El uso de un medio adecuado, adecuado e industrial es tan importante como el

Despliegue de un microorganismo adecuado en microbiologa industrial. A menos

que el medio sea adecuado, no importa cun innatamente productivo sea el
organismo, no ser posible aprovechar los potenciales industriales completos del
organismo. De hecho, no slo se puede reducir la produccin del producto deseado
sino tambin producir materiales txicos. Los medios lquidos se emplean
generalmente en la industria porque requieren menos espacio, son ms
susceptibles a los procesos de ingeniera y eliminan el coste de proporcionar agar
y otros agentes slidos.

4.1 LOS REQUISITOS NUTRITIVOS BSICOS DE LOS MEDIOS INDUSTRIALES

Todos los medios microbiolgicos, ya sean industriales o de laboratorio, deben

satisfacer las necesidades del organismo en trminos de carbono, nitrgeno,
minerales, factores de crecimiento y agua. Adems, no deben contener materiales
que sean inhibidores del crecimiento. Idealmente, sera esencial realizar un anlisis
completo del organismo que se va a cultivar, a fin de decidir cunto de los diversos
elementos deben aadirse al medio. Sin embargo, se dispone de cifras aproximadas
para los tres grupos principales de organismos heterotrficos generalmente
cultivados a escala industrial y pueden utilizarse en tales clculos (Tabla 4.1).

Los requerimientos de carbono o energa se satisfacen usualmente a partir de

carbohidratos, especialmente (en experimentos de laboratorio) de glucosa. Debe
tenerse en cuenta que algunos organismos pueden utilizar carbohidratos ms
complejos tales como almidn o celulosa. Adems, las fuentes de energa no
necesitan limitarse a hidratos de carbono, sino que pueden incluir hidrocarburos,
alcoholes o incluso cidos orgnicos. El uso de estos ltimos sustratos como
fuentes de energa se considera en los Captulos 15 y 16 donde se discuten las
producciones de protena y levadura de una sola clula. Al componer un medio
industrial, el contenido de carbono debe ser adecuado para la produccin de clulas.
Para la mayora de los organismos, el peso del organismo producido a partir de un
peso dado de carbohidratos (conocido como la constante de rendimiento) en
condiciones aerobias es aproximadamente 0,5 g de clulas secas por gramo de
glucosa. Esto significa que los carbohidratos son al menos dos veces el peso
esperado de las clulas y debe ponerse como glucosa o su compuesto equivalente.

El nitrgeno se encuentra en protenas incluyendo enzimas as como en cidos

nucleicos por lo tanto es un elemento clave en la clula. La mayora de las clulas
usaran amonaco u otras sales de nitrgeno. La cantidad de nitrgeno a aadir en
una fermentacin puede calcularse a partir de la masa celular esperada y de la
composicin media de los microorganismos utilizados. Para las bacterias, el
contenido medio de N es del 12,5%. Por lo tanto, para producir 5 g de clulas
bacterianas por litro se necesitaran alrededor de 625 mg de N (Tabla 4.1).

Debe aadirse cualquier compuesto de nitrgeno que el organismo no pueda

sintetizar. Los minerales forman porciones componentes de algunas enzimas en la
clula y deben estar presentes en el medio. Los principales elementos minerales
necesarios incluyen P, S, Mg y Fe. Los elementos de rastreo requeridos incluyen
manganeso, boro, zinc, cobre y molibdeno.

Los factores de crecimiento incluyen vitaminas, aminocidos y nucletidos y deben

agregarse al medio si el organismo no puede fabricarlos.

Bajo condiciones de laboratorio, es posible satisfacer el requerimiento del

organismo mediante el uso de productos qumicos purificados, ya que el crecimiento
microbiano generalmente se limita generalmente a unos pocos litros. Sin embargo,
a escala industrial, el volumen de la fermentacin podra ser del orden de miles de
litros. Por lo tanto, los productos qumicos puros no se utilizan generalmente debido
a su alto gasto, a menos que el coste del material acabado justifique su uso. Los
productos qumicos puros se utilizan sin embargo cuando los medios industriales se
estn desarrollando en el laboratorio. Los resultados de tales estudios se utilizan en
la composicin del medio industrial final, que se hace generalmente con materias
primas no purificadas. Los materiales extraos presentes en estas materias primas
no purificadas no siempre son una desventaja y pueden ser responsables de la
propiedad final y distintiva del producto. As, aunque el alcohol parece ser el material
deseado para la mayora de los bebedores de cerveza, los otros materiales extraos
a la maltosa (de la que las levaduras fermentan el alcohol) ayudan a conferir a la
cerveza su sabor distintivo (Captulo 12).

CRITERIOS PARA LA ELECCIN DE MATERIAS PRIMAS UTILIZADAS EN

MEDIOS INDUSTRIALES

Al decidir las materias primas que se utilizarn en la produccin de determinados

productos utilizando microorganismos designados, debern tenerse en cuenta los
siguientes factores.

(A) Coste del material

Cuanto ms baratas sean las materias primas, ms competitivo ser el precio
de venta del producto final. No importa, por lo tanto, cun adecuadas son las
materias primas nutrientes, normalmente no se emplearn en un proceso
industrial si su costo es tan alto que el precio de venta del producto final no
es econmico. Por lo tanto, aunque la lactosa es ms adecuada que la
glucosa en algunos procesos (por ejemplo, la produccin de penicilina)
debido a la lentitud de su utilizacin, se suele reemplazar por la glucosa ms
barata. Cuando se utiliza, la glucosa se aade slo en pequeas cantidades
intermitentemente con el fin de desacelerar la produccin de cido. Debido
a estas consideraciones econmicas, las materias primas utilizadas en
muchos medios industriales suelen ser residuos de otros procesos. El licor
de maceracin de maz y la melaza son, por ejemplo, productos de desecho
de las industrias de almidn y azcar, respectivamente. Se discutirn ms
detalladamente a continuacin.
(B) Disponibilidad pronta de la materia prima
La materia prima debe estar fcilmente disponible para no detener la
produccin. Si es de temporada o importado, entonces debe ser posible
almacenarlo por un perodo razonable. Muchos establecimientos industriales
mantienen grandes existencias de sus materias primas para este propsito.
Las grandes existencias ayudan a superar el creciente costo de las materias
primas; Sin embargo grandes existencias significan que el dinero que podra
haber encontrado uso en otro lugar se gasta en la construccin de grandes
almacenes o almacenes y en asegurar que las materias primas no son
atacadas durante el almacenamiento por microorganismos, roedores,
insectos, etc. No siempre es fcil darse cuenta de que el material utilizado
debe ser capaz de almacenamiento a largo plazo sin deterioro concomitante
de la calidad.

C) Gastos de transporte
La proximidad de la industria usuaria al lugar de produccin de las materias
primas es un factor de gran importancia, ya que el coste de las materias
primas y del material acabado y, por tanto, su competitividad en el mercado,
pueden verse afectados por los costes de transporte. Cuanto ms prxima
sea la fuente de la materia prima al punto de uso, ms adecuada ser para
el uso, si todas las dems condiciones son satisfactorias.

D) Facilidad de eliminacin de los residuos resultantes de las materias

primas
La eliminacin de residuos industriales se controla rigurosamente en muchos
pases. Los materiales de desecho suelen ser utilizados como materias
primas para otras industrias. As, los granos usados de las fbricas de
cerveza se pueden utilizar como alimento para animales. Sin embargo, en
algunos casos no se puede utilizar ms para los residuos de una industria.
Su disposicin especialmente donde la intervencin reguladora del gobierno
es rgida podra ser costosa. Al elegir una materia prima por lo tanto, el costo,
si existe, de tratar sus residuos debe ser considerado.
E) Uniformidad en la calidad de la materia prima y facilidad de normalizacin
La calidad de la materia prima en trminos de su composicin debe ser
razonablemente constante para asegurar la uniformidad de calidad en el
producto final y la satisfaccin del cliente y sus expectativas. En los casos en
que los productores son abundantes, normalmente compiten para asegurar
el mantenimiento del requisito de calidad constante exigido por el usuario.
Por lo tanto, en la industria de la cerveza hay informacin disponible sobre
la calidad de la malta de cebada antes de ser comprada. Esto se debe a que
existe un gran nmero de productores de malta de cebada y los productores
intentan satisfacer las necesidades especiales de la industria cervecera, su
principal cliente. Por otra parte, la melaza, que es una fuente importante de
nutrientes para los microorganismos industriales, es un producto de la
industria azucarera, donde se considera como un producto de desecho. La
industria azucarera no se preocupa tanto por la constancia de la calidad de
la melaza como por la de la azcar. Por lo tanto, cada lote de melaza debe
ser analizado qumicamente antes de ser utilizado en una industria de
fermentacin con el fin de determinar cunto de los diversos nutrientes debe
ser aadido. Una materia prima con extremos de variabilidad en la calidad
es claramente indeseable ya que se necesitan costes adicionales, no slo
para el anlisis de la materia prima, sino tambin para los nutrientes que
pueden ser necesarios para alcanzar la calidad habitual y esperada en el
medio.
F) Composicin qumica adecuada del medio
Como se ha discutido ya, el medio debe tener cantidades adecuadas de
carbono, nitrgeno, minerales y vitaminas en las cantidades y proporciones
apropiadas necesarias para la produccin ptima del producto en cuestin.
Las exigencias de los microorganismos tambin deben cumplirse en
trminos de los compuestos que pueden utilizar. As, la mayora de las
levaduras utilizan azcares de hexosa, mientras que slo unos pocos
utilizarn lactosa; La celulosa no es atacada fcilmente y es utilizada
solamente por un nmero limitado de organismos. Algunos organismos
crecen mejor en uno u otro sustrato. Los hongos, por ejemplo, crecen
fcilmente en el licor de maz, mientras que los actinomicetos crecen ms
fcilmente en la torta de soja.
G) Presencia de precursores pertinentes
La materia prima debe contener los precursores necesarios para la sntesis
del producto acabado. Los precursores a menudo estimulan la produccin
de metabolitos secundarios aumentando la cantidad de un metabolito
limitante, induciendo una enzima biosinttica o ambas. Estos son
generalmente aminocidos, pero otras molculas pequeas tambin
funcionan como inductores. La naturaleza del producto acabado en muchos
casos depende en cierta medida de los componentes del medio. Por lo tanto,
las cervezas oscuras, como la cerveza negra, son producidas por la malta
de cebada caramelizada (o sobre-tostada) que introducen el color oscuro en
estas cervezas. De manera similar para la penicilina G a producir, el medio
debe contener un compuesto de fenilo. El licor de maz que es el componente
estndar del medio de penicilina contiene precursores de fenilo necesarios
para la penicilina G. Otros precursores son el cobalto en los medios para la
produccin de vitamina B12 y el cloro para los antibiticos que contienen
cloro, la clortetraciclina y la griseofulvina.
H) Satisfaccin de las necesidades de crecimiento y produccin de los
microorganismos
Muchos organismos industriales tienen dos fases de crecimiento en el cultivo
por lotes: la fase de crecimiento, o la trofofase, y la fase de produccin, o la
idiofasa. En la primera fase, la multiplicacin celular tiene lugar rpidamente,
con poca o ninguna produccin del material deseado. Es en la segunda fase
que tiene lugar la produccin del material, generalmente sin multiplicacin de
clulas y siguiendo la elaboracin de nuevas enzimas. A menudo estas dos
fases requieren diferentes nutrientes o diferentes proporciones de los
mismos nutrientes. El medio debe ser completo y ser capaz de satisfacer
estos requisitos. Por ejemplo, altos niveles de glucosa y fosfato inhiben la
aparicin de la idiofasa en la produccin de una serie de metabolitos
secundarios de importancia industrial. Los niveles de los componentes
aadidos deben ser tales que no afecten negativamente a la produccin. La
relacin de trofofaseidiofase y los metabolitos secundarios se discuten en
detalle en el Captulo 5.
 ALGUNAS MATERIAS PRIMAS UTILIZADAS EN COMPUESTOS DE
MEDIOS INDUSTRIALES

Tabla 4.1Composicin media de microorganismos (% peso seco)

Revisin bibliogrfica
OPTIMIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS PARA
MICROORGANISMOS,
UNA VALIOSA ESTRATEGIA PARA LA PRODUCCIN
DE BIOPREPARADOS DE INTERS AGRCOLA
Gretel Gmez
RESUMEN. Los medios de cultivo constituyen el micromundo
de los microorganismos en condiciones de laboratorio, intentando
simular su hbitat natural en relacin con la satisfaccin
de sus ms vitales necesidades como ser vivo. El diseo de un
medio de cultivo responde a las exigencias del microorganismo
en cuestin y a la finalidad que se persigue con su multiplicacin;
por tanto, la seleccin y la concentracion adecuada de
los nutrientes es un factor de vital importancia. Sin embargo, el
empleo de una apropiada metodologa es lo que hace posible
la obtencin de un medio de cultivo ptimo, ya sea para el
crecimiento y/o la produccin de metabolitos por parte del
microorganismo. Existen numerosos mtodos y diseos de
optimizacin con dismiles caractersticas, ventajas y limitaciones
que determinan su empleo en las diversas ramas de la
investigacin. Se abordaron en el trabajo los diseos factoriales
completos y fraccionados, el Plackett Burman, el Box-Behnken
y el uniforme. La optimizacin de los componentes del medio y
de las condiciones ambientales garantiza notables incrementos
en los rendimientos de los procesos fermentativos de forma
rpida y econmica. Por tanto, esta revisin pretende abordar
los principios y mtodos de optimizacion, as como caracterizar
y ejemplificar la aplicacion de los diseos ms usados
en la optimizacin de medios de cultivos, con el fin de extender
su uso a la biotecnologa agrcola.

INTRODUCCIN
Los microorganismos necesitan
de condiciones bioqumicas y
biofsicas apropiadas para su desarrollo.
El principal objetivo de los
medios de cultivos es crear un ambiente
adecuado para el crecimiento,
simulando las condiciones lo ms
cercanas posibles a las naturales,
asegurando as el apropiado funcionamiento
de la maquinaria enzimtica
de los microorganismos (1), lo cual
implica un adecuado balance de los
componentes. Teniendo en cuenta
los requerimientos de cada microorganismo
en particular y de los fines
del investigador, se ha desarrollado
una gran variedad de medios de cultivo
con diferentes propsitos y usos.
El xito del diseo y la formulacin
de medios de cultivo para procesos
microbianos, est muy relacionado
con la aplicacin de conocimientos
bsicos acerca de los microorganismos
y sustratos.
Para el desarrollo de un medio
de cultivo es necesario seleccionar
adecuadamente los componentes a
usar. Esto incluye la seleccin del
tipo y la concentracin de los diferentes
nutrientes, como son: fuente
de carbono, energa, nitrgeno, fsforo,
factores de crecimiento, entre
otros, tambin de condiciones tales
como concentracin de oxgeno, temperatura
y pH (2).

Los estudios relacionados con

el diseo de nuevos medios de cultivo
para la obtencin de biopreparados
con fines agrcolas han sido numerosos.
Sin embargo, el empleo de
una apropiada metodologa estadstica
es lo que hace posible la obtencin
de un medio de cultivo ptimo,
ya sea para el crecimiento o la produccin
de metabolitos por parte del
microorganismo. En los procesos
fermentativos microbianos, es necesaria
la optimizacin del medio de
cultivo y las condiciones ambientales,
para explotar completamente el
potencial de las cepas seleccionadas
(3). De esta forma se garantiza
que el proceso sea lo ms econmico
y productivo posible.
Existen numerosos mtodos y
diseos estadsticos, que son aplicados
con xito en la optimizacin
de sistemas en diversas reas de la
investigacin, entre las que se encuentra
la microbiologa. No obstante,
el adecuado y extensivo uso de
estas herramientas estadsticas en
todas las vertientes de esta rama es
an una limitacin; por tanto, se pretende
abordar en este material los principios
y mtodos de optimizacion, as
como caracterizar y ejemplificar los
diseos ms usados en la
optimizacin de medios de cultivos
para microorganismos, con la finalidad
de extender su empleo a la
biotecnologa agrcola.
FORMULACIN Y OPTIMIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIN:

Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los componentes, en 1)

medios sintticos o medios qumicamente definidos, y 2) medios complejos en cuya composicin
intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura,
macerado de maz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas,
pero que son qumicamente indefinidas y de composicin variable

No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que
pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes: a)
Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn representados por las
fuentes de C, N, S, P, K y Mg; b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales
de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o
microgramos por litro; y c) Factores de crecimiento, que estn constituidos generalmente por
componentes orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni
metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin metablica
especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados, etc..

La formulacin tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir debe establecer
las concentraciones de cada componente a ser utilizadas. Una primera aproximacin con respecto
a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composicin de
biomasa del microorganismo a ser empleado. Una composicin elemental y tpica de la biomasa
es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrgeno, 7-12; Fsforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%.
Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa
debemos proveer las distintas fuentes que aseguren como mnimo las cantidades de elementos
que deben ser suministrados.

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimizacin de los medios de cultivo.
Entre ellas podemos mencionar las siguientes: 1) No existencia de informacin respecto a
coeficientes de rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo
determinado. 2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de
microelementos y factores de crecimiento. 3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos
en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestin, que
pueden causar inhibicin del crecimiento. 4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e
inhibidoras del crecimiento y formacin del producto. 5) Empleo de fuentes nutricionales no
convencionales. La metodologa ms elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales
se vara la concentracin del componente a ensayar mantenindose constante las
concentraciones de los dems ingredientes. Para organismos aerobios generalmente se utiliza
como sistema de cultivo erlen meyers agitados. En este caso, se analiza el efecto de la variable
escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentracin de biomasa obtenida.

Los medios de cultivo se clasifican en qumicamente definidos y complejos,

dependiendo de si su composicin es conocida o no. Es necesario un balance de
componentes elementales para proporcionar los nutrientes requeridos para obtener la
biomasa. Los microorganismos requieren para su crecimiento una fuente de energa y
una de carbono, en la mayora de las fermentaciones industriales una misma fuente
provee ambas, es necesario que la fuente de materia contenga todos los elementos
constitutivos de la masa celular en las proporciones requeridas para la composicin
interna del organismo (H2, C, S, P, Mg, Mn,Ca^e,Co,Zn,Cu,Mo). La
composicin celular depende del tipo de microorganismo, por ejemplo bacterias,
levaduras y hongos caen en el siguiente rango; carbn 45-55%, nitrgeno 6-14%,
potasio 0.5 - 2%, fsforo 1-3%, magnesio 0.1-1%, azufre 0.02-1%, calcio 1% (% en
peso seco). Tambin estn presentes minerales menores tales como cobre 0.1- 10 mg,
fierro 1 - 1 0 mg, zinc 1 mg y manganeso 0 - 5 mg. La formulacin del medio de cultivo
debe considerar todos los elementos antes mencionados adems de otros necesarios para
la produccin de metabolitos especiales (antibiticos, enzimas, etc.). Los constituyentes
se clasifican en grupos del A - D; el grupo "A" contiene todos los nutrientes necesarios
excepto nitrgeno (Glucosa, KH2P04, MgS04.7H20, CaCl2, Fe2(S04)3, ZnS04. 7H20,
CUSO4.7H2O, MnSO< .HjO), el grupo "B" provee nitrgeno en forma de ion amonio,
que es metabolizado por la mayora de los microorganismos y el anin fosfato provee
alguna capacidad buffer ((NH+hHjPO^ (Nl^HPCU). La funcin del grupo "C" un
quelato cuya formula general es C^HsNajO?. 2H2O, proporciona el ion metal en
solucin, este tambin causa efectos txicos sobre todo cuando el inoculo es pequeo.
La propiedad buffer de los componentes del grupo "D" es necesaria para mantener el
PH (NajHPCU, KH2PO4).
Los estudios cinticos son necesarios para entender el comportamiento de
cualquier fermentacin y consisten en la estimacin de las velocidades de sntesis
celular, formacin de productos y efectos del medio ambiente sobre stas velocidades.
El crecimiento unicelular de un cultivo esttico a nivel matraz o fermentado!", limitan
por la cantidad de substrato inicialmente, puede ser expresado en trminos de la
concentracin celular X, la del substrato limitante S y la del inhibidor I. En la cintica
tambin deben considerarse las condiciones de temperatura, fuerza inica y pH, que se
establecen al principio de la fermentacin y estas varan durante su transcurso a menos
que se controlen estrictamente, esto puede contribuir notablemente en el crecimiento
 celular y los metabolitos secundarios que se produzcan (4,56,73,86).
Cuando a un microorganismo se le proporcionan los nutrientes necesarios y
las condiciones ambientales ptimas, realiza un conjunto de reacciones metablicas, las
clulas crecen y/o producen algunos metabolitos de inters. La conversin de substrato a
biomasa determina el rendimiento del crecimiento celular, generalmente cuanto ms
oxidado esta el substrato menor es el rendimiento (56,73).
En un cultivo microbiano se presentan diferentes fases de crecimiento: I Lag o de
retardo, aceleracin del crecimiento, m crecimiento exponencial, IV desaceleracin,
V estacionara y VI declinacin; estas fases reflejan cambios en la biomasa y en el
medio ambiente. Despus de un periodo lag el crecimiento ocurre a la mxima
velocidad y finalmente cesa, como resultado del balance entre los siguientes factores:
carencia de un nutriente, acumulacin de un producto inhibitorio o algn cambio
fisicoqumico en el medio ambiente (56,73,86)
Cuando el crecimiento de un cultivo est limitado por la cantidad inicial de
substrato, la curva de crecimiento puede expresarse en trminos de parmetros de
crecimiento; la ecuacin de Monod describe la relacin entre la velocidad especifica de
crecimiento n y la concentracin del nutriente limitante S, en el cultivo.
dx ,, "jazl
Ecuacin de Monod : = fjx A* x. +5
dt
La concentracin celular X, se puede determinar por diferentes mtodos: el
nmero de clulas y la masa celular, dependiendo de las caractersticas fsicas de los
microorganismos, principalmente su tamao. Para microorganismos miceliales se
determina por peso seco (56,73, 86).
En la fermentacin se estudian los efectos de los siguientes factores: velocidad de
agitacin, aereacin, pH y temperatura; en muchos casos los instrumentos estn
conectados a una computadora y estudiar la dinmica de los cultivos. Un proceso de
fermentacin, comprende, adems de las reacciones bioqumicas efectuadas por un
microorganismo y/o por enzimas, las caractersticas fsicas y de operacin del recipiente
donde se va a realizar el proceso y las operaciones que se efectan antes y despus de
la fermentacin. El escalamiento de procesos es una tarea interdisciplinaria que requiere
del uso combinado e integrado de conceptos y mtodos de Ingeniera Qumica y
Fisiologa Microbiana. ( 14,16,73,89).

1. EXPLICACION DE TRABAJOS PRACTICOS -2007 MICROBIOLOGIA GENERAL-

BIOQUIMICA

MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCION
 Las bacterias son organismos muy verstiles. Presentan un gran potencial en su capacidad de utilizar
disitntas fuentes de alimentos, desde sustancias inorgnicas hasta materias orgnicas sumamente
complejas. Muchas especies han aprendido a crecer en una amplia diversidad de nichos ecolgicos con
temperatura, acidez o tensiones de oxgeno extremas.
Es muy difcil estudiar microorganismos en forma individual; lo ms prctico es trabajar con
poblaciones de los mismos. Para lograr estas poblaciones es necesario disponer de un medio artificial que
brinde a los microorganismos todos los requerimientos nutricionales para desarrollarse. Este ambiente
artificial se denomina MEDIO DE CULTIVO.

* MEDIO DE CULTIVO es toda preparacin artificial, slida, semislida o lquida que suministra al
microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una fuente de energa y condiciones
ambientales adecuadas para la sntesis y mantenimiento de su protoplasma.

CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo.
Los cultivos pueden ser:
a) puros o axnicos, cuando la poblacin est constituida por una nica clase de
microorganismos.
b) mixtos, cuando la poblacin est constituida por ms de una clase de microorganismos.

En la actualidad, la mayora de los grmenes patgenos se pueden cultivar fuera de su hbitat natural.
Ciertos parsitos obligados como las Rickettsias, nunca han podido cultivarse en medios artificiales;
requieren clulas vivas, cultivos de tejidos o embriones de pollo.

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS SEGN LA FUENTE DE ENERGIA Y CARBONO QUE UTILIZAN

Al disear un medio de cultivo es importante conocer los requerimientos de energa y
carbono de las especies a cultivar.

- Fuente de energia, puede ser:

- luz: energa luminosa que se convierte en energa qumica. Los
microorganismos que utilizan esta fuente de energa se denominan fototrofos.
 - reacciones de oxido-reduccin a partir de compuestos qumicos
inorgnicos u orgnicos. Los microorganismos que utilizan esta fuente de energa se denominan
quimiotrofos.

Todos los organismos requieren una fuente de energa para obtener ATP y generar poder reductor (NADH,
NADPH) por alguno de los siguientes metabolismos:

- respiracin aerobia: aceptor final de electrones O2

- respiracin anaerobia: aceptores finales de electrones: NO3-, SO4=, CO2 , fumarato
- fermentacin: conjunto de reacciones donde compuestos orgnicos sirven como donadores y
receptores de electrones. Se produce ATP por fosforilacin a nivel de sustrato.
- Fotosntesis

- Fuente de carbono, puede ser:

- CO2: los microorganismos que utilizan esta fuente de carbono se
denominan autotrofos.
- compuestos orgnicos carbonados (azcares, aminocidos, cidos
grasos, etc). Los microorganismos que utilizan estas fuentes de carbono se denominan heterotrofos.

De la combinacin de estas categoras surge la sig. clasificacin de microorganismos:

Fuente de energa Fuente de carbono Categora Ejemplos

Luz CO2 Fotoautotrofos Algas,

cianobacterias

acetato Fotoheterotrofos Alg. bacterias

Reacciones CO2 Quimiolitotrofos Bacterias oxidantes
de
de xido-reduccin H2 , del azufre, de
Fe2+
compuestos orgnicos Quimioorganotrofos Hongos, bacterias

Fotoautotrofos = fotolitotrofos
Fotoheterotrofos = fotoorganotrofos

COMPOSICION QUIMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Cuando se disea la frmula del medio de cultivo, es necesario conocer en qu categora est incluido el
microorganismo a cultivar para elegir acertadamente los componentes del medio: generalmente
compuestos inorgnicos para microorganismos fototrofos y quimiolitotrofos, y orgnicos para
quimioorganotrofos.

Un medio de cultivo est integrado por:

1. Elementos energticos y constitutivos:

a) Macroelementos (g/l):
Fuente de carbono: puede ser CO2 compuestos carbonados orgnicos. Se utilizan en la
construccin de innumerables molculas necesarias para la clula. Los hidratos de carbono
se consideran fuente de carbono y energa por excelencia en los quimioorganotrofos. Los
ms comunes son:
- hexosas como glucosa, fructosa, galactosa;
- pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa;
- disacridos como lactosa, sacarosa, maltosa;
- trisacridos como rafinosa;
- polisacridos como almidn, glucgeno;
- alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y
- glucsidos como salicina, y esculina.
Fuente de nitrgeno: muchos organismos son autotrofos respecto de la fuente de nitrgeno
y pueden crecer utilizando molculas sencillas como NO3-, NH3 N2 . El nitrgeno es
metabolizado para proveer protenas, cidos nucleicos y polmeros de pared. Otros
microorganismos pueden incorporar nitrgeno en forma de aminocidos, bases pricas o
pirimdicas.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el aporte de nitrgeno es realizado
por las peptonas, que son los productos de la hidrlisis cida o enzimtica de protenas de
origen animal o vegetal (carne, soja, casena, gelatina, harina de maz y girasol). Esos
productos de hidrlisis pueden tener longitud variable, desde aminocidos, hasta dipptidos,
tripptidos, polipptidos, albumosas, proteosas.
La hidrlisis cida puede ser realizada con HCl H2SO4 y presenta las siguientes desventajas:
- el triptofano se destruye
- se pierde el 10% de vitaminas presentes
- desaparecen casi completamente los polipptidos
Se prefiere la hidrlisis enzimtica que emplea diferentes proteasas actuando a pH
especficos, ej. papana a pH 6.5, tripsina a pH 8.5, pepsina a pH 2.
Las peptonas son fuente de nitrgeno y, en ausencia de hidratos de carbono en el medio
de cultivo complejo, cumplen la funcin de fuente de carbono y energa. Aportan vitaminas
del grupo B, trazas de metales y fosfatos que dan carcter buffer al medio.
Las peptonas de origen vegetal pueden aportar carbohidratos fermentables.
Fuente de fsforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o potasio que tambin confieren poder
buffer al medio de cultivo (pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de cultivo,
el aporte de P es realizado por los glicerofosfolpidos de la yema. El fsforo se incorpora a
cidos nucleicos, fosfolpidos, polmeros de membrana, ATP, y sustancias de reserva
(grnulos de volutina)
Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, cisterna o metionina. En la clula se incorpora a
aminocidos y diferentes coenzimas.
Fuente de calcio, magnesio y potasio: potasio, calcio y magnesio se adicionan como sales
inorgnicas. Son cationes que estabilizan macromolculas aninicas. K+ acta como
coenzima y estabilizador de RNA. Mg2+ se integra a colorofila en organismos fotosintticos.
Ca2+ abunda en esporas como dipicolinato de calcio.
 Fuente de sodio: sodio contribuira a equilibrar la presin osmtica del medio extracelular.
Es un catin requerido por bacterias haloflicas. Se suele suministrar como NaCl.

b) Microelementos o trazas (mg ug/ml): suelen estar naturalmente presentes como

contaminantes de los macroelementos.
* Frecuentemente esenciales:
Mn: estimula el crecimiento, favorece la esporulacin.
Fe: cofactor de enzimas para la funcin respiratoria en citocromos, catalasa y flavoprotenas.
En adecuada concentracin favorece la sntesis de toxina diftrica.
Co: interviene en la sntesis de vitamina B12 .
Cu: presente en oxidasa terminal de la cadena respiratoria.
Esenciales en casos especiales: B, Al, Si, V, As, Se, Mo, Sn, Be, F, etc.
Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentracin
mayor que 10-4 M puede resultar txico para el desarrollo de los microorganismos.

2. Factores de crecimiento
Son compuestos orgnicos especficos requeridos en muy bajas concentraciones que no
pueden ser sintetizados por la clula que los necesita. Por esta razn, deben ser agregados al
medio de cultivo. Ej.: principalmente vitaminas del grupo B, algunos aminocidos, purinas,
pirimidinas, cidos grasos. Hay ejemplos clsicos como los factores X y V (porfirinas) de la
sangre requeridos por la bacteria Haemophilus influenzae para crecer. El suero fetal bovino, que
aporta numerosos factores de crecimiento, es imprescindible para el cultivo de clulas animales.
Cmo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La capacidad de sintetizar un compuesto
esencial est relacionada con una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que se
completa satisfactoriamente. Cuando por alteraciones genticas, alguna enzima de la secuencia
no puede ser sintetizada, la serie de reacciones se bloquea en algn paso y no finaliza con xito.
El compuesto que por esta razn dej de sintetizarse, se convierte en un factor de crecimiento.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, los factores de crecimiento pueden ser
aportados por diversos extractos:
-Extracto de carne: su funcin es ser complemento vitamnico de las peptonas. Pero tambin
aporta sustancias nitrogenadas como: aminocidos, bases pricas y pirimdicas, cidos
 orgnicos, creatina, xantina, hipoxantina, cido rico, urea, y sustancias no nitrogenadas como
glucgeno, fosfatos de hexosas, cido lctico, sales inorgnicas.
La calidad de este tipo de extracto vara con la carne empleada, el tiempo y la temperatura de
extraccin.
-Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis de las clulas de levadura. Su funcin
es ser suplemento vitamnico de las peptonas, pero tambin aporta mezclas de aminocidos y
pptidos, y carbohidratos.
-Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto de levadura ya que posee adecuado
contenido de vitaminas, carbohidratos y aminocidos. Es el extracto soluble en agua de la malta
de cebada.

3. Agentes solidificantes
Su agregado al medio de cultivo es opcional.
El ms usado:
- el agar, es un polisacrido cido derivado de algas marinas, formado principalmente por
galactosa con un grupo sulfato cada 10 a 50 restos. Suele contener sustancias nutritivas en
pequeas concentraciones, y por esto no puede ser utilizado en medios de composicin qumica
estrictamente definida destinados a autotrofos. Se usa sin problemas en medios de cultivo
complejos para quimioorganotrofos.
Se agrega al 1.5-2% en medios de consistencia slida normal, al 0.2-0.3% en medios semislidos
o blandos, al 5% en medios de consistencia muy firme para detener el crecimiento de grmenes
muy mviles, y al 0% cuando se preparan medios lquidos (caldos).
Sus caractersticas:
- Funde a 80-100C y permanece lquido hasta 50-55C.
- A 45-55C se pueden agregar suspensiones de clulas sin afectar la viabilidad (supervivencia)
de las mismas.
- Permanece slido a 37C, temperatura de incubacin de la mayora de las bacterias patgenas
del hombre.
- No es txico para las bacterias, ni es degradado por stas.
- Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de microorganismos
derivadas de una nica clula), lo que resulta imposible en medios lquidos!
- Es transparente, lo que facilita la visualizacin de las colonias.
 - Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para permitir la difusin de los nutrientes
del medio de cultivo en todas direcciones, y suficientemente cerrada segn la concentracin
empleada- para impedir la movilidad de los microorganismos.

Otros solidificantes:
- Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa intensamente para fines especficos
en Inmunologa y Biologa Molecular.
- Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de cultivo para autotrofos, cuando debe
excluirse materia orgnica del medio de cultivo.
- Gelatina: es una protena obtenida por hidrlisis del colgeno. Fue el primer solidificante usado
en Microbiologa, pero es degradado por la mayora de las bacterias (lo comen, por lo que el
medio inicialmente slido termina convertido en medio lquido) y la temperatura de incubacin
no puede ser mayor a 22C (es el punto de fusin) con lo que cultivos slidos a temperaturas
ms altas resultan inviables.
- Albmina de huevo, suero: a 80C estas protenas coagulan y solidifican el medio de cultivo.

4. Agua
El agua representa una altsima proporcin (80-90%) del peso total de una clula y es
fundamental para la realizacin de todos los procesos metablicos, funciones enzimticas,
solvatacin de materiales orgnicos e inorgnicos, donacin de electrones para organismos
fotosintticos. Los medios de cultivo se preparan en el laboratorio con agua destilada lo que
estandariza su composicin y asegura la ausencia de iones como Ca2+ y Mg2+ que pueden
precipitar con fosfatos o generar reacciones indeseables.

CONDICIONES FISICAS DE UN MEDIO DE CULTIVO

An cuando las condiciones qumicas del medio de cultivo estn cubiertas, el crecimiento y desarrollo
de los microorganismos no tendr lugar si se desconocen las siguientes condiciones fsicas:

- temperatura: cada especie tiene su temperatura ptima de crecimiento.

* mesfilos: 35-37C
* psicrfilos: 15-20C
 * termfilos: 50-60C
-presin osmtica: la mayora de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl. Las halfilas requieren
concentraciones superiores.
-presencia de oxgeno: segn sus requerimientos de O2 las bacterias se clasifican en:
* aerobios estrictas: requieren oxgeno para crecer. Metabolismo respiratorio.
* microaerfilos: necesitan bajas tensiones de O2 y una atm enriquecida en CO2 .
Pueden
realizar respiracin aerobia.
*anaerobios obligados: el O2 les resulta txico. Crecen en medios muy reducidos (sin
O2 ).
Metabolismo fermentativo.
* anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2 (metabolismo fermentativo)
y
cuando son expuestos al O2 no mueren.
*anaerobios facultativos: pueden crecer en condiciones aerobias (metabolismo
respiratorio)
como anaerobias (metabolismo fermentativo).

-humedad: todas bacterias necesitan un ambiente mucho ms hmedo para su desarrollo que los hongos.
En condiciones ambientales adversas, algunas especies producen estructuras de resistencia a la
desecacin llamadas esporas que permanecen viables durante tiempo prolongado hasta que el ambiente
sea propicio para la germinacin. Producen esporas los gneros Clostridium (ej. C. tetani,, C. botulinum),
Bacillus (ej. B. cereus, B. subtilis ), Sporosarcina, entre otros.
- luz: es importante para los microorganismos fotosintticos.
-pH: la mayora de las bacterias crece en medio neutro o ligeramente alcalino (7 7.6). Excepciones son
los lactobacilos (pH 5, acidfilos), Vibrio cholerae (pH 8.6,). Los hongos crecen a pH menor que 7.

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

a) Por su consistencia (esto depende de la inclusin o no de un agente solidificante)

-lquidos (no permiten el aislamiento de colonias)

-slidos (permiten el aislamiento y observacin de colonias)

b) Por su origen (esto depende de que la frmula se pueda describir qumicamente con precisin)

-sintticos: estrictamente definidos desde el punto de vista qumico,

generalmente
se usan para cultivar fototrofos y quimiolitotrofos.
-naturales o complejos: se preparan a partir de sustancias naturales de
origen ani-
mal o vegetal de composicin qumica no
rigurosamente
constante: leche, suero, macerado de maz,
peptonas, ex
tractos de carne, levadura. Son aptos para el cultivo
de
quimioorganotrofos. Son los que prepararemos y
usaremos en el Laboratorio de Microbiologa.
c) Por su composicin:
- comunes: incluyen una frmula nutritiva bsica que permite el crecimiento de
microorganismos poco exigentes.
- enriquecidos: mejoran su calidad nutritiva por el agregado de componentes muy ricos
como leche, sangre, huevo, lquido asctico, extracto proteico de
cianobacterias. Se utilizan en el cultivo de bacterias exigentes.
d) Por su funcin:
- Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que sembrados con poblaciones mixtas de
microorganismos, favorecen la multiplicacin de ciertos grupos e inhiben el desarrollo de las especies
restantes. Para funcionar de esta manera incluyen compuestos qumicos especficos o requieren
condiciones fsicas especiales (temperatura, pH).
Ej.: agua peptonada alcalina favorece el desarrollo de Vibrio cholerae tolerante a pH alto e inhibe otros
microorganismos presentes en la misma muestra; caldo selenito contiene selenito de sodio que favorece
la proliferacin de especies como Salmonella y Shigella pero inhibe otras enterobacterias; caldo EC a
44.5C, una temperatura que favorece a Escherichia coli y no a otras bacterias.
- Medios selectivos: son medios slidos que de manera parecida a los anteriores, permiten el
desarrollo de ciertos microorganismos e impiden el desarrollo de otros. La selectividad se logra alterando
las condiciones fsicas del medio de cultivo o agregando compuestos qumicos inhibidores. Ej:
- cambiando pH: para favorecer el desarrollo de Lactobacillus, un gnero implicado en la produccin de
yogur, se puede agregar cido actico a los medios de cultivo para obtener un pH final de 5.4, totalmente
inadecuado para muchas bacterias acompaantes.
- altas concentraciones osmticas: en agar manitol salado con una concentracin de NaCl de 7.5% muy
pocas bacterias pueden crecer, salvo las que presenten una elevada tolerancia a NaCl, como
Staphylococcus aureus
- agregando antispticos: colorantes como verde brillante, cristal violeta y eosina, se utilizan para inhibir
grmenes Gram positivos mientras los Gram negativos desarrollan sin dificultad. Las sales biliares se usan
con el mismo propsito.
- agregando antibiticos: en Ingeniera Gentica es prctica rutinaria la inclusin de antibiticos
(ampicilina, tetraciclina) en los medios de cultivo para poner en evidencia la presencia de bacterias
genticamente manipuladas. Estas clulas son resistentes a uno o ms antibiticos y pueden desarrollar
en un medio que los incluye, mientras las clulas acompaantes, sensibles a los antibiticos, no pueden
crecer. En Microbiologa Clnica, se usan antibiticos de espectro de accin reducido que inhiben o
destruyen microorganismos cuyo estudio no interesa, a la vez que no afectan los grmenes que se estn
investigando.

-Medios diferenciales: permiten demostrar caractersticas metablicas de un determinado grupo de

microorganismos. Por ej.: puede el germen A utilizar glucosa por una va fermentativa? Si agregamos
glucosa a un medio de cultivo slido y un indicador de pH que indique por cambio de color si el azcar ha
sido fermentado o no, estaremos analizando una caracterstica metablica de A. Existen medios
diferenciales donde se pueden detectar varias caractersticas metablicas distintas. La clave es incluir en
la frmula del medio de cultivo a usar: , el sustrato adecuado para la caracterstica metablica que se
desea estudiar y un sistema indicador que refleje por variacin de color u otro fenmeno perceptible, los
cambios que hayan tenido lugar. Las pruebas bioqumicas que veremos en los Trabajos Prcticos son claros
ejemplos de medios de cultivo diferenciales.

-Medios de transporte: se usan cuando se transcurre cierto tiempo entre la toma de una muestra y
su procesamiento. Incluye compuestos que aseguran la supervivencia de las clulas hasta que sean
sembradas en un medio de cultivo adecuado.

IMPORTANTE: un gran nmero de medios de cultivo tienen funciones mixtas. Ej.: puede ser enriquecido
porque lleva sangre y selectivo porque incluye algn antibitico. Puede ser selectivo porque incluye
inhibidores y diferencial porque pone en evidencia propiedades metablicas.

EJERCICIOS DE APLICACIN

1. Para un microorganismo fotoautotrofo mencione qu componentes tendra en cuenta para disear un

medio de cultivo qumicamente definido o sinttico que incluye:
- fuente de carbono:
- fuente de energa:
- fuente de nitrgeno:

2. Para un microroganismo quimioorganotrofo qu componentes tendra en cuenta para disear un medio

de cultivo complejo o qumicamente indefinido que incluye:
- fuente de carbono:
- fuente de nitrgeno:
- fuente de energa:
3. En el Trabajo Prctico tendremos ocasin de preparar algunos de los siguientes medios de cultivo:
a) Caldo nutritivo
 Extracto de carne. 0.3 g a.1. Qu aporte realiza cada componente?
Peptona de carne . 0.5 g a.2. Si no hay hidratos de carbono, qu componente aporta
C?
NaCl . 0.5 g a.3 Cul es la fuente de energa en el medio de cultivo?
Agua destilada. 100 ml a.4. Clasifique este medio por su consistencia, origen y
composi-
pH: 7- 7.2 cin. Qu clase de microorganismos segn fuente de C
y
energa- creceran en l?
b) Agar nutritivo
Extracto de carne. 0.3 g b.1. Qu aporte realiza cada componente?
Peptona de carne . 0.5 g b.2. Qu componente aporta los factores de crecimiento?
NaCl . 0.5 g b.3 Cul es la fuente de energa en el medio de cultivo?
Agar . 1.5 g b.4. Clasifique este medio por su consistencia, origen y
composi-
Agua destilada. 100 ml cin. Qu clase de microorganismos segn fuente de C y
pH: 7 -7.2 energa- creceran en l?

c) Medio BW3
K2 HPO4 ... 0.25 g c.1. Mencione fuente de carbono y fuente de nitrgeno
CO2 burbujeo constante c.2 Cul sera la fuente de energa?
MgSO4 ... 0.0375 g c.3. Por su consistencia y su origen, cmo clasificara este
medio?
Na2MoO4... 2.5 x 10-3 g c.4. Para qu clase de grmenes segn fuente de C y de
energa-
 NaVO3 .. 1.24 x 10-4 g sera adecuado?
KNO3 . 1 g
Agua destilada 1000 ml

d) Cul de los siguientes componentes agregara a un medio de cultivo comn para convertirlo en un medio
enriquecido?
- agua destilada -penicilina -suero fetal bovino -colorantes
- sangre de oveja -leche -extracto proteico de cianobacterias
-sales biliares -antispticos -yema de huevo -agar

e) Se desea propiciar el desarrollo de un grupo A de microorganismos quimioorganotrofos, acidfilos y

resistentes a penicilina, incluidos en una poblacin mixta formada por los grupos A, B y C. Los grupos B y C
pertenecen a flora acompaante.
e.1. Qu medio de cultivo sera ms adecuado para lograr ese propsito? (marque la/s respuesta/s
correcta/s)
- un medio de transporte - un medio enriquecido
-un medio de enriquecimiento - un medio selectivo
-un medio slo diferencial
e.2. Disee un medio de cultivo complejo semislido que incluya una fuente de C, una fuente de energa, una
fuente de N y factores fsicos y/o qumicos que favorezcan slo el desarrollo del grupo A.