FACULTAD DE ZOOTECNIA
BIOTECNOLOGIA REPRODUCTIVA
CONGELAMIENTO DE SEMEN DE CONEJO A 3500 M.S.N.M
GRUPO: CONEJOS
ALUMNOS:
- LOZANO FERNANDEZ JACK
- NUEZ DE LA CALLE JULIAN
- PAUCAR HUAMAN STHEFANI
- RUIZ TERRONEZ JHOSSELYN
DOCENTE:
- Ing. SAUL ESPINOZA
1
INDICE
Resumen pg. 3
Introduccin pg. 4
I. Marco terico pg. 5
1.1 Antecedentes pg. 5
1.2 Caractersticas del semen de conejo pg. 5
1.3 Factores que determinan el xito en la congelacin del semen. pg. 7
1.4 Crioprotectores pg. 10
1.5 Factores que determinan el fracaso en la congelacin del semen. pg. 12
1.6 Almacenamiento. pg. 14
1.7 Usos y beneficios. pg. 15
1.8 Fisiologa de la reproduccin en conejas. pg. 16
1.9 Productos comerciales utilizados en la ovulacin. pg. 17
1.10 Celo de la coneja pg. 19
1.11 Ovulacin. pg. 19
1.12 Sistema de induccin a la ovulacin en conejas. pg. 19
1.13 Diluyente natural utilizado en la inseminacin. pg. 20
1.14 Carbetocina aadido al agua de coco. pg. 22
1.15 Diluyente utilizado en inseminacin artificial pg. 25
1.16 Procedimiento a la inseminacin artificial en coneja pg. 27
II. Objetivos pg. 30
III. Material y mtodos pg. 30
IV. Resultados y discusin pg. 33
V. Conclusiones pg. 33
VI. Referencias bibliogrficas pg. 34
2
RESUMEN:
SUMMARY:
Rabbit semen training, collection and evaluation were carried out during May,
June and July of 2017, from samples of three males, the first male was trained
and loaned from the Yauris (GAY) farm, while That the second specimen was
borrowed from a family breeding and finally the third male was bought by the
group from a market, the characteristic of these three selected males were;
Who were already in sexual maturity and who were complete males. Its
objective was to determine the microscopic characteristics: concentration,
motility, percentage of live and dead and percentage of abnormalities. And thus
proceeding to the freezing of semen, by straws.
3
INTRODUCCION:
4
I.- MARCO TEORICO
1.1.- ANTECEDENTES:
5
El semen del conejo a diferencia de otras especies resiste ms el shock
trmico. Esto es atribuido a su alto contenido de colesterol y fosfolpidos. Estos
componentes seminales son esenciales para mantener la estructura celular de
la membrana espermtica (AbdelGhaffar, 1995; Castellini, 2003).
(Zrate, 2002).
Plasma Seminal
Fructuosa (ml/100 ml) 40150
Sorbitol (ml/100 ml) 80
cido ctrico (ml/100 ml) 70200
Protena (ml/100 ml) 415
Glyserolfosforicolina (ml/100
ml) 215370
(Zrate, 2002).
6
1.3.- FACTORES QUE DETERMINAN EL XITO EN LA CONGELACIN DEL
SEMEN.
7
Factores que ayudan a la criopreservacin exitosa de semen.
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1.3.4.-Solucin de citrato.
Trisbuffer. 3.029 g.
cido ctrico monohidratado. 1.675 g.
Dglucosa monohidratada. 1.250 g.
Agua destilada. 85 ml.
Albmina de huevo. 20 ml.
Penicilina Gsdica. 100000 U.I.
Estreptomicina, sulfato. 0.1 g.
DMSO. 20 ml.
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(Vargas, 2002; Zrate, 2002).
1.4.- CRIOPROTECTORES.
Durante el proceso de congelacin, las sustancias crioprotectoras son
esenciales para disminuir el dao espermtico ocasionado por el descenso de
temperatura, ya que estos remplazan el agua intracelular durante la
congelacin, permitiendo que el fluido intracelular pueda ser superenfriado a
temperaturas entre 5 y 15 C sin que ocurra la formacin de cristales de
hielo, debido a que estas sustancias disminuyen el punto de congelacin por
medio de la reduccin en la interaccin entre las molculas de agua. Por su
parte, la velocidad del enfriamiento puede determinar un mayor o menor efecto
de la congelacin sobre la viabilidad espermtica (Cruz, 2006).
1.4.1.- Glicerol.
Bernstein y Petropavlovsky fueron los primeros en describir el uso del Glicerol
al 9.2% como solucin crioprotectora en semen de conejo (Pesch, 2007). El
descubrimiento esta accin crioprotectora del glicerol, permite congelar los
espermatozoides con ayuda de agentes potenciales crioprotectores, el glicerol
ha permanecido sin excepcin como el mejor crioprotector en todas las
especies (Crabo, 2001; Castle, 1997).
10
provee un efecto similar en el semen de sementales como el glicerol
(Vidament, 2002).
Agente crioprotector.
Descongelado. Espermtica.
1.
0 M glicerol. 17.0 3.3 % 17.0 2.6 %
1.
0 M lactamida. 37.8 3.0 % 35.9 3.3 %
1.
0 M acetamida. 28.3 3.8 % 30.2 3.0 %
1.0 M DMSO. 25.3 3.5 % 27.0 2.4 %
(Kashiwazaki, 2006).
11
1.5. FACTORES QUE DETERMINAN EL FRACASO EN LA CONGELACIN
DEL SEMEN.
1.5.1. Congelacin.
12
(lisada), esto hace que pierdan la integridad de la membrana celular (Castle,
1997; Chen, 1989; Navarro, 2004; Cruz, 2006), alteracin del metabolismo
espermtico y prdida de la motilidad, factores que afectan la capacidad
fecundante del semen (Stornelli, 2006; Green, 2001).
1.5.2.Crioprotectores.
El grado de toxicidad del crioprotector y su velocidad de difusin a travs de la
membrana plasmtica, dependen de la temperatura a la cual son incorporados
a la solucin de semen y del tiempo de exposicin celular. Esta difusin puede
verse afectada por el descenso de la temperatura, ya que durante este proceso
la membrana celular aumenta la proporcin de colesterol con el propsito de
lograr mayor estabilidad mecnica; sin embargo, este aumento del colesterol
tambin disminuye la permeabilidad de la membrana a pequeas molculas,
pudiendo afectar la penetracin del crioprotector en la clula de una manera
efectiva (Cruz, 2006).
1.5.3.Cambios de temperatura.
Se considera que el principal sitio de dao asociado a los cambios de
temperatura son las membranas espermticas. La reduccin de la fertilidad
asociada al semen congelado es atribuida en gran parte a la alteracin de la
estructura y funcin de las membranas durante los procesos de refrigeracin,
congelacin y descongelacin. Para poder interactuar con el ovocito, los
espermatozoides deben estar vivos, motiles y poseer las membranas
plasmtica y acrosomal intactas y funcionales (Stornelli, 2006).
Los procesos de congelacindescongelacin resultan en reduccin de la
fertilidad del semen criopreservado si lo comparamos con el semen fresco.
Este hecho es el resultado tanto de la prdida de viabilidad espermtica
(poblacin de espermatozoides muertos) como de las alteraciones funcionales
instauradas en la poblacin sobreviviente (Stornelli, 2006).
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1.5.4.Dao acrosomal
Los procesos de criopreservacin afectan la integridad acrosmica. El
acrosoma debe estar intacto en el momento de la inseminacin debido a que la
reaccin acrosmica debe ocurrir en el sitio donde ocurra la fertilizacin. La
morfologa acrosmica puede ser observada mediante microscopio de
contraste de fase, microscopio electrnico de transmisin, lectinas marcadas
con sustancias fluorescentes y anticuerpos monoclonales (Stornelli, 2006;
Gravance, 1998; Royere, 1996; Zekariya, 2006).
1.6.- ALMACENAMIENTO.
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El almacenamiento de nitrgeno lquido fue tambin un problema porque el
aislamiento de los tanques era ineficiente. La recarga frecuente era requerida
para mantener una temperatura segura de 196 C.
15
La utilizacin de semen congelado para la inseminacin artificial es una
herramienta comnmente usada en el ganado actual (Gravance, 1998).
16
1.8.1.- Hipotlamo.
Composicin.
17
Indicaciones.
18
1.10.- CELO DE LA CONEJA.
1.11.- OVULACIN.
Con el coito se estimula, que tendr lugar al cabo de 10-12 horas del
acoplamiento sexual. La ovulacin puede asimismo provocarse por medios
artificiales, mediante estmulos vaginal inducido por la monta de un macho
castrado, mediante vibraciones vaginales elctricas, o con hormonas
gonadotrofinas. Estos mtodos son los ms usados para efectuar la
inseminacin artificial.
La ovulacin vara con la edad, con los factores genticos y con el estado
fisiolgico del animal, as como de la gestacin.
19
cuenta con dos vas: va aferente-nerviosa, que se trasmite por estmulos
provocados por el coito al SNC y la otra aferente-hormonal que enva la
seal del SNC al ovulo, produciendo la ovulacin.
20
Cuadro Composicin del agua de coco
1.13.2.- Azcares.
21
1.13.3.- Minerales.
1.13.4.- Protena.
1.13.5.- Vitaminas.
22
tambin en el tero. Contiene carbetocina la cual posee efectos estimulantes
en el msculo liso del tero, se traduce en contracciones ms potentes;
selectivos, constantes y de larga accin que se sugieren que dicho
octapptido, a diferencia de las oxitcina poli pptidas, posee una funcin
hormonal verdadera en dicho rgano.
1.15.1.- Diluyente.
23
Por otra lado, el efecto de dilucin lleva a que determinados compuestos
presentes en el plasma seminal estn en muy bajas concentraciones en el
semen diluidos y alteren la viabilidad espermtica, como por ejemplo la
reduccin de la concentracin de K+ (Harrison et al., 1978), o de protenas
plasmticas. Ests perdidas deben compensarse con la adecuada
formulacin del diluyente, as por ejemplo la adicin de albmina srica
bovina (BSA), ya que se ha demostrado que esta adicin estimula la
motilidad y mejora las tasas de fertilidad del semen conservado.(Jorda, M.
2011)
1.15.3.- Nutrientes.
25
plazo son propios de estructuras como las presentes en los USA o Noruega
donde las distancia entre el lugar de produccin seminal y el lugar donde va
a ser utilizado es grande.
Las ventajas que aportan los diluyentes de larga duracin son la posibilidad
de transporte a largas distancias, permiten realizar pruebas diagnsticas
sobre el semen antes de ser utilizadas, como pruebas mediante tcnicas
PCR (Polymerase Chain Reaction) para detectar la presencia de diversos
virus o anlisis completos de la calidad seminal, permite una mejor
organizacin de las tareas en los centros de recogida seminal y facilita en
gran medida la distribucin de las muestras a las granjas de
reproduccin.(Alvuto, J. 2000)
26
1.15.7.- Diluyente utilizado.
Especfico
para la conservacin de semen fresco o refrigerado de conejo
desarrollado por el Dpto. de I+D+i
Libre de protenas de origen animal.
Contiene antibiticos segn la Directiva del Consejo Europeo 90 429 CEE.
El cuerpo de la vagina (tubo PVC) est recubierto en su interior por una capa
de gomaespuma. Dentro del cuerpo de la vagina se coloca el ltex formando
una cmara aislada donde se coloca el agua caliente, de manera tal que el
agua nunca tome contacto con el semen. En el extremo posterior del tubo
rgido se coloca un tubo colector graduado para la recoleccin del semen.
Como lubricante se utiliza vaselina.
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1.16.4.- Tcnica para la inseminacin Artificial.
agua destilada y
Lavar todo el material utilizado con detergente, luego
posteriormente alcohol cada vez que se lo utiliza.
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II.- OBJETIVOS
Objetivo general:
- El objetivo del presente proyecto fue la congelacin del semen del conejo
a 3500 msnm atreves de un mtodo convencional.
- Obtener buenos resultados en la congelacin de semen, para poder
inseminar a las conejas de la Granja Agropecuaria Yauris.
Objetivos especficos:
- Diagnosticar preez en las conejas de la Granja Agropecuaria de Yauris.
- Recolectar semen en conejos usando distintos mtodos.
- Evaluacin del semen extrado del conejo.
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- Cuerpo rgido (parte fundamental) de plstico (jeringa de 20 ml).
- Revestimiento interno o camisa. En este caso usamos globos previamente
desinfectados (2).
- Colector de eyaculado. Un tubo de ensayo de 3 a 5 ml.
- Para sujetar los globos a la jeringa se us ligas gruesas (para amarrar cada
extremo).
El cuerpo que es la jeringa (material rgido) con dos aberturas terminales; se
pas el globo por el medio y se sujet en ambos extremos, se pas el segundo
globo con un lado sujetado y el otro unido al tubo de ensayo, dejando una
abertura que permiti la entrada del pene del animal y la eyaculacin. La
jeringa tena un orificio por el cual permiti el ingreso de agua caliente y aire.
Al no obtener respuesta de los machos por el estrs ocasionado por la llevada
al INIA e IVITA, se opt por la castracin de un reproductor y extraer
espermatozoides de la cola del epiddimo.
En la castracin (intervencin quirrgica) se us:
- Bistur
- Guantes de ltex
- Yodo a discrecin
- Pinzas de sujecin
- Algodn
- Hilo de sujecin
- Lidocana
Se coloc al conejo con el vientre arriba, se busc los testculos y se procedi a
realizar el corte superficial (escroto), se cort la segunda capa () y se aplasto
hasta sacar el testiculo, una vez sacado todo () se hizo un nudo a los
conductos espermticos y se le aplico yodo en las heridas, as como 0.5 ml de
lidocaina.
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sobre vapor de nitrgeno lquido (- 104C) a 5 cm del nitrgeno lquido, antes
de sumergir las pajuelas de 0,25ml en nitrgeno lquido (-196C).
Para la descongelacin del semen se sumergieron las pajuelas durante 10-15
segundos en un bao de agua caliente, atemperado a 38C.
3.5.1. Movilidad:
Movilidad y parmetros cinticos del eyaculado y del semen antes de congelar
y post descongelacin: se valor la movilidad individual, tomando una gota del
semen diluido y colocndolo en un porta objetos calentado (38C), se coloc en
un microscopio binocular y se observ 40 60 y 100X.
3.5.2. Vivos - muertos:
Se realiz mezclando una gota del semen diluido con la tincin de eosina-
negrosina, se mezcl y se realiz un frotis; se observ en un microscopio
binocular a 100 X.
n de espermatozoides anormales x
Porcentaje de morfo anomalas = 100 n total de espermatozoides
contados
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IV. RESULTADOS Y DISCUSIN:
Movilidad:
60% al diluirlo
40% a 5C
20% despus e la congelacin
VIVOS MUERTOS:
50% AL DILUIRLO
30% DESPUES DE CONGELAR
ANALISIS DE ANORMALIDADES:
40%ANTES DE CONGELAR
40% DESPUES DE CONGELAR
4.1. Caractersticas del semen diluido del extrado de la cola del epiddimo
del macho raza california:
No se pudo observar ya que el semen del conejo sacado de la cola del
epiddimo era en mnima cantidad.
V. CONCLUSIONES
33
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
34
ANEXOS
35
PROCEDIMIENTO ENTRENAMIENTO
DE LA DEL MACHO
COLECCIN DE
MEDIANTE MADURO Y
SEMEN EN UNA VAGINA COMPLETO Y
CONEJOS ARTIFICIAL COLECCIN EN SU
PROPIA JAULA.
MEDIANTE LA
CASTRACION, NO SE PUDO
EXTRACCION CONCLUIR CON
DEL SEMEN INSEMINACI EL SEMEN DEL
DE LA COLA ON CONEJO,
DEL ARTIFICIAL PORQUE
EPIDIDIMO ESTABAN
INTIMIDADOS
CON LA
PRESENCIA DE
LAS
PERSONAS.
OBTENER UN
MACHO
MADURO Y
COMPLETO, Y
PROCEDER OBSERVACION DE
CON LA ESPERMATOZOIDES
VIVOS Y MUERTOS
CIRUGIA (DESCONGELAMIENTO)
(CASTRACION).
EXTRACCION,
DILUCION Y DETERMINACION CONGELAMIE
OBSERVACION DEL PORCENTUAL DE NTO
SEMEN ESPERMATOZOIDES
(ESPERMATOZOIDES) VIVOS, MUERTOS Y (NITROGENO
MORFOANORMALIDADES LQUIDO)
.
36
SELECCION DEL MACHO REPRODUCTOR
37
TESTICULOS EXTIRPADOS DEL MACHO
DONANTE DE SEMEN
38
MUESTRA LLEVARA AL MICROSCOPIO
39
TINCION CON EOSINA NEGROSINA
RESULTADOS OBSERVADOS
RESULTADOS OBSERVADOS
40