Anda di halaman 1dari 13

TAKE HOME EXAMINATION

Stimulasi produksi Taxol tanaman Taxus cuspidata var. Nana menggunakan kultur
kalus dengan stimulan oligosakarida

Disusun Oleh :
HILDA SRIAVALIANA
ILHAM K11016R091

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA

2017

A. PENDAHULUAN

Kyaraboku, Taxus cuspidata var. nana dengan daun-daun gelap, linier dan

selalu hijau adalah pohon kebun yang popular di Jepang (Uehara, 1969).
Kyaraboku adalah variasi kerdil dari ichii, Taxus cuspidata. Peneliti telah

meneliti ekstraksi dari daun-daun T. cuspidata var. nana dan mendapati bahwa

ada kandungan taxol, meskipun dalam jumlah kecil (Tachibana et al, 1994a).

Taxol, adalah suatu diterpene alkaloid yang pada awalnya diisolasi dari kulit

batang pohon Taxus brevifolia oleh Wani et al., (1971), mempunyai aktivitas

sitotoksik yang kuat terhadap kanker payudara, kanker ovarium, kanker lambung,

dan tipe-tipe kanker lainnya (Gelmon, 1994). Oleh karena itu, agar taxol dapat

dimanfaatkan sebagai sumber T. cuspidata var. nana, produksinya perlu

ditingkatkan.

Pada saat ini, sumber komersial taxol adalah kulit batang Taxus brevifolia,

yang tumbuhnya lambat dan menghasilkan jumlah taxol yang relative sedikit.

Banyak usaha telah dilakukan untuk memproduksi taxol dengan sintesis kimiawi

(Nicolaou et al., 1994; Holton et al., 1994ab), sintesis simi kimiawi (Holton, et al.,

1995), kultur jaringan tanaman (Fatt-Neto et al., 1992 993,1 994a, 1994b;

Wickremesinhe et al., 1 993; Tachibana et al., 1994b; Ketchum et al., 1995; Wang

et al., 1997; Son et al., 2000; Zhang dan Xu, 2001) dan fermentasi (Sierle, et al.,

1993; Strobe et al. 1996). Namun, sintesis kimiawi membutuhkan banyak langkah

(lebih dari 20) dan hasil totalnya sangat rendah. Metode-metode yang paling

menjanjikan untuk produksi skala besar taxol tampaknya adalah sintesis semi

kimiawi dan kultur jaringan tanaman.

Produksi taxol telah dilaksanakan dengan kultur kalus Taxus cuspidata

(Fett-Neto eta al, 1992, 1993, 1994a, 1994b), T. cuspidata var. nana (Tachibana et

al., 1994b), T. cuspidata and T. media (Furmanowa et al., 2000) dan empat Taxus

spp. (Wickremesinhe et al., 1993). Namun, telah belum ada laporan mengenai
efek-efek stimulasi atau perangsangan terhadap produksi taxol pada perlakuan

dengan oligosaccharides dalam kultur-kultur kalus Taxus spp. Oleh karena itu,

peneliti meneliti produksi taxol dalam kultur-kultur kalus Taxus cuspidata var.

nana dan efek oligosakadrida terhadap produksi tersebut.

B. PRINSIP / PENDEKATAN BIOTEKNOLOGI YANG DIGUNAKAN

Untuk menghasilkan taxol dari kultur-kultur jaringan Taxus cuspidata var.

nana. Titik leleh taxol ditentukan dengan alat Yanagimoto MP micro

melting point dan tidak dikoreksi. Data FDMS diperoleh dengan Jeol

JMS-700 mass spectrometer. Taxol otentik dibeli dari Sigma Chemical

Company serta diisolasi dari daun-daun T. cuspidata var. nana (Tachibana

et al., 1994a). Chitosan dan sigal laminaran dibeli dari masing-masing

Seikagaku Kogyo Ltd. and Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd. Tunicase

diperoleh dari Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Chito-

oligosaccharides otentik (glucosamine sampai chitoheptaose sebagai

masing-masing hydrochloride) dan polyvinylpyrrolidon diperoleh dari

Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

Induksi dan pembiakan kalus dari T. cuspidata var. nana. Kalus

dihasilkan dari tangkai-tangkai steril T. cuspidata var. nana pada ketiga media

yang ditambah dengan 2,4-D (4.0 mg/L) and kinetin (0. 5 mg/L) yang dipadatkan

dengan agar (0,9%) dalam suasana gelap. Tidak ada kalus yang terbentuk dalam

media yang tidak mempunyai regulator pertumbuhan. Masing-masing kalus

dibentuk dalam 20 hari kultur pada tiga media tersebut. Kalus-kalus tersebut

umumnya tampak berwarna putih sampai coklat kekuningan. Tingkat kontaminasi


selama inisiasi dalam masing-masing media adalah kurang lebih 40% untuk

jaringan tumbuan yang ditanam dikebun. Kecepatan terbesar pertumbuhan

masing-masing kalus adalah pada media SH diikuti oleh media B5 (85% dari

media SH), dan kemudian, media MS (45% dari kecepatan di media SH). Fett-

Neto et al (1992, 1993) dan Son et al. (2000) melaporkan bahwa kalus-kalus

dihasilkan dari T. cuspidata pada media B5. Wang et al., (1997) dan Zhang et al.,

(2001) menumbuhkan kalus-kalus dari T. chinesis pada media MS.

Wickremesinhe et al., (1993) menumbuhkan kalus dari Taxus spp., pada media

SH. Namun, perbandingan kecepatan pertumbuhan pada masing-masing kalus

yang ditumbuhkan pada tiga media (B5, MS dan SH) tidak dilakukan. Dari hasil-

hasil yang diperoleh di sini, peneliti menemukan bahwa ada perbedaaan dalam

kecepatan pertumbuhan masing-masing kalus yang ditumbuhkan pada ketiga

media tersebut.

Untuk menemukan konsentrasi optimum 2.4-D dan kinetin untuk

pembiakan kalus yang beradal dari tangkai-tangkai tersebut, tiga kombinasi [(A)-

(B)] dari masing-masing regulator pertumbuhan ditambahkan ke media B5. Hasil-

hasilnya diperlihatkan dalam Tabel 1. Kalus yang ditumbuhkan dengan kombinasi

C adalah yang paling besar dalam tiga kombinasi tersebut (Tabel 1). Kalus

meningkat 9,7 kali lipat selama 50 hari. Dari hasil-hasil yang diperoleh disini,

konsentrasi optimum 2,4-D dan kinetin untuk pembiakan kalus tersebut masing-

masing adalah 4,0 dan 0,5 mg/L. Disamping itu, media B5 yang ditambah dengan

2,4-D dan kinetin mendukung pertumbuhan tanpa regenerasi. Pembuatan

subklutur pada media ini menuntun ke penurunan pembiakan kalus setelah lima
kultur dan pada akhirnya, pembiakan tersebut berhenti sama sekali setelah sepuluh

kultur.

Dalam paper sebelumnya, Tachibana et al., (1994) melaporkan bahwa kalus

ditumbuhkan dari T. cuspidata var. nana pada media MS yang ditambahi dengan

2,5-D dan kinetin. Konsentrasi optimum 2,4-D dan kinetin untuk pembiakan kalus

tersebut masing-masing adalah 4,0 dan 0,5 mg/L. Pertumbuhan kalus meningkat

kira-kira 4 sampai 5 kali lipat selama 30 hari. Namun, kalus yang ditumbuhkan

pada media MS menjadi berwarna coklat setelah tiga subkultur dan pertumbuhan

berhenti sama sekali setelah lima subkultur.

Produksi taxol dengan T. cuspidata var. nana. Jumlah taxol dalam masing-

masing kalus yang berasal dari tangkai-tangkai pada ketiga media diperlihatkan

dalam Gambar 1. Taxol dalam kalus yang berasal dari tangkai-tangkai pada media

B5 adalah 0,084% dari berat kering, ketika dibandingkan dengan 0,061% untuk

tangkai utuh. Taxol yang berasal dari tangkai-tangkai pada media MS dan media

SH, masing-masing, 0,073% dan 0,029% . Jumlah taxol dalam kalus yang berasal

dari tangkai pada media B5 kurang lebih 1,4 kali lebih tinggi daripada yang

terdapat dalam tanaman utuhnya. Disamping itu, tidak ada taxol yang ditemukan

dalam tiga media agar. Dalam paper sebelumnya, Tachibana et al (1994)

melaporkan bahwa kandungan taxol dalam kalus yang berasal dari tangkai T.

cuspidata var. nana dengan menggunakan media MS adalah hampir sama dengan

yang ada dalam tanaman utuh, meskipun jumlah taxol yang dihasilkan oleh kultur

kalus dalam media MS adalah adalah lebih rendah daripada di media B5 seperti

yang disebutkan di atas. Fett-Neto et al., (1992) melaporkan bahwa kandungan

taxol yang dihasilkan oleh kultur-kultur kalus T. cuspidata dalam media B5 adalah
hampir sama dengan yang ada dalam tanaman utuh. Hasil-hasil yang diperoleh di

sini hampir konsisten dengan hasil-hasil sebelumnya yang didapatkan oleh Fett-

Neto et al., (1992) dan Tachibana et al., (1994). Berdasarkan pada kecepatan

pertumbuhan dan hasil taxol, media B5 dianggap sebagai yang terbaik untuk

produksi taxol dengan kultur kalus dari T. cuspidata var. nana. Karena kandungan

taxol meningkat dengan kultur kalus T. cuspidata var. nana, dianggap bahwa

produksi taxol dengan kultur tersebut dapat ditingkatkan melalui beberapa

metode, misalnya, perlakuan dengan elicitor.

Effek oligosaccharides terhadap produksi taxol dalam kultur kalus T.

cuspidata var. nana: Produksi taxol dirangsang secara signifikan ketika COS

ditambahkan ke kalus tersebut (Gambar 2). Produksi tersebut dirangsang 5,1 kali

lipat dibandingkan dengan kontrol (tidak ada COS) ketika 1 mg COS

ditambahkan ke kalus segar (1 G) dan campuran tersebut diinkubasi pada media

B5 selama 15 hari pada suhu 25oC dalam gelap.

Efek LOS terhadap produksi taxol diberikan di Gambar 3. Stimulasi atau

perangsahan produksinya kurang menonjol pada perlakuan dengan LOS daripada

dengan COS, yang hanya meningkat 1,2 kali lipat daripada kelompok kontrol

(tidak ada LOS).

Hasil-hasil tersebut memperlihatkan COS merangsang produksi taxol

dalam kultur kalus T. cuspidata var. nana. Ini adalah laporan pertama mengenai

stimulasi produksi taxol dalam kultur kalus Taxus spp. yang diberi perlakuan

dengan oligosaccharides. Disamping itu, Furmanowa et al., (2000) melaporkan

bahwa chitosan (polimer dari glucosamine) meningkatkan hasil taxol sebesar 1,5

kali lipat dalam kultur kalus T. media. Mereka juga melaporkan bahwa produksi
taxol tidak meningkat dalam kultur kalus T. cuspidata yang diberi perlakuan

dengan chitosan.

Muranaka et al., (1998) melaporkan bahwa produksi podophyllotoxin dalam

kultur kalus Junperus chinensis dirangsang kurang lebih 15 kali lipat ketika COS

ditambahkan. Kobayashi et al., (1993) melaporkan bahwa LOS mempunyai

aktivitas elicitor dan merangsang produksi senyawa antijamur dalam alfalfa.

Namun, dalam kasus kultur kalus T. cuspidata var. nana, efek LOS terhadap

produksi taxol kurang dari efek terhadap senyawa antijamur dalam alfalfa.

Muranaka et al., (1998) menemukan bahwa produksi produksi podophyllotoxin

oleh kultur kalus J. chinensis dirangsang kurang lebih 3,5 kali lipat ketika LOS

ditambahkan. Dalam kasus kultur kalus T. cuspidata var. nana, perangsangan

produksi taxol dengan perlakuan LOS adalah 2,9 kali lebih rendah dari

perangsangan produksi podophyllotoxin. Hasil-hasil tersebut menunjukkan bahwa

COS dan LOS bertindak sebagai elicitor, meskipun deraja pengaruhnya terhadap

produksi taxol bisa bervariasi.

Senyawa aktif dalam chito-oligosaccharides yang merangsang

produksi taxol. Produksi taxol dirangsang secara signifikan ketika Fr. 5

ditambahkan (Gambar 4). Produksi tersebut meningkat kurang lebih 5,7 kali

daripada kelompok kontrol (tidak ada COS) ketika 1 mg Fr. 5 ditambahkan ke

kalus segar (1 g). Fr. 5 dianalisis lebih lanjut dengan HPLC. Komposisi Fr. 5

diperlihatkan dalam tabel 2. Konstituen utamanya adalah chitotriose, chitotetraose

dan chitoheptaose.

Efek masing-masing konstituen dalam Fr. 5 terhadap perangsangan produksi

taxol dalam kultur kalus diteliti dan hasil-hasilnya diperlihatkan dalam Gambar 5.

Produksi meningkat kurang lebih 8,2 kali lipat dibandingkan dengan kontrol
(tidak ditambah chito-oligosaccharide) ketika 1 mg chitoheptaose ditambahkan ke

kalus segar (1 g). Hasil-hasil etrsebut memperlihatkan bahwa chitoheptaose

adalah senyawa yang paling aktif dalam COS untuk perangsangan produksi taxol.

Tidak ada laporan mengenai perangsangan produksi taxol dalam kultur kalus

Taxus spp. yang diberi perlakuan dengan chitoheptaose. Peneliti juga menemukan

bahwa chitoheptaose merangsang produksi taxol dalam kultur suspense sel T.

cuspidata var. nana. Hasil-hasilnya akan dipublikasikan di masa datang.

C. METODE / APLIKASI TEKNOLOGI

Bahan tumbuhan, media kultur jaringan. Tangkai segar pohon T.

cuspidata var. nana yang ditanam dikebun digunakan sebagai bahan explant.

Tangkai-tangkai tersebut dikumpulkan pada bulan Mei 1999 masing-masing dari

Ehime Prefectural Garden Center yang terletak di kota Shigenobu, Ehime, Jepang

dan dari kebun rumah yang terletak di daerah pinggiran kota Matsuyma, Ehime,

Jepang.

Media Murashige-Skoog (MS) (Murashige dan Skoog, 1962), Gamborg's

B5 (Gamborg et al., 1968) and Schenk-Hildebrandt (SH) (Schenk dan

Hildebrandt, 1972) disiapkan. Dalam kasus media MS dan SH, kandungan

sukrosa adalah 30 g/l. Dalam kasus B6, kandungan sukrosa adalah 20 g/l. pH

ketiga media tersebut disesuaikan menjadi 5,6. Regulator pertumbuhan yang

ditambahkan ke masing-masing media adalah 2,4 D (4.0 mg/L) and kinetin (0,5

mg/L). Asam casamino (1,0 g/L dan polyvinylpyrrolidone (15 g/L) juga

ditambahkan. Media tersebut dipadatkan dengan agar 0,9% W/V.


Inisiasi Kalus dan Kultur. Explant disterilisasi melalui merendamnya

dalam ethanol 70% selama beberapa menit dan dengan mencelupkannya dalam

sodium hypochloride (1% active chlorine) selama 20-30 menit dengan

pengadukan pelan diikuti pencucian tiga kali dengan air steril. Jaringan yang

rusak dibuang dan ruas-ruas tangkai atau batang tersebut dipindahkan ke dalam

masing-masing media yang disterilisasi tersebut.

Explant ditempatkan di atas permukaan media agar yang dipadatkan (30 ml)

ditambah dengan 2,4 kinetin dan asam casamino dalam tabung Erlenmeyer, atau

pada 20 ml media yang dipadatkan dalam cawan petri 9 cm. Cawan petri ditutup

dengan Nescofilm. Kultur-kultur dipertahankan pada suhu 25o dalam gelap.

Kalus-kalus (kurang lebih berat segarnya 1 g) yang terbentuk dipindahkan ke

tabung Erlenmeyer 200 ml yang masing-masing berisi 70 ml media B5 yang

ditambah dengan regulator pertumbuhan, asam casamino (1,0 g/L) dan agar

(0,9%). Guna mendapatkan konsentrasi optimal pada regulator-regulator

pertumbuhan untuk pembiakan kalus, kombinasi (A)-(C) dua jenis regulator

pertumbuhan ditambahkan ke media B5. Kombinasi tersebut adalah (A): 2,4 D

(12,0 mg/L) dan kinetin (1,5 mg/L); (B): 2,4 D (8.0 mg/L) dan kinetin (4,0 mg/L)

dan (C): 2,4 D (4.0 mg/L) dan kinetin (0,5 mg/L). Kultur-kultur tersebut dijaga

pada suhu 25o dalam gelap selama 30 hari. Semua kalus disimpan pada suhu 25 o

dan secara rutin disubkulturkan pada media B5 padat agar segar yang ditambah

dengan 2.4-D (4,0 mg/L) dan kinetin (0,5 mg/L setiap 30 hari pada suhu 25o

dalam gelap.
Berat segar kalus diukur secara langsung dan berat kering setelah

pengeringan beku jaringan. Kecepatan pertumbuhan dikalkulasi dari peningkatan

berat kalus dibandingkan dengan waktu inkubasi (hari).

Ekstraksi dan isolasi. Kalus segar (61,7g, berat kering 8,02g) yang

disubkulturkan tiga kali pada media B5 dikering-bekukan selama 5 hari,

dihaluskan dengan penumbuk dan diekstraksi dua kali dengan methanol dan air

(1,1 W/V) [100 ml] selama 4 hari pada suhu kamar. Ekstrak yang dihasilkan

kemudian dipekatkan dibawah tekanan yang berkurang dan dipisahkan antara

dicloromethana dan air (1:1 W/V). Lapisan dichloromethane dikeringkan dengan

Na2S04 dan diuapkan untuk menghasilkan larutan dichloromethane (0,54g).

Larutan-larutan dichloromethane tersebut kemudian diperlakukan dengan

kromatografi lapisan tipis secara berulang diikuti dengan pengkristalisasian

kembali dari methanol dan air untuk menghasilkan taxol sebagai kristal-kristal

tanpa warna (0,8 mg), m.p. 213- 215C. Taxol yang diisolasi ini ditegaskan

sebagai identic dengan taxol otentik (titik leleh campuran dan perbandingan

spectrum massa). FDMS m/z (rei. int.): 854 [M++Hl (73), 853 [M+] (12), 836 (7),

794 (15),568 (16), 211 (21), 210 (100), 105 (12), 61 (5), 43 (6).

Kromatografi Lapis Tipis. KLT preparasi dilaksanakan dengan

menggunakan 1 mm lapisan gel silica (preparative) (Merck Kiesel gel G F254).

Taxol ditempatkan dekat sinar UV dan dengan menyemprotnya dengan potassium

dichromate dalam asam sulfur 40%, kemudian memanaskannya dengan pemanas

udara panar (McLaughlin et al., 1981).

Efek media terhadap pertumbuhan kalus dan produksi taxol dalam

kalus. Berat segar kalus yang diinduksi pada media MS, B5 dan SH ditentukan
setiap sepuluh hari selama periode 60 hari. Taxol diekstraksi dari kalus yang

berasal dari tangkai-tangkai T. cuspidata var. nana dengan metode Witherup et al.

(1990). Masing-masing kalus dikering-bekukan, ditumbuk dan diekstraksi dengan

dengan methanol dan air (1:1 v/v) selama satu minggu pada suhu kamar. Ekstrak-

ekstrak yang dihasilkan diuapkan in vacuo guna menghasilkan residu-residu

mentah. Residu-residu mentah tersebut kemudian dipisahkan antara

dichloromethane dan air (1:1 v/v) untuk menghasilkan larutan dichloromethane.

Jumlah taxol dalam larutan dichloromethane tersebut ditentukan dengan HPLC

yang dilaksanakan pada kolom fase terbalik (Supelcosil TM LC F) dalam

Shimadzu LC 1OA liquid chromatograph yang diperlengkapi dengan detector UV

(ultraviolet) (panjang gelombang: 227nm) melalui isocratic elution dengan fase

mobile acetonitrile - tetrahydrofuran - water (17: 28: 55 v/v). Kecepatan aliran

adalah 1,5 ml/menit, dan semua chromatograms diatur pada maksimum

absorbansi taxol, 227nm. Larutan dichloromethane dilarutkan dalam 5 ml

methanol, dan 10l larutan tersebut diinjeksikan ke dalam kolom. Taxol dalma

larutan dichloromethane diidentifikasi dengan membandingkan waktu retensinya

dengan waktu retensi taxol otentik yang diisolasi dari T. cuspidata var. nana

(Tachibana et al., 1994a) dan melalui membandingkan spectrum massanya dengan

spectrum massa taxol otentik. Untuk perbandingan dengan kandungan taxol dalam

kalus yang dikulturkan, tangkai-tangkai utuh diekstraksi secara serupa dan

diperlakukan dengan analisis HPLC.

Pembuatan oligosaccharides melalui hidrolisis parsial chitosan dan

algal laminaran. Chito-oligosaccharides (COS) disiapkan melalui hidrolisis

parsial chitosan menurut metode Kikkawa et al., (1990). Laminaran-


oligosaccharides (LOS) dibuat dari algal laminaran dengan tunicase menurut

metode Kobayashi et al., (1993).

Fraksinasi dan analisis chito-oligosaccharides: Chito-oligosaccharides

dipisahkan menjadi 8 fraksi (Fr. 1 Fr. 8) dengan ion-exchange chromatography

(Dowex 50W-X8H) dengan gradient air dan asam hydrochlorat encer (dari 1, 15N

HCI sampai 4,1 ON HCI). Masing-masing fraksi dinetralisasikan dengan ion-

exchange resin (Amberlite, IRA-410) dan dikeringkan in vacuo untuk

menghasilkan residu. Fr. 5 dianalisis dengan HPLC yang dilaksanakan pada suhu

30o dalam reverse-phase column (Asahipak NH2P-50) menggunakan Shimadzu

LC-1 OA liquid chromatograph yang dilengkapi dengan 1OOmM

tetrapropylammonium hydroxide (pH 10) acetonitrile (30: 70 v/v). Kecepatan

aliran adalah 1,0ml/menit. Fr. 5 dilarutan dalam 1 ml air, dan 10l larutan tersebut

diinjeksikan ke dalam kolom. Konstituen-konstituennya (glucosamine sampai

chitoheptaose) dalam Fr. 5 diiidentifikasi melalui membandingkan waktu

retensinya dengan waktu retensi chito-oligosaccharides otentik (glucosamine

sampai chitoheptaose) dan melalui menambahkan sampel-sampel otentik. Kurva

kalibrasi diperoleh dengan menggunakan authentic chito oligosaccharides.

Perlakuan terhadap kalus dari T. cuspidate oligosaccharides var. nana

dengan oligosaccharides: Chito-oligosaccharides dan laminaran oligosaccharides

digunakan. Satu milliliter larutan encer chito-oligosaccharides (0,5mg, 1,0mg dan

5,0mg), masing-masing fraksi dipisahkan dengan ion-exchange chromatography

(1,0mg), dan sampel-sampel standar (glucosamine sampai chitoheptaose) (1,0 mg)

ditambahkan ke kalus segar (1g). Setelah penambahan senyawa-senyawa tersebut,

kalus diinkubasi selama 15 hari pada suhu 25oC dalam gelap. Sejumlah taxol
dalam kalus-kalus tersebut diperlakukan diberi perlakuan dengan chito-

oligosaccharides, masing-masing fraksi dipisahkan dengan menggunakan ion-

exchange chromatography, sampel-sampel standar (glucosamine sampai

chitoheptaose) dan laminaran-oligosacharrides ditentukan seperti digambarkan di

atas. Masing-masing eksperimen diulangi secara sendiri-sendiri sebanyak 3 kali

dan hasil-hasil yang diperlihatkan adalah rata-rata tiga pengukuran, penyimpangan

masing-masing nilai eksperimen berada dalam 13%.

DAFTAR PUSTAKA

Yoshida M. Et al. 2002. Stimulasi Produksi Taxol oleh Oligosaccharides


dalam Kultur Kalus Taxus cuspidata Var. Nana. Pakistan Journal of
Biotechnologi Science