDR.
2. Colocar la placa sobre la plantilla )perforar los pozos. Extraerles el agar
con cuidado.

8> 3. Llenar los reservorios de la cubetaelcctrofortica con el tampn veronal


y colocar la placa de agar entre losreservorios con la polaridad adecua-
da. Poner los puentes de papel de filtroy proceder a ambientar la cma-
ra como en la IEF.

Figura40. Electroforesis en cohete (tcnica de Laurell ). ElAg se coloca en los pozos ( 1-4) in
4. Preparar las muestras y las diluciones pertinentes con el mismo tampn.
cantidades decrecientes. Mee.liante electroforesis el Ag is conducido hacia el anticueI)o 5. Desconectar la fuente de corriente \'llenar cuidadosamente los pozos con
contenido en el agar. El patrn de precipttado tien;:, el conomo de la estela de un cohete. Su
longitud es proporciona) a la cantidad de Ag. las muestras y estndares, de acuerdocon el esquema seleccionado.
6. Cubrir la cubeta y dejar pasar la corriente, chequendola a intervalos de
30 minutos .
159
7. Parar la corrida cuando se hayan obtenido los cohetes (2-6 horasf
8. Medir la longitud de los cohetes, desde el borde del pozo hasta su extre-
mo. Calcular la concentracin de antgeno en las muestras,

LECTURA Y REGISTRO DE LOS RESULTADOS


La mejor observacin de las reacciones de inmunodifusin se realiza con
iluminacin en campo oscuro con luz incidente. La fuente de luz puede ser
una lmpara fluorescente circular que ofrezca luz omnidimensional . Un lec-
tor de construccin sencilla se muestra en la Figura 41.
El registro permanente de los resultados puede lograrse mediante la tincin de
las preparaciones o la fotografia de las preparaciones teidas o hmedas. El
procedimiento de teido es ms laborioso que el fotogrfico, pero tiene la
ventaja de que consigue leerse ms fcihnentc la preparacin. Por otra parte,
la cmara fotogrfica puede registrar lineas que son invisibles al ojo humano.
Antes de efectuar el teido, las preparaciones deben lavarse exhaustivamente
con salina fisiolgica para eliminar todo el antgeno y el anticuerpo que no
hayan reaccionado. Se recomienda el empleo de un preservativo para retra-
sar la contaminacin durante ese tiempo. Una vez lavadas, las preparacio-
nes deben secarse para reducir la capa de agar a un.film delgado y transpa-
rente. Despus del secado las preparaciones estn listas para teir.
La tincin Je los inmunoprecipitados permite, adems, su caracterizacin
bioqumica. Las tinciones para protenas se emplean a menudo en las tinciones
no selectivas debido a que los inmunoprecipitados siempre contienen prote-
na anticuerpo. Los colorantes comnmente usados son amido negro y rojo
Ponceau. El negro amido es el ms popular, debido a que sus resultados son
muy consistentes. El principal i.nconveniente de algunos colorantes ms li-
geros es la prdida de color durante el proceso de lavado. El colorante se
disuelve en solucin de cido actico. Se puede emplear glicerina en el
solvente, lo que facilita el despegue del agar, una vez teido y secado. El
proceso de coloracin consiste en cambios sucesivos de la solucin de cido
actico hasta que se haya eliminado todo lo posible el color de fondo . Esta
operacin puede demorar varios das . Cuando las preparaciones teidas
estn secas, el agar tiende a despegarse de los portas. La aplicacin de una h gura:41. lluminadordec.ampooscW'o parraobscnapa:?pi~engel~. la fu~~ '!t !~!f
solucin acrlica clara o una pulverizacin con laca evitar este inconve- es W1 tubocircularde luz lrluoresc.enk. la lap!ll tDD111118&iJada en la figura) ti.:n.: una apertura
que se adapta a los c.iiforentes, tama0& l ~ckl'asmninas_
niente. La pulverizacin, adems, preservar las preparaciones y tornar la
pelcula ms clara y fcil de visualizar.
160
Los mtodos selectivos son ampliamente empleados para la caracterizacin
de lpidos, lipoprotenas, polisacridos y glicoprotenas (Ouchtcrlony y Nilsson. 5. Eliminar la tincin de fondo sumergiendo las lminas sucesivamente du-
1973). rante 1 hora cada vez en la solucin de lavado (al menos dos recipientes
con solucin de lavado deben prepararse) . Mantenerlas el tiempo sufi-
Tincin de las placas de inmunodifusin ciente para su decoloracin o llevarlas a una tercera solucin de lavado
hasta que se aclare en su totalidad el fondo .
Materia/
6. Secarlas al aire libre, rotularlas bien. Estn listas para ser fotografiadas o
- Lminas <le inmunodifusin conservadas . Gu~rdarlas protegidas del polvo.
- Negro amido: 5 mg de negro amido. 150 mL de glicerina. ! 00 111 L de Observacin
cido actico glacial y l 00 mL de agua destilada
Se recomienda el uso de preservativo en la salina yel agua para los prime-
- Rojo Ponceau : 50 mg de rojo Ponceau y 100 mL de cido actico al 2 %
ros lavados, para evitar la contaminacin. Emplear pinza para no mancharse
- Solucin de lavado: cido actico al 2 % que contenga 1O % de glicerina los dedos de colorante.
.
- Agua destilada con azida sdica al O, 1 %
- Papel de filtro duro (Whatman No. 50)
- Pinza
- Recipientes para el colorante y las soluciones
- Estufa o ventilador

Mtodo
l. Sumergir las lminas o portas en solucin salina fisiolgica durante
1-3 das para eliminar todo el antgeno y el anticuerpo que no hayan
reaccionado. La solucin debe cambiarse varias veces (puede contener
azida sdica al O, l %).
2. Efectuar otro lavado con agua destilada durante 0,5-1 da para eliminar
la sal de la preparacin, que cristalizaria tras el secado.
3. Secar la preparacin para reducir la capa de agar a una pelcula delgada
y transparente. Utilizar el papel de filtro duro. Para facilitar el manejo.
cortar las tiras del tamao de las lminas. Embeberlo con agua y aplicar-
lo mojado sobre las preparaciones . Seguidamente colocarlas en la estu-
fa, delante del ventilador o al aire libre.
4 . Una vez secas, sumergirlas en la solucin de colorante durante 1O minu-
tos (o menos) o teirlas con un. pincel. Esto ltimo reduce notablemente
la tincin de fondo y los sucesivos pasos de lavado.

162
163
o
e
o o o CAPTULO IV
o
o o o
o REACCIONES Y TCNICAS
,
o DE INMUNOAGLUTINACION
o
o
o O O
o 'O
La inmunoaglutinacin es una reaccin que tiene lugar cuando se combinan
o
antgenos particulares (aglutingenos) con sus anticuerpos especficos
OO o ooo o o o '() ' o (aglutininas) .
' ' o o o O o Esta reaccin se ha usado <l!npliamcnte debido a la facilidad con que se
e ' ' ' o ' o o lleva a cabo y a su bajo nivel de detectabilidad. Aunque no permite la cuanti-
o ficacin exacta de anticuerpos, los resultados pueden expresarse semicuan-
e e i o titativamente en funcin de'la dilucin mayor del suero que permite aun
observar aglutinado (ttulo).
o o o o

..,
\! o
'
o
o
o
o o o
En la aglutinacin, fas partculas quedan asociadas en retculo por anticuerpos
bivalentes (IgG) o pentavalentes (IgM), y se combina cada extremidad de la
molcula anticuerpo (regin Fab) con un sitio antignico idntico portado

. '
e

o o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o

o
o

o
o por partculas distintas (Figura 43) . La tcnica de inrnunoprecipitacin em-
plea antgeno soluble, por lo tanto, de dimensiones pequeas . Para exteriori-
zarse el inmunoprecipitado se requieren grandes cantidades de antgeno y
lb ms, de anticuerpo. Las reacciones de inrnunoaglutinacin necesitan poco
antgeno y aun menos anticuerpo para manifestarse. Los sitios antignicos
~4l! ..A!~mt&losrdcp'!anbltas:r.ar;a 1inmun00ilfusl'ooesrdoblcsyrotrasvar1D1es. son dependientes de una estructura relativan1cnte voluminosa, de ah que
una ligera modificacin del estado de dispersin de las partculas sea sufi-
ciente para.exteriorizar la reaccin serolgica.

165
1

o;..r1 IY
1
Anticuerpo
~~/ h ~ ~
--~7
,~OAtJi
1
1

-( 4,'--J>,
~o-
~(),-{
1
1
1
1
1
1
1 Antlgeno
?;_\ 'Entrecruzamiento y aglu---<;..
1 Exceso de anticuerpo ti nocin
I , no entrecruzamiento
Figura 44 . Inhibicin di: la aglutinacin por exceso de Ac.
Figurn43. Reprcs1..11tacinesquemtic.a de la reaccin de nglutirnKifin

La exteriorizacin de la aglutinacin requiere de electrlitos en el medio. A. Aglutinacin directa


Bordet consider la aglutinacin ramo un proceso en dos etapas . En la
primera se produce la unin de los antil.:ucrpos con los determinantes
o
Ag propio de
+ r Ac
~O
Aglutlnacio'n
antignicos de la partcula . En la segunda, la agregacin de las partcu las lo partcula
J.os electrlitos, en concentraciones apropiadas, producen condiciones de
cohesin y carga superficial qui; causan la aglutinacin de las clulas e.Aglutinacin indirecta .
recubiertas de anticuerpo, pero no de las no recubiertas . En la pr;lctica se O+ .
sensibilizacin .r'f...
+ Y---~~oAo
utiliza comnmente una so!ucin de NCI al 0,85 % (salina fis.iolgica) . Ag V
soluble Aglutinacin
Las reacci ones de inmunoaglutinacin esti~ mucho menos sujetas al 'fon-
meno de zona que las rc::iccioncs de pn ;~ ipitac 1n . La inhibicin por exceso C.Aolutlnocln reversa
de antgeno es dificil que se produ zca. La inhibicin por exceso de anticuer
.J;..,
-?~
~ sensibilizacin
po (fenmeno ele prozona) puede observarse con sueros hiperinmunes a
co ncentraciones elevadas de anticuerpo . Una interpretacin dada a este
O + I .. :}~{ +
.
fc nmc1w , al igual que a la prozona de b inmunoprecipitacin cuantitativa, Aglutinacin
es que --a un gran exceso de anticuerpo--- cada clula est recubierta D. Inhibicin de la aglutina ::in
completamente por mol culas de anticuerpo, siendo poco probable el entre
- En presencio de antgeno
cmzamicnto de las clulas por un mismo anticuerpo (Figura 44) .
La reaccin de aglutinacin puede ser directa (activa, simple) o indirecta
(pa:- iva, condicionada) En el primer tipo, los antgenos son componentes
~ + {)
No aglutinac:i&n
natura les de la partcula. En el tipo indirecto, los antgenos son unidos en -En ausencia de anti'gono
forma artificial a la superficie de la partcula que slo funciona como su
soporte . La partcula tambin puede ser recubierta con anticuerpos: a esta
variante se le ha denominado aglutinac;i<in reversa. Existen, adems, la
inhibic in de la aglutinacin y la coaglutinacin (Figu ra 45) .
;0-+ {) :c:0o
Aglutinacin
Figura 45. Algunos tipos de reacciones de aglutinacin.
166
La aglutinacin puede efectuarse en lminas, en tubos o en placas multipozos - Bao de agua
de microtitulacin, estas ltimas son pozos de fondo U.
Mtodo
Las bacterias, los eritrocitos y el ltex de poliestireno son las partculas ms
comnmente utilizadas en la aglutinacin, denominndose hemaglutinacin 1. Colocar en la gradilla una hilera de 1O tubos. Aadir a cada uno 250 L
aquellas que emplean glbulos rojos sanguneos . de SF y proceder a hacer diluciones dobles del antisuero, tal como se
describi en la pgina 123 . Desechar 250 L del tubo 9. El tubo 10 es el
Las reacciones de inmunoaglutinacin se usan para identificar y clasificar control.
bacterias y para tipificar hemates Se han observado reacciones de aglutina-
cin de leucocitos, plaquetas e incluso espermatozoides, esta ltima en ciertos 2. Adicionar a todos los tubos 250 L del antgeno O y agitarlos .
casos de infertilidad debido a la existencia de aglutininas en el espemta o en la 3. Sumergir la gradilla en el bao de agua e incubar los tubos 60 minutos.
secrecin vaginal. La aglutinacin se ha extendido a la deteccin de antgenos
moleculares y de anticuerpos contra antgenos particulares y solubles. 4. Buscar en el fondo del tubo Ja presencia de aglutinacin. Determinar el
ttulo. Los resultados se dan en unidades aglutinantes por mililitro de
suero que se calculan multiplicando el ttulo por 4 (se emple la cuarta
TCNICAS DE AGLUTINACIN DIRECTA. '
parte 'de 1 mL en el ensayo).
AGLUTINACIN BACTERIANA
Observacin
La aglutinacin de bacterias se lleva a cabo entre los antgenos localiza-
dos en su superficie (cpsula, pared, flagelo) y los anticuerpos especfi- Si hay aglutinacin en el tubo control se desecha la prueba y se prepara de
cos. Entre las aplicaciones de la aglutinacin bacteriana estn la identifi- nuevo el antgeno.
cacin y clasificacin de microorganismos aislados de diversas fuentes ,
tales como: exudados, heridas, sangre, alimentos, aguas residuales y otras; Prueba rpida para aglutinacin bacteriana (mtodo de la lmina)
y la deteccin de anticuerpos especficos en el suero de pacientes con En una lmina de vidrio o portaobjetos colocar una gota del antisuero y una
vista al diagnstico de enfermedades, en el seguimiento de la evolucin gota de la suspensin bacteriana (una muy cerca de la otra). Mezclarlas
del proceso infeccioso cuando exista una correlacin entre el ttulo de bien con un aplicador o varilla (o el fondo de un tubo de ensayo), esperar
anticuerpos y el cuadro clnico, en la evaluacin y seguimiento de progra- unos minutos moviendo la lmina, y observar. En el caso de una reaccin
mas de vacunacin y en la titulacin de anticuerpos en los sueros de ani- positiva se forman copos bien visibles a simple vista. En la reaccin negati-
males inmunizados. va la mezcla se mantiene turbia.
Material
Prueba de aglutinacin directa con eritrocitos humanos
- Antgeno O de Salmonella
La superficie de los eritrocitos contiene gran nmero de determinantes
- Antisuero anti-O de Salmonel/a
antignicos, que son productos directos o indirectos de los genes. Estos
- Salina fisiolgica determinantes constituyen aloantgenos, por lo que permiten clasificar a las
- Tubos de ensayo 13 x 100 mm
- Gradilla Aloantgeno: Antgeno encontrado solamente en algw10s miembros de una especie. Los Ac
correspondientes se denominan aloa11tic11erpos. En el caso de las aloaglutininas anti-A y
- Pipetas anti-B se acostwnbra llamarlas isoagluti11i11as.

168 169
La estructura de A y B se muestra en fonna esquemtica en la Figura 46.
personas en diferentes grupos. Se han identificado hasta el momento ms Los tres ltimos azcares de la cadena madre, la llamada sustancia H, son
de 20 sistemas diferentes de grupos sanguneos. Dentro de cada sistema los N-acet1lglucosamina, galactosa y fucosa . La N-acetilglucosamina en el gru-
aloantigenos se heredan -al parecer- como productos de un gen sencillo
po sangulneo A y la galactosa en el B, estn unidas al ltimo residuo de
o de un conjunto de genes estrechamente ligados. galactosa de la cadena madre.

La importancia clnica de un sistema de grupos sanguneos depende de dos


factores: la frecuencia de los aloanticuerpos para estos antgenos en la po-
blacin y su potencia relativa (inrnunogenicidad). Aunque muchos de los
grupos sanguneos no son importantes en la prctica clnica de la transfusin A
sangunea y el trasplante de rganos y tejidos, son marcadores objetivos,
heredados genticamente en forma simple, tiles en estudios antropolgicos
y en casos de disputa sobre la paternidad. J'
B
En 190 l Landsteiner public sus observaciones acerca de la aglutinacin de ~\
los eritrocitos humanos por otros sueros tambin humanos. El comporta- Leb
miento de los individuos lo condujo a clasificarlos en los grupos A, B y O .
Las clulas de personas del grupo A eran aglutinadas por el suero de indivi- H Gl u z g lu cosa
Ga 1 : ga l ac t osa
duos del grupo B, y viceversa. En cambio, las clulas de otros individuos Fue "fu c osa
(grupo 0) no eran aglutinadas por ningn suero. Estas personas tenan Noc zorupo N-acet ilo
aloanticuerpos anti-A y anti-B. Poco tiempo despus del descubrimiento de
Figura 46. Estn1ctura qui mica de los antgenos A, B, H, Le" y Leb de los grupos sanguneos.
Landsteiner se encontr el cuarto grupo, AB, sin aloanticuerpos para los
otros eritrocitos humanos (Tabla XI).
Los grupos sanguneos ABO estn determinados por los genes A, B y O .
Estos genes codifican para enzimas glicosiltransferasas que conjugan los
TABLA XI. Grupos sanguineos del sistema ABO azcares al carbohidrato precursor. Estas enzimas son especficas para sus
sustratos: la transferasa A para la N-acetilglucosamina y la transferasa B
Grupo Antgeno en el Anticuerpo Frecuencia para la galactosa. El gen O no produce transferasa que pudiera modificar la
san guineo eritrocito en el plasma en Cuba(%) sustancia H, debido a ello las personas del grupo O slo tienen el antgeno
A1 A +A 1 anti-B H . Por esto, algunos autores denominan al sistema ABH.
37,2
A1 A+H anti-B (anti-A 1) La cadena precursora es influida por una transferasa que conjuga la fucosa
a la galactosa. Esta enzima es el producto del gen H, el cual se hereda en
B B (+H) anti-A 8,6
forma independiente del sistema ABO . Existen unas cuantas personas a
o H anti-A + anti-B 50,6 quienes faltan los genes H (genotipo hh), por lo que son incapaces de sinte-
tizar una cadena precursora completa . Este fenotipo se llama Oh o tipo
A 1B A+ A,+ B - Bombay. A causa de esta deficiencia las sustancias A y B no pueden for-
A2B A+ B (+H) (anti-A,) 3,6 marse a pesar de existi r transferasas A y B.

Nota: Los parntesis indican que pueden o no estar presentes. 171


170
El grupo sanguneo A puede subdividirse en los subgrupos A y ~ basado
1
en el nmero de sitios antignicos A sobre el eritrocito. Aproximadamente Los anti-A y anti-B soo, por lo gcnerat lgM. Los aJoanticuerpos lgG son
rnis frecuenk.~ ,en indi,iduos -del grupo O que en tos de k?s grupos A y B,
el 80 % de las personas A y AB pertenecen al subgrupo A, . La elevada
densidad del antgeno A sobre los eritrocitos en la mayora de estos indivi- p<>r esta .razn l a enfermedad hemoltica del recin nacido es mucho ms
duos se traduce en una especificidad antignica diferente, pero relativamen- comn en la desoendencia de madres del tipo O (rcc<>Rlar que la lgG atra-
te dbil, tal vez como consecuencia de la interaccin de dos oligosacridos A , icsa ta placenta). Con mucho menor frecuencia las aloaglutininas son del
estrechamente adyacentes. Las personas ~ y, en especial, las ~B pueden isotipo lgA
tener anticuerpos contra estas estructuras (anti-A ) . Los aloanticucrpos anti-A y anti-B puc.den -c ausar hemlisis en presencia de
1

Puesto que los anticuerpos para A 1 son dbiles, no siem pre son prcti- complement.o y son ms potentes en tas personas del _grupo O . El plasma de
cos para la diferenciacin entre A, y A 2 . La distincin, por lo general , se csh: grupo no dct>cr transfundirse en grandes cantidades a pacientes A o
hace empleando lectnas . La lectina de Do/ichos biflorus aglutina slo B Es recomendable osar oonccntrados de eritrocitos del grupo O que con-
a las clulas A 1 . Con frecuencia se emplea simultneamente con la lectina tengan slo pequeos rnlmcnes de plasma en \'ez de sangre entera.. si no
de U/ex europaeus, la cual reacciona con la sustancia H qu e los hubier- tiempo para dctcnninar el .tipo de sangre dd paciente o si no se
eritrocitos A 2 poseen en elevadas concentraciones comparados con los d-isponc de sang!re de su mismo grupo .
eritrocitos A 1 En 1939. l...enc y S.tetson descubrieron que el suero de una mujer que dio a
El origen de las aloaglutininas es todava objeto de discusiones, pero se sabe 'luz un fcto muerto aglutinaba 1os ent:roci-tos del ,g5 % de los adultos huma-
que la naturaleza qumica de los antgenos A y B es muy corriente en el nos . Al siguiente ao. Landstciner y Wicner pubhcaroo sus obsen-aciones
entorno humano, especialmente en bacterias. Experiencias llevadas a cabo sobre la .inmunizacin de cobayos y conejos con sangre de monos rhesus y,
en animales libres de grmenes han mostrado que algunos anticuerpos natu- despus de absol'Ciones apropiadas. obtu\icron un anticuerpo que poda aglu-
rales presentes en el pollo se deban a una hetcroinrnunizacin microbiana tinar en p~oporcin semejante los eritrocitos humanos . Al grupo se le nom-
(anti-B originados por la estirnulacin con E. co!i 086, gennen que podra br Rh. aunque mucho despus se demostr que el anrigmo del mono rhesus
ser el responsable del anti-B identificado en humanos). difiere dcl antgeno de los eritrocitos humanos y se rebautiz LW en honor a
Landsteiner '" Wiienor.
Los nios comienzan a producir anti-A y anti-B despus de los primeros
meses de vida. En los pacientes con inmunodeficiencia humoral, como la De acuerdo .c on 1a teora de Risher y Race, los aloantgenos Rb esl3n deter-
hipogamrnaglobulinemia, la cantidad de anti-A y anti-B puede reducirse a minados por tres paces de .senes ntimamente hgados (Clc.., Dfd, Ele). Pro-
concentraciones no detectables. El anti-H (adems del anti-A y el anti-B) bablemente e:I ()OOilpfomento de D (d) no sea antigniro o el gen d sea
est siempre presente en el suero de los escasos individuos Oh, por lo que no amrfioo, pues no se han encontrado anticuerpos oontra d .
se les puede transfundir con sangre de los grupos A, B, AB u O De los aloantgenos Rh el D es el irunungeno ms poticnte y., por tanto, el
ms .i mportute . Provoca .rcs;pucs,t a de anticuc<rpos coo una frecuencia
50 veces ma~1oc que ;t os alloantgenos 'C y E. s, una unidad de sangre D
Lectinas: Protenas que reconocen residuos especficos de carbohidrato y se unen a positi,:a se itramsfuode a un rooeptor Rh negatll\'O, se producien anti-O en el
glicoprotenas o glicolpidos de la superficie celular. Son bivalentt:s o polivalentes ya 60-8() % de los casos. Se fnnan anti-e y anti-E en menos del 2 % de las
menudo aglutinan los eritrocitos. Fueron originalmente aisll'ldas de st:m illas de plantas,
transfusRJnes i~bles . Por esta causa, en la rutina de los bancos de
pero se han encontrado en otros organismos, como hongos, algas, peces y moluscos.
~"e .slo se invcsti~ga el ~geno D y :su !PfCSeDoia clelrcnnina la designa-
Anticuerpos naturales: Anticuerpos que no son resultado de una imnunizacin conocida . cin Rh posikw o Rh negativo.

172
113
parcialmente) la aglutinacin. Las enzimas proteolticas desdoblan las
El antgeno D puede aparecer en la membrana del eritrocito en formas glicoprotc nas de la membrana del eritrocito que contienen cido silico, lo
dbiles, lo que dificulta la tipificacin del Rh. Estas variantes se denominan D" que reduce la carga elctrica negativa y debilita las fuerz.as de repulsin,
y difieren del D normal en que tienen un menor nmero de sitios antignicos. pcnnitiendo a las molculas de lgG tender el puente entre los eritrocitos . No
La deteccin de ou requiere un antisuero potente y la tcnica de Coombs. obstante, pueden participar otros mecanismos.
Si se identifica ou la sangre se considera Rh positiva. La inmuniz.acin de madres Rh negativas por la sangre fetal Rh positiva
Puesto que los antgenos Rh slo existen en los glbulos rojos, no hay puede evitarse por la administracin pasiva de anticuerpos anti-Rh . Una
anticuerpos anti-Rh naturales. La respuesta inmunitaria slo aparece des- sola dosis de 150 a 300 g de inmunoglobulina anti-Rh, administrada dentro
pus de la exposicin a sangre incompatible, ya sea por embarazo o transfu- Je las 72 horas posteriores al parto, es suficiente en la mayora de los casos.
sin. Una excepcin es el anti-e, que puede existir como autoanticuerpo. El paso de anticuerpos anti-O (tambin anti-A o anti-B) a travs de la
El anti-O es el ms comn y el ms potente de los anticuerpos anti-Rh. Una placenta origina la anemia hemoltica del recin nacido. La prueba directa
cantidad tan pequea como 1O L de sangre Rh positiva puede ser suficien- de Coombs permite detectar los anti-O fijados a los glbulos rojos del recin
te para originar la formacin de anticuerpos. Ya que los antgenos Rh apare- nacido en sospecha de eritroblastosis fetal. La prueba indirecta de Coombs
cen pronto en la ontogenia, es posible la inmuniz.acin despus del aborto de se empica para detectar anti-O en el suero sanguneo de la madre Rh nega-
un feto Rh positivo, aunque el riesgo es l0-20 veces menor que despus de tiva. as como para tipar un antgeno determinado de los hemates cuando se
un embarazo a trmino. empican anticuerpos incompletos.
Despus de una inmuniz.acin intensa, los anticuerpos pueden ser inicial-
mente IgM, pero por lo general son IgG. Slo hay 10 000-30 000 sitios REACTIVOS HEMOCLASIFICADORES
antignicos Rh sobre cada eritrocito en comparacin con casi un milln de
Estos reactivos. comnmente llamados sueros hemoclasificadores, son mez-
sitios A 1 Debido a esta baja densidad de sitios antignicos en la superficie
clas de anticuerpos policlonales obtenidos del suero de donantes sanos
celular, pueden fijarse pocas molculas de anticuerpo . Si estos son del isotipo
inmunizados con uno o va rios antgenos de grupos sanguneos, ya sea de
IgG, los entrocitos no aglutinan en solucin salina fisiolgica, por no haber
una forma natural, como en el caso de las mujeres sensibilizadas durante el
suficientes molculas de anticuerpo para contrarrestar las fuerz.as de repul-
embarazo, o mediante inm unizacin inducida . En este ltimo caso estn las
sin que mantienen a las clulas en suspensin. Los anticuerpos IgM -por
personas sensibilizadas por transfusin o donantes sanos inoculados volun-
su mayor tamacr- pueden tender un puente, juntando los eritrocitos . Los
tariamente con sustancias especficas de grupo (obtenidas de estromas
anticuerpos anti-Rh de la clase IgG se denominan incompletos y los de la
clase lgM, anticuerpos completos. eritrocitarios) o con glbulos lavados cuando no se dispone de la sustancia
especfica de grupo.
La aglutinacin por los anticuerpos IgG puede intensificarse de varios mo-
Estos sueros pueden utilizarse tal como se obtiene del donante especial* me-
dos: 1) Mediante el uso de anti-irununoglobulina G humana (reactivo de
diante plasmafresis, o pueden ser sometidos a precipitacin por salado. En
Coombs). 2) Por la adicin de BSA al 20-30 % a la mezcla reaccionante.
3) Tratando los eritrocitos con una eitzima proteoltica, por ejemplo, papana.
\
Donante especial: Categora con la que se designan los donantes de sueros que se ut ilizan
El anticuerpo anti-IgG humana reconoce determinantes isotpicos sobre dos
en la elaboracin de los reacll\OS hemoclasificadores .
molculas anti-O que han reaccionado con eritrocitos distintos, establecien-
Plasmafresis: Procedimiento de extraccin <le plasma, en el qu.: lns .:kmentos fonncs <le
do un puente entre las partculas, lo que facilita su agregacin. La BSA
la sangre le son devueltos al donante.
cambia la constante dielctrica de la solucin, lo que intensifica (al menos
175
174
la actualidad se producen anticuerpos monoclonales hemoclasificadon.--s ror
Resultados de la prueba
la tecnologa del hibridoma. a p.1rtir de sustancias cspc..--cificas de grupo obteni-
das por sntesis quimicas o de los eritrocitos correspondientes (/ r11po sanguneo anti-A anti-E anti -Rh
A positivo (A+) T - +
Tipificacin ABO y Rh de eritrocitos humanos
A negativo (A- ) +
Malerial B positivo (B+) - + +
Sueros hernodasificadores anti-A, anti-B y anti-O B negativo (B-) - +
Lminas de l.-idrio o portaobjetos O positivo (0 +) - - +
Lan~tas dt.-sechablcs estriks (o agujas estriles) O negativo (0 -)
- Apli~dorcs AB pos itivo (AB+) + + +
- Algodn AB negativo (AB-) + +

- Alcohol aJ 70 ' Deteccin de aloaglutininas para antgenos del sistema ABO


- Guantes
Material
M1odo
- Suero problema
1. Ponerse los guantes y realizar toda la tcnica con dios puestos .
- Sangre humana de los grupos A, B y O (citratada o heparinizada)
2. Limpiar la yema del dedo medjo de la mano con alcohol.
- Tubos de ensayo de 13 x 100 mm
3. Practicar un corte con la lanceta y dejar fluir 1 o 2 gotas de sangre.
- Pipetas
4. Dejar caer 3 gotas de sangre separadas una de la otra aproximadamente
2 cm en la lmFm de vidrio. - Lminas de vidrio o portaobjetos

5. Aadir J gota de cada uno de los sueros tipificadon:s en las respectivas - Varillas o aplicadores
gotas de sangre ( 1 gota de sangre para cada tipo de suero) . - Centrfuga
6. Homogeneizar rpidamente las tres reparaciones con aplicadores di fe- - Guantes
rentes y rotar suavemente la lmina unos pocos minutos
Mtodo
7. Observar los aglutinados Con el suero ami-Rh puede demorar hasta
5 minutos la c.'tcriorizacin de la reaccin . En caso de duda se repite el 1. Colocarse los guantes .
ensayo, incubando la lmina a } 7 C durante 3 minutos . 2. Tomar los tres tubos de ensayo que contienen las sangres A, B y O , y
8. Dctenninar cl grupo sangu ~nco basado en la presencia (+ )' o ausencia (-) centrifugarlos durante 1Ominutos a 2 500 rpm .
de aglutinacin con los. sueros hemoclasificadores . Los resultados se 3. Eliminar el plasma sobrenadante con pipetas (no decantar) . Este debe
dan de acuerdo con el siguiente cuadro: ser incoloro y transparente. Si se observa hemlisis, desechar la sangre.

L76
177

IJ
..
4. Tomar una lmina o portaobjetos y dejar caer 2 gotas de la sangre A, . Preparar sendas suspensiones de eritrocitos A y B al 2 %. Para realizar
3
separadas aproximadamente 3 cm, a 1-2 cm de los bordes . los clculos puede aplicar la ley de la volumetra (pgina 125), conside-
rando V, = 100 % (el paquete de clulas) . Tambin se pueden preparar
5. Dejar caer al lado de cada gota de sangre 1 gota del suero problema . resuspendiendo una gota de clulas en 49 gotas de SF. J-IOOlQitMWizar
Mezclar con un aplicador o varilla formando una superficie circular de bien y cuidadosamente la suspensin.
reaccin de aproximadamente 3 cm de dimetro.
4. Preparar por duplicado dos series de diluciones dobles del suero proble-
6. Imprimir a la lmina un movimiento rotatorio y observar durante 2-3 mi- ma, aadiendo 50 L de SF a partir del segundo pozo en todos los pozos
nut~ la aparicin o no de aglutinacin .
d::: cuatro hileras (por ejemplo, A, 8 , C y D) . Proceder como se describi
7. Repetir la operacin con las sangres de los tipos B y O en la pgina 123 . Desechar 50 L del ltimo pozo.

8. Valorar la reaccin de aglutinacin de los sueros problemas de fuerte 5. Prcp:irar tan1bin por duplicado dos controles con 50 L de SF y 50 L
(F), media (M), dbil (D) o no aglutinacin (NA) . de cada una de las suspensiones (control de eritrocitos del grupo A y
control de eritrocitos del grupo 8).
Microtcnica para titular anticuerpos anti-A y anti-Ben suero 6. Aadir a todos los pozos de dos hileras (A y 8) 50 L de la suspensin
humano ("naturales" o inmunes) de eritrocitos del grupo A y a todos los pozos de las otras dos hileras (C
y D). 50 L de la suspensin de eritrocitos del grupo 8 .
Material
7. Mezclar los inmunorrcactantes dndole unos golpes laterales a la placa o
- Suero problema
rotndola varias veces . Cubrirla y dejarla en reposo a temperatura am-
- Sangres humanas de los grupos A y B citratada o hcparinizada biente durante 1-2 horas .
- Placa Takatsi 8. Observar los resultados. Las clulas aglutinadas forman una especie de
- Tubos de centrfuga alfombra que cubre el fondo del pozo, y pueden tener los bordes retra-
dos dando una imagen de 'sombrilla" o formar un anillo. Las clulas no
- Tubos de ensayo
aglutinadas resbalan por las paredes hasta formar un botn en el centro
- Pipetas del fondo del pozo. Comenzar la observacin por los controles, que de-
- Guantes ben ser negativos (botones en el fondo del pozo) . Determinar el ttulo
que se corresponder con la mayor dilucin en la que se observa reac-
- Centrfuga cin positi\'a Se pueden hacer extensiones en portaobjetos y observar la
Mtodo reaccin al microscopio ptico con lente de menor o mediano aumento.
Los resultados se presentan en la forma indicada en la Figura 47. Para
1. Colocarse los guantes . calcular el swre se asigna el valor de 5 al ttulo, 1Oal mximo de aglut i-
2. Centrifugar las sangres a 2 500 rpm durante JO minutos Hct1rar e,1plas nacin y valores entre 5 y 1O a las diluciones intermedias . Debe haber
ma con pipeta Pasteu r u otra (no decantar). Este tjr bc !;Cr incoloro y una corr-:spondcncia entre los nmeros y las cruces . La suma de todos
transparente : de lo contrario, desechar la sa ngre P:ir:i l'~ta tcnica los nmeros -..~ el 11..: ore . Es te \al or puede resultar til para estudios
1-2 mL de sangre de cada grupo es sufi ciente. cstadsttcus ~

l 7X 7u
Observacin - Aplicadores o varillas
No se puede utili zar sangre ni suero si no se les realiza las pruebas para - Pipetas
hepatitis By SIDA. Debe tenerse el cuidado de homogeneizar las suspen-
siones de eritrocit0s en el momento de aadirlas a los pozos, pues las clulas - Centrfuga
sedimentan rpidamente. Los tubos, pipetas y puntas que se utilicen para !a - Incubadora
sangre y los eritrocitos deben estar bien secos o endulzados con S F para
prevenir la hemiisis, as como enjuagarse inmediatamente despul!s de ser Mtodo
usados con agua corriente abundante . Hacer lo mismo con la placa de
microtitulacin ai concluir el ensayo. 1. Centrifugar la sangre 1Ominutos a 2 500 rpm. Eliminar el plasma y lavar
una vez las clulas con SF. Retirar d sobrenadante que, como el plasma,
debe ser incoloro y transparente.
Di lucin 1/2 1/4 tia 1/16 1132
2. Preparar dos suspensiones al 2 % con los dos tipos de eritrocitos, y
Observacin ~ ~ ~
microscp i ca \~ ~ \~

Resultados
en cruc~s ++ t t++ t+ ++
o .
..
aadir 150 L del sedimento celular a 6 mL de SF.
3. Disponer en una gradilla 11 tubos numerados del 1 al JO. El tubo 11
corresponde al control negativo (CN).
4. Aadir a cada uno de los JO tubos 1 mL de SF y en el primero agregar
+
1 mL del suero problema. Preparar diluciones dobles (pgina 123) y, al
Seor e 10 8 7 6 5 o;: 36 final , desechar 1 mL del tubo nmero JO. En el tubo 11poner1 mL del
suero problema sin dilu ir.
Figura 47 . Resultados de la aglutinacin .
5. Aadir a los 1Otuhos 0,5 mL de la suspensin de eritrocitos del grupo Q+.
Prueba huUrecta de Coombs para titular Al tubo nmero 11 agregar 0,5 mL de la su sp~nsin de eritrocitos del
antkueli'pos incompletos anti-D grupo o-.
Material 6. Mezcla r suavemente el contenido de todos los tubos e incubarlos 1 ho ra
- Suero problema a 37 C.
7. Centrifugar el contenido de los tu bos a 2 500 rpm durante 10 minutos y
- Sangre humana del grupo o+citratada o heparinizada
lavar los eritrocitos tres veces con SF.
- Sangre humana del grupo o-citratada o heparinizada
8. El ltimo lavado real izarlo a 1 000 rpm por 5 minutos . Retirar los
- Suero de Coombs (suero anti-IgG humana) sobrenadantes . Se puede decantar y escurrir.
- Salina fisiolgica
9. Aadir a todos los tubos 2 gotas del suero de Coombs .
- Tubos de ensayo 13 x 100 mm
10. Centrifugar 1 minuto a 1 000 rm .
- Tubos de centrfuga
11 . Observar la aglutinacin. Es recomendable utilizar un espejo cncavo .
- Gradilla Determinar el ttulo.
180
181
- ~

Observaciones Ajustar pH a 6, 1 con cido ctrico al


1O % y autoclavcado a 0,5 atmsfera
Tener en cuenta las sealadas en la tcnica anterior. La observacin de los 15 minutos .
resultados tambin puede realizarse colocando 1 o 2 gotas del contenido de
Utilizar una parte de solucin de Alsever
cada tubo sobre una lmina, extendiendo la gota y rotando la lmina . La
por una parte de sangre.
prueba directa de Coombs se utiliza para demostrar la sensibilizacin (recu-
brimiento) de los eritrocitos con anticuerpos anti-O. Estos anticuerpos pa- A los eritrocitos se les puede acoplar cualquier sustancia molecular o
san a travs de la placenta y reconocen el antgeno D en los eritrocitos macromolecular. La pureza del antgeno es muy importante, ya que las im-
fetales. La prueba se realiza aadiendo el suero de Coombs a los eritrocitos purezas compiten por los sitios de unin durante la sensibilizacin. Casi to-
del recin nacido. dos los polisacridos se adsorben espqntncamente al ponerlos en contacto
unos minutos con los eritrocitos. Tratndose de protenas, los glbulos rojos
HEMAGLUTINACIN PASIVA deben someterse con antelacin al tratamiento con cido tnico. De modo
\
...... aparente las protenas ligeramente agregadas o parcialmente desnaturaliza-
Una tcnica capaz de detectar hasta 0,2-0,4 g de anticuerpo es esta que das son adsorbidas con preferencia. Despus del tanado y la adsorcin, las
involucra la aglutinacin por anticuerpos de glbulos rojos sanguneos clulas rojas se guardan en solucin de suero al l % para prevenir su agre-
recubiertos con antgeno. Debido a que este ltimo no es un componente gacin espontnea. Si el tanado no funciona, el tratamiento con cloruro
natural de la clula, la reaccin se denomina hemaglutinacin pasiva . Los crmico facilita la adsorcin de algunos antgenos proteicos, aparentemente
eritrocitos recubiertos con el antgeno se dice que estn sensibilizados y el neutralizando la carga negativa de las clulas. Para finalizar, la unin de las
procedimiento por el cual se le acopla a la clula se nombra sensibilizacin protenas puede efectuarse covalentemente a travs de reactivos bivalentes
(Figura 45). (de cross-linking) como bisdiazobencidina o glutaraldehido (pgina 48) o a
Los glbulos rojos de diversas especies se utilizan como soporte, ya que son travs de intermediarios carbodiimidas.
fciles de obtener, de ser mantenidos en el laboratorio y de estandarizarse. Para asegurar la especificidad de la reaccin, el antisuero debe ser previa-
A ellos se les puede acoplar prcticamente cualquier tipo ~e ligando. Es mente absorbido frente a glbulos rojos no recubiertos, y un control de clu-
posible utilizarlos frescos (entre una semana y un mes, conservados en una las rojas no recubiertas debe incluirse en cada ensayo. Anticuerpos del tipo
solucin apropiada como la de Alsever) o bien momificados con fonnaldehdo aglutininas contra eritrocitos heterlogos se presentan normalmente en la
o glutaraldehdo, en cuyo caso alcanzan a conservarse hasta aos en conge- sangre de varias especies animales. Los conejos poseen aglutininas que
lacin o liofilizados. Los hemates de carnero y humano son comnmente rcaccionari con eritrocitos de curicl, caballo, carnero y humano. El suero
empicados con estos fines . Los eritrocitos de.pavo, que son nucleados, rin- humano contiene anticuerpos contra eritrocitos de conejo, camero, buey,
den patrones de aglutinacin en tiempos ms cortos . caballo, curiel y paloma (Carpenter, 1969).
Solucin de Alsever: La hemlisis tambin debe ser prevenida descomplementando el suero. Para
dextrosa .. .. .. .. ....... .. ... .... .. ..... ..... 2,05 g ello se coloca en un bao de agua a 56 C durante 30 minutos con agitacin
suave.
citrato de sodio ....... .. ............ .... 0,80 g
La ventaja de la hemaglutinacin pasiva es que es mucho ms sensible que
cloruro de sodio .. .... ........ .. ........ 0,42 g la inmu noprecipitacin, ya que los eventos moleculares se transforman en la
agua destilada hasta .. ............ 100 mL aglutinacin de una estructura voluminosa: la clula roja. La especificidad

182 183
de la reaccin es la misma que en la inmunoprecipitacin. Si, por ejemplo, 2. Calcular el volumen que se necesita de sangre de camero atendiendo
clulas rojas nucleadas (eritrocitos de pavo) son recubiertas con un antgeno a la cantidad de suero problema para absorber, para la sensibilizacin
y clulas rojas no nucleadas (eritrocitos humanos) con otro, la reaccin con y los controles, recordando que un volumen de sangre da aproxima-
la mezcla de los dos antisueros especficos para cada antgeno da lugar a damente la mitad de sedimento celular.
dos tipos de agregados, que contiene cada uno un solo tipo de clula roja.
3. Lavar los eritrocitos tres veces con SF. Realizar las centrifugaciones
Uno de los problemas de esta tcnica es la variacin que puede haber en el a 2 500 rpm durante 1Ominutos. Eliminar con pipeta el sobrenadante.
recubrimiento de antgeno, lo cual tiene un marcado efecto sohre la
Preparacin del suero problema (dcscomplementacin y absorcin) :
detectabilidad de la tcnica. Adems, la IgM es 750 veces ms eficiente
que la IgG para causar aglutinacin. Finalmente, d titulo puede variar por un 4. Colocar el suero problema en bao de agua a 56 C durante Yi hora
factor de 2, simplemente debido a la subjetividad de las estimaciones. con agitacin suave. Al cabo de este tiempo dejarlo 10-15 minutos a
temperatura ambiente.
Titulacin de anticuerpos contra un antgeno polisacardico 5. Para la absorcin de posibles aglutininas mezclar en la relacin 1 mL
(de E. co/1) por hemaglutinacin pasiva d sedimento celular: 1 mL de suero, homogeneizando suavemente la
mezcla y mantenindola durante i 5 minutos a temperatura ambiente.
Material
Centrifugar a 2 500 rpm durante 1O minutos . Extraer cuidadosamen-
- Suero problema te el suero absorbido (no arrastrar clulas; si esto sucede, volver a
Sangre de camero en Alsever, citratada o heparinizada centrifugar) .

- Solucin de antgeno polisacardico de E. coli (p. 32) Sensibilizacin:

- Salina fisiolgica 6. Preparar una suspensin de eritrocitos al 10 % en SF.

- Placa Takatsi 7. Mezclar 0,5 mL de la suspensin de eritrocitos al l O% con 0,5 mL de


la solucin de polisacrido de E. coli .
- Tubos de centrfuga
8. Incubar la mezcla J hora a 37 C.
- Tubos de ensayo
9. Lavar los hemates sensibilizados (recubiertos) tres veces con SF
- Pipeta Pasteur
para eliminar el antgeno libre.
Pipetas 1O. Aadir el volumen de SF necesario para hacer una suspensin al 2 %
- Guantes de los eritrocitos sensibilizados (ES) . Aplicar la ley de la volumetra.
Centrfuga Titulacin:
- Bao de agua 11 . Preparar una suspensin al 2 % de eritrocitos normales (EN) (no
recubiertos) para utilizar en los controles .
Mtodo
12. Preparar los siguiente.s controles:
Preparacin de los eritrocitos:
50 L de susp. al 2 % de ES + 50 L de SF
1. Colocarse los guantes y mantenerlos puestos durante toda la tcnica

184 185
50 L de susp. al 2 % de EN+ 50 L de SF
_ Placa Takatsi
50 L de susp. al 2 % de EN + 50 L del suero problema sin diluir
_ Tubos de centrfuga
13 . Preparar por duplicado una serie de diluciones dobles del suero pro-
blema, aadiendo 50 L de SF a partir del segundo pozo en dos hile- - Tubos de ensmo
ras (por ejemplo, A y B) y proceder como se describi en la pgina - Pipeta Pasteur
123 . Desechar 50 L del ltimo pozo.
- Pipetas
14. Aadir a todos los poros de las dos hileras 50 L de la suspensin de ES .
- Centrfuga
15. Mezclar los inmunorreactantes dando unos golpes laterales a la placa
- Bao de agua
o rotndola varias veces. Cubrirla con una lmina de cristal y dejarla
en re>Qso a temperatura ambiente durante 1 hora o hasta el otro da . - Solucin de cido tnico (5 mg en 50 mL de SF)
16.0bservar los resultados, comenzando por los controles. Determinar el Mtodo
ttulo de aglutininas. Proceder como en el mtodo directo (pgina 181 ) .
1. Tomar los eritrocitos Si son frescos , centrifugarlos y lavarlos tres veces
Observacin con SF. El sobrcnadante debe ser incoloro y transparente. Si son
Las mismas que se sealaron en el mtodo directo (pgina 180). El la\.ado fom10lados , slo hay que centrifugarlos. Es suficiente 1 mL de clulas.
de los eritrocitos consiste, despus de separado el plasma por centrifugacin, 2. Preparar una suspensin al 1O % en SF.
en aadirles y resuspenderlos con cuidado en 2-5 volmenes de SF u otro
3. Tomar 1 mL de la suspensin para pr~parar el control de clulas norma-
diluente apropiado. A continuacin se centrifuga, se retira el sobrenadante y
les (EN) y adicionarle 2 mL de SF.
se repite la operacin segn el nmero de lavados a realizar. Habitualmente
las centrifugaciones se realizan a 2 500 rpm durante 1O minutos . 4 . Tomar 4 rnL de la suspensin y adicionarle 6 mL de la solucin de cido
tnico para preparar las clulas tanadas (ET).
Titulacin de anticuerpos contra un antgeno proteico 5. Incubar ambos tubos (EN y ET) a 37 C durante 15 minutos .
(lgG humana) por hemaglutinacin pasiva con eritrocitos tanados
6 . Centrifugar y lavar las clulas una vez con aproximadamente lO mL de SF.
Material 7. Resuspender los EN en 3 mL de SF y los ET, en 6 mL del mismo diluente.
- Suero problema, sueros controles positi vo y negativo 8. Tomar 1,5 mL de la suspensin de ET y adicionarle l,5 mL de SF para
- Sangre de camero fresca citratada o heparinizada, o eritroc itos fo n nolados preparar el control de ET.

- IgG humana previamente calentada a 56 C durante 1 hora 9. Mezclar los 4,5 mL restantes con 4,5 mL de solucin de lgG humana
previamente calentada, para sensibilizar los eritrocitos (ES) .
- Salina fisiolgica
10. Incubar los tres tubos (EN , ET y ES) a 37 C en bao de agua durante
- Suero de conejo normal al 1 % en SF (SCN 1 %)
30 minutos, centrifugarlos y lavar las clulas tres veces con SF.
- PBS pH 7,2 ( 100 mL de SF :32,2 mL de KHl0 4 O,15 mol/L:76,0 mL de 11 . Rcsuspendcr los EN y los ET en 4 mL del SCN 1 % v los ES, en 12 mL,
Na2HP0 4 0,15 mol/L)
para una concentracin del 2-2 .5 % .
186
187
_ Eritrocitos humanos previamente lavados con salina fisiolgica
12. Para la titulacin preparar con SCN 1 % diluciones dobles del suer
problema (50 L) previamente descomplementado y absorb ido (p _ Anti cuerpo monoclonat anti-CRI
gina 185 ), as como de los sueros controles _ Antic uerpo policlonal anti-lgG de ratn
13 . Adicionar a todos los pozos 50 L de los ES . - PBS
14. Preparar los siguientes controles:
M todo
50 L de EN + 50 L de SCN l %
l. Preparar diluciones dobles det anticuerpo monoclonal anti -CRl en PBS
50 L de ET + 50 L de SCN 1 % para un volumen de 25 L .
50 L de ES + 50 L de SCN l ~ 2 Adicionar a cada pozo 25 L de una suspensin de eritrocitos al 0,5 %.
15 . Rotar la placa para mezclar los inmunorreactantes y dejarla en reposo 3 Incubar 1 hora a 4 "C.
temperatura ambiente l hora o hasta el da siguiente.
4 Lavar dos veces las clulas con PBS.
16. Determinar el ttulo de anticuerpo~ . Se puede proceder como en el m
5. Rcsuspcndcr los eritrocitos en 25 L del anticuerpo anti-IgG diluido con-
todo directo (pgina 181 ).
venientemente en PBS .
Observacin 6. Dejar rex>Sar la placa de microtitulacin 1 hora a la temperatura del cuarto.
Se pueden momificar los eritrocitos, lo que permite contar con un lote d 7. Registrar la aglutinacin usando los patrones de sedimentacin despus
clulas de caractersticas similares por un largo tiempo, y rea lizar 1 de inclinar casi a posicin vertical la placa 1O minutos (mtodo de la
hemaglutinacin con estas clulas estabilizadas, las cuales mantienen mu lgrima) . Los eritrocitos no aglltinados drenarn dando un patrn pare-
chas de las propiedades de las clulas frescas . En este caso no es necesari cido a una lgrima y las clulas aglutinadas permanecern adheridas al
la descomplementacin de los sueros a titular. fondo de los pozos . Los resultados de actividad de CR 1 alta, intermedia
y baja se darn de acuerdo con la tab la siguiente:
Determinacin de receptores para complemento tipo 1 (CRl)
Actividad alta Ttulos >256
sobre eritrocitos humanos mediante una mirrotcnica
de hemaglutinacin pasiva Actividad intermedia T tu los 64: 128 y 256

Los receptores para C3b (CR I) han sido demostrados sobre muchos ti Act ividad baja T tu los< 64
celulares, incluyendo los eritrocitos humanos. La actividad sobre eritrocit,
est genticamente regulada y tres fenotipos, caracterizados por el nme Prepa racin de eri trocitos formo,ados
de receptores (alta, intermedia y baja), se han encontrado en poblacion
Materia l
normales. Estos receptores estn asociados con la e liminacin
inmunocomplejos circulantes . La tcnica se lleva a cabo en un equipo - Sangre recin extrada citratada o hcparinizada
rnicrotitulacin y utiliza un anticuerpo monoclonal murino anti-CR 1. - Salina fisi olgica
Material - PBS pH 7,2 (1 00 mL de SF:32.2 mL de KHl0 4 O, 15 mol/L :76.0 mL de
Na:HP0 4 0,15 mol/L)
- Equipo de microtitulacin
189
188
- Solucin acuosa de fonnaldehdo al 3 % libre . Este es el principio de los ensayos de inhibicin de la aglutinacin, que ~
- T1merosal al 10 % se caracterizan por una elevada detcctabilidad . Del mismo modo, la agluti-
nacin por anticuerpos de glbulos rojos recubiertos del antgeno especfico
- Tubos de centrfuga
puede inhibirse incubando previamente el anticuerpo con suero anti-idiotpico.
- Pipetas Esto provee de un ensayo sensible para la deteccin y cuantificacin de
anticuerpos anti-idiotpicos, que reaccionan con la regin variable del anti-
- Centrfuga
cuerpO . bloqueando estricamente la unin del antgeno (Berzofski and
- Zaranda Bcrkower. 1986 ).
- Incubadora
- Bulbos de cristal AGLUTINACIN CON PARTCULAS DE LTEX -k
Mtodo Las partculas de ltex son e~fer;ts microscpicas constituidas de polmeros
de estireno.J..as partculas ms empleadas en los ens yos serolgicos son
1. Tomar la sangre recin extrada (en el da), centrifugarla y lavarla cuatro de 0.8 1ro de dimetr~ son mu~ .lllifonnes en su tamao, Por la presen-
veces con SF y una vez con el PBS. cia en su superficie de grupos sulfato estn cargadas negativamente y se
2. Preparar una suspensin al 10 % en el PBS . repelen entre s, mantenindose en suspensin.

3. Mezclar la suspensin con un volumen igual de fonnaldehdo al 3 % . La caracterstica ms importante de estas entidades es_g_ue fonnan suspen-
siones estables que puaj~n ser de~estabilizadas...ines.pecftcamentiij:>oreje1-
4. Dejar la mezcla en agitacin a 37 C durante 18 horas . plo. con cido tricloroacticol ~ es~ ficamcnte y ba~ciones contro-
5. Centrifugar y lavar los eritrocitos cinco veces con SF o agua destila- ladas. como una r~ccin ant~eno-anticuerpo . Cuando estn recubiertas o
da . sensibilizadas con un ligando, tal como antgeno o anticuerpo, las partculas
asumen las propiedades de este ligando, y fonnan coloides liofilicos estables
6. Preparar una suspensin al 1O % en SF o agua destilada y a adi rle que se agregan cuando reaccionan con el reactivo correspondiente.
timerosal como preservativo para una concentracin final del 0,02 % .
Los ligandos son umdos a las partculas de ltex por dos mtodos: adsorcin
7. Dispensar a razn de 5 mL en bulbos de cristal y conservarlos a 4 C. pasiva o simp le y unin covalente . La adsorcin pasiva se prOduce cuando
Tambin pueden gua rdarse en congelacin o ser liofilizados . csro'n tancamente y al azar las molculas del ligando se unen a la superficie
de la x1 rt cula. recubrindola con una doble capa molecular. La interior se
INHIBICIN DE LA HEMAGLUTJNAC IN rnanticnl! firmemente unida por enlaces no covalentes, en la mayora de los
casos por interacciones hidrofbicas entre los aminocidos hidrfobos de la
Una vez que el ttu lo de anticuerpos en el suer~ se determin, este ensayo protena~ las regiones no cargadas de la superficie del policstireno . La capa
puede resultar til. Para ello, a cantidades constantes del antisuero (a una 1.' \lcnor est dbi lmente u111da . y pt1t.:de ser removid:i por lavado. lo que en
concentracin dos veces mayor que la concentracin limitante para proJu - l)C,1.,.1n1K's fl(' es necesario. Esta rcaccion se p roduce tan rpidamente que
cir aglutinacin) se le adic ionan cantidades va1 iablcs de antgeno libre, y sc en 1 n ' ininutos d 98 % del ligando queda adsorbido Fl ligand~ debe
incuban 15-30 minutos a temperatura ambiente o a 3 7 C'. A continuacin se 111 tl11n 1~e lo mis puro posible Adems de su concentracion. otros factores
aade la stspcnsin de eritrocitos sensibilizados La aglutinacin se inh1hc , n1lln In temperatu ra. d pl I. l;i prcsc11c1;i de sust;inci.:t<; tcns0act1\as ~ b
cuando la mitad o ms de los sitios dcl anticuerpo cstan ocupados por antgeno 'l lll"t.1111~ dielctrica del medio pueden alrct;ir la ad'>orc11)1J ,id ti~:i ndo

1(/() 14 1
La albmina es utilizada frecuentemente, a una concentracin final de O, 1-1 %, .ft /0l<'
1 1

como agente estabilizador de los reactivos de ltex. Las molculas de Por .::ida rnil dm.o de G BS qu..: contiene 500 g de lgG humana, adicionar
albmina ocupan los espacios vacos sobre la superficie del ltex y forman u. 1 m L dt.: la suspcn:,ion de latcx al 1O % .
multicapas de estabilizador que se encuentran en equilibrio con las mol- ..:\!I,Jtar la mezcla vigorosamente durante l hora a 37. Coa temperatura
culas en solucin . Por otra parte, el exceso de albm ina conlleva a un :ur:bi.:ntc
aumento del nmero de multicapas, lo que dificulta la unin del antgeno y el
~ \"1:.i1; a b suspensin de ltex albmina y azida sdica para una con-
anticuerpo.
cc11trac1n fina l del O 2 y O, l % , respectivamente.
La desorcin del ligando casi siempre es mnima o nula si el ltex se lava
Agitar !a suspci~sn 30 minutos de fonna vigorosa .
se guarda en el mismo tampn que se us en la adsorcin y no se somete
cambios bruscos de temperatura. ' E:i'>ayar la estabi lidad de l reactivo. Para ello colocar sobre una lmina o
p<rtaobJdus 25 L de la suspensin de ltex y 50 L de GBS. Mezclar
Se recomienda prevenir el crecimiento microbiano aadiendo azida sdica ..:11 fonnJ c1rcular y obscna r durante 3-5 minutos, manteniendo la agita-
tirnerosal (concentracin final del O, 1 %) a la suspensin de ltex. cin S1 fuera inestable el reactivo, es decir, si aglutinara, aadir al bmina
hasta una concentracin finctl m-x1rna del 0,4 % .
Preparacin de un reactivo de ltex (, Ens:iy:ir d react ivo frente a un suero positi\o (que contenga Ac contra
para anticuerpos anti-IgG humana b l,;(1 humana) ) un suero negati vo.
Materia/ 7 Conscrva r en frio, evitando su congelacin . Estos reactivos pueden man-
tener~: \, ..:n buenas condiciones hasta 2 aos o ms de preparados .
- IgG humana pura en GBS
- Ltex de poliestireno de 0,81 m al 1O % Titulacin de a n tic uerpos median h:: agl u tinacin
- Salina tamponada con glicina (GBS) (glicina 0,2 mol/Len salina fisiolgi con partcu las de ltex
ca, pH 8,2)
Maten al
- Albmina bovina o humana al l O % en GBS
Reactivo de ltex recub ierto con lgG humana
- Azida sdica al l O %
Suero problema anti-IgG humana
Bulbos de cristal
Controles positi vo y negati vo
- Pipetas - Salina tamponada con glicina (GBS) pH 8,2
Incubadora a 3 7 C - Placa de microtitulacin pa ra hacer las diluciones del suero problema
'
Zaranda - Portaobjetos o lminas para aglutinacin
- Portaobjetos - Pipetas

- Varilla o aplicador - Apl icadores o varillas


- Bombillo flu orescente
'\

192 193
n:accionan con lgG de otra::. cspccH.:s animaks Sustancias similares al FR
Mtodo ht1nK1110 se han encontrado en el suero de carneros y animales de otras

l . Sacar los reactivos del fro y dejar que tomen Ja temperatura ambic-nte. l.SpCC Je~ .

t\ la hora de preparar un reactivo de ltex para un inmunodiagnstico, es


2. Preparar con GBS las diluciones del suero problema ut1hz.a.ndo la placa
multipozos .. Un volu men de 100 L de cada dilucin es suficiente . preciso <lctcnn inar l.l c;)lccntracin ptima de inmunorreactante para la
5,:ns1b1 l1za cin , que permita detectar los niveles patolgicos .
3. Agitar el frasco del reactivo de ltex para homogenc1zarlo bien.
Material
4. Dividir un portaobjetos en tres campos de reacc in En uno de ellos
colocar 50 L del control positivo; en el siguiente. 5U L del control Los mismos que para la preparacin de un reactivo de ltex para anticuerpos
negativo; y en el tercero, 50 L del suero problema si n diluir ( olocar al anti-lgG humana y, adems, sueros controles positivo y negativo.
lado de cada una de las gotas 25 L de la suspensin de ltex . Mezclar
:\fr1odo
bien con tres varillas diferentes y rotar la lmina
I. Preparar en GGS las sigu ien1es soiucioncs de IgG humana : l 000; 800;
5. Observar los resultados en 2-3 minutos, pues ms all de este tiempo !as
600: 500: 400: 200 y 100 g/ niL . F.s ~ uficiente 1 mL de cada una.
preparaciones se alteran por la C\aporacin del agua . La observacin se
facilita con luz fluorescente tangencial al mantener la limma sobre un 2 \ adir a 1 mL de todas las diluciones O.! mL de la suspensin de ltex.
fondo oscuro. 3 Agitar los bulbus en zaranda rotatona durante 2 horas a 37 C.
6 Continuar del mismo modo con el resto d~ las dilu ciones dd suero pro- 4 Etml\ar la estabilidad de los siete reactivos . Para ello colocar sobre un
blema. portaobj.:!tos 25 L del react ivo y 50 L de GBS ; mezclar las 2 gotas con
7. Determinar el ttu lo y asignar cruces atendiendo a la intensidad de la una vanlla; rotar la lmina y obsef\/ a r.
aglutinacin o al tiempo de su aparicin. :'i. S1 el reactivo es inestable, es decir, si ;:glutina. aadlf albmina al 1O% a
razn de 20 L por frasco.
Observacin
Puede no haber aglutinacin a concentraciones altas del anticuerpo (fen- 6. Agitar 15 minutos ms .
meno de prozona, pgina 166). 7. Ensayar de nuevo la estabilidad .
8. Los reactivos estables se enfrentarn a los sueros positivo y negativo
Determinacin de la concentracin ptima de sensibilizacin (50 L del suero y 25 L de la suspensin de ltex) . Medir el tiempo que
en un reactivo de ltex para factor reumatoideo (FR) demora en aparecer la aglutina<;:in .
Los factores reumatoidcos son autoanticuerpos contra la lgG o la lgA lige- 9. Seleccionar aquel reactivo que presente la mejor aglutinacin en el me-
ramente desnaturalizada, usualmente de la clase lgM, encontrados con fre- nor tiempo.
cuencia en el suero de pacientes con artriti s rcumatoidea Ellos reaccionan
con la IgG humana o animal que ha sido agregada por calor o combinada Observacin
con e l ant geno, pero no con la IgG normal . Para detectar facto res El suero cont rol positivo pa ra FR ya est dilu ido adecuadamente; las mues-
reumatoideos (FR) se emplean generalmente partculas de ltex recubi ertas tras a procesar se dilu irn 1:20 para su ensayo.
con IgG o IgA que son "glutinadas por esos factores. Los FR humanos

195
194
Cuando el reactivo de lte\. debe aglutinar en una gama de co11C1..11trac1011cs 2. Agregar 25 L del reactivo de ltex (por ejemplo, el de mioglobina).
del analito. ser neces:trio ensayar los diferentes r~ct1\ os frente a esas Homogeneizar bien la mezcla. Rotar la lmina y observar el resultado.
concentraciones ~ seleccion:n aqud que sea capaz de disi.ingu1r los ni1 cks
patolgicos de los no pacolgicos. E..;c es el ca~o dd rcact1\ o de btc' para
mioglobina humana, que se recubre con ai1ticuerpos anti-mioglobma. d cual
debe aglutinar por encima de 60- 70 ng de mioglobina por md1htro de suero.
ya que los valores patolgicos estan por encima de l 00

Preparacin de una solucin de absorcin


para factores reumatoideos
Los FR presentes en el suero de los pacientes pucJu1 da r lugar a r~~ult4do~
falsamente positivos en los ensayos scrok>gicos Para.;\ 1ta1 :"tn 1111,', f..:r..::.
cia se preparan soluciones de absown que bloquean L.sto:> fctwes

Material
- IgG humana al 1O %
- Bao de agua a 56 ''C
Centrfuga
- Control positivo del reactivo de ltex para FR (EPB c.J. Finlay")

Mtodo
1. Calentar la IgG en bao de agua a 56 C durante 2 horas .
2. Centrifugarla a 12 000 rpm durante 2-3 minutos. Guardar el sobrenadante
(solucin de a bsorcin) y desechar el precipitado.
3. Comprobar su accin bloqueadora frente al suero control positivo del
reactivo de ltex para FR.

Ensayo del reactivo de ltex con el empleo


de la solucin de absorcin
Mtodo
1. Colocar en la lmina 50 L del suero problema o de su dilucin y al lado
1O L de la solu cin de absorcin , Mezclar bi en unos segundos para que
ocurra la reaccin entre los posibles FR y la IgG arcg ada .
197
196
CAPTULO V
INMUNOENSAYOS ENZIMTICOS

Los inrnunocnsayos enzimticos ::e basan en importantes fenmenos biol-


gicos : 1) el extraordinario poder discriminatorio de los anticuerpos y 2) el
poder cataltico y la .:specificidad de las enzimas, que pueden, a menudo, ser
detectadas con gran ~aciliaad .
Los EIA integran una estrategia dual : la reaccin entre los irununorreactantes
(antgeno y su correspondiente anticucrpo) y-id deteccin de esa reaccin al
empicar como indicador una enzima conjugada al antgeno o al anticuerpo
(Figura 48), o a un tercer compuesto como, por ejemplo; la protena A (SpA)
(Figura 49) .

Producto
Sustrato colorea.do
Ag Ac-E o
<>> . E ~
o'
o
J

Reaccin Ag+Ac Reaccin enzima+ sustrato

Figura 48. Estrategia dual de Jos EIA

199
EIH: del ingls enzyme immunohistochemistry (ensayo histoqumico
inmunoenzimtico).
.
Producto CELISA: del ingls ce/111/ar enzyme l~nked immunosorbent assay (ensa-
Ag SpAE Sustrato coloreado

Ac ,.0 inmunoenzimtico celular sobre fase slida).
o
<>> Cf . O-e
o

ELISA-DAS : del ingls ELISA sandwich double antibody (ELISA sand-
wich de doble anticuerpo).
ELI SA-HADAS : del ingls EL/SA sandwich double antibody with
heterologous antibody (ELISA sandwich de doble anticuerpo con anti-
Reaccin Ag tAc Reaccin ActS~ Reaccin enzima +sustrato cuerpo heterlogo).
Figura 49 . Ensayo irununoenzimtico con protena A (SpA). ELISA-CAB : del ingls ELISA-avidinlbiotin complex (ELISA-complejo
av1dina/biotina).
Los EIA tienen especificidades y detectabilidadcs similares o superiores a ' .
los radioinmunoensayos (RIA), y presentan algunas ventajas sobre estos, PAP : del ingls POase-antiPOase comp/ex (complejo POasa-antiPOasa) ,
aunque tambin tienen sus inconvenier.tes y riesgos. Se emplea fundamentalmente en los EIH.

VENTAJAS DE LOS EIA (Tijssen, 1985) CLASIFICAON DE LOS ETA


1. Sensibilidad, detectabilidad y especificidad muy altas. Ls EI A pueden dividirse, de auerdo con sus diferencias esenciales, en:
EIA basados en la amplificacin de la actividad (tipo AA) y en la modula-
2. Equipamiento relativamente barato.
cin de la actividad (tipo MA). Aunque no se corresponden siempre con los
3. Rapidez y simplicidad en su ejecucin. ensayos no competitivos y cpmpetitivos, a menudo se relacionan los ensa-
yos tipo AA con los no competitivos y los del tipo ~1A, con los competitivos.
4. Reproducibilidad elevada y evaluacin objetiva.
Tanto en los ensayos AA homogneos (de un solo paso) como en los
5. Factibilidad de ejecucin en condiciones de campo.
heterogneos (de varios pasos), se emplea un gran exceso de
6. Ningn riesgo por radiacin. inmunorreactante para obtener una seal mxima del compuesto que va a
ser chequeado (analito). Esto est en correspondencia con la ley de accin
7. Reactivos relativamente baratos y de larga vida.
de masas e implica que -aun a muy bajas concentraciones de las molcu-
8. Versatilidad notable por la gran variedad y especificidad de las enzimas . las- una elevada fraccin reaccionar@ ! _inmunorreactante se adiciona
en excesa1 El lmite terico del nmero de molculas detectables por los
9. Todas las ventajas de los anticuerpos monoclonales cuando estos se in-
corporan a los EIA. mtodos AA es 1, pero en la prctica se detectan hasta aproximadamente
104 molculas.
Numerosos mtodos inmunoenzimticos han sido desarrollados, algunos de
Por su parte, Jos mtodos MA. dependen de la modulacin de la seal
los cuales se han identificado por siglas:
enzimtica debido a la competencia del analito por el inmunorreactante. A
ELISA : del ingls enzyme linked immunosorbent assay (ensayo ?iferencia de los mtodos AA, la sensibilidad de los ensayos MA se
inmunoenzimtico sobre fase ~lida) . mcrementa a concentraciones ms bajas del inmunorreactante, ya que -a

200 201
bajas concentraciones- una variacin en la cantidad de molculas que co
piten tiene un efecto mayor sobre la interaccin con las especies marca
J\'fTODO ELJSA

:Una cantidad constante de anticuerpo requiere menos antgeno para la Este mtodo fue descrito primeramente por Engwall y Perlman ( 1971 , 1972),
1

, tra~in del 50 % de sus sitios de combinacin si su afinidad es mayor. quienes - para titular inmunoglobulinas- utilizaron como inmuno~rben!-CS' .
constante de afinidad es, por tanto, de la mayor importancia en los ensay tubos de pohestireno . .Un paso importante en el desarrollo del ELISA lo
del tipo MA. El lmite de det~~... de estos ensayos tan1bin depende d dieron Voller y sus colegas (1974 ), al realizar la tcnica en microplaca de

'
error-..e xpe.rimqltal (Ee) , siendo~ la cantidad mnima de analito que pu
de ~ei: --dete ctada.
La detectabilidad de los EIA tipo AA es potcncialrt1cnce superior a la de 1
mtodos MA. Por lo general la exactitud y detectabilidad de los ensay
MA son menores que las que se obtienen con marcadores radioacti vos e
. pliestireno y sugerir su empleo en la titulacin de anticuerpos inducidos por
agent es infecciosos .
Al estar el antgeno o el anticuerpo mareado con una~ y adems
nsolubifufilio sobre el inmunoadsorbcnt~. Ja reaccin antgeno-anticuerpo
q'tcda inmovilizada y puede ser fcilmente revelada por la adicin del sustrato .

los RIA . Por otra parte, los _!n.todos AA t ie nen potencial me nt que. al actuar la enzima, produce un coJ,or observable a simple vista o
detectabilidades mucho mayores q_ue l9s an lisis de saturacin por RIA. cuant ificable mediante un espectrofotmetro o colormetro. A menudo la
coloracin se logra o amplifica con el empleo de cromgenos.
e!- especificidad de los ensayos inmu'nocnz_ftticps est determinada por 1 Desde 1977 hasta hoy da se observ~ un auge creciente en la aplicacin de
mteraccin Ag~Ac) as como tanlbin por factore&,del medio. La no espec
los EIA y, muy en particular, de los ensayos sobre fase slida (ELISA),
ficidad de la reaccin inmunolgica puede deberse a dos fenmenos : 1
siendo ejecutados y desarrollados en numerosos laboratorios . Ellos constitu-
reactividad compartida y la reactividad cruzada.-1( Figura 50) . La especific
~cn uno de los mtodos de diagnstico de enfermedades, tanto ~n el hom-
dad de un antisuero policlonal es, generalmente, may.o r que la de su
bre. animales y vegetales, ms extensan1ente utilizado en ,fl.Jllisis rutinarios,
anticuerpos individuales .
as como en progran1as de investigacin. Algunas de S.U~ \lah~tes permiten
la cuantificacin de antgenos o anticuerpos con gran exactitud y precisin .
'

>-< >--<
)-(
]~
- }--(
}-[
- )-(
VARIANTES DE ELISA
La variedad de EIA sobre fase slida (ELISA) puede tender a confundir
tanto con respecto a su ordenamiento como a sus requerimientos (chequeo
de antgeno o anticuerpo, con alta especificidad o alta detectabilidad). Sin
Ag especfico Ac contra A Ag con reactivida embargo, un anlisis de los diferentes ELISA revela que, independiente-

HG,
compartida

t}H
mente del diseo, siempre pueden disti nguirse tres etapas :

....__ }-{ - 1. La unin a la fase slida del inmunorreactante de ca ptura.


2. La incubacin con la muestra a chequear para que las molculas del
analito se siten o compitan por la segunda capa .
lntera~cin homloga Ac contra A
Un paso de amplificacin en los ensayos AA, el cual puede contener varias
Figura 50. Reacti viciad compartida (arriba ) y cruzada (abajo). capas de inmunorrcactantes. Este paso de amplificacin es posible tanto en
los ensayos no competitivos como en los competitivos indirectos (Figura 51 ): .
202
203
,. dt lw sealar que. con muy raras cxccpc1oncs. slo una capa de antgeno
~~ 5 Lfll~'lca. bien como molcula de captura (R l ), en la muestra (R2) o en el
S'-
]] pJsc Je amplif~cac1on ( R3 ) en los mtodos de captura de clases de
~ r
o
e:
QI
- ~"'
11 n11noglobu lin.1"

<t <t
-
..._

<t
CJI
e: ~i
. .B
! Fi H ISA/ hi.:tcrngn~ que es el ms difundido, tiene vanas etapas Se
rc:1l11:tla acfic1~1cncial de una serie de reactivos. incubacin,. lavados
~~ -~
<t ~ C\I ,,nn..:Jio:. A continuac1011 se presentan slo algunas de las , ariantcs ms
tt: 11

~ < ~ > ttid 1.adas


1
1 1 >-. "' ~
oQ. .(]
u~ ~
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... ii ~ . l 1 ISA no competitivo con antgeno fijado .

~-
QI
.1 I~ fase slida (mtodo directo)'
~~~
~

...
-~

~ ~:t 1-+- -
. a::
e:
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a::
b ., g
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o .!5

3. Sustrato
g~ ~ o
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E J1 ~ s 2. Ac -enzimo

~ l..J.J
:: ! .!!. ..8
e:
~

~ a
"' i] ~
:; e: J.!
O <,,? ~~ J 1. Antgeno

= t.:J - Figura 52 ELISA directo


;;;~~
..2 e~ ~
~ ~ ,
...
o
g ;\~
C0nsta de las siguientes etapas:

ci.' . ~. .
:::>. -e: !:I
u i. F1.1acin del antgeno. Lavado para eliminar el reactivo fijado del>ilmcntc
~ u e:

-~~ ~i :
-

~ ~
u

ij
o no fijado. Bloqueo y lavado.
\

2 Adicin del anticuerpo marcado con la enzima . Si el anticuerpo reaccio-


1 u - ... na con el antgeno, el complejo queda insolubilizado. Lavado para elimi-
L----------1 i5 Q,. "'
Si ~~ nar las molculas de anticuerpo que no reaccionaron
tj

_ 1-~-~a .t .E u -
5 Adicin del sustrato de la enzima. Aparicin del proJucto coloreado
61> sjl
-
-8 ~
o e:
111"'
:s 4 Paralizacin de la reaccin y_lectura .
1 fil :2 Est:i. \ariante .se emplc~ frecuentemente parJ la titulacin de los conjugados
o...; ~9"i.::14 anticuerQo-cnzima.\ Puede utilizarse como mtodo diagnstico para detectar
; >-.:a ~-:.!3 en este caso no se bloquea la placa. Tiene como des\cntaja el alto
00~ ~ hackgrmmd (color de fondo) y su alta dependencia de los factores de ddu -
: ~ :! c111 rc::.ultados ptimos slo se obtienen en una 'gama reducida de di lucio-

205
nes, debido a la competicin por protenas no especficas o a la msuficiencia
de antgeno para cubrir todos Jos sitios disponibles sobre la fase slida. FLISA no competitivo con anticuerpo fijado a la fase slida
(mtodo .m nrlwich directo o ELISA-DAS)
ELlSA no competitivo con antgeno fijado
a la fase slida (mtodo in di recto)
o o 4 . Sustrato
3. Ac-enz imo
4 . Sustrato 2. An t geno
3 . Anti -1g-enzimo 1. Anticuerpo
2. Anticuerpo Figura 54 . EIJSA sandwich di recto.
1 . Antgeno
Cuida de las siguientes etapas:
Figura 53 . ELISA in<l1n:cto F1.1 acin del anticuerpo . Lavado para eliminar los a ntic ue rpos
dcficcntemente adsorbidos o no adsorbidos. Bloqueo y lavado
Consta de las sigui~tes etapas :
2 Adicin de la muestra Si contiene el antgeno este es capturado por el
1. Fijacin del antgeno. Bloqueo y lavado . ant icuerpo. Lavado.
2. Adicin de la muestra. Sus anticuerpos reaccionan con el antgeno inmo ~ Adicin del mismo anticuerpo conjugado con la enzima . Lavado.
vilizado . A ellos se les denomina primer anticuerpo
-t. Adicin del sustrato.
3. Adicin de anticuerpos anti-inmunoglobulina conjugados con la enzim
5 Paralisis de la reaccin y lectura .
(segu ndo ant icuerp.o) . Ellos reaccionan con el prime r anticuerp
Lavado para eliminar la anti-inmunogl obu li na qu e no haya reacci o Los mtodos sandwich se utilizan para detectar y ~~antificar antgenos . Un
nado . requisito que d~ cumplir <?1 antisuero pol iclonal es la presencia de anticuerpos
que reconozcan, al menos, dos ep1topos convenientemente situados en la
4. Adicin del sustrato. molcula de antgeno (epitopos opuestos) Tambin pueden emplearse dos
5. Paralizacin de la reaccin y lectura. anticuerpos monoclonaJes que reconozcan taks sitios . Para la cuantificacin
de. antgeno es necesario disponer de una sene de estndares de concentra-
Este mtodo se emplea para detectar anticuerpos lgG o IgA. Tiene al cin conocida del mismo, con vista a establecer la currn de calibracin
detectabilidad, ya que varias molculas de anti-l g ma rcadas reaccion
con cada molc ula del primer ant icuerpo y l Ac ant -Ig st obtiene d ELISA no competitivo con anticuerpo fijado a la fase slida
suero hiperinmune. Cuando se buscan anticuerpos del isotipo IgG, el se (mtodo sambvich indirecto o ELISA-HADAS)
gundo anticuerpo puede sustituirse por protena A o protena G conj uga
con la enzima. Consta de las siguientes etapas:
1 Y 2. Anlogas al ELISA sanchtich directo
Adicin de anticuerpo especfico para el antgeno a detectar obtenido en
una l'SPl'Cic riistinta a la del anticuerpo de captura . Lavado.
206
20 7
5 1 la densidad ptima es anloga en aj y en b), el antgeno no est presente
en la muestra . Si hay diferencia. el antgeno est presente. La diferencia de
absorbanc ias es p1 oporcional a la concentracin del analito. Para cuantifi-
5. Sustrato
car se utilizan varias concentraciones del antgeno estndar para hacer la
4, AntiIg-enz1ma curva de titulacin.
3. Ac heterlogo
2. Anti;eno ELJSA de competicin con antgeno fijado a la fase slida
1. Anticuerpo
Figura 55 . EUSA .s1111d>11ch mdmxto

4. Adicin de anti-irununoglobulina espccfica para el anticuerpo di.: b eta-


pa 3 conjugada con enzima. La\ado.
...,...
3. Su3tr.
/dor:z
O
5 Adicin del sustrato.
6. Paralizacin de la reaccin y lectura
,t 2, Ac-E
1. Ag
2.AcE+Ag mueatral

Figura 57. ELISA de competicin con Ag fij ado a la fase s01ida.


ELISA de competicin con anticuer po fijado a la fase slida
Consta de las siguientes etapas :
t. ~ 1. Fijacin del antgeno. Lavado. Bloqueo y lavado.

o 0 o.f o o o 0 o o o
3 . S1;str. o
0
3 . Sus1r. 2. a) Adicin del anticuerpo conjugado con h enzima. Lavado.
2. Ag-E O _ } j 2.Ag-E+Ag b) Adicin simultnea del anticuerpo conjugado con la enzima y la mues-
muest ro tra. Lavado.
1. Ac
...____,..___ 1. Ac 3. Adicin del sustrato.
Figura 56. ELISA de co1npeticin con Ac fijado a la fase slida. 4. Paralizacin de la reaccin y lectura.

Consta de las siguientes etapas: Si la absorbancia es anloga en a) y en b), el antgeno no est presente en la
muestra. La diferencia de absorbancias es proporcional a la concentracin
1. Fijacin del anticuerpo . Lavado. Bloqueo y lavado. del analito. Al igual que en el ELISA de competicin con anticuerpo fijado a
2. a) Adicin del antgeno homlogo marcado con la enzima . Lavado. la fase slida, la densidad ptica disminuye con la concentracin de antgeno.
Los ensayos de competicin no requieren anticuerpos contra dos epitopos
b) Adicin simultnea del antgeno marcado con la enzima y la muestra. diferentes del antgeno, como en los mtodos sandwich, por lo que pueden
Lavado. ser una alternativa cuando slo se dispone de un anticuerpo monoclonal o de
3. Adiciu del sustrato. un policlonal que no rena condiciones para el sandwich. Para cuantificar
se utilizan varias concentraciones del antgeno estndar para hacer la curva
4 . Paralizacin de la reaccin y lectu ra.
de titulacin.
208 209
,1 un dcfocto en el volumen a.iiadido, pr evaporacin o por no ha~se man-
ELISA amplificado con ti complejo avidina-biotina t-:n 1do la placa durante la adsorcin en posicin horizontal. Estas interacciones
u11.:spccficas pucd..;n evitarse adsorbiendo la placa con BSA, gelatina o pro-
Existen varios sistemas de reconocimiento no mmuriolgico qu e se emplean
te nas del suero de leche al 2-4 % en el mismo tampn de fijacin. En esto
en los inmunoensayos como sistemas auxiliares . Los ms popu la1 cs :5on el
cons iste el bloqueo.
complejo avidina-biotina,*la protena A y las lectinas .
U bloqueo de los posibles espacios vac6s se realiza despus del lavado.
El sistema avidina-biotina (AB) se ha convertido en una importante herra- ..::-.:haustivo de los pozos (tres a seis veces), para eliminar el antgeno o el
mienta para los EIA debido a que: 1) la avidina tiene una afinidad excepcio- :wt1cucrpo que no haya quedado fim1emente adsorbido, siendo ocupados
nalmente alta pvr la biotina (10 1~ M-1). 2) la biotina puede ser flmcntc ..;tos sitios por la protena bloqueadora (Figura 59).
acoplada a los anticuerpos y a muchas enzimas sin prdida de su acti\idad .
3) la avidina es muy estable y ti ene varios sitios de unin. por 10 que puede

looo! ~
ser usada, como la protena A, como una molcula puente entre dos rnok:-
cu las biotiniladas (Figura 58) . El empico de l s istema A.B prod uce
detectabilidades superiores y bajos hackgro11nd en los EIA
Tapizado con el Ag Bloqueo
r 1- igura 59. Recubri miento d.:: los espacios vacos (bloqueo).
Anticuerpo I Enzima
morc".ldo morcada
con
Avidino
O1 cor,
La placa tapizada ) IJioqucada o simplemente tapizada permanecer reactiva
mucho tiempo siempre qu\, :>e mantenga seca y se guarde a baja temperatu-
biotina ~ i otin a ra . Esto pe rmite reducir notabl eme nte el tiempo de ejecucin del
mmunocnsayo.
Figura 58. Puente con l sistema avidina-hiotina (amplificacin). Es importante utilizr un tiempo correcto de incubacin en las distintas eta-
pas del mtodo. Frecuentemente las incubaciones se realizan a 37 C y a
ALGUNAS CONSIDERACIONES PRCTICAS temperatura ambiente, siendo necesario cubrir bien la placa y mantenerla
en un ambiente hmedo, .para evitar la evaporacin que afecta principal-
Para la ejecucin de las tcnicas ELISA normalmente se utilizan placas de
mente los pozos situados en los bordes de la placa.
poliestireno o cloruro de polivinilo, de fondo plano y 96 pocillos con capaci-
dad de 350 L cada uno. Un aspecto de la mayor importancia es el lavado. Si .e ste es insuficiente
pueden producirse errores, principalmente tras la incubacin del conjugado,
El tapiz.a.do o recubrimiento de la fase slida debe realizarse con una concen- y los lavados muy intensos y a gran presin consiguen ser nocivos en cua-
tracin adecuada del antgeno o el anticuerpo, previamente seleccionada. lesquiera de las etapas . Por ello esta operacin debe estandarizarse al mxi-
Fijaciones inespecficas pueden producirse en zonas no cubiertas del pocillo mo y, si e$ posible, realizarse en un equipo automtico para este fin .
debido al empleo de cantidades inapropiadas del antgeno o del anticuerpo, o Los tampones y reactivos deben estar en su pH correcto y no tener conta-
minaciones que posibiliten la presencia de enzimas microbianas y, por tanto,
Avidina: Glicoprotena de la clara de huevo que tiene afinidad extremadamente alta por la posibles chores por interferencia o reaccin . -
biotina (vitamina H, soluble en agua). Consiste de cuatro subunidades idnticas, cada w1a de Deben utilizarse sustratos o mezclas sustrato+cromgeno recin prepara-
las cuales une una molcula de biotina. La estreptavidina, una protena ligeramt:nte ms
pequea aislada de Srreptomy,es avidi11ii, puede usarse en lugar de la avidina . dos y comprobar en ellos la ausencia de coloracin. Asimismo equilibrarse

211
21 ()
peridicamente las micropipetas automticas y los dispensadores para ase-
~. Como un titulo (dilucin lmite). Las muestras se diluyen seriadamente y
gurar el volumen que se aplica de cada uno de los reactivos .
todas las diluciones se ensayan El titulo es la mayor dilucin que rinde
un valor supenor al de un grupo de muestras negativas conocidas o al
RESULTADOS\' FORMA DE EXPRESARLOS valor de corte establecido.
(Voller et al., 1979) ~ En unidades de concentracin, por ejemplo: mg/mL . Se ensayan junto
El resultado final de un ELISA puede obtenerse por simple observacin con las muestras una serie de estndares de concentracin conocida. Se
visual o medido en un fotmetro. construye una curva de calibracin con la absorbancia de los estndares
y con ella se calcula el contenido de las muestras. Este mtodo se utiliza
Las lecturas visuales son rriuy consistentes y seguras, particulanncnte cuando con antgenos o haptenos bien definidos y es menos adecuado para en-
slo se requiere un "s" o un "no". Los resultados positivos se identifican por sayos de anticuerpo, debido a las variaciones de la afinidad de estas
la aparicin de color. En el rango amarillo-pardo (400-500 nm) el ojo huma- molculas en los sueros.
no puede distinguir sin dificultad soluciones con absorbancia.s 0. 1-0.2 de !:is
soluciones negativas incoloras. Si lo que se requiere es un titulo, se hacen
diluciones seriadas de la muestra y el ttulo corresponde a la mayor dilucin ENZIMAS Y CONJUGADOS
que da una reaccin coloreada visible.
Las enzimas ms utiliiadas en las tcicas ELISA para el marcado de
Para ensayos de alta precisin los resultados deben leerse fotomtncamente antgenos o ms frecuentemente de anticuerpos, son la fosfatasa alcalina
a la longitud de onda apropiada (para el amarillo ric fosfatasa alcalina. (PA) de mucosa intestinal de ternera, y la peroxidasa (PO) de rbano pican-
405 nm y para el rojizo de la peroxidasa, 492 nm) . itos lectores automticos te (HRPO). Esta ltima er la favorita de muchos tcnicos por su bajo costo,
realizan la lectura de una placa completa en menos de l minuto. Estos resul- su fci l conjugacin y la amplia variedad de sustratos que posee.
tados pueden registrarse de las siguientes formas :
El objetivo de la conjugacin es unir la e.iZima con el anticuerpo o el antgeno
1. Como "positivo" o "negativo". En este caso todas las muestras que tie- de tal forma que cada uno retenga la cantidad mxima de su reactividad. En
nen un valor de absorbancia por encima de un nivel umbral (valor de el caso de la conjugacin de la PO por el mtodo del periodato, la oxidacin
corte, cut-off), por ejemplo, 0,2-0,4, son consideradas "positivas". El ni- de la enzima por este ltimo rinde peroxidasa-aldehdo sin prdida significa-
vel umbral o valor de corte se predetermina ensayando un gran nmero tiva de la actividad enzimtica. El peroxidasa-aldehdo forma bases de Schiff
de muestras negativas; el valor umbral est por encima del valor ms con los grupos a- o &-amino disponibles de la molcula JgG con una elevada
alto de estos negativos y suele calcularse como la absorbancia media de eficiencia. Estas bases de Schiff son luego estabilizadas con el borhidruro
las muestras negativas ms dos o tres vees ta desviacin estndar. de sodio (Nakane y Kawaoi, 1974).
2. Como valores de absorbancia, por ejemplo: 0,2; 0,7; 1,2 . Estos valores se El glutaraldehdo (GA), un reactivo bifuncional (dialdehdo), reacciona irre-
obtienen en ensayos ELISA realizados bajo condiciones controiadas con versiblemente con los grupos &-amino de la lisina, formando bases de Schiff.
la inclusin de muestras de referencia. Estos valores de absorbancia pue- El mtodo del GA de un solo paso es ms adecuado para la PA, mientras
den emplearse como una medida directa de la reactividad de las muestras . que con la PO se emplea el procedimiento de dos pasos .
3. Como una relacin, por ejemplo: absorbancia de la muestra/absorbancia Se recomienda la filtracin de los conjugados a travs de una columna de
media de muestras negativas. Un valor dos o tres veces superior a la Sephadex G- 100 o G-200 para la separacin de los anticuerpos no marca-
media de las muestras negativas a menudo se considera positivo. dos que podnan competir con los conjugados por los antgenos,' interfiriendo
en los inmunoensayos o en las determinaciones RZ del conjugado.
212
213
Las actividades inmunolgica y enzim tica de la preparac in deben ser c\a -
- NaIO, 0. 1 mol/ L (prepa rado al momento: 10, 7 mg para 0.5 mL de agua:
luadas . La titulac in combina ambas .a ctividades y con frecuencia el ttulo destilada)
se expresa por la mayor dilucin del conjugado con densidad pti ca igua l a
la unidad . Tampn acetato 0,00 l mol/!., pH 4,4(O, 136 g de acetato de sodio para
l L: ajustar pH a 4.4 con HCI 1 mol/L)
La concentracin ptima del conjugado depende li geramente del tipo de
- HCl l mo l/L (83 mL de HCI concentrado para 1 L)
ELISA. En aquellas variantes que cmple:an conjugados de anti-inmunoglobUlinas
o protena A se deben ensayar diferentes diluciones del w njugado (desde - Tampn bicarbonato 0.05 mol/L, pH 9,5 (4,20 g para l L)
1/100 hasta 1/2 000) frente a sucesivas dil uciones del antisucro ..:n placas .. l\a ~ CO i 0,2 mol/L (0,212 g para 10 mL de agua destilada)
tapizadas con una concentracin apropiada del ant1gcno. La dilucin del con-
- NaBH 4 0,5 % (preparado a l momento y en agua destilada fra, 5 mg para
jugado que produzca menor reaccin ini:_-specfic.a (background) con .muc!:- l mL)
tras negativas , e implique una clara distmcin de las muestras positivas, ser la
ptima. El conocimiento del ttulo de un conjugado no sustituye la determina- - Tampn f'ns-HCl 0,0 1 mol/ L NaCI 0,9 %, pH 7,4 ( 1,2 g de Tris-HCI y
9 g de "iaCI para 1 L)
cin de su concentracin ptima en el sistema de trabajo .
Papel de pH
El conjugado se conserva mezclado con igual volumen de glicerol (para e"itar
su congelacin) a -20 C en alcuots convenientes, con BSA ( l O mg/mL de - BSA al 10 %
conjugado) y timerosal o azida sodica al O.O 1 % . Puede aadrscle un inhibidor - Azida sdica al 1 %
de proteasa (por .e jemplo, PMCF a una concentracin final de 0,0 l mmol/L)
- PMCF
La no congelacin del conjugado durante sUl'conscrvacin permite tomar cada
vez la cantidad requerida sin desechar el resto . El preparado puede mantener- - Cnstalera
se activo al menos 2 aos y por lo general mucho ms tiempo . - Columna de Sephadex G-200 (2.6 x 100 cm)
En el easo de la PO su sustrato es el H 2 0 2 y uno de los cromgenos ms - Glicerol
empleado es el ortofenilendiamina (OPD) a pH 5. En el de la PA se emplea - Pipetas automticas
con mayor frecuencia el p-nitrofenilfosfato (sustrato) en dietanolamina (DEA)
apH 9,8. . - Membrana de dilis is
- Agitador magntico
El tiempo ptimo de incubacin es aquel en el que se obtiene la mayor diferen-
cia de color entre muestras positivas y negativas. Al cabo de este tiempo la - Tubos Eppcndorf
reaccin puede ser frenada con H,SO 4 12,5 % en el caso de la peroxidasa y PBS pH 7,2
con Na OH 1O mol/L, en el de la fosfatasa alcalina. Se deben esperar unos
M todo
5 minutos para que se estabilice la coloracin antes de proceder a la lectura .
1. Tomar 5 mg de HRPO y disol ver en 1, 1 mL de agua destilada. A 100 L
Conjugacin mediante rl mtodo del periodato adicionar le 2 ,9 mL de agua des tilada (dilucin 1:30) . Leer en e l
es pectrofotmetro. Calcular RZ y la concentracin (C ) de la enzima,
Material empicando las siguientes frmulas :
- Peroxidasa de rbano picante (Sigma grado V I)
- Anticuerpos (6-10 mg/mL) DO 403 nm = (debe dar 3)
RZ = DO 280 nm
2 14 -~ -
2"15
C (mg/mL) =DO 403 nm K dilucin Conjugaci n de un solo paso con glutaraldehdo
siendo K = 0,44 y dilucin = 30 Mate n o/
2. Adicionar a 1 mL de la solucin de HRPO 0,2 mL del periodato O, 1 moVL - Enzima
preparado al momento. El color debe cambiar a verdoso. Incubar la mez-..
cla durante 29 minutos a temperatura ambiente. Agitar1a dos o tres veces . Anticuerpos
Dializarla toda la noche contra el tampn acetato a 4 C (500 mL). - Tampn fosfato 100 mmol/L, pH 6,8
3. Dializar los anticuerpos (6-1 Omg/mL) en el tampn bicarbonato (500 mL) - GA al 1 % (para microscopa electrnica)
a 4 C.
- L-lisina 1 mol/ L
4. Despus de las dilisis, llevar a temperatura ambiente y mezclar las dos
Cristalera. pipetas, membrana de dilisis
soluciones en la proporcin 1: 1. Segudamente ajustar el pH a 9,5 con
unas gotas de la solucin de Na 1 C03 {de forma rpida). FI pi 1 c;c toma /1.1i:todo
con papel de pH. Proteger de la luz.
Dializar en forma exhaustiva (separadas o juntas) las soluciones de enzi-
5. Incubar la mezcla 2 horas a tem~ratura amb1rnte y moverla cuidadosa- ma y anticuerpo contra el tan1pn fosfato . Las proporciones recomenda-
mente cada 15 minutos, ma~tcni ndola siempre en la oscuridad. das se dan en la siguiente tabla:
6. Enfriar la mezcla a 4 C y adicionarle la solucin di) borhidrato prepara- TABLA XII. Cantidades de protena y GA para la conjugacin
da al momento y fra. Incubar 2 horas a.t "C . de un solo paso (Anameas et al., 1978)
7. Poner a dial izar el conjugado frente al tampn Tris-NaCI pH 7,4. Reali-
zar tres cambios con un volumen cada uno de 500 mL . Volumen Enzima IgG Fab GA 1 %
Enzima
total (mL) (mg) (mg) (mg) (mL)
8. Para la purificacin, aplicar el conjugado a una columna de Sephadex
PO 1 JO 5 2,5 0,05
G-200 equilibrada con PBS . Leer las fracciones a 280 y 403 run . Selec-
cionar aquellas con RZ entre 0,3 y 0,45 . AP 2 JO 5 2.5 0.05

9. Para su conservacin, aadir al conjugado: BSA, timerosal (o azida GO l 10 5 2.5 O, 15


sdica) y PMCF (inhibidor de proteasa) hasta una concentracin final BG 2 10 5 2,5 O.JO
del 1 %; 0,01 % y 0,01 mmoVL, respectivamente. Mezclar con un volu-
GO-glucosaoxidasa
men igual de glicerol. Homogeneizar, alicuotar y conservar el conjugado BG-heta-galactosidasa
bien rotulado a -20 C.
2. Adicionar a la mezcla enzima-anticuerpo la solucin de GA gota a gota .
Para calcular los volmenes de BSA y preservativo, y la cantidad de
3. Incubar 2-3 horas a temperatura ambiente. '
PMCF puede utilizar las siguientes frmulas :
4. Adicionar un exceso de L-lisina l mol/L (1/20 volumen) para bloquear
V de BSA al l O % = 0,22 V del conjugado
los sitios reactivos .
V de azida o timerosal al l % = Q,02 V del conjug.
5. Dializar exhaustivamente contra el tampn apropiado, purificar, titular y
g de PMCF = 0,0015 V del conjugado en mL conservar.

216 217
Mtodo de dos pasos para conjugar peroxidasa Tit ulac in del conjugado anticuerpo-peroxidasa
a protenas (lgG. Fab) con glutaraltJehdo
,H ot1rwl
Ma te ria l - Conjugado
- Peroxida sa Placa de m1crotttu lac in
- Anticuerpo o fragmentos Fab Ant geno en tampn carbonato-bicarbonato 0.05 11101/L. pH Q_6 (Na:CO.i
- Tampn fosfato 100 mmol/L, pH 6.8 1.59 g: NaC O,H 2.93 g: agua destilada hasta l L)

GA - BSA al 3 % (o protenas de l suero de leche) en el mi smo tampn carbo-


nato-bicarbonato (solu cin de bloqueo)
- Tampn carbonato de sodio 500 mmol/L. pH 9.5
- PBS (N aCI 3 g. KPO.,H: 0.2 g: Na POJH: 2.9 g: KCl 0.2 g : agua desti-
- Salina fi siolgica lada hasta l L)
- L-lisina 1 mo l/ L Sol ucin de lavado (NaCI 8.5 g: Twccn 20 0.5 mL agua destilada hasta
- PBS 1 L)

Cristalera , pipetas , membrana'1e dili sis - Mezc la sustrato + cromgeno (-W mg de O PD en 100 mL de solucin
tampn + 40 ~L L de HP: al 30 % )
M todo
- Solucin tampn pa ra el cromgeno 2. 1-+ g de c ido ctrico en 100 mL
l. Activar la peroxidasa (1 O mg de enzima en 0. 2 mL del tam pn fosfa to) de agua dest + >.54 g de fo sfat o di sdico en l 00 m L de agua desti-
con un exceso de GA durante 18 horas a temperatura ambiente. lada + 200 mL de agua destilada
2. Remover el exceso de GA por di lisis exhau sti va o por filtrac in a travs - Solucin acuosa de 11..SO., al 12.5 %
de una columna de Sephadex G-25 equilibrada con SF Concentrar la
- Cmara hmeda
PO hasta 1 mL .
- Pipetas de precisin y pipeta multi canal
3. Adicionarle 5 mg de anticuerpo o 2,5 mg de Fab (en 1 mL, equilibrado
con SF) y 0,2 mL del tampn carbonato de; sodio 500 mmol/ L, pH 9,5. - Incu badora
(Note que la relacin molar de PO/lgG es aproximadamente 7/ 1 y la de
- Lector de micro-ELISA
PO/Fab, 4/1 .)
- Frasco lavador o la vador automtico
4. Incubar durante 24 horas a 4 C y bloquear los grupos que pem1anecie-
ron activos con lisina 1 mol/L durante 2 horas . Mtodo
5. Dializ.ar tcxia la noche contra PBS y filtrar a travs de membrana Milliporc Tapi zar los pozos de la placa de mi crm itulacin con la concentracin
(0,22 m) . Purificar, titular y conservar. seleccionada del antgeno. Pa ra titul a r conjugados d(' anti -lg se puede
ut ili za r la Ig a 2-1 O g/mL . Aadir l 00 ~1 L de (a solucin de antgeno e
incuba r la placa 2 horas a 3 7 ''C o toda la nocllC' a 4 ''( ~n cma ra
h m~da ~- posi c in hori zontal

2 18 2 l lJ
2. Eliminar el contenido de los pozos y lavar la placa tres veces corr .la
solucin de lavado. Para esto llenar los pozos con la solucin y dejarla en
contacto con la placa durante 2-3 minutos. o,9r.

3. Bloquear los posibles espacios vacos aadiendo a cada pozo 150 L de
la solucin bloqueadora. Incubar 1 hora a 37 C. Decantar y lavar la
o
o
e

placa tres veces, de la forma en que se indic en el paso anterior. "....
.s:J
1i1 Valor de
4. Preparar diluciones del conjugado (por ejemplo, desde 1I 100 hasta .J:J :....~.....__....,,..-w-~--.--~-..------.---~-----------corte
<:
1/5 000) utilizando el PBS y aadir por duplicado 100 L de cada dilucin
en la placa de microtitulacin. lncubar 1 o 2 horas a 3 7 C. Decantar los Muestras
sobrenadantes y lavar tres veces la placa con el PBS-Tween . Figura 60 . R~ s ultados de un ELISA para Ac anti-Ig en sueros positivos y negativos.

5. Preparar la mezcla sustrato+ cromgeno. Observar que no tiene color y La cuanv ficacin exacta de anticuerpos puede realizarse, en el caso de
aadir 100 La cada pozo. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente anticuerpos monoclonales o policlonales purificados, a partir de sus caracte-
y en la oscuridad. rsticas isotipicas con anticuerpos anti-isotpicos en un mtodo sandwich . El
6. Parar la reaccin con 50 L del 8:SO 4 al 12,5 %. Esperar 5 minutos. empico de diferentes diluciones de un anticuerpo estndar de concentracin
Secar el fondo de la placa y proceder a su lectura en el lector de micro- conocida y de la misma clase (o subclase) del anticuerpo a valorar, permite
ELISA a 492 run . construir una curva de calibracin para la cuantificacin de anticuerpos en
las muestras.
7. Expresar el ttulo como la mayor dilucin con absorbancia igual o mayor
que l . Ma teria/
lgG humana (10 g/mL) en tampn carbonato pH 9,6
Observacin
- Muestra a titular (suero anti -lgG humana)
Emplear como control el PBS, aadiendo 100 La dos pozos.
- Sueros controles positivo (CP) y negativo (CN)
ELISA indirecto para la titulacin - Materiales relacionados en la tcnica anterior
de anticuerpos anti-IgG humana
Mtodo
Esta t<;nica permite estimar semicuantitativamente anticuerpos anti-IgG
humana en el suero. Los resultados pueden expresarse como la mayor dilu- 1. Tapizar la placa de microtitulacin con lgG hunuia aadiendo l 00 La
cin del antisuero con una absorbancia mayor al valor de corte (cut off). cada pozo. Incubar 2 horas a 37 C, a temperatura ambiente o toda la
Este se determin ensayando un nmero de muestras positivas y negativas, noche a 4 C. Desechar sobrcnadante y lavar seis veces la placa.
y calculando la media y desviacin estndar de los sueros negativos. El 2. Aadir 150 Len cada pozo de la solucin bloqueadora. Incubar 2 horas
valor de corte correspondi a ~N + 2SD (Figura 60). Como ya se explic a 37 Coa temperatura ambiente. Decantar y lavar seis veces la placa.
(pgina 213), la cuantificacin exacta de anticuerpos es dificil y lo que gene- Secarla bien.
ralmente se hace es un estimado, como en la tcnica que se describir a
continuacin.
22 1
220
3. Aadir por duplicado 100 L de cada d1luc1n de los sueros controles y
de las muestras en los pozos . Incubar 1 hora a 3 7 C. Decantar y la var _ M1oglobina estndar (Mb)
tres veces la placa. - SHN libre de mioglobina (previamente absorbido en una columna de
4. Aadir en cada pozo 100 L de l conjugado an ti-irunu noglobulina- a fi.nidad con anu-m1oglobina)
peroxidasa diluido convenientemente. Incubar 1 hora a 37 C. Decantar - Suero problema
y lavar tres veces la placa.
Placa de mic rolitulacin de cloruro de poli vi nilo
5. Aadir a cada pozo 100 L de la mezcla HP ~ + OPD recin preparada .
PBS (SF tamponada con fosfato 0.0 1 mol/L) pH 7.2
Incubar en la oscuridad 30 minutos a temperatura ambiente .
Materiales relacionados en la titulacin del conj ugado
6. Agregar 50 L del HzS 4 al 12,5 % a cada pozo. Esperar 5 minutos .
7. Leer en el lector de micro-ELISA a 492 nm . .\ fero do

8. Promediar las absorbancias de cada una de las diluciones . Determinar el Tapizar la placa aadiendo a cada pozo 200 L del anti suero anti-Mb
ttulo de anticuerpos en el suero problema . ( 1O ~rnL en el PBS) . Incubar toda la noche a temperatura amb iente.
Lavar dos veces la placa .
Observacin
, Preparar los siguientes estndares de Mb: 0, 1; 2; 4; 8; 16; 32; 63; 125;
Todas las incubaciones se realizan en cmara hmeda y los lavados con 250; 500 y 1 000 ng/mL en suero libre de mioglobina.
salina-T\veen o PBS-Tween . Todos los tampones deben prepararse con
agua bi- o tridestilada y se les puede aadir timcrosal pa ra su conservacin. Aadir 20 L de cada estndar y del suero problema por duplicado o
Las diluciones de los sueros v dems reactivos se realTzan en PBS o salina tn plicado y simultneamente 200 pL del conj ugado anti-mioglobina-
que contenga BSA al 3 %. Las placas recubiertas con antgeno (o anticuer- peroxidasa diluido de modo conveniente. Incubar la placa a 3 7 C duran-
po) y bloqueadas pueden conservarse a 4 Cuna semana o indefinidamente te QO minutos . Decantar y lavar cuatro ve.ces la placa.
a -20 C. t>ara lograr resultados reproducibles es importante sistematizar -+ A11adir 200 L en cada pozo de la mezcla sustrato-cromgeno prepara-
los lavados cuando se realizan manualmente. La seal es posible incrementarla da en el momento de su uti lizacin . Incuba r en la oscuridad 30 minutos a
con tiempos de incubacin ms largos . Para ensayos semicuantitativos rpi- temperatura ambiente
dos los tiempos pueden reducirse a 30 minutos y aun a menos . El segundo
anticuerpo debe aadirse en exceso para asegurar buenos resultados . Para 5. Aadir 100 L del H2SO 4 al 12,5 % a cada pozo. Esperar 5 minutos y
determinar su concentracin saturante se \!nfrentan diluciones del conjuga- leer la absorbancia a 492 nm .
do a cantidades saturantes del primer anticuerpo. 6. Promediar las lecturas correspondientes a cada estndar y suero proble-
ma . Trazar la curva DO vs log de la concentracin de Mb . Determ inar
ELISA de competicin para cuantificar mioglobina srica las concentraciones de Mb en el suero problema. uti lizando la cu rva de
(Juronen et al., 1988) calibracin .

Materia/ Obse rvqcin

- Anti-mioglobina policlonal Este ensayo fue denominado por sus autores ELISA de captura" para
mioglobina. Este trmino es ampliamente utilizado en los inmunoensayos e
Conjugado anti-mioglobina-peroxidasa indica que el analito es capturado por el inmunorreactante que ta piza la fase
222
22 3
slida (pgina 203) . En el ELISA de captura de anticuerpo el antgeno recubre M I: todo
la placa y en el de captura de antgeno, el anticuerpo. En el primer caso se
1. La solucin prn.teica (en este caso, la lgG) a una concentracin no me-
encuentran los ELISA cijecto, indirecto y de competicin con antgeno fija-
nor de 1 g/mL se adiciona a la membrana de nitrocelulosa a razn de
do a la fase slida. En ef"Segundo caso, los mtodos sandwich y de compe-
0. 1 mL/cm=. Dejar 1 hora a temperatura ambiente para que ocurra la
ticin con anticuerpo fijado a la fase slida (este ltimo es el caso que se
unin del ligando. Ma~ores concentraciones de la protena proporcionan
describi) .
una seal ms fuerte, po.r 10 que -si hay suficiente antgeno- se reco-
mienda emplear concentraciones de 1-50 g/mL . La nitrocelulosa pue-
Dot-ELISA (dot-blot) de unir aproximadamente 100 g de protena por cm= .
Los antgenos proteicos y los anticuerpos se unen con facilidad a la nitroce- 2 Lavar la membrana tres veces con PBS-Tween.
lulosa. Este material puede fijar aproximadamente 1 000 veces ms prote-
na que las placas convencionales de microtitulacin, y constituye una de las 3. Bloquear los espacios vacos colo.;ando la tira de nitroceluloSa en la so-
fases slidas ms tiles en los inmunoensayos y la matriz de elecci0n para lucin de BSA al 3 % durante 2 horas o toda la noche.
los dot-b/ots . .+ . Lavar tres veces la tira con PBS-Tween . Si se desea conservar, colo-
En esta tcnica, como lo indica su nombre (dot , punto y blot, mancha), los carla a 4 C con az ida sdica o timerosal al 0,02 % en PBS .
resultados se observan como manchas esfricas cuya intensidad est en 5 Aplicar 1 L de cada una de las diluciones de las muestras y de los
correspondencia con la concentracin del analiti:> inmunorreactante (Figura 61 ). controles e incubar a la temperatura del cuarto en cmara hmeda
En este caso el producto de la reaccin enzimtica es i1\soluble. 30 minutos .
6 Lavar tres veces . Demorar 5 minutos en cada lavado.

1/4 1/16 1/64

Figura 61 . Dot-ELISA para anticuerpos anti-Ig con diferentes diluciones del antisuero.
7. Adicionar el conjugado anti-inmunogld mlina-peroxidasa convenientemen-
te diluido (alrededor de 2 mL/cm~) e incubar 30-60 minutos con agitacin
a temperatura ambiente.
8. Lavar como en el punto 6 .
9. Aadir la mezcla sustrato-cromgeno e incubar hasta la aparicin de las
Dot-ELISA para anticuerpos anti-IgG humana manchas .

Material Observacin

- Los mismos empleados en el ELISA indirecto Las operaciones se realizan colocando las tiras de nitrocelulosa dentro de
tubos de ensayo con tapa de rosca.
- Membrana de nitrocelulosa en vez de placa multipozos
- Mezcla sustrato-<:romgeno: 10 L de I-Ip 2
+ 4 mg de diaminobencidina + MARCAJE DE ANTICUERPOS CON BIOTlNA
+ 10 mL de PBS
La unin covalcnte de grnpos biotina a protenas es una tcnica simple. La
- No lector de micro-ELISA
biotinilacin normalmente no tiene efectos adversos sobre el anticuerpo Y
- Zaranda las condiciones de acoplamiento son suaves . Los anticuerpos biotinildos se ~
224 225
~
\. \
detectan con avidina o estreptavidina marcada Ambos rcacti\'Os pueden
adquirirse comercialmente, marcados con enzimas, luorgenos o yodo La ') Adicionar el ster de biotma al amicuerpo en una relacin de 25-250 g \
altsima afinidad de la avidina por la biotina (Kn = l0 14 M1 ) hace que l!Sla del ster por miligramo de anticuerpo. Mezclar bien e incubar 4 horas a
unin sea prcticamente irreversible . Se prefiere la estreptavidina en la la temperatura del cuarto. Las concentraciones elevadas del ster de
mayora de las aplicaciones porque tiene un punto isoclctrico ms favora- b1otina conducirn a la unin de mltiples grupos b1otina al anticuerpo e
ble. Los anticuerpos biotinilados son estables bajo condiciones nonnales de incrementarin la probabilidad de que todos los anticuerpos se marquen.
conservacin . Las relaci ones menores darn un grado menor de biotinilacin. Por ejem-
plo, 25 g de ster por miligramo de anticuerpo da una relacin molar de
La detectabil idad de los ensayos con el empleo de reactivos marcados con aproximadamente l O: 1.
avidina o estreptavidina es similar a las detcctabilidades con anticuerpos
anti-Ig marcados . No obstante, detectabilidadcs ms bajas puedi..:n obtenerse 3. Adicionar 20 L de NH 4 CI por 250 g de ster. Incubar 10 minutos a la
con complejos multimtricos . Tanto la avidina como la cstrepta vidma son temperatura del cuarto .
tetravalentes, as que sitios adicionales de unin putden utilizarse pa ra in- 4 Dializar la solucin de anticuerpos contra PBS u otro tampn para remo-
crementar el tamao del complejo a detectar y consecuentemente la inten- ver la biotina libre. La biotina se dializa muy lentamente por su tamao
sidad de la seal. pequeo (<500 Da), por io que se necesita efectuar la dilisis
La mayora de las biotinilaciones emplean un ster !>ucc inmida de biotina . exhaustivamente.
El acoplamiento se realiza a travs de los gmpos amino libres del anticucrpu 5 Conservar.
o de otra protena, normalmente residuos lisil. Si un grupo amino libre fonna
parte del sitio activo de la protena. por ejemplo, del sitio de combinacin del
anticuerpo, la biotinilacin con el ster succinimida disminui r o destruir la
actividad de la protena, por lo que en esos casos deber utilizarse ot ro
mtodo de marcaje.

Material
N-hidroxisuccinimida biotina
- Dimetil sulfxido
- Solucin de anticuerpo
- Tampn borato O, 1 mol/L
NH4 Cl 1 mol/L
- PBS u otro tampn

Mtodo
l . Preparar una soluin del anticuerpo de al menos 1-3 mg/mL en tampn
borato". Si los anticuerpos estaban conservados en azida sdica debern
dializarse exhaustivamente contra el tampn borato para su remocin .
221)
227
CAPTULO VI
RADIOINMUNOENSAYOS

Los ra.dioinmunoensayos (RIA), como los inmunoensayos enzimticos (EIA),


se fundamentan en una estrategia dual : la reaccin antgeno-anticuerpo,
altamente especfica, y su '.l mplificacin con el empleo de istopos radioac-
tivos conjugados a uno de los dos inmunorreactantes, generalmente el
antgeno.
Entre las ventajas de los RIA se encuentran : su alta especificidad (dada por
la calidad del anticuerpo), su bajo lmite de deteccin (10-12 g/mL), rapidez,
e levada sensibilidad (pendiente de la curva dosis/respuesta), alta
rcproducibilidad de los resultados y elevada capacidad de procesamiento de
muestras .
Tienen como limitaciones los costos relativamente altos' del equipamiento y
los istopos radioactivos; adems, en el caso de estos ltimos, su corta vida
media y Jos riesgos que presuponen para la salud.
A pesar de sus limitaciones, los RIA son ampliamente utilizados en el diag-
nstico clnico y las investigaciones biomdicas; constituyen un instrumento
analtico valioso para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran a
muy bajas concentraciones en mezclas complejas como los fluidos biolgi-
cos . Las dimensiones de Jos istopos radioactivos Jos convierten en marca-
dores excelentes para sustancias de baja masa molecular, como las hom10-
nas .

229
Oc lo anterior se dcsprc11dc que para He\ar a cabo el RIA de competicin
Al igual que en los inmunocnsa~os enzimticos . existen RIA no compct1ti-
si..: deb..: disponer de tres rcacti\'os fundamentales : anticuerpos de alta afini-
vos y competiti\OS . El radioinmunocnsayo de competicin. t.;crnca introdu- dad. antgeno raJiumarcado y :mtigeno estndar. Es necesario determinar
cida por Bcrson et o/. en 1959, constituye una de las \:Hiantes ms popula- las wncent racion(.;s ptimas de anticuerpo y trazador para tener una sensi-
res. Con ella es posible cuantificar con gran exactitud tanto antgenos como bilidad mx.inu .
anticuerpos .
Los RIA de competicin pu ~dcn efectuarse en solucin y sobre fase slida.
El principio de este RIA es la comp e tencia cntrl un antgeno l.Jno de los requerimientos tcnicos ms crticos de los ensayos en solucin
radioactivamente marcado (trazador o antgeno caliente) y uno 110 m::i1c;1d c es distinguir el traz.ador radioactivo unido al anticuerpo del trazador libre,
(antgeno competidor o fro) por una cantidad limitada de anticu..:rpos espe- para poder ci:)ntar uno u otro o ambos . Si una fraccin est contaminada con
cficos de gran avidez (Figura 62). Si se emrtean cantidades conocidas de la otra, los errores en los conteos pueden ser muy altos.
antgeno no marcado (estndar) que compitan con una misma cant1daci de
El nomb11;! de la variante del RJA de competicin viene dado por el mtodo
trazador, se genera una curva de calibracin con la q1te se: detcnmna n la ~
que empica para separar el trazador libre del unido al anticuerpo. Estos
concentraciones del analito en las 1~1uestras (Figura 63 ).
rndodos no deben alterar el equilibrio alcanzado por el sistema de reaccin
~ pueden agruparse en tres c:uegorias : 1) precipitacin dei antgeno unido al
anticuerpo. dejando el antgeno libre en solucin: 2) precipitacin del antgeno
Ag no en
Qrnorcado _:x.ceso ~O Meno r libre. dejando los inrnunocomplejos en solucin; 3) separacin del antgeno
competido1~ ~Qconreo unido y el libre por filtracin en gel. Estos ltimos resultan muy engorrosos y

--< +
lentos cuando se procesan muchas muestras.

--<
Ag rnor- en Los mctodos que precipitar. ~l antgeno unido al anticuerpo son rriuy popula-
Anticuerpo de
alto afin idad
O codo
t rozador
ex.ceso Mayor
o.conteo
res . Si et'a ntgeno es mucho ms pequeo que el anticuerpo (masa molecular
menor que JO 000 Da), pennanecer en se ~ucin a concentraciones de sulfato
en defecto de amonio y de pol ictiknglicol (PEG) 6 000 del 10 % (W:W), precipitando
rigura 62. Fundamento del RI /\ de competicin El /\g marcado\"el no marcaJC> compi1.:n funda.mentalmente todo el anticuerpo. Si la masa molecular del antgeno es
por d anticcierlO especifico de alta afinidad y cn dct~cto . En e:.;ccso rclal irn de uno u otro. los mucho mayor o no es globular, las concentraciones de PEG que precipitan
comp!cjc< . '\~-Ac que predominan contienen..:! /\g cn e'Xceso. el anticuerpo completamente pueden insolubilizar ms del 1O% del antgeno
libre, y se produce un bockground inaceptable. En estos casos el anticuer-
o 100 po puede precipitarse con un segundo anticuerpo, o sea , una anti-
"O
e: inmunoglobulina . Este mtodo es muy utilizado aunque ,requiere un tiempo
::i
.... relativamente largo (24-48 horas) en comparacin con unos pocos segun-
o dos que demora la precipitacin con el PEG . Si se utiliza el segundo anti-
"O
o cuerpo mezclado con bajas concentraciones de PEG, el tiempo se reduce
N
....o
+-
notablemente . Otra forma de precipitar el anticuerpo (cuando se trate del
Q)
i:J
isotipo lgG) es la protena A unida ~Sepharosa o S. aureus muertos (en
cu~ a superficie est la protena A). ~
o~
10 20 40 "
El otro tipo de separacin es la adsorcin ~I antgeno libre a una partcula
Concenfrocin del Ag
para dejar los inmunocomplcjos en solucin.' Los materiales ms utilizados
Figura 63 Cur\'a de \:<1libraci11 de un RI/\ de c0mp,'tici0n
\ . e'
- DO 231
son el carbn activado y el talco. Ya que la unin del antgeno a estos agen- s1blc es el ensayo. Una vez que se preparan los anticuerpos de mayor afini-
tes est determinada por la hidrofobicidad y tamao del antgeno, estos dad. este parmetro limita la extensin a la cual los otros parmetros pueden
mtodos slo se utilizan en ciertos sistemas . Ellos son baratos y rpidos. ser manipulados . Por ejemplo, ya que el antgeno no marcado en la muestra
pero requieren un cuidadoso ajuste y monitoreo del pH. fuerza inica y tem - desconocida va a competir con el trazador, a menores concentraciones del
peratura para obtener resultados reproducibles, y evitar la adsorcin de los trazador menores concentraciones del analito podrn medirse , hasta un cierto
complejos Ag-Ac . Estos agentes tienen una alta afinidad por el antgeno y lmite. Este viene dado por la afinidad (K). La parte ms empinada de la
pueden competir con anticuerpos de baja afinidad, alterando el equilibrio. El curva de calibracin (Figura 63) estar en el rango de concentraciones cer-
carbn amortigua el centelleo beta. por lo que deben utilizar!>e istopos que canas a 11K. Concentraciones del trazador muy por debajo de 1/ K dejarn
emitan radiaciones gamma,, como el m 1, o empicar lquidu de centelleo para la mayora de los sitios del anticuerpo sin ocupar y la competencia ser
amplificar la seal beta. menos efectiva . Aunque en general es til incrementar la radioactividad
especfica del trazador y reducir su concentracin, es importante hacer uso
RIA SOBRE FASE SLIDA del lmite 1/K. Debe sealarse que el incremento exagerado de la actividad
es pecfica puede conducir a la desnaturalizacin del antgeno, y su disminu-
Estos inmunoensayos tienen la ventaja de facilitar el procesamiento de un cin. a tiempos de conteo demasiado largos .
gran nmero de muestras e incrementar la a finidad deb ido a los efectos de
Similarmente. bajando la concentracin de anticuerpos se incrementa la sen-
la interfase slido-lquido (pgi na 111 ). Por este motivo no rr.iden la verda-
si bilidad. hasta un lmite. Este tambin depende de L'K y del background
dera afinidad infrnseca como los inmunoen~ayos en solucin.
producido por las uniones no especficas . En general, la fraccin del trazador
Los RIA sobre fase slida utilizan peri~ de Sepharo!'.a , las paredes de tubos unido en ausencia de competidor debe mantenerse entre 0,2 y 0.5.
o los pozos de una placa de microtitulacin a los que se une el anticuerpo .
Para optimizar las concentraciones de trazador y anticuerpo lo primero es
Los espacios vacos se cubren con una protena irrelevante como BSA , de
fonna similar que en los ELISA. Una vez recubierta y bloqueada la fase elegir la concentracin ms baja del trazador que d tiempos de conteo y
slida se incuba con la mezcla antgeno marcado + antgeno competidor, :ie precisin del conteo satisfactorio. para unir 0.2-0,5 del trazador total. Enton-
lava y se cuenta la radioactividad unida a las paredes plsticas o la ces, manteniendo esta concentracin del trazador constante se diluye el
Sepharosa. Para medir concentraciones de un analito en muestras descono- anticuerpo hasta que la relacin trazador unido/trazador libre. en ausencia
cidas se utilizan, como en el RIA en solucin, diferentes concentraciones de competidor, sea cercana a 1 (unido/total = 0,5). Esta concentracin de
del antgeno estndar y se construye la curva de calibracin. anticuerpos con la seleccionada del trazador, por lo general rinde
detcctabilidades cercanas a la ptima, dentro de los limites referidos arriba.
Los anticuerpos marcados con istopos radioactivos se utilizan en los dot- Es importante tener en cuenta que, si se cambia de tra?..ador, hay que reajus-
blots, de forma similar a Jos anticuerpos marcados con enzimas (pgina 224) . tar la concentracin del anticuerpo para optimizar el sistema.
El revelado de la mancha se realiza por autorradiografia .

PROCESAMfENTO DE LOS DATOS


OPTIMIZACIN DE LAS CONCENTRACIONES
DEL ANTICUERPO Y DEL TRAZADOR Al realizar el ensayo de competicin se debe conocer:~.

La afinidad y concentracin de los anticuerpos en los ensayos de competi- 1. El total de radioactividad en el sistema (7).
cin son dos importantes factores a tener en cuenta para lograr resultados 2. La capacidad mxima que ti ene el anticuerpo de unir antgono marcado
sensibles y precisos . En general, a mayor afinidad del anticuerpo, ms sen- (RJ Da la mxima radioactividad pos ible en el ensayo.
232 2)~
son el carbn activado y el talco. Ya que la unin del antgeno a estos agen- 51
bk es el ensayo . Una vez que se preparan los anticuerpos de mayor afini-
tes est determinada por la hidrofobicidad y tamao del antgeno, estos dad. este parmetro limita la extensin a la cual los otros parmetros pueden
mtodos slo se utilizan en ciertos sistemas . E.llos son baratos y rpidos. ser manipu lados Por ejemplo, ya que el antgeno no marcado en la muestra
pero requieren un cuidadoso ajuste y monitoreo del pH, fuerz.a inica y tem- desconocida va a competir con el trazador, a menores concentraciones del
peratura para obtener resultados reproducibles, y evitar la adsorcin de los trazador menores concentraciones del analito podrn medirse, hasta un cierto
complejos Ag-Ac . Estos agentes tienen una alta afinidad por el antgeno y lmite Este viene dado por la afinidad (K). La parte ms empinada de la
pueden competir con anticuerpos de baja afinidad, alterando el equilibrio. El curva de calibracin (Figura 63) estar en el rango de concentraciones cer-
carbn amortigua el centelleo beta. por lo que deben utiliz.ar!>e istopos que canas a 11 K Concentraciones del trazador muy por debajo de 1/ K dejarn
emitan radiaciones gamma, ,como el 1 ~ 5 1, o empicar liquidu de centelleo para Ja mayora de los sitios del anticuerpo sin ocupar y la competencia ser
amplificar la seal beta. menos efecti va . Aunque en general es til incrementar la radioactividad
espec fica del trazador y reducir su concentracin, es importante hacer uso
dd lmite l/K. Debe sealarse que el incremento exagerado de la actividad
RIA SOBRE FASE SLIDA
especifica puede conducir a la desnaturalizacin del antgeno, y su disminu-
Estos inmunoensayos tienen la ventaja de facilitar el procesamiento de un cin. a tiempos de conteo demasiado largos .
gran nmero de muestras e incrementar la afinidad debido a los efectos de Similannente. bajando la concentracin de anticuerpos se incrementa la sen-
la interfase slido-lquido (pgina 11 l ). Por este motivo no rr.iden la verda- sibilidad. hasta un lmite. Este tambin depende de l/K y del background
dera afinidad intrinseca como los inmunoens~yos en solucin. producido por las uniones no especficas En general, la fraccin del trazador
Los RIA sobre fase slida utilizan perlas de Sepharo!>a, las paredes de tubos unido en ausencia de competidor debe mantenerse entre 0,2 y 0.5.
o los pozos de una placa de microtitulacin a Jos que se une el anticuerpo.
Para optimizar las concentraciones de trazador y anticuerpo lo primero es
Los espacios vacos se cubren con una proteina irrelevante como BSA , de
elegir la concentracin ms baja del trazador que d tiempos de conteo y
forma similar que en los ELISA. Una vez recubierta y bloqueada la fase
precisin del conteo satisfactorio. para unir 0.2-0,5 del trazador total. Enton- .
slida se incuba con la mezcla antgeno marcado + antgeno competidor, se
ces, manteniendo esta conce ntracin del trazador constante se diluye el
lava y se cuenta la radioactividad unida a las paredes plsticas o a la
anticuerpo hasta que la relacin trazador unido/trazador libre. en ausencia
Sepharosa. Para medir concentraciones de un analito en muestras descono-
de competidor, sea cercana a l (unido/total = 0,5) . Esta concentracin de
cidas se utilizan, como en el RIA en solucin, diferentes concentraciones
anticuerpos con la seleccionada del trazador, por lo general rinde
del antgeno estndar y se construye la curva de calibracin .
dctectabilidades cercanas a la ptima, dentro de los lmites referidos arriba
Los anticuerpos marcados con istopos radioactivos se utilizan en los dot- Es importante tener en cuenta que, si se cambia de trazador, hay que reajus-
blots, de forma similar a los anticuerpos marcados con enzimas (pgina 224) . tar la concentracin del anticuerpo para optimizar el sistema .
El revelado de la mancha se realiza por autorradiografia .
PROCESAMfENTO DE LOS DATOS
OPTIMIZACIN DE LAS CONCENTRACIONES
DEL ANTICUERPO Y DEL TRAZADOR Al realizar el ensayo de competicin se debe conocer:...
1. El total de radioactividad en el sistema (11
La afinidad y concentracin de los anticuerpos en los ensayos de competi-
cin son dos importantes factores a tener en cuenta para lograr resultados 2 La capacidad mxima que tiene el anticuerpo de unir antgeno marcado
sensibles y precisos . En general, a mayor afinidad del anticuerpo, ms sen- (BJ Da la mxima radioactividad posible en el ensayo.
..,..,..,
232 L.'-'
3. Las uniones no especficas (hac/.:gm1111cl) d1..'. la 1..:cnica ( f ,'i\'F o IJ)
p 3 rJ cJ k11lar el por ciento de union de antgeno marcado en los tubos co-
Para ello se pre p~ran por duplicado (o triplicado) tres tu bos qu e contengan rr1..s pondi cntes a los est ndares (!-.) . controles de calidad. (C ) y muestras
los siguientes rcactantcs (figura 64 ): (.A f) . se utili za la fmrnla

0 de unin de Ag marcado = cpm E e .H - cpm 8 . 100


cpm fln - cpm 8
Tampon
Tampn Con los por cientos de unin de Ag marcado correspondientes a los est.in-
d::ircs ' sus concentraciones respectivas se construye la curYa de calibra-
Trazador Trazador c1on (Figura 63) .
T B Bo
F1gtua 64 . Pr.:par~1 n <lo: los tubos total ({). u111oncs no c~ p..:t:1l i..:a s 1! \ i: o /Jl ' u n1 0 11 .\ l ..\RCAJE DE ANTICUERPOS co~ IODO
rnax.ima (8 J. Conu.:ncn la misma .:m1t1<la<l <le tr;.11,a<lor
0

L1 icxbcin de prote nas es un mtodo efccti,o de marcaje. Los istopos


Los otros tubos del ensayo son: r::id1oact1\os de iodo estn disponibles en el mercado en forma de soluciones
lt bres de portadores y el uso de estos prod uctos permite obtener protenas
- Los del estndar(/:), en los que el anugeno cornpt:11dor es el estndar del
con relaciones amplras de sustituci n qum ica . El 1=> es el mis utilizado en
ensayo. Con ellos se construye la curva de calibracin.
los i nm un ocn s::i~ os Su decl inacin rinde rad iacin gamma de baja energa.
- Los de los controles de calidad (C), en los que d antgeno com;ct1dor qui: es fcil de detecta r: su vida med ia es de aproximadamente 60 das y es
est presente en muestras de concentracin conocida. Si\cn par..i con- harato El probl ef!~ principa l del i : 5 es su peligro potencial para la salud.
trolar la calidad del ensayo. por lo que slo deber trabajarse donde existan las condiciones que exige la
- Los de las muestras desconocidas (!vi). en los que el compet1~or es d man ipulacin de istopos radioact ivos .
antgeno disuelto en la muestra (analito) . Dos procedimientos son los ms utilizados para marcar protenas con iodo.
En uno el 1=51. en forma de NaL se oxida y ataca los grupos disponibles
mediante una reaccin de halogenacin. En las protenas, el blanco ms
Esta'ndar frecuente es la tirosina. pero algunos residuos de histidir\a tambi~n pueden
' : : Muestra
ser iodados . Estas reacciones son simples de mampular ~ controlar. Su prin-
Anticuerpo cipal problema es el dao oxidativo a las protenas o la modificacin de un
residuo de tirosina crtico. En la tcnica de la cloramina T. esta es el agente
Trazador Trazador Trazador oxidante y se adiciona a una solucin que contiene la protena y el yoduro.
E e M La reaccin se tem1ina adicionando un agente reductor y tirosina libre o
Figura 65 . Tubos de cstn<lan:s, curllrolcs y mucstras. realizando rpidan1ente la separacin ce los re<.1ctantes a travs de una co-
lumna de .filtracin en gel.
Todos los tubos, con excepcin de los totales. se incuban com cnicniemcntc:
se procede a separar los c9mplcjos Ag-Ac del antgeno !ibrc ~ se realiza el En el segundo procedimiento un reactivo iodado. que contiene un grupo de
conteo de las radiaciones . acople reactivo. es unido a la protein::i . El ms empicado c:s el reactivo de

234 235
- Cloramina T
Bolton-Hunter. Bajo condiciones suaves este reactivo se une a los grupos
amino libres sobre residuos lisil o el grupo amino tcnninal. - Fosfato de sodio 0,5 mol!L, pH 7.5
- Tubos cnicos de 1.5 mL
PURIFICACIN RPIDA DE ANTICUERPOS - Columna de filtracin en gel (Sephadex G-25)
PARA IODACIN
J..f,;rodn
A menudo un gran nmero de preparaciones de anticuerpo necesitan ser
iodadas a la vez. Este mtodo utiliza perlas recubiertas con prcotena A y Pre,io a laiodacin preparar la columna de filtracin en gel para separar
el anticuerpo marcado.
pennite la purificacin de anticuerpos de fom1a r pida y senc illa.
2. Adicionar 10 g de protena en un volumen total de 25 L de fosfato
Mtodo
sodico en un tubo cnico de 1,5 mL .
1. Ajustar el pH de Ja preparacin cruda de anticuerpos (suero. sobrcnadante 3. Adici?nar 500 Ci de Na 1 ~~ 1.
de cultivo, ascitis) a 8,9, adicionando O, 1 volumen de borato 1 mo l/L,
pH 8,9 . Adicionar NaCI hasta 3 mol! L . Chequear el pH y ajustarlo si .f Adicionar 25 L de cloramina T a 2 mg/mL rec in preparada . Si la
fu era necesario. oxidacin daa mucho la protena. reducir la concentracin de cloramina
T a 0,02 mg/mL .
o
2. Adicionar 1 mL del sobrenadante de cultivo 1O L de suero o ascitis a
un tubo cnico de 1,5 mL . Para el suero o la ascitis adicionar 1 mL de .:; Mezclar con una pipeta e incubar 60 segundos a la temperatura del cuar-
borato 100 mmolfL, pH 8,9. Adicionar 1O L de las perlas de protena A. to .
Estas unen aproximadamente 10-20 mg de anticuerpo por mililitro de 6. Aplicar inmed iatamente en la columna de filtracin en gel.
perlas hmedas.
Obs ervac in
3. Agitar 1 hora manteniendo la mezcla a 4 C.
El iodo producido por oxidacin es voltil. por lo que la iodacin debe reali-
4. Lavar las perlas dos veces con borato JO mmol/L, pH 8,9; NaCI 3 mol/L .
zar.se bajo una campana ventilada. El anticuerpo u otra protena marcada
5. Despus del segundo lavado, adicionar 100 L de fosfato de sodio puede conservarse a 4 C. El anticuerpo marcado podr ser usado durante
100 mmol!L, pH 2,8. Incubar 5 minutos a la temperatura del cuarto. las 6 semanas posteriores a su preparacin. Ms del 90 % del iodo se incor-
Centrifugar y remover el sobrcnadante a ocro tubo cnico de 1,5 mL, que pora por este mtodo y rendir actividades sobre 5-45 C i/g . Estos nive-
contenga JO L de fosfato de sodio 1 mol/L, pH 7,5. Mezclar suavemen- les pueden ajustarse variando las concentraciones de iodo y protena .
te. Los anticuerpos estn listos para la iodacin .
RIA DE COMPETICIN PAR<\ SEROALBMINA
MTODO DE LA CLORAMINA T HUMANA (HSA). MTODO DEL DOBLE ANTICUERPO

Material Mate rial


- Solucin de anticuerpo o de otra ~rotena - Juego
... de RIA para HSA (Instituto de Endocrinologa)
- Na1~ s 1 - Muestras

23 7
236
'

,cz concluido el ensayo. La fom1a de proceder con los datos es similar en


- Incubadora o bao de agua
Jos inmu nocnsayos enzimticos de competicin descritos en el captulo an-
- Centrifuga de ngulo mvil terior Puede aplicarse y resulta com eniente la transformacin Logit que
- Contador de radiaciones gamma pc nrntc linealiz.ar los resultados . pues se incrementa con ello su exactitud y
prcc1s1n.
- Papel scmilog y papel de filtro
- Gradilla y tubos
Mtodo
l. Preparar los tubos, tal como se indica a continuacin:
Ti1bos T B Bo E e M
Tampn - 400 200
E - - - 200 - - (Volme
e - - - - 200
-
M - - - - - 200
Anticuerpo - - 200 200 200 200
Trazador 100 100 100 100 100 100
El traz.ador es HSA- 1 ~ 5 1.

2. Mezclar e incubar a 37 C durante 2 horas .


3. Aadir a todos los tubos (menos a los totales) 100 L del agente prccipi
tante: anticuerp0s anti-irununoglobulina en PEG al 8 % + ~ ucro normal
4. Mezclar e incubar l hora a 37 C.
5. Centrifugar a 2 500 rpm durante 30 minutos . Decantar, secar el intcrio
de los tubos con papel de filtro y efectuar el conteo.
6. Calcular los por cientos de trazador unido y hacer la curva de calibra
cin. Determinar en la curva, las concentraciones de los controles d
calidad y las muestras .

Observacin
Se deben cumplimentar todas las medidas de bioseguridad establecidas para1
el trabajo con istopos radioactivos y la eliminacin de los materiales una
23 9
238
CAPTULO VII
\....

INMUNOFLUORESCENCIA

La inmunofluorescencia es esencialmente una tcnica histoqumica o


citoquimica para la identificacin y locaJiz.acin de antgenos (en ocasiones,
para detectar anticuerpos) El anticuerpo especfico se conjuga con sustan-
cias fluorognicas, y se convierte en un traz.ador sensible con reactividad
inalterada frente al antgeno. El anticuefl'\() conjugado se aade a las clulas
o a los tejidos y se fija a los antgenos, enton\:es se fonna un complejo Ag-
Ac estable. Las protenas no fijadas se eliminan mediante lavados y la pre-
paracin resultante se observa en w1 microscopio fluorescente.
Virtualmente cualquier antgeno puede ser descubierto en cortes de tejido
fijado o en suspensiones de clulas vivas mediante inmunofluorescencia.
Esta tcnica fue introducida en 1941 por Coons, quien emple J3-antraceno,
un compuesto fluorognico de color azul, conjugado con antisuero
antineumoccico, para describir los antgenos bacterianos en cortes de te-
jido. Poco despus su grupo emple antisueros conjugados con fluorescena,
la cual emite una luz verde que puede ser diferenciada de la fluorescencia
azul de muchos tejidos .
La fluorescencia es la emisin de luz de un color, es decir, de una longitud de
onda, cuando una sustancia se irradia con luz de un color diferente. La
longitud de onda de la luz emitida est necesariamente a un menor nivel de
energa que la luz absorbida (Figura 66).

241
' ,. " vl.'0-1o \
~<) ' ... ~ \
"S ........
'-< ~ ,
\(lf:I f\1"
,_ BIDL .......
l.}~ ...........
e
~~-
~- excitacin se enfoca direct.amente sobre la muestra de tejido a travs de la .
~c~'-
i>&ir.qp \:I~~-:'--------:-::-
f:.J"
tente del objetivo. La luz fluorescente emitida a partir de la muestra
i -
epluminada es transmitida al ojo a travs del espejo dicroico. Este permite
Flourescencio
g 11- Excitacin . el paso de la luz seleccionada en una direccin a travs del ojo, pero en

-
Q.
o
"O
\.~misin
.'.
sentido opuesto.

TABLA XllL Principales propiedades de los fluorgenos


o ms empleados
~
"'e
Q)
o . .
Fl uorgeno Excitacin Emisin Color
DAPI 365 nm 420 nm Azul
Longitud de onda creciente
fl uoreSCt" na .t95 525 Verde
Figura 66. Espectros de absorcin y em1s1n de w1luorgl!flo.
Hoechst 33258 360 470 Azul
Los fluorgenos (o fluorocromos) tienen espectros caractersticos de ab- R-ficocianina 555 ; 618 634 Rojo
sorcin (excitacin) y emisin (Tabla XIII). La fluorescen.a. rodamina y
ficoeritrina son muy populares. El isotiocianato d~ fluorescena (FITC) es B-ficoeritrina 545; 565 575 Naranja, rojo
u:ia forma de fluorescena que se fija fcilmente a I~ protenas mediant R-ficoeritrina 480; 545; 565 578 Naranja, rojo
enlaces covalentes a pH alcaljno Su absorcin mxima es a 495 nm y emite Rodamina 552 570 Rojo
su color verde caracterstico a 525 nm . El isotiocianato de tetrametilrodamina,
Rojo Texas 596 620 Rojo
que emite luz roja, tiene una absorcin mxima a 552 nm y una emisin
mxima a 570 nm . Consecuentemente, se deben emplear excitaciones y
filtros de barrera diferentes para visualizar el color verde o rojo de estos Posee varias ventajas el sistema de Ploem . La fluorescencia puede combi- '
colorantes. Por lo general, se puede lograr una longitud de onda excitante narse con la luz transmitida para el examen por contraste de fases de los
casi igual a la que produce la excitacin mxima del colorante. De manera tejidos, lo cual pennite una mejor definicin de la morfologa y la fluorescen-
semejante debe eliminar el filtro de barrera toda la emisin de longitudes de cia. Tambin el sistema de filtros intercambiables posibilita el examen rpi-
onda del espectro, salvo la emitida. De esta forma se obtiene un fondo do de la muestra a diferentes longitudes de onda para la tincin doble. Esto
oscuro y una imagen de alta resolucin. ha proporcionado a la tcnica una sensibilidad superior para el estudio de la
fluorescencia de la membrana celular en los linfocitos vivos.
Como existen fluorocrornos cuyos espectros de emisin no se solapan, pue-
den utilizarse para teir una misma muestra. Esta fluorescencia doble per-
mite el estudio de dos antgenos diferentes en la muestra, aunque tengan VARIANTES DE LA INMUNOFLUORESCENCIA
distribuciones celulares parecidas .
La inmunofluorescencia puede ser directa o indirecta. Al igual que en los
Los microscopios empleados para visualizar las muestras fluorescentes son EIA, en la directa el fluorgeno se conjuga al anticuerpo de inters . En la
simples modificaciones de los microscopios con transmisin estndar de la segunda, a un segundo anticuer:po que--reconoce las inmunoglobulinas de la
luz. En 1967 Ploem introdujo un sistema de epiiluminacin que emplea un especie de donde proviene el anticuerpo de inters . La primera variante se
iluminador vertical y un espejo dicroi co. En este sistema el haz luminoso de utiliza con anticuerpos policlonales y monoclonales. Al conjugar con .dife-

242 243
rentes fluorgenos anticuerpos monoclonales que reconocen varios marca-
dores sobre una misma clula, puede hacerse su dob le marcaje. En la
citometra de flujo el empleo de anticuerpos monoclonales conjugados a
fluorgenos diferentes permite clasificar y(o) separar estirpes celulares dis-
tintas. La variante indirecta permite amplificar la seal de la reaccin Ag-
Ac y ofrece la ventaja de que un mismo conjugado puede emplearse con
muchos Ac monoclonales.
Muestr o
CITOMETRA DE FLUJO Y FACS
fluoresc;nd~
. Detect
i:11tro
La citometria de flujo es una tcnica analtica que permite distinguir y cuan- op.t ic o o : = c 10
tificar tipos celulares sobre la base de diferentes caractersticas como: ta-

~ - ----------8'""'_::._-~Q-
mao, granulosidad, viscosidad, propiedades qumicas y fl uorescencia, con- '-.._Envo! u ra Abert ura ,
forme pasan a gran velocidad a travs de un orificio. Existen instrumentos de o1uo J.: _.. .,
que ~rmiten, adems, la clasificaci.:m y separacin de clulas vivas .
,,' ," ... , , ... ,,., . 2
El analizador o separador de clulas activadas por florescencia (FACS) es "" , , ,.

un equipo que posibilita el anlis\s y(o) la separacin d~ partculas, de acuer- ' -- -- ,


e': -......'~...,,
l~exin:~ ','{S:
do con su fluorescencia y sus propiedades de dispersin de la luz, permitien- p loc
1d 1 osd ' "----- Ob et1vo
' d '
e microsco .e.
do el empleo de hasta tres fluorgenos diferentes. Las clulas no se daan
al pasar por el FACS. I.
1 .
3 ... ,' ' ...
P IO

i' closifi~od';P
1 ' ... ' '
i, ' ' --:-
' Ro yo loser
'
La variante analtica es el FACS scanning y la preparativa, el FACS sorter
: ... . - . -->-
(Figura 67). .
El anlisis hecho por este equipo es computariz.ado y complejo. Los resulta-
dos se expresan en forma de histogramas. Requiere parmetros de control
{}4 ~
muy estrictos.
El FACS se ha empleado para estudiar las funciones de diferentes poblacio-
nes de linfocitos en la respuesta inmune. Las clulas se separan despus de Tub os de recolecc in
marca:se co11 reactivos fluorescentes que reconocen un antgeno .especfi-
co de la superficie celular. Por ejemplo, linfocitos T CD4+ se hacen reac-
cionar con AcM anti-CD4 y se marcan cori anti-inmunoglobulina de ratn Figura 67. Separacin de clulas en el FACS. 1, las clulas de la muestra teftidas con colorantes
t1uorescentes espc;:cficos para detectar molculas de superficie celular se introducen en una
conjugada con fluorescena. Despus se pasan por el FACS (sorter) y los
camara de flujo vibratoria y pasan a presin a travs de una lxxuilla. 2, la corriente se iltunina
linfocito.; 1 CD4+ (qm contienen la mayora de las clulas T helper) se con lser yen cada ce lula se mide la fluorescencia, quedando clasificada. 3, el chorro pulveri-
separan. Estas clulas se utilizan en diferentes experimentos. mdo se separa en gotitas. Aquellas que contienen las clulas seie!\:cionadas se cargan en un
campo de alto voltaje entre las placas de del1exin. 4, las gotitas cargadas se desvan a los
tut>os de rewlecc1n.

244
PREPARACIN DE UN CONJUGADO Observacin
ANTICUERPO-FLUORESCENA Esta tcnica pu cd~ ser utilizada para conjugados con is0tiocianato de
tctrametilrodamina (TRJTC) : En este caso las lecturas se realizan a 575 y
Materia/
280 nm, y la relacin debe estar entre 0,3 y O, 7. Si el conjugado queda muy
- Solucin de Ac de al menos 2 mg/mL en carbonato de sodio O, 1 mol/L, diluido puede concentrarse por ultrafiltracin, extraccin de agua o liofilizacin.
pH9,0

- Isotiocianato de fluoresceila en dimctil sulfxido (del mc.:jor grado, sm INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
agua) a l mg/mL, preparado al momento P\ RA DETERJ\.'tlNARSUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS
- NH 4 Cl l mol/L
Mate rial
- Cinalol xileno
Sangre perifrica hepariuizada
- Glicerol
- Ficoll-Urovideo*
- Columna de Sephadex G-200 - PBS o salina fisiolgica
- Cristalera - Cmara de Neubaer
- Pipetas - Solucin azul Tripn O, l %
Mtodo - AcM : lOR-Tl (anti-CD6)
1. Por cada mililitro de la solucin de anticuerpo adicionar muy lentamente IOR-T3 (anti-CD3)
(en alcuotas de 5 L) 50 L del colorante, agitando gentilmente durante IOR-T4 (anti-CD4)
la adicin .
IOR-T8 (anti-CDS)
2. Dejar reposar la mezcla en la oscuridad 8 horas a 4 C .
IOR-DR (anti-HLA-DR)
3. Adicionar NH4 Cl para una concentracin 50 mmol/L. Incubar 2 horas a
4 C . - BSA O, l %; NaN 3 0,02 % en PBS
- PBS-glicerol l :9
4. Aadir cinafol xileno y glicerol para una concentracin final del O, l y
5 %, respectivamente. - Placa multipozos fondo U

5. Separar el conjugado del colorante libre por gel filtracin. - Portaobjetos y cubres

6. Conservarlo a 4 C protgido de la luz. Adicionar azida sdica al O, 02 %. - Centrfuga ngulo mvil


Cuando la concentracin de anticuerpo sea menor de 1 mg/mL es con-
veniente aadir BSA para una concentracin del l %.
-
.
Microscopio de fluorescencia

7. La relacin fluorescena/protena se d~tennina leyendo las absorbancias El medio de separacin puede ser comercial (Lymphoprep, Ficoll-Paque) o "casero"
a 495 y 280 nm . La relacin debe estar entre 0,3 y 1,0. (Yisotrast, Yerografin, Urografin, Urovideo, Telebrix con o sin Ficoll). Lo fundamental es
que su densidad sea 1,077 g/mL .

246 247
Mtodo , JJ,,,no c .<1n

l . Diluir la sangre heparinizada l: 1 con PBS o SF Lo!> :11Hgcnos de mcrnbr:.uu. sobre tcx:lo al unirse a los ancucrpos. pueden
:,i.:r cndocit:idos (o d1.~sprcndid05) o cambiar su ubicacin en la membrana.
2 . Depositarla suavemente sobre el Ficoll-Uro-video, aproximadamente f~1 rinando un .. go rro (co 1p111~:0 en uno de los polos de la cdula . Por ello es
35 mL de sangre por 15 mL del Ficoll . nportank usar inhibidores metablicos. como la azida sJica, y tempcratu-
11
3 . Centrifugar a 2 500 rpm 30 minutos a temperatura ambiente . r:is fria s durante tcx:l:i la t0cnica .
4. Ext raer cuidadosamente el anillo de clulas mononuclcares
5 . Lavar las clulas tres veces a 1 200 rpm durante 1O minutos .
6. Contar las clulas en la cmara de NeubaUcr y aj ustar su ~nc.ent rac ion
a 0,5-1 106 clulas/mL con PBS-BSA-azida .
7 . Dispensar 200 L de la suspensin celular por pozo. Se calcula un pozo
por muestra ms un control negativo.
8. Centrifugar la placa a 800 rpm 5 n:inutos a 4 C.
9. Eliminar cuidadosamente el sobrenadantc. disgr-;:gar el sedimento sua -
vemente y aadir los AcM en las diluciones apropiadas. Al control ne-
gativo se le aade PBS-BSA-azida.
10. Incubar la placa 30 minutos a 4 C en cmara hmeda.
11. Lavar la placa tres veces, centrifugando como en el punto 8 y aadiendo
200 L de PBS-BSA-azida cada vez.
12. Aadir el segundo anticuerpo conj ugado con fluorescena en un volu-
men de 50 L .
13. Lavar como en el punto 11 , pero co.n PBS-azida.
14. Aadir al p elle! una gota de PBS-glicerol, resuspenderlo y colocarlo
sobre la lmina portaobjetos .
15. Colocarle cuidadosamente un cubreobjeto y sobre este depositar una
gota de dimetil-ftalato (o de glicerol) para la lectura con lente de inmer-
sin.
16. Leer al microscopio de fluorescencia. Contar al menos 200 clulas tota-
les y calcular el por ciento de clulas que fluorescen .

248 249
CAPTULO VIII
IMMUNOBLOTTING*

Esta tcnica combina la resolucin de la electroforesis en gel con la especi-


ficidad de la reaccin Ag-Ac . Mediante la electroforesis se separan los
componentes individuales de una mezcla, generalmente de protenas, que se
transfieren a una membrana para hacerlos reaccionar con anticuerpos es-
pecficos .
Las protenas, qu e constituyen los antgenos, son usualmente separadas
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsu lfato de
sodio (SDS-PAGE) . La transferencia se lleva a cabo por electroblotting
a una hoja de nitrocelulosa o nylon, la cual se incuba con el anticuerpo
especfico para el (o los) antgeno(s) de inters . Los anticuerpos deben
estar marcados con una enzima o radi oistopo, y aquellos que no se
unen se eliminan mediante lavados . La unin de los anticuerpos marca-
dos se revela por una tcnica aprop iada (adicin del su strato o
autorradiografia, Figura 68) . Pueden emplearse los anticuerpos espec-
fico s sin marcar y revelarst: la uni n Ag-Ac con un segundo anticuerpo
anti-inmunoglobulina marcado .

rnotting: Estrictamente hablando, b/011i11g se retien: a la transferencia desd.:: d gd a la


membrana de nitrocelulosa, pero se utiliza para describir to.lo t.!l procedimiento.

25 1
La tcnic::i 1mmunoblotting tambicn s~ conoce como Western blomng debi-
do a su similitud con el Southcm blottrng** y el 1\orthem blottmg .. .
Cualquier mezcla de protenas puede ser analizada mediante immunoblonmg,
como lisados de cdulas y tejidos. sobrenadantes de cduias productoras de
proten::is rccombinantes y 'encnos de ongen animal El immunoblotting
pcm1ite detectar l::i presencia de un Ag. as como la masa molecular de sus
cadenas po!ip\.Ttdicas y la dirn;ncia de su e:-..traccion. Es particularmente
til para caracterizar mezclas compkJ<IS como los \cncnos de serpiente. Es
tambi0n una tcn1c:i poderosa para ensa~ ar la presencia. canudad y especi-
ficidad de anticuerpos en muestras diferentes de antisueros poltclonalcs.
El factor principal que determinad xito de un immunoblonmg es la natura- 1. Preparacin 2.Resolucin 3 . Transferencia
leza de los ep1topos reconocidos por !os a1111cucrpos Las tcnicas de mayo d~ lo rtlu estra. de l o muutro de los polippti-
resolucin de Ja electroforesis en gel conlJc,an la dc..:snaturahzac1n de la por e lectrofo- dos o uno membro
res i s en SDS- no de nitrocelu-
muestra de Ag. de ah que slo resultan tiles ios :inticucrpos que reconocen PAGE . losa.
cpicopos resistentes a la di.:snaturaliz.acin kpitopos no dependientes de la
confom1acin) . La mayora de los antisueros policlonah::s contii.:nen J.l me-
.

LJ ~ D
nos algunos anticuerpos de este tipo. pero muchos anticuerpos monockmalcs
no reaccionan con antgenos desn:iruraiizados.
El immunoblotting no requic1 e de anticuerpos de alta :ifin1dad .-\lgunos
anticuerpos que funcionan dbilmente en la inmunoprccipll:icin rccu ltan
s:iti sfactorios en esta tcnica. Esto se debe a la exposicin de algunos ep1topos
des pus de la desnaturalizacin y a la concentracin ele' ada de Ag sobre la 4. Bloqueo de 5. Adicin Jel 6 . Revelado.
membrana. tos sitios de anticuerpo mor-
unin no espe cado.
cfico.

Figura 68. J>:ocedimiento del irnmw10blotting.


** Southem blolling: Tcnica descrita por E.M. Southern para Jetc:ctar secuencias particu-
lares en una mezcla de fragmentos Je DNA, usWtlmente obtenida por digestin con La detectabilidad del immunoblotting est detenninada por el mtodo de detec-
en<lonucleasas Je restriccin, que se separan tkspues por electroforesis en gel. Los cin o revelado. En la mayora de los sistemas este lmite puede ser aproximada-
fragmentos resultantes S<: dr...'Snaturalizan y se transf:ren a una hoja de nylon o mtrocdu- mente 20 femtomoles (1 fino! = 1 1015 mol). Para una protena de 50 kDa
losa . El ON/\ transferido es hibnJ1zado con un apropiado lJNA o RN/\ radioman.:aJo, el
esto es aproximadamente 1 ng . Debido a que las capacidades de carga de los
cual se hibri<lim a las secuencias wmplemr...1\tarias en los fragmentos. Las sondas 4ue no
se UJ\\.11 se eliminan por lavado' la lcx;lizacin U.: los hibriJos se re~da por :mtorrn<lto::'-Ialia. geles son limitadas, u~ualmellte no puede ser detectada ~ protena si su con-
centracin en la muestra es menor que 1 ng . L1 capacidad de transferencia de
Northem blotting: Tl:cnica para detet:Wr secu.:m:ias <le RNA dentro Je una poblac1on <le
mol::ulas !U 'A que han sido separadas por electroforesis. El tennmo Northern blottmg
la membrana puede constituir un factor limita nte cu~o la msa mokx:ular del
se acuiio porqu.: el mdo<lo es s1r111 lar al Southem blottmg Ag de inters es similar al de una protena abundante en la mezcla.

252 2:' 3
Tres tipos de anticuerpo pueden empicarse : anticuerpos policlonales, tibie con el gel. Para geles SDS-PAGE Tris/glicina, el pH de la solucin
anticuerpos monoclonales y una mezcla de estos ltimos . Los primeros son proteica debe estar cercano a la neutralidad y las concentraciones salinas
los ms utilizados y como -por lo general- contienen concentraciones aproximadamente por debajo de 200 mmoVL, a menos que se vaya a utilizar
elevadas de anticuerpos especficos, pueden diluirse extensamente. Esta una dilucin grande de la muestra.
dilucin permite reducir el fondo no especifico (background) sin afectar la
detectabilidad . En algunos casos resulta conveniente prcincubar los sueros Materia/
poli clonales con antgenos contaminantes (absorcin) para evitar - Muestra de protenas
interacciones especificas no deseadas en el immunoblotting que podran afec-
- Tampn de la muestra: H1 0 destilada 20 mL; tampn Tris 5 mL (ver
tar la interpretacin de los resultados.
abajo): gliccrol 4 mL: SOS al 10 % 8 mL; 2-mercaptoetanol 2 mL: azul
La ventaja principal de los anticuerpos monoclonales es la especificidad de de bromofenol 50 mg/mL 0,2 mL
su interaccin. Debido a que ellos se unen a un solo epitopo, constituyen una
- Tampn Tris: Tris-HCl 6,0 g y llevar a 100 mL con 8i0 destilada
herramienta ideal para identificar una regin particular del Ag . Los
anticuerpos monoclonales que funcionan bien en iriununoblotting son usual- - Bao .de agua hirviente y centrifuga
mente aquellos que interactan con eptopos no dependientes de la confor-
macin, llamados epitopos secuenciales . Sin embargo, muchos anticuerpos Mtodo
monoclonales reconocen epitopos que s dependen de la conformacin o 1. Mezclar la solucin proteica con el tampn de muestra. La menor rela-
epitopos conformacionales .. que se destruyen por los reactivos que se uti- cin tampn:muestra debe ser 4: l (ejemplo, 80 L de tampn:20 L de
lizan para desnaturalizar las protenas en la preparacin de la muestra . muestra) .
El empleo de mezclas de anticuerpos monoclonales combina las mejores 2. Colocar la muestra en bao de agua hirviente. Para muestras sencillas
propiedades de los anticuerpos monoclonales y policlonales: especificidad y puede ser suficiente 1 minuto y para muestras complejas, 10-15 minutos.
detectabilidad. Obviamente, la mezcla debe componerse de anticuerpos que Despus de la centrifugacin las muestras pueden congelarse a -20 C,
reaccionen con epitopos diferentes resistentes a la desnaturalizacion y que siendo estables durante meses.
no muestren reacciones cruzadas indeseables .
ELECTROFORESIS EN GEL SDS-PAGE
PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ANTGENO
Dos factores deben tenerse en cuenta para la electroforesis: la cantidad de
La mayora de las soluciones proteicas pueden mezclarse con el tampn de protenas que puede cargar el gel y las dimensiones fsicas y la concentra-
muestra y analizarse mediante immunoblotting. El tampn debe ser compa- cin de acrilamida del gel separador. Si se utiliza un extracto tota.1 de clulas,
la cantidad de protenas no deber exceder los 30 ~Lg/nun 2 de supertice de
gel. Para bandas individuales, la carga de ms de 0,3 g/mm 2 provoca dis-
Epitopo secuencial: Epitopo dependiente de la secuencia de unos pocos residuos conti- torsin .
guos en la macromolcula, que no debe ser afectado por la desnatura!izacin.
Ya que las tcnicas de bloning requieren de una buena transferencia de
Epitopoconformacional: Epitopo dependiente de la esuuctura tridimensional de la mol- protenas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa, debe tenerse en cu..:nta
cula de Ag. Los residuos de aminocidos que lo constituyen no son contiguos, pero se
que los por cientos de acrilamida y entrecruzamiento bajos facilitan la trans-
encuentran yu>ctapuestos en la superficie por el plegamiento de la protena. Estos epi topos
usuahnente son afectados por la desnaturali7..acin. ferenci~. Por tanto, se deber utilizar el gel ms blando que rinda la r~solu -

254 255
cin deseada. En general, las protenas que corren ms lentamente son ms 4. Despus que el gel se ha asentado (20-30 minutos), decantar la capa
dificilcs de eluir. La transferencia ser ms rpida y completa en geles del- sobrelapnte y lavar el tope del gel separador varias veces con agua
gados, aunque los geles ultrafinos son difciles de manipular. En la prctica. destilada. Decantar bien.
una anchura de 0,4--0,5 nun constituy~ casi siempre el limite superior permi- 5. Preparar la solucin de acrilamida para el gel concentrador y verterla
sible. Se debe recordar que durante la transferencia todas las protenas en directamente sobre el gel separador polimerizado. Colocar el peine apro-
la anchura de una barida se concentran en la superficie de la membrana, as piado en la solucin de gel, con cuidado pala no atrapar burbujas. Colo-
que la corrida de muestras ms concentradas sobre geles muy finos mejora car el gel en posicin vertical a la temperatura del cuarto. El gel
la detectabilidad. Las transferencias desde geles con ms de 2 mm de an- concentrador se asienta en unos 1O minutos.
chura son ineficientes.
6. Remover cuidadosamente el peine. Lavar los pozos inmediatamente con
Material agua destilada para remover la acrilamida no polirnerizada. Enderez.ar
- Muestra de protenas desnaturalizadas y equipo de electroforesis los dientes del gel concentrador, si fuera necesario. Ensamblar la cma-
ra de electroforesis y adicionarle el tampn de corrida. Cualquier burbu-
- Soluciones de acrilamida para geles separador y concentrador (ver Ta- ja entre las placas en el fondo del gel debe ser removida.
bla XIV) preparadas al momento
7. Colocar las muestras en el fondo de los pozos utiliz.ando una micropipeta
- Isobutanol en Tris-HCl pH 6,8 (VN) con una punta estrecha y alargada u otro dispositivo apropiado.
- Solucin de pironina 8. Conectar la fuente de voltaje para comenz.ar la electroforesis. El voltaje
- Micropipeta ajustada con una punta estrecha y larga (o un similar para requerido estar en func1on del tamao del gel. Para los minigeles puede
aplicar las muestras) ser suficiente 60 V. Despus que el frente coloreado se ha movido en el
gel separador, incrementar el voltaje' 120 V en los minisistemas).
- Tampn de corrida: Tris-HCI 15 g; glicina 72 g; SOS 5 g; ajustar pH a 8,3
y llevar a 1 L con ~O destilada 9. Cuando el frente coloreado alcance el fondo del gel, apagar la fuente de
voltaje y aadir a cada pozo l OL de la solucin de pironina. Conectarla
Mtodo unos minutos hasta que el colorante haya penetrado en el gel separador.
l . Ensamblar las placas de cristal del equipo de electroforesis, segn las Suprimir la corriente y proceder a remover el gel con sumo cuidado,
instrucciones del fabricante. Las placas deben estar limpias y libres de utilizando una esptula o algo similar, nunca algo puntiagudo. Cortar un
detergente. ngulo de gel en el extremo superior izquierdo para identificar la posicin
de las muestras. El gel est listo para fijar, teir o transferir.
2. Preparar la solucin de acrilamida para el gel separador.
3. Verter la solucin de acrilamida entre las placas. El menisco de la solu-
cin debe quedar a una distancia que permita na buena altura para la
separacin de la mezcla molecular, quedando espacio para el gel
concentrador y los pozos. Cubrir cuidadosamente la solucin de acrilamida
con isobutanol. Esta solucin sobrelapante sirve de barrera al oxigeno,
ya que este inhibe la polimerizacin de la acrilamida. Colocar el gel en
posicin vertical a la temperatura del cuarto.

256 257
TABLA XIV. Solucion o p8ra rlf'ctroforub rn SDS-PAG E T r l1.1 i llcin a
T RANSFERENCIA DE PROTENAS DEL GEL
6% S mL 10 mL IS mL ::O mL 15 m L 30 mL 40 m i. ~1 mL
A LA MEMBRANA (BLOITING)
H O 2,7 5,3 8,0 10.6 13.3 15.9 ; 1.1 :!'i}\
Mezcla de 1cril1m Kla 30 % 1.n 2,0 3,0 4.0 s.o 6.0 8 ,, 11\()
3,8 5,0 7, 5 JO.O 12.5
Para la transferencia de protenas se utiliza la nitrocelulosa, adems del
Tris l ,S mol/I.., pH 8.8 1,3 2.S 6 .3
sos 10 %' o.os 0,1 0, 15 0.2 0 ,25 0, 3 0 .4 o.s papel y el nylon activados . La nitrocelulosa es la ms usada aunque tiene
APS 10 %' o.os 0,1 O. I S 0.2 o.:s 03 0,4 0.5 ciertas desventajas, como S<in que no une C<?valentemente las protenas y
TEMED' 0,004 0 ,008 0.012 0 ,0 16 0,02 0.0:4 0.032 0.04
8% 5 mL 10 mL 15 mL :o ml. ~S t1 1L 3\J m!. 40 mL ~ l m~
su fragi lidad, especialmente cuando se seca. El papel activado (con grupos
HO 2,3 4/i 7,0 9,3 11 ,6 13,9 IS.6 23 .~ diazo) puede adqui rirse comercialmente y une covalentemente las prote-
Mezcla de acrilam ida 30 % ' l.l 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,1 13.4 nas. Tiene, adems. buena resistencia mecnica, pero el mtodo de acopla-
Tris 1,5 mol/I.., pH 8,8 1,3 2,S 3,8 s.o 6 .3 7,S 10.C 12. ~ .
miento que utiliza es incompatible con muchos sistemas de electroforesis en
sos 10 %' o.os 0.1 O.IS 0 ,2 0, 25 0, 3 O.< o. ~

APS 10 %' o.os 0,1 0,15 0, 2 0.2( C, 3 0 ,4 0,5 gel. La unin es a travs de grupos amino primarios, as que tienen que
TEMED' 0,003 0,006 0.009 0.012 0,015 0,0 18 0.021 1).03 empk arse con este material tampones sin grupos amino. El papel es caro y
10 ~~ S mL 10 mi. 15 mL :O m L 25 m l. JO mL 40 rn L ~ mi.
1 ~.8
los g rupo~ reactivos tienen vida limitada una vez que es activado. El nylon
H O 2,0 4,0 S,9 7,9 9.9 11.9 20.0
Mezcla de acrilamida 30 % ' 1. 7 3,3 s.o 6,7 8,3 10,0 13.3 16,1' puede unir slo una pequea cantidad de protenas y no es adecuado para
Tris l ,S mol/I.., pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6 ,3 i. ~ 10.0 1: .s muchas aplicaciones 1 aunque tiene propiedades mecnicas excelentes y no
sos 10 %' o.os 0,1 015 \J,l 0. 25 0, 3 0 ,1 0.5
cambia su tamao durante d lavado o secado. El nylon activado resuelve
APS 10 %' o.os 0 ,1 o.IS o,: 0. 2~ 0, 3 0.4 0.5
TEMED' 0,002 0,004 0,006 0,008 0.01 1).012 0 ,016 o.o: algunos de estos problemas. pero da altos fondos . Debido a todo esto, las
12 o/t S mL 10 f1'L I S mL 20ml. 25 mL 30 mL 4\'I mL 511 m L membranas de nitrocel ulosa son las ms empleadas.
H O 1, 7 3,3 5,0 6,6 8 ,3 9.9 IU 16,4
Me zcla de acrilam1da 30 4 2.0 4,0 6,0 8.0 10.0 lZ.O 14,0 200 La transferencia de protenas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa
Tris 1,S m ol/I.., pH 8,8 1,3 2,S 3,8 5,0 6,3 7,S 10,0 i :.s se puede realizar de tres formas : por difsin simple, por flujo de solvente al
sos'"" o.os 0,1 O,lS 0,2 0,2S 0,3 0, 4 0,5
APS 10%' o.os 0,1 0,15 0,2 0 ,2S 0,3 0 ,4 0,5 vaco y por elucin electroltica. La difusi.1 simple tiene pocas ventajas y
TEMED' 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,0 12 0 ,014 'o.Ol se empica raramente. El flujo de solvente al vaco tiene un nmero de
l S y, S mL 10 mL lS mL 20mL 25 J11L 30 m L 40 m L 50 m L
ventajas y es fcil y rpido. Sin emba rgo, las tcnicas de electrotransferencia
H, O 1,2 2.3 3,5 4,6 5.1 6,9 9,2 11 ,4
Mezcla de acrilamida 30 % ' 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20.0 25,0 o elucin e/ectrofortica son los mtodos ms utilizados. Su ventaja princi-
Tris l ,S mol/I.., pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6 .3 7,5 10,0 12,S pal es la rapidez y la calidad de la transferencia. Existen dos modalidades: la
sos 10 %' 0,05 0,1 0, 15 0 ,2 0,25 0,3 0.4 0.5 transferencia semiseca y la mojada. En la primera, el gel-membrana se
APS 10%' o.os 0, 1 0, 15 0 ,2 0,2S 0, 3 0.4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0 ,008 0.01 0,01 2 0,0 16 0.01
coloca entre el papel absorbente mojado en tampn de transferencia y entre
Oel concenindoc 1 mL 2 mL 3 mL 1 mL S mL 6 mL 8 mL 10 m i. dos electrodos de placa de carbn. En la transferencia mojada el empareda-
HO 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4, 1 5,5 6,8
do o sandwich se coloca en un tanque que contiene tampn con electrodos
Mezcla de acrilam ida 30 'lt' 0, 17 0,33 0,5 0,67 0.83 1,0 1,3 1,7
Tris 1,0 motil, pH 6,8 0,13 0. 25 0,38 0,5 0,63 0,7 5 1.0 1.2 5
de alambre de platino. Los aparatos para ambos tipos de transferencia es-
SDS 10 %' 0,01 0,02 0,03 0 ,04 0,05 0,06 0 ,08 0.1 tn disponibles comercialmente. Ambos trabajan bien, aunque el transferidor
APS 10 %' 0,01 0,02 0,03 0 ,04 0,05 0,06 0,08 0,1 semiseco es ms rpido y a menudo realiza transferencias ms completas.
TEMED 0,001 0,002 0,003 0 ,004 0,005 0,006 0,008 0,0 1

'Comnmente acrilamida 29,2 o/o y N, N-metileno-bis-acrilamida 0,8 %; bDodecil sulfato de Material


sodio; cpersulfato de amonio; <IN, N, N', N'-tetrametiletib1odiamino; Tris 1,5 mol/L, pH 8,8:
Tris-HCI 18, 15 g y llevar a 100 mL con agua destilada; Tris 1 mol/L, pH 6,8: Tris 12,0 g y - Equipo para transferencia semiseca (transfer semi~c:co)
llevar a 100 mL con agua destilada.
- Gel de SDS-PAGE

259
- Hoja de nitrocelulosa 7. Desconectar la fuente de voltaje . Desamblar cuidadosamente el apara-
to. Marcar la membrana para poder orientarse. Usualmente se recorta
- Papel absorbente
un ngulo en el extremo superior izquierdo (como en el gel de
- Tampn de transferencia: Tris 5,8 g; glicina 2,9 g; SOS 0,37 g; metano! pohacrilamida).
200 mL y llevar a 1 L con J-1,0 destilada
8. Teiiir el gel de poliacrilamida con azul Coomassie o tincin de plata para
Mtodo verificar la transferencia.
l. Enjuagar los electrodos de placa con agua destilada.
TlNCIN DEL GEL CON AZUL COOMASSIE
2. Cortar 6-8 hojas de papel absorbente y una hoja de nitrocelulosa del
tamao del gel. Si el papel sobresale del borde del gel la corrienlt: har Ma terial
cortocircuito y desviar el gel, impidiendo una transferencia eficiente.
- Gel de polia<;rilamida
3. Empapar la membrana de nitrocelulosa en tampn de transferencia. Para
- Solucin de colorante: azul Coomassie O, l g; metanol 20 mL; cido ac-
ello, colocarla cuidadosamente sobre la superficie del tampn. Permitir
tico 40 mL y llevar a l 00 mL ~on agua destilada
que la hoja se moje por capilaridad durante varios minutos y despus
sumergirla 2 minutos. Me>,iar el papel absorbente empapndolo con el - Solucin decolorante: igual que la anterior, pero sin el colorante
tampn.
M todo
4. Ensamblar el gel, la membrana de nitrocelulosa y el papel absorbente
l . Transferir el gel a un recipiente limpio de cristal o plstico. Adicionar
sobre la placa inferior del equipo, de la siguiente forma:
colorante hasta cubrirlo.
- electrodo inforior (nodo)
2. Incubar unos 15-20 minutos con agitacin a la temperatura del cuarto . .
- 3-4 capas de papel absorbente mojado en tampn de transferencia
3. Decantar el colorante y recuperarlo. Lavar el gel con agua destilada
- la membrana de nitrocelulosa embebida en el tampn para remover el colorante que no penetr en el gel.
- el gel de poliacrilamida ligeramente mojado en el tampn 4. Adicionar varios volmenes del decolorante. Cambiarlo las veces que
- 3-4 capas de papel absorbente mojado en el tampn sea necesario . La decoloracin puede acelerarse por calentamiento a
60 C.
5. Chequear cuidadosamente si hay burbuj~ de aire y, si las hubiera, remo-
verlas rodando una pipeta sobre el emparedado o sandwich. Secar el
TINCIN DE LA MEMBRANA DE NITROCELULOSA
tampn que pueda quedar alrededor del emparedado.
CON ROJO PONCEAU
6. Colocar cuidadosamente el electrodo superior (ctodo) sobre la superfi-
cie del emparedado. Conectar los electrodos para comenzar la transfe- El Ponceau S se aplica en solucin acuosa cida. La tincin es rpida pero
rencia. El tiempo de corrida es de 45 minutos a 1,5 horas con una co- no permanente, por tanto, puede emplearse para verificar la transferencia y
rriente de 0,8 mNcm2 de gel. Evitar la extensin del tiempo de corrida localizar los marcadores de masa molecular. Sin embargo, la tincin no es
pues podra haber desecacin. muy sensible y es dificil de fotografiar.

260 261
Ma te rial TABLA XV. Soluciones de bloqueo
- Solucin de tmcin: rojo Ponccau S 0,5 g y llevar a 100 mL con cido
tricloroactico (TCA) al 5 % Soluciont>s Ventajas Desventajas
- Solucin decolorante: PBS
Deterioro rpido
Lec he seca descre mada ' ! Bara ta
Enmascara algunos
M todo '.!%en Pl3S F1' ndo claro
antgenos
1. Transferir la membrana de nitrocelulosa a un recipiente de c1 istal o pl::.- Deterioro rpido
tico limpio. Cubrirla con la solucin del colorank. Leche s~ca de sc re mada al 13u m ta
Enmascara algunos
2 %, Twccn 20 al J,2 % Fondo :;!aro
antgenos
2. Incubarla unos minutos a temperatura ambiente.
l3arn1a
3. Enjuagarla unos minutos con varios cambios de PBS . Posibilidad de fondo
Twecn 20 al 0,2 % Pcrrrnte teir despus
residual
4. Marcar con lpiz la posicin de los marcadores de masa molecular. para jete1:1<1r antgeno
lS.!\ al 3 % t librc de lgG , Scl'lal fuerte Relativamente cara
fracci n V de Cohns)
BLOQUEO DE LOS SITIOS DE UNIN NO ESPECFICA .
Suero de caballo al 10 % Fondo claro Moderadamente cara con
. Antes de procesar la membrana para la deteccin de los antgenos es esen- alguna deteccin de
cial. su bloqueo para prevenir la adsorcin no especfica de los reactivos anticuerpos anti-IgG
inmunolgicos. La Tabla XV resume las soluc1onc.:s ms empleadas. Aun-
que todas son satisfactorias, en algunas circunstancias es necesario la se- Mtodo
leccin para asegurar la compatibilidad con el analito a detectar. Por ejem- 1. Enjuagar la m~mbrana varias veces con PBS .
plo, el empleo de suero completo resulta inapropiado si se utiliza la protena A 1

para la deteccin. La compatibilidad con el sistema de deteccin puede 2. Adic ionar la solucin de bloqueo.
chequearse tomando un pedazo de membrana fresca, bloquendolo y tra- 3. Incubar a la temperatura del cuarto con agitacin suave 1 hora.
tndolo con el sistema de deteccin. Dos soluciones bloqueadoras que son
4. Lavar con PBS dos veces durante 5 minutos cada vez.
compatibles con la mayor parte de los sistemas de deteccin, son la leche
seca descremada y la BSA. Si las soluciones de bloqueo dan un fondo exce-
sivo, se puede ensayar el bloqueo con Tween 20. ADICIN DEL ANTICUERPO

Materia/ La deteccin del antgeno en un immunoblotting se realiza por la unin de


anticuerpos a las protenas inmovilizadas sobre la membrana. Los anticuerpos
Membrana de nitrocelulosa
pueden estar marcados con una enzima o un istopo radioactivo, lo cual
- Solucin de bloqueo permite la deteccin del antgeno (mtodo directo); o pueden estar no mar-
cados para ser localizados a su vez por un segundo reactivo marcado, como
- PBS
anti-Ig o protenas A o G (mtodo indirecto) . La deteccin directa tiene la
ventaja d producir un fondo menor, es ms rpida y fcil, y disminuye la

262 263
oportunidad de detectar reacciones cruzadas indeseables . Su principal des- 5. Adicionar el reactivo secundario marcado. Hacer las diluciones en el tam-
ventaja es que se requiere la purificacin y marcaje de cada Ac . El 'm todo pn que contiene protena. Para reactivos secundarios marcados con iodo:
remover la membrana del ltimo lavado y adicionarle aproximadamente
indirecto pennite el empleo de un lote de reactivos para detectar un rango
1O" cpm de reactivo secundario marcado con 125 1 (protenas A o G o
amplio de anticuerpos . La mayora de los immunoblotting usan el mtodo
indirecto, excepto cuando se requiere Ja especificidad del mtodo directo. anticuerpos anti-lg) en aproximadamente 1O mL de tampn de bloqueo
por 15 x 15 cm 2 de membrana. Para reactivos secundarios marcados con
Material enzima utilizar concentraciones de 5-0,5 g/mL (usualmente una dilucin
de 1/200 a 1/2 000). Los reactivos marcados con peroxidasa deben diluirse
- Membrana de nitrocelulosa bloqueada
en tampn sin azida sdica, y los marcados con fosfatasa alcalina deben
- Solucin del anticuerpo marcado (mtodo directo) diluirse y lavarse la membrana con tampn Tris-salina y no con PBS .
- Solucin del anticuerpo especfico y del reactivo marcado (mtodo indi- 6 Incubar 1 hora a la temperatura.del cuarto con agitacin suave.
recto)
7 Lavar la membrana con cuatro cambios de PBS durante 5 minutos cada
Mtodo vez para proceder entonces a su desarrollo o revelado .

l. Remover la membrana de la so~ucin de bloqueo y lavarla dos veces Ohservaciim


du.rante 5 minutos con PBS .
Cuando se prueban las carrileras con anticuerpos primarios diferentes, las
2. Adicionar la solucin del anticuerpo primario. Todas las diluciones deben mismas debern manipularse por separado. Cuando se emplea fosfatasa
hacerse en PBS que contenga protena como BSA al 3 %. Las alcalina la membrana deber lavarse dos veces con NaCl 150 mmol/L;
incubaciones pueden efectuarse en bolsas selladas, en bandejas de poca Tris 50 mmol/L, pH 7,5 antes de la adicin del conjugado enzimtico.
profundidad o en tubos con tapa de rosca. Para anticuerpos primarios no
marcados utilizar sobrenadantes de cultivo sin diluir o diluidos hasta l O. DETECCIN CON REACTIVOS MARCADOS CON ENZIMA
Esto rinde una concentracin de anticuerpos entre 1 y 50 g/rriL . Para
anticuerpos policlonales, 'fluido asctico o anticuerpos purificad0s, la con- Los reactivos marcados con fosfatasa alcalina y desarrollados con el
centracin de anticuerpos deber estar en este rango. Si se desconoce bromocloroindolil fosfato/nitroazul tetrazolium (BCIP/NBT}, son probable-
su concentracin, se pueden probar diluciones diferentes para determi- mente la mejor eleccin para immunoblotting, pues rinden un intenso. color
nar la ms apropiada. Para anticuerpos primarios marcados la concen- negro-prpura con poco fondo . Resultados satisfactorios pueden obtenerse
tracin adecuada debe detenninarse previamente. Con anticuerpos mar- con peroxidasa de rbano picante desarrollada con 4-cloro- i-naftol, 3-amino-
cados con 1251, puede probarse adicionando aproximadamente 106 cpm 9-etilcarbazol (AEC) o diaminobencidina (DAB) .
por 15 x 15 cm 2 de blot. Para anticuerpos marcados con enzima, adicio-
nar O, 1-1 g de anticuerpos por ' 15 x 15 cm 2 de blot.
FOSFATASA ALCALINA
3. Incubar la membrana con el Ac al menos 1 hora a . la temperatura del
El sustrato BCIP/NBT genera un precipitado negro-prpu ra intenso en el
cuarto con agitacin suave o 12-18 horas a 4 C.
sitio donde est la enzima unida. La solucin de sustrato es estable en au-
4 . Lavar la membrana con cuatro cambios de PBS durante 5 minutos cada sencia de enzima. La reaccin tiene lugar a un ritmo unifonne, lo que penni-
vez. Si se emple el mtodo directo ya la membrana est lista para su te controlar'su desarrollo. Hay otros sustratos cromognicos para la fosfatasa
deteccin . En el mtodo indirecto continuar con los pasos siguientes : alcalina, pero para los immunoblonings el BCIP/NBT es el mejor.

264 265
Material ,\ 1aterial

- Solucin de NBT: NBT 0,5 gen 1O mL de dimctilfonnamda al 70 % Solucin de cloronaftol : cloronaftol 0,3 gen 1O mL de etanol absoluto. La
solucin es estable a -20 C al menos 1 ao
- Solucin de BCIP: BCIP (sal disdica) 0,5 g en 1O mL de dimctil-
fonnamida al 100 % l'ris 50 mmol/L, pH 7,6
- H,O, al 30 %
Tampn para fosfatasa alcalina : NaCI 100 mmol/L; MgCI , 5 mmol/L:
Tris 100 mmol/L, pH 9,5 - - Pss
1
- Las tres soluciones son estables a 4 C al menos 1 ao ' Mtodo
- EDTA 20 mmol/L en PBS 1. Inmediatamente antes de desarrollar el imrnunoblotting adicionar O, 1 mL
de la solucin de cloronaftol a 10 mL de Tris 50 nunol/L , pH 7,6. Se
Mtodo
fom1a un copioso precipitado blanco.
1. inmediatamente antes del desarrollo del imrnunoblotting, preparar la so- '
2. Remover el precipitado filtrando la preparacin a travs de papel
lucin de sustrato . Para ello, adicionar 66 L de N BT a 1O m L del tam-
Whatman # 1 (o su equi valente) .
pn para fosfatasa alcalina . Mezclar bien y adicionar 33 ~1L del BCIP.
Usar en l hora. 3 Adicionar 1O L del H2 0 2 al 30 ~-

2. Colocar la membrana lavada en un recipiente adecuado. Adicionar la 4. Colocar la membrana en un recipiente adecuado y adicionarle la solu-
solucin de sustrato y desarrollarla a la temperatura del cuarto con agita- cin de sustrato. Desarrollar el immunoblotting a Ja temperatura del cuarto
cin suave hasta que las baildas estn suficientemente oscuras . F.s to con agitacin suave hasta que aparezcan las bandas. Esto demora aproxi-
puede demorar aproximadamente 30 minutos. madamente 30 minutos.

3. Parar la reaccin enjuagando el blot con PBS que contiene EDTA, el 5. Para parar la reaccin, remover el Hp1 enjuagando con PBS .
cual acompleja los iones Mg....
Aminoetilcarbazol (A'f'C) .
,
PEROXIDASA DE RABANO PICANTE Este sustrato (3-amino-9-etilcarbazol) rinde un producto de reaccin rojo.
Es ligeramente ms sensible que el cloronaftol, pero ms dificil de fotogra- .
Tres sustratos resultan adecuados para desarrollar los immunoblottings con fiar.
reactivos conjugados a la peroxidasa de rbano picante : cloronaftol ,
aminoetilcarbazol y diarninobencidina. Materia l
- Solucin de AEC : 3-amino-9-et il carbazo l 0,4 g en 100 mL de
Cloronaftol dimetilfom1amida . Es estable a la temperatura del cuarto al menos le ao
El 4-cloro-l-naftol (cloronaftol) es relativamente insensible, pero da un pro- - Acetato de sodio O, 1 mol/L, pH 5,2
ducto de intenso color negro-azul en una reaccin fcilmente controlable.
Estos blots deben ser rpidamente fotografiados, pues el color se desvane-
- Hp2 al 30 %
ce rpidamente. El color de fondo es bajo. - PBS

267
266
Me todo . Parar la reaccin removiendo el ~0 2 con PBS.

1. Inmediatamente antes del desarrollo del immunoblotting adiciona


Diaminobencidina facilitada con iones metlicos (DAD/metal)
0,67 mL de la solucin de AEC a 10 mL de la solucin de acetato d
sodio. Puede fonnarse un pequeo precipitado, que se puede eliminar Material
por filtracin a travs de papel Whabnan # 1.
- Solucin de sustrato: DAB tetrahidrocloruro en 9 mL de Tris 50 mmol/L,
2. Adicionarle al filtrado 1O L del ~O: al 30 % . pH 7,6. Filtrar por papel Whabnan # 1 si se forma precipitado. Adicionar
1 mL de NiC1 2 o CoCl 2 al 0,3 % (peso/volume~ y 10 L de "20 2 al
3. Colocar la membrana lavada en un recipiente adecuado y cubrirla con
30 %. Prepararla en el momento de su empleo
la solucin de sustrato. Desarrollar la reaccin a la temperatura del
cuarto con agitacin suave hasta que las bandas estn suficientemente - PBS
oscuras . M todo
4. Parar la reaccin removiendo el ~0 2 con PBS . 1. Colocar la membrana en un recipiente adecuado y cubrirla con la solu-
cin' de sustrato recin preparada . Desarrollar el immunoblotting a la
Diaminobencidina (DAD) temperatura del cuarto y con agitacin hasta que las bandas desarrollen
el tono adecuado.
El 3,3 ,4,4 -tetraminobifenil es un sustrato excepcionalmente sensible, que
rinde un producto de color pardo. Su sensibilidad puede ser incrementada 2. Parar la reaccin sumergiendo la membrana en PBS .
aadiendo iones cobalto o nquel a su solucin . En presencia de estos iones
el producto de la reaccin es de. color negro pizarra, ms fcil de fotografiar. DETECCIN CON REACTIVOS MARCADOS .
El inconveniente del DAB es que la reaccin es tan rpida que puede
CONfADIOISTOPOS
sobredesarrollarse el blotting, dando una fuerte coloracin de fondo .
Estos mtodos tienen dos ventajas : la medicin es fcil y la imagen
Materia/ autorradiogrfica es clara y exacta para su publicacin. Sus principales des-
- Solucin de DAB : DAB tetrahidrocloruro 6 mg en l O mL de Tri ventajas son que requieren de un equipamiento y condiciones especiales, as
50 mmol/L, pH 7,6 como el riesgo que presupone el trabajo con istopos radioactivos.

- Puede fonnarse un precipitado que se elimina por filtracin a travs d Materia/


papel. Aadir 10 L de ~0 2 al 30 %. Esta solucin se prepara irunedia - Membrana de nitrocelulosa
tamente antes de usarse
Pelcula de rayos X
- PBS
- Cassette de autorradiografia con pantalla amplificadora
Mtodo 'V
- Reactivos para el revelado
l. Colocar la membrana en un recipiente adecuado y cubrirla con la solu
Mtodo
cin dr. sustrato recin preparada. Desarrollar d immunoblotting a 1
temperatura del cuarto y con agitacin suave hasta que las bandas dcsa 1. Despus del ltimo lavado, drenar la membrana de nitrocelulosa colo-
rrollen el tono adecuado. cndbla sobre una pieza de papel absorbente.

268 269
2. Envolver la membrana en una envoltura plstica. Alinear la pcleula
rayos X y la membrana, colocndolas y fijndolas convenientemente
el cassette de autorradiografia.
3. Exponer la membrana a la pelcu la de rayos X a - 70 C con una pantall
amplificadora .
4 . Realiz.ar el revelado .

Observacin
La cubierta plstica bloquear el contacto con los istopos radioactivos. CAPTULO IX
Cuando no sea necesario su empico, la membrana de nitrocelulosa deber,
estar seca para que no se pegue a la pelcula. Si quedara adherida, se su
PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
mergir el emparedado en PBS para que la nitrocelulosa se hidrate y pod
ser separada de la pelcula. MONOCLONALES. TECNOLOGA
DEL HIBRIDOMA
OTRA FORMA DE REVELADO
Actualmente se dispone en el mercado de membranas cubiertas con el sis:
terna de deteccin (Web) que se colocan sobre la membrana de nitrocelul
sa, las cuales dan en unos pocos segundos una banda coloreada en el siti Se coryoce desde hace bastante tiempo que es posible fusi onar clulas de
donde est presente la enzima. Esta deteccin rpida y sensible ocurre, difer9'1tcs tipos y especies para fonnar hbridos. Sin embargo, la retencin
el caso de la peroxidasa, por un proceso de transferencia de electrones de caractersticas altamente diferenciadas se pierde si los parentales no
sistema de deteccin, iniciado por la peroxidasa, que produce una color, provie