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DETERMINACIN DE PROTENAS: MTODO DE BRADFORD:

Materiales para la Determinacin de Protenas: Mtodo de Bradford


REACTIVOS:
Reactivo de azul brillante de coomassie G-250
50 ml de etanol 95 %.
A cido fosfo rico al 85 %(w/v).
Agua destilada
MATERIALES:
Tubos de ensayo
Espectrofoto metro
Matraces

Metodologa Experimental

Para la determinacin de protenas se prepar 100 ml de solucin estndar de protena de


albumina de una concentracin de 0.5 g/L, y con ayuda de una micropipeta agregamos las
cantidades de la solucin estndar y tampn citrato como se muestra en la tabla 1. Una vez
diluida las soluciones en cada tubo de ensayo, se agreg 5ml de Reactivo Bradford(a cada tubo)
se mezcl y se dej reaccionar durante 5 minutos. Se observ que s hubo una reaccin,
porque el color que present.

NTubo Solucin Tampn


Estndar(Ul) citrato
1 100 0
2 80 20
3 60 40
4 50 50
5 40 60
6 20 80
7 10 90
8 0 100

TABLA1. Determinacin de protenas

Para conocer la concentracin albumina para cada tubo de ensayo, se utiliz la formula
C1V1=C2V2, donde C1 ser la concentracin de la solucin estndar 0.5g/L, V1 la cantidad se
solucin estndar que contiene cada tubo de ensayo, y V2 100 para cada tubo. Las cantidades
que se muestran en la tabla 2(concentracin albumina), son las cantidades que se llev a leer
la absorbancia a 595m, obteniendo lo siguiente.

NTubo Concentracin Absorbancia


albumina(ml)
1 0.5 0.191
2 0.4 0.161
3 0.3 0.129
4 0.25 0.096
5 0.20 0.078
6 0.10 0.027
7 0.05 0.011
8 0 0

TABLA2. Concentracin de albumina

HALLANDO EL RANGO DE LINEALIDAD


Para hallar el rango de linealidad, primero se agrego 2.9ml de sacarosa a los
tubos excepto al tubo BE, a e ste se le agrego tampo n citrato. Luego a todos
los tubos se los coloco a ban o mara y al minuto 3 se agrego 100uL la
enzima con dilucio n de 1:6, excepto al BS, a e ste se le agrego 100uL de
tampo n citrato. Apenas se agrego la enzima al primer tubo (tubo 0) se
coloco en una olla, se controlo 5 minutos desde el momento que sacamos de
ban o mara, en la olla se controlo 3 minutos, cumpliendo los 3 minutos se
les coloco en hielo. Y as se controlo cada 5, 10, 15, 20(sacar BE y BS)
minutos para sacar los tubos de ban o amarilla

C1 C2 C3
Diluci 1:1 1:4 1:6
n
T( min)
0 1:2 1:2 1:2
5 1:2 1:1 1:5
0 0
10 1:2 1:1 1:5
0 0
15 1:2 1:1 1:1
0 0 0
20 1:2 1:1 1:1
0 0 0
BE 1:1 1:1 1:1
BS 1:1 1:1 1:1

Grupo C3
Tiempo DNS/dilucin Para realizar la curva de calibrado, se realizaron diluciones como se
observa en la tabla 4. Para el primer tubo, se agreg 250uL de la
0 1:2 muestra +250uL de agua. Para el segundo y tercer tubo se agreg
5 1:5 100uL de la muestra+ 400 uL de agua. Para el cuarto y quinto tubo
se agreg 100uL de la muestra +900 uL, pero solo necesitamos 500
10 1:5 uL, es por eso que a partir de esta dilucin, se realizaron en tubos
aparte. Para el tubo seis, se agreg 500 uL de muestra. Y para el
15 1:10
tubo ocho, solo se agreg 500UL de agua.
20 1:10
Una vez listas los tubos, se agreg a todos 500uL de DNS, y se llev
BE 1:1 a ebullicin por 5 minutos. Luego se les coloc en hielo por 3
minutos, se agreg 5 ml de agua destilada para cada tubo, se dej
BS 1:1 reposar 15 minutos se agit y finalmente se midieron las
absorbancias.
B0 1:1

ANEXOS

1. Determinacin de protenas

Para el tubo n1 Para el tubo n6

C 1 V 1=C 2V 2 C 1 V 1=C 2V 2

0.5 ( 100 )=C 2 ( 100 ) 0.5 ( 20 )=C 2 ( 100 )

C 2=0.5 C 2=0.10

Para el tubo n2 Para el tubo n7

C 1 V 1=C 2V 2 C 1 V 1=C 2V 2

0.5 ( 80 )=C 2 ( 100 ) 0.5 ( 10 )=C 2 ( 100 )

C 2=0.4 C 2=0.0.05
Para el tubo n3 Para el tubo 8

C 1 V 1=C 2V 2 C 1 V 1=C 2V 2

0.5 ( 60 )=C 2 ( 100 ) 0.5 ( 0 )=C 2 ( 100 )

C 2=0.3 C 2=0

Para el tubo n4

C 1 V 1=C 2V 2

0.5 ( 5 0 )=C 2 ( 100 )

C 2=0.25

Para el tubo n5

C 1 V 1=C 2V 2

0.5 ( 40 )=C 2 ( 100 )

C 2=0.20

CURVA DE CALIBRADO( DNS)

GRUPO C1
GRUPO C2
GRUPO C3

TIEMPO(MIN 1/DILUCIO ABS(540nm P(g/L)*DIL


) N ) P(g/L) U P(g/L)
0.1416366
0 2 0.024 0.0708183 1 0
0.1676476 0.8382380 0.6016707
5 5 0.075 2 9 8
0.3726979 1.8634896 1.6269223
10 5 0.183 3 5 5
0.2359977 2.3599772 2.1234099
15 10 0.111 2 2 1
0.3195367 3.1953673 2.9588000
20 10 0.155 4 8 8
0.1201822 0.1201822
BE 1 0.05 7 7
0.1163850 0.1163850
BS 1 0.048 4 4

P(g/l) = Fd*(X- (BS+BE))


BE+BS 0.2365673
1

GRUPO: C3 - E1:6
3.5

3
Azucares reductores( g/L)

2.5

1.5

0.5

0
0 5 10 15 20 25
Tiempo ( min)