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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PER

FACULTAD DE ZOOTECNIA

BIOTECNOLOGIA REPRODUCTIVA
CONGELAMIENTO DE SEMEN DE CONEJO A 3500 M.S.N.M

GRUPO: CONEJOS

ALUMNOS:
- LOZANO FERNANDEZ JACK
- NUEZ DE LA CALLE JULIAN
- PAUCAR HUAMAN STHEFANI
- RUIZ TERRONEZ JHOSSELYN

DOCENTE:
- Ing. SAUL ESPINOZA

HUANCAYO, JULIO DEL 2017

1
INDICE

Resumen pg. 3
Introduccin pg. 4
I. Marco terico pg. 5
1.1 Antecedentes pg. 5
1.2 Caractersticas del semen de conejo pg. 5
1.3 Factores que determinan el xito en la congelacin del semen. pg. 7
1.4 Crioprotectores pg. 10
1.5 Factores que determinan el fracaso en la congelacin del semen. pg. 12
1.6 Almacenamiento. pg. 14
1.7 Usos y beneficios. pg. 15
1.8 Fisiologa de la reproduccin en conejas. pg. 16
1.9 Productos comerciales utilizados en la ovulacin. pg. 17
1.10 Celo de la coneja pg. 19
1.11 Ovulacin. pg. 19
1.12 Sistema de induccin a la ovulacin en conejas. pg. 19
1.13 Diluyente natural utilizado en la inseminacin. pg. 20
1.14 Carbetocina aadido al agua de coco. pg. 22
1.15 Diluyente utilizado en inseminacin artificial pg. 25
1.16 Procedimiento a la inseminacin artificial en coneja pg. 27
II. Objetivos pg. 30
III. Material y mtodos pg. 30
IV. Resultados y discusin pg. 33
V. Conclusiones pg. 33
VI. Referencias bibliogrficas pg. 34

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RESUMEN:

Se realiz el entrenamiento, la coleccin y evaluacin de semen de conejo,


durante los meses de mayo, junio y julio del 2017, de muestras procedentes de
tres machos, el primer macho fue entrenado y prestado de la granja agropecuaria
Yauris (G.A.Y), mientras que el segundo ejemplar fue prestado de una crianza
familiar y por ltimo el tercer macho fue comprado por el grupo de un mercado,
la caracterstica de estos tres machos seleccionados fueron; que ya estaban en
la madurez sexual y que eran machos completos. Cuyo objetivo fue determinar
las caractersticas microscpicas: concentracin, motilidad, porcentaje de vivos
y muertos y el porcentaje de anormalidades. Y as procediendo a la congelacin
de semen, mediante pajillas.

Palabras clave: conejos, coleccin, evaluacin, semen.

SUMMARY:

Rabbit semen training, collection and evaluation were carried out during May,
June and July of 2017, from samples of three males, the first male was trained
and loaned from the Yauris (GAY) farm, while That the second specimen was
borrowed from a family breeding and finally the third male was bought by the
group from a market, the characteristic of these three selected males were;
Who were already in sexual maturity and who were complete males. Its
objective was to determine the microscopic characteristics: concentration,
motility, percentage of live and dead and percentage of abnormalities. And thus
proceeding to the freezing of semen, by straws.

Key words: rabbits, collection, evaluation, semen.

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INTRODUCCION:

La crianza de conejos en el Valle del Mantaro viene teniendo un crecimiento


sostenido, debido al incremento de pequeos y medianos criadores, al margen
del gran nmero de animales en la crianza familiar, los mismos que hacen uso
del sistema de reproduccin tradicional, es decir la monta natural. Sin embargo,
el mtodo de reproduccin artificial a travs de la inseminacin artificial an no
ha sido introducido entre los criadores ms progresistas.

La inseminacin artificial es una tcnica que ha ido adquiriendo a lo largo del


tiempo un mayor nmero de adeptos, siendo practicada en numerosas
explotaciones cunculas de todo el mundo y ms reciente en Espaa, donde la
prctica de la inseminacin en cunicultura se est imponiendo. Sin embargo,
para poder dar inicio a esta tcnica en nuestro medio es importante poder
resolver un problema bsico: la coleccin del semen y la evaluacin macro y
microscpica del semen. Se han reportado diferentes tcnicas de coleccin y
evaluacin del semen, sin embargo los resultados son muy dismiles en cada
una de las tcnicas y lo que es ms importante, requiere de un adecuado
adiestramiento de los animales.

Otro aspecto importante, al margen de la inseminacin artificial, es que al igual


que en especies superiores, los conejos utilizados como reproductores en la
monta natural deben ser evaluados reproductivamente a travs de la
caracterizacin de su semen, ya que no siempre es la hembra la responsable
de las deficiencias reproductivas de una granja cuncila, sino que tambin lo
puede ser el macho.

Frente a esta problemtica, poco estudiada en la actualidad y descuidada por


parte de los productores tecnificados es que nos proponemos caracterizar los
ms importantes aspectos macroscpicos y microscpicos del semen de
algunas granjas del valle as como la de contrastar las caractersticas
seminales de los conejos de carne, piel, pelo y criollos.

Ante esta situacin, se ha planteado el presente trabajo de investigacin que


tiene los siguientes objetivos:

Evaluar las caractersticas microscpicas del semen: concentracin,


motilidad, morfoanormalidades, porcentaje de semen vivos y muertos de
conejos reproductores de diferentes razas y ambientes.

Llegar a la congelacin de semen mediante pajillas.

Poder obtener buenos resultados mediante la inseminacin artificial,


descongelando el semen.

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I.- MARCO TEORICO

1.1.- ANTECEDENTES:

Desde el descubrimiento de mtodos para la congelacin del semen en 1940


por Polge, se han tenido espectaculares resultados; a pesar de esto, an
existen algunos obstculos que no han sido superados (Crdova, 2005).
Varios investigadores lograron recuperar espermatozoides de varias especies
despus de congelarlos en solucin con agentes crioprotectores como el
glicerol. A partir de entonces, se han desarrollado diversas tcnicas para
congelar gran cantidad de material biolgico (espermatozoide, clulas
sanguneas, tejidos, vulos, embriones, etc.) con buenos resultados en algunos
casos, aunque en otros no han sido satisfactorios (Crdova, 2001).

1.2.- CARACTERSTICAS DEL SEMEN DE CONEJO.


La calidad del semen debe de evaluarse antes de usar a los machos como
sementales. Una vez que se ha colectado el semen, pueden emplearse varios
criterios para evaluar la calidad del semen. No debe de confundirse la
evaluacin del semen con la prueba de fertilidad, ya que la ltima se cuantifica
mediante las tasas de concepcin y la produccin de descendencia viable
(Noguez, 2004).

El semen es el producto de la mezcla de materia seminal, fluido producido por


los conductos excretores, las glndulas accesorias del aparato genital
masculino (Noguez, 2004). La eyaculacin del conejo es bifsica, primero
eyacula el contenido de las ampollas de Henle y casi al mismo tiempo el lquido
prosttico que al reunirse con la secrecin de las glndulas vesiculares,
determinndose la gelificacin del semen, y a su vez formndose una especie
de tapn mucoso que acta mecnicamente impidiendo el reflujo del semen a
travs de la vagina (Wall, 1999).

Las caractersticas seminales varan segn los eyaculados dentro de un mismo


individuo, el volumen del semen del conejo va desde 0.1 hasta 1.5 ml. y con un
concentracin de un milln hasta cien millones (Bad, 2000).

Otra caracterstica del semen del conejo es la cantidad de catalasa, fructosa


acido ctrica clicerolfosforicolina (GPC) las cuales son protectores del semen
para evitar una reaccin por parte del perxido de hidrgeno, esto lo tienen
pocas especies, gracias a la catalasa se mejora la supervivencia de los
espermatozoides (Echegaray, 1999; Holtz, 1978). Al igualmente, es sensible a
las soluciones hipertnicas y a la adicin de agentes crioprotectores como
grupos hidroxilo y al glicerol (Liu, 2004).

El estudio bioqumico y biofsico de la membrana plasmtica ha probado


variaciones nter especies, en la cual el grado de sensibilidad por
congelamiento se cree va ligado a la funcin de la membrana y ha sido
correlacionado con los fosfolpidos y el colesterol contenidos en esta.
Evidencias indican de esta variacin en el esperma de ratn crioperservado el
cual es atribuido a las diferencias en la sensibilidad de la membrana plasmtica
y al shock osmtico (Thurston, 2001).

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El semen del conejo a diferencia de otras especies resiste ms el shock
trmico. Esto es atribuido a su alto contenido de colesterol y fosfolpidos. Estos
componentes seminales son esenciales para mantener la estructura celular de
la membrana espermtica (AbdelGhaffar, 1995; Castellini, 2003).

Composicin del semen en conejos.

Parmetros Primer eyaculado Segundo eyaculado


Volumen (sin gel) ml 0.11.1 0.20.4
Volumen de la fraccin de gel
(ml) 0.320.50 0.10.18
Eyaculados con gel (%) 54 15
Espermatozoides/ml semen
(x106) 2801,050 420800
Motilidad (%) 5890 5787
Ph 7.7 8.4 7.7 8.4

(Zrate, 2002).

Composicin del plasma seminal en conejos.

Plasma Seminal
Fructuosa (ml/100 ml) 40150
Sorbitol (ml/100 ml) 80
cido ctrico (ml/100 ml) 70200
Protena (ml/100 ml) 415
Glyserolfosforicolina (ml/100
ml) 215370

Sodio (moles/l) 80140


Potasio (mmoles/l) 23120
Fsforo (mmoles/l) 13
Magnesio (mmoles/l) 24
Calcio (moles/l) 28

(Zrate, 2002).

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1.3.- FACTORES QUE DETERMINAN EL XITO EN LA CONGELACIN DEL
SEMEN.

La cripreservacin del semen has sido ampliada exitosamente en otras


especies, sin embargo existen variaciones en la calidad del semen
descongelado entre individuos (Thurston, 2001). Para esto el propsito de la
criobiologa el cul es encontrar el ptimo proceso para congelar (usando
nitrgeno lquido), y prevenir la cristalizacin del agua dentro de los tejidos
(Kieselev, 2000).
El semen puede ser conservado mediante refrigeracin o congelacin. La
congelacin disminuye la tasa metablica y prolonga la sobr vivencia
espermtica. Los diluyentes del semen utilizados para la congelacin protegen
las membranas espermticas de los daos causados por los cambios de
temperatura, proveen energa, estabilizan el pH y la presin osmtica (Stornelli,
2006).

1.3.1.- Recoleccin del semen.

La capacidad de fuentes fidedignas para recoger muestras de semen


eyaculadas de modelos artificiales para estudios androlgicos es crtica. Los
conejos con regularidad han sido usados en estudios androlgicos debido a la
facilidad relativa de obtener el semen eyaculado con la ayuda de una vagina
artificial (Moriya, 1996; Oliveira 2004; Bustamante, 1980). Aunque en ciertos
casos se da la prdida del 10 % del eyaculado dependiendo del tipo de vagina
artificial que se llegara a utilizar, ello depende del modelo, dimensiones y tipo
de lubricante (Amann, 2004).
La carencia de preparacin sexual probablemente puede contribuir a tener
valores bajos, en el eyaculado total. La evaluacin apropiada de un macho
requiere mltiples colecciones cada 2 o 3 das, usando montajes falsos, por el
perodo de semanas o meses (Amann, 2004).
El pronto procesamiento de semen despus de la recoleccin es importante
para evitar la acumulacin de productos del metabolismo, mantener la motilidad
espermtica, y prevenir los efectos peligrosos de la exposicin a la luz (Foote,
1982).
Para la recoleccin del semen se utilizan conejos en jaulas individuales con el
fin de presentar a la hembra, el macho intentara montarla, se tendr ya una
vagina artificial (Naughton, 2003) con temperatura de 45 a 50 C al momento
de la colecta la cual se considera como un receptculo que trata de
proporcionar al rgano copulador los estmulos trmicos, mecnicos y de la
elasticidad necesarios para que la eyaculacin se produzca (Wall, 1999;
Naughton, 2003).

La recoleccin de semen se tendr que mantener a 35C para poder evaluar el


volumen, color, motilidad progresiva, vivos/muertos y morfologa (Devireddy,
1999.). El dispositivo es puesto abajo de la hembra con una direccin caudal.
Cuando el macho comienza a montar, el dispositivo es colocado ms
posteriormente e inferiormente permitir la penetracin del conejo en la vagina
artificial. El tiempo de eyaculado ocurre rpidamente y el dispositivo es retirado
(Moriya, 1996.). El tiempo de preservacin del semen afecta a la motilidad,
viabilidad y morfologa (Devireddy, 1999).

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Factores que ayudan a la criopreservacin exitosa de semen.

Factor importante en criopreservacin Substancias o condiciones usualmente


utilizadas
Procesamiento de semen Inmediatamente despus de la
recoleccin
Macromolculas para proteger al esperma Yema de huevo buferizada
contra el
shockfrio de la precongelacin Leche caliente
Enfriar en 12 hrs
Tasa de enfriamiento y tiempo de El tiempo de precongelacin varia con el
precongelacin diluyente
y la especie
Crioprotector especial Usualmente glicerol
Tasa de congelacin Varia: de + 5 C a 100 C en 10
minutos
Temperatura de almacenamiento 196 C en nitrgeno liquido
Tasa o temperatura de descongelamiento Usualmente se descongela de 3037 C
(Foote, 1982).

1.3.2.- Dosis de semen.


La dosis normal oscila entre 15 a 20 millones de espermatozoides. De esta
manera las conejas no receptivas requieren de un cantidad de 13 millones en
comparacin de conejas receptivas con 11 millones aproximadamente
(Srisombut, 1998), haciendo de esto una dosis de semen por cada pajilla de 20
millones en 0.5 ml (Devireddy, 1999).

En explotaciones cuncolas comerciales, los eyaculados generalmente no estn


muy diluidos (1:4 a 1:10) una cantidad espermtica mayor a los 16 millones
(Vargas, 2002; Zrate, 2002).

1.3.3.- Soluciones amortiguadoras comnmente utilizadas en la dilucin de


semen.

Puede evitar cambios o alteraciones mnimas en el pH al neutralizar los cidos


producidos por la actividad metablica de los espermatozoides, as como un
ambiente isotnico para los mismos. Una caracterstica de los buffer, es que
debe ser atxica para los espermatozoides (Vargas, 2002; Zrate, 2002).

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1.3.4.-Solucin de citrato.

El comn es el citrato de sodio deshidratado, el inconveniente se da cuando se


mezcla con la yema de huevo, dejando sumamente transparente la muestra y
de difcil observacin en forma individual (Vargas, 2002; Zrate, 2002; Royere,
1996).

La adicin de yema de huevocitrato despus de la recoleccin, protege al


esperma contra el shock frio (Foote, 1982).
Solucin: Citrato de sodio al 2.9% (medio de Strazinger), disuelto en 100
ml. de agua destilada y se aade un 20% de yema de huevo (Vargas, 2002;
Zrate, 2002).

Tris (hidroximetilaminometano) / gr. 3.028


Glucosa / gr. 1.25
cido ctrico / gr. 1.675
(Vargas, 2002; Zrate, 2002).

1.3.5.- Solucin Tris.

Conocida como Hidroximetilaminometano, como un medio amortiguador. Este


parece prolongar la vida de los espermatozoides a temperaturas de 5 y a 196
C (Vargas, 2002; Zrate, 2002; Royere, 1996).

Se han realizado diversas combinaciones de diluyentes basados en


amortiguadores como: Tris adicionado con cido ctrico, utilizados en
combinacin de la yema de huevo (20%), obteniendo una capacidad
amortiguadora suficiente para mantener un pH neutro (Vargas, 2002; Zrate,
2002).

El buffer Tris y la yema de huevoglicerol tambin proveen de una excelente


proteccin para el esperma congelado en dosis de 1 g/100 mL y descongelado
(Foote 2002; (LpezGatiusa, 2005).

La sustancia basada en TAM (trishidroximetilaminometano) ha sido la ms


especfica por su eficiencia en la conservacin de semen de conejo (Vargas,
2002; Zrate, 2002).

Trisbuffer. 3.029 g.
cido ctrico monohidratado. 1.675 g.
Dglucosa monohidratada. 1.250 g.
Agua destilada. 85 ml.
Albmina de huevo. 20 ml.
Penicilina Gsdica. 100000 U.I.
Estreptomicina, sulfato. 0.1 g.
DMSO. 20 ml.
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(Vargas, 2002; Zrate, 2002).
1.4.- CRIOPROTECTORES.
Durante el proceso de congelacin, las sustancias crioprotectoras son
esenciales para disminuir el dao espermtico ocasionado por el descenso de
temperatura, ya que estos remplazan el agua intracelular durante la
congelacin, permitiendo que el fluido intracelular pueda ser superenfriado a
temperaturas entre 5 y 15 C sin que ocurra la formacin de cristales de
hielo, debido a que estas sustancias disminuyen el punto de congelacin por
medio de la reduccin en la interaccin entre las molculas de agua. Por su
parte, la velocidad del enfriamiento puede determinar un mayor o menor efecto
de la congelacin sobre la viabilidad espermtica (Cruz, 2006).

Las clulas durante las fases de congelamiento se enfrentan a cambios


osmticos por la entrada y salida del agua en la membrana celular para evitar
esto se ha creado los crioprotectores que ayudan a la clula a sobrevivir a este
proceso (Srisombut, 1998).

Las optimizacin de tcnicas para la croconservacin del esperma esta


limitada por el conocimiento referente a la permeabilidad del agua,
caractersticas durante el enfriamiento, la presencia de hielo extracelular y
agentes crioprotectores (Curry, 2000).

Algunos de los crioprotectores utilizados son: dimetil sulfoxido (DMSO), glicerol,


metanol, propanediol, etyl glicol, acetamida, tetralosa, metil celulosa, yema de
huevo y leche descremada estos crioprotectores funcionan ya que son de bajo
peso molecular y penetran la membrana del esperma (Castle, 1997;
LopezGatius, 2005; Moc, 2002; Foote, 1993; Kiselev, 2000; Chenier, 1998;
Royere, 1996).

Durante el congelamiento de las clulas en suspensin: el hielo se encuentra


en el espacio extracelular causando un gradiente osmtico (Castle, 1997;
LopezGatius, 2005).

1.4.1.- Glicerol.
Bernstein y Petropavlovsky fueron los primeros en describir el uso del Glicerol
al 9.2% como solucin crioprotectora en semen de conejo (Pesch, 2007). El
descubrimiento esta accin crioprotectora del glicerol, permite congelar los
espermatozoides con ayuda de agentes potenciales crioprotectores, el glicerol
ha permanecido sin excepcin como el mejor crioprotector en todas las
especies (Crabo, 2001; Castle, 1997).

La adicin de glicerol al medio de preservacin causa que el esperma se


mantenga frtil despus de la congelacin y el descongelamiento (Foote,
1995).

El glicerol es un esencial crioprotector en todos los diluyentes convencionales


para esperma de equino. Muchos otros crioprotectores han sido recientemente
probados en esperma de sementales. Entre estos el dimetil formamide el cual

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provee un efecto similar en el semen de sementales como el glicerol
(Vidament, 2002).

La utilizacin de 1.0 M de glicerol ha demostrado un alta grado de preservacin


en el semen de conejo (Kashiwazaki, 2006).

1.4.2.- Yema de huevo.

El descubrimiento de la yema de huevo para minimizar el shock trmico fue


hecho en Selivanova (Pesch, 2007).

La yema de huevo es un componente habitual de los diluyentes para semen


debido a que sus fosfolpidos y protenas de baja densidad protegen al
espermatozoide del shock de fro (Stornelli, 2006).

La membrana de los espermas de los conejos es ms permeable a


componentes lpidos, la emulsificacin con la yema de huevo, podra disminuir
el shock trmico en la congelacin del esperma (Arriola, 2001).
La yema de huevotris, yema de huevocitrato, yema de huevolactosa, y
diluciones de leche que han sido utilizadas exitosamente en Ganado, han sido
adaptadas para muchas otras especies. Muchas de estas diluciones protegen
al esperma durante la congelacin, se a juzgado por la motilidad post
congelacin y la integridad de los acrosomas (Foote, 1982) se ha visto que la
adicin de un 20% de yema de huevo en diluyantes para congelacin de
semen en conejo (Vargas, 2002; Zrate, 2002).

En las ltimas dcadas, varios procedimientos para la crioconservacin de


espermatozoides de diferentes especies han evaluado el uso de una amplia
variedad de sustancias crioprotectoras, utilizadas en diferentes
concentraciones y protocolos de congelacin, con resultados variables, lo cual
hace necesario la realizacin de ms estudios para estandarizar un protocolo
definitivo (Cruz, 2006).

Dosis de crioprotectores usadas para la congelacin de semen.

Motilidad progresiva post Integridad de la membrana

Agente crioprotector.
Descongelado. Espermtica.
1.
0 M glicerol. 17.0 3.3 % 17.0 2.6 %
1.
0 M lactamida. 37.8 3.0 % 35.9 3.3 %
1.
0 M acetamida. 28.3 3.8 % 30.2 3.0 %
1.0 M DMSO. 25.3 3.5 % 27.0 2.4 %

(Kashiwazaki, 2006).

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1.5. FACTORES QUE DETERMINAN EL FRACASO EN LA CONGELACIN
DEL SEMEN.

La posibilidad de obtener buenos resultados de semen cropreservado puede


cambiar segn sea el caso en diferentes especies (Polgr, 2000), tambin se
ha visto que en ptimos protocolos de criopreservacin en espermatozoides de
mamferos solamente se conservan vivos el 50 % de los espermatozoides
totales (Green, 2001; Rasul, 2001).

La criopreservacin de semen a demostrado bajos rangos de concepcin y


pequeas camadas despus de la inseminacin artificial en comparacin con la
inseminacin con semen fresco (Buhr, 2001).

Existen variados tipos de daos asociados tanto al congelamiento propiamente,


dicho como a los componentes de un diluyente (Stornelli, 2006).

Las anormalidades morfolgicas de los espermas son utilizadas como un


indicador de stress biolgico causados por crodaos o intoxicaciones
(Gravance, 1995).

Estos daos estn relacionados con los cambios de temperatura (shock de


fro), la toxicidad de los crioprotectores y la formacin y disolucin de hielo en el
medio ambiente intracelular. Cada paso del protocolo de criopreservacin
podra afectar la estructura de la membrana as como el metabolismo y la
funcin celular. Sin embargo los pasos estn interrelacionados entre s y un
cambio en uno de ellos puede modificar el efecto de otras variables (Stornelli,
2006; Hassa, 1996).

Una limitante importante en el conejo es el bajo volumen del eyaculado y la


baja concentracin de los espermatozoides en proporcin con su poca
resistencia de las clulas durante largos periodos de almacenamiento hacen
deficiente el uso de este para la inseminacin artificial (Bad, 2000).

Varios protocolos para la crioconservacin de espermatozoides han sido


desarrollados durante los ltimos 25 aos. En general, los resultados son muy
variables, indicando una alta sensibilidad de los protocolos propuestos, lo cual
hace necesario, en la mayora de los casos, ajustar el procedimiento para cada
especie (Navarro, 2004).

1.5.1. Congelacin.

En este sentido, la congelacin intracelular es letal para la clula dependiendo


particularmente del tamao y de la cantidad de cristales de hielo formados en el
citoplasma, ya que altas velocidades de enfriamiento producen cristales
intracelulares pequeos que pueden llegar a ser inocuos, pero stos pueden
unirse y crecer durante la descongelacin por medio de un proceso
denominado recristalizacin. En la mayor parte de los casos, las clulas bajo
formacin de hielo intracelular (IIF) dejan inactivada osmticamente a la clula

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(lisada), esto hace que pierdan la integridad de la membrana celular (Castle,
1997; Chen, 1989; Navarro, 2004; Cruz, 2006), alteracin del metabolismo
espermtico y prdida de la motilidad, factores que afectan la capacidad
fecundante del semen (Stornelli, 2006; Green, 2001).

Generalmente el semen de conejo es diluido para su utilizacin inmediata, por


lo que no ha sido necesario un mtodo de congelamiento, adems que posee
caractersticas que hacen difcil su congelamiento (LopezGatius, 2005; Lpez
1998), ya que la problemtica se basa en las caractersticas del centrosoma, el
cual sirve como organizacin de los microtbulos en el centro de los cigotos
(Liu, 2004).

1.5.2.Crioprotectores.
El grado de toxicidad del crioprotector y su velocidad de difusin a travs de la
membrana plasmtica, dependen de la temperatura a la cual son incorporados
a la solucin de semen y del tiempo de exposicin celular. Esta difusin puede
verse afectada por el descenso de la temperatura, ya que durante este proceso
la membrana celular aumenta la proporcin de colesterol con el propsito de
lograr mayor estabilidad mecnica; sin embargo, este aumento del colesterol
tambin disminuye la permeabilidad de la membrana a pequeas molculas,
pudiendo afectar la penetracin del crioprotector en la clula de una manera
efectiva (Cruz, 2006).

El uso del glicerol se ha restringido en su utilizacin para la congelacin del


semen, ya que en el caso del conejo se puede deber a una alteracin en la
permeabilidad de la membrana (Crabo, 2001; Castle, 1997; LopezGatius,
2005; Bad, 2000), adems de la posible toxicidad en los espermatozoides,
mientras que con la adicin de otros crioprotectores como la Acetamida,
Lactamida y DMSO (Dimetil sulfoxido), no se han observado dichos resultados
Kashiwazali, et. al, 2004).

El semen congelado luego de la descongelacin posee una vida mucho ms


corta que el semen fresco, debido a que los protocolos de criopreservacin
producen un nmero potencial de factores de estrs que pueden producir
variados cambios en el espermatozoide (Stornelli, 2006; Gravance, 1998).

1.5.3.Cambios de temperatura.
Se considera que el principal sitio de dao asociado a los cambios de
temperatura son las membranas espermticas. La reduccin de la fertilidad
asociada al semen congelado es atribuida en gran parte a la alteracin de la
estructura y funcin de las membranas durante los procesos de refrigeracin,
congelacin y descongelacin. Para poder interactuar con el ovocito, los
espermatozoides deben estar vivos, motiles y poseer las membranas
plasmtica y acrosomal intactas y funcionales (Stornelli, 2006).
Los procesos de congelacindescongelacin resultan en reduccin de la
fertilidad del semen criopreservado si lo comparamos con el semen fresco.
Este hecho es el resultado tanto de la prdida de viabilidad espermtica
(poblacin de espermatozoides muertos) como de las alteraciones funcionales
instauradas en la poblacin sobreviviente (Stornelli, 2006).

13
1.5.4.Dao acrosomal
Los procesos de criopreservacin afectan la integridad acrosmica. El
acrosoma debe estar intacto en el momento de la inseminacin debido a que la
reaccin acrosmica debe ocurrir en el sitio donde ocurra la fertilizacin. La
morfologa acrosmica puede ser observada mediante microscopio de
contraste de fase, microscopio electrnico de transmisin, lectinas marcadas
con sustancias fluorescentes y anticuerpos monoclonales (Stornelli, 2006;
Gravance, 1998; Royere, 1996; Zekariya, 2006).

1.5.5. Dao en la membrana espermtica.

Los espermatozoides criopreservados exhiben modificaciones de membrana


similares a las ocurridas en espermatozoides capacitados, dichos eventos
reducen la longevidad espermtica. Estos cambios similares a la capacitacin
espermtica estn relacionados con eventos que desestabilizan las
membranas. Un aumento de la tasa de concepcin puede lograrse mejorando
los mtodos de criopreservacin tratando de prevenir o minimizar la ocurrencia
de los eventos que desestabilizan las membranas y aumentando as la
cantidad de espermatozoides con capacidad fecundantes en la poblacin de
espermatozoides sobrevivientes luego del proceso de criopreservacin
(Stornelli, 2006; Tamer, 2005; Royere, 1996; Zekariya, 2006).

1.5.6. Almacenamiento del semen.

Durante el almacenamiento el incremento de la temperatura con el manejo


descuidado de las pajillas, la posibilidad de fallar en mantener los tanques de
nitrgeno lquido recargados a tiempo, pueden contribuir a una pequea baja
en la fertilidad (Foote, 1982).

1.6.- ALMACENAMIENTO.

Empacar el semen congelado para su uso con dixido de carbono slido o


nitrgeno lquido fue un problema, las ampolletas de vidrio se rompan durante
el congelamiento y la descongelacin. Se desarroll un mtodo de sellado en
pajillas plsticas y una pistola para inseminacin (Foote, 2002).

Originalmente se utilizaron pajillas de 0.5 ml de capacidad, pero se usan ms


las de 0.25 ml de capacidad por que utilizan menos espacio de
almacenamiento (Foote, 2002).

Otro cambio mayor en el almacenamiento ocurri en 1950, con el cambio de


almacenamiento en dixido de carbono slido a 79 C a nitrgeno lquido a
196 C. Se ha demostrado que la sobre vivencia del esperma a 196 C es
virtualmente infinita, mientras que a 79 C ocurren cambios biolgicos (Foote,
2002).

14
El almacenamiento de nitrgeno lquido fue tambin un problema porque el
aislamiento de los tanques era ineficiente. La recarga frecuente era requerida
para mantener una temperatura segura de 196 C.

Una prctica comnmente usada para el almacenamiento en periodos cortos


48 horas, es a temperaturas de 5 a 25 C (Bad, 2000).

Los fabricantes no estaban interesados en mejorar los tanques, hasta que J.


Rockefeller Prentice, dueo del Servicio Americano de Criadores, privadamente
proporcion una suma de dinero substanciosa, que convenci a la divisin
Linde de la Compaa Americana Cyanamid, de que haba mercado para
contenedores de nitrgeno lquido con una aislamiento mejorada. La exitosa
crio preservacin del esperma y el desarrollo de contenedores de nitrgeno
lquido, proporcionaron la fundacin en la que toda la industria de la crio
preservacin ahora est construida (Foote, 2002).

1.7.- USOS Y BENEFICIOS.

El conejo es un importante modelo de estudio en espermatozoide y la


fertilizacin. Es usado ya por su facilidad en la recoleccin del semen, as como
el simple proceso de inseminacin artificial que facilita el estudio del mismo
(Arriola, 2001; Chen, 1989; Farrell, 1993).

El semen de conejo no solo puede ser utilizado para estudios de fertilidad, si no


tambin para la propia reproduccin de la especie, sin embargo la motilidad en
los espermatozoides puede diferir no solo en su utilizacin para su manejo ya
sea fresco o congelado, sino tambin en la raza (Moriya, 1999).

El desarrollo de la tecnologa en criopreservacin ayuda a machos y a hembras


en problemas de infertilidad. La criopreservacin nos da la oportunidad de tener
esperma para usar en el futuro siguiendo claro buenos protocolos de
descongelacin (Hassa, 1996).

Un programa de mejoramiento gentico animal requiere de una utilizacin


intensiva de los machos superiores, los cules deben ser avaluados,
seleccionados y comparados en su valor gentico en diferentes hatos por
pruebas con machos de referencias (Gibbons, 2002).

Una tcnica que reduce considerablemente estos inconvenientes para el


mejoramiento gentico es la inseminacin artificial con semen congelado. Esta
tcnica reproductiva incrementa la utilizacin de los machos genticamente
superiores y amplios las posibilidades de su difusin a gran escala. La
conformacin de un banco de semen congelado permite disponer con tiempo
del material gentico y programar su distribucin en los diferentes hatos
(Gibbons, 2002).

La criopreservacin de los espermatozoides puede ser usada en tcnicas de


asistencia reproductiva especialmente en casos cuando el macho ya no puede
producir espermatozoides (Tamer, 2005).

15
La utilizacin de semen congelado para la inseminacin artificial es una
herramienta comnmente usada en el ganado actual (Gravance, 1998).

La conservacin del semen de diferentes especies en especial en peligro de


extincin podran veneficiar los programas de manejo gentico, incluyendo la
aplicacin de tecnologas para la asistencia reproductiva (Thiangtum, 2006).

La congelacin aun no es una prctica comn en el semen del conejo ya que la


viabilidad de los espermatozoides de conejo es baja (Bad, 2000).

1.8.- FISIOLOGIA DE LA REPRODUCCIN EN CONEJAS.

La reproduccin que la reproduccin depende de diversos factores, como son,


entre otros, la raza, el sexo, las condiciones ambientales y la herencia
gentica. Las razas de tamao pequeo son los ms precoces, alcanzando la
madurez sexual a los 4,5 5 meses las hembras y a los 5-6 los machos. En
las razas gigantes para las hembras es a los 8 meses y para los machos al
ao.

La coneja se trata de una hembra sin ciclo definido y regular y con la


necesidad de ciertos mecanismos reflejos que dan lugar a una
ovulacin inducida.

El potencial de gametos que una coneja puede llegar a desarrollar en toda su


vida reproductiva, se define entre los 28 das de vida fetal y los 10 das de vida
extra uterina. La coneja comienza el periodo prepuberal hacia las 10 semanas
de vida, observndose las primeras oleadas de maduracin folicular entre los
65 y 90 das de edad. No obstante, un desarrollo folicular pleno se alcanza
cuando la coneja tiene entre 17 y 20 semanas de edad. (Padilla, F. 2005)

La actividad ovrica despus del parto se vuelve a instaurar coincidiendo con el


descanso de progesterona el da 29 de gestacin. Aunque las conejas aceptan
al macho al mismo da del parto, a medida que avanza el periodo postparto y si
se quiere aplicar un ridmo semi-intensivo de inseminaciones (das 10-11 post-
parto para bandas de 42 das) es conveniente la aplicacin de tratamiento o
mtodos de sincronizacin de celo hormonales, de manejo, de iluminacin, etc.
(Ramrez, F. 2008)

16
1.8.1.- Hipotlamo.

El hipotlamo se encuentra en la parte interior del cerebro. Produce unas


sustancias llamadas hormonas liberadoras (RH). Cumple una funcin
importante en la regulacin de la homeostasis (funciones vitales que mantienen
constante en el medio corporal interno), el comportamiento sexual y las
emociones. (Patologa Cursos Dexeus 2008)
(lvarez, A,
(2009)
1.8.2.- Hipfisis.
La hipfisis o glndula pituitaria se divide en lbulos: anterior y posterior e
intermedio, el anterior se identifican cinco clulas de estas, las ms importantes
en reproduccin, las gonadotrpicas que secretan las hormonas luteinizante y
la folculo estimulante. Las hormonas hipofisarias tambin estimulan el
crecimiento y controlan el equilibrio del agua del organismo.

1.9.- PRODUCTO COMERCIAL UTILIZADOS EN LA INDUCCIN DE


OVULACIN.

1.9.1.- Gonadotropina (PMSG).

Este producto contiene (PMSG) en forma de liofilizado junto con diluyente


para su reconstitucin. Desde el punto de vista farmacolgico, la PMSG es
una Gonadotropina con una alta actividad tanto de FSH como de LH.

A causa de su actividad FSH, la Gonadotropina srica estimula el


crecimiento y maduracin de los folculos. Por su actividad LH, la PMSG
induce tambin la ovulacin lo cual se pudo demostrar en estudios de
superovulacin.


Composicin.

Cada frasco de material liofilizado contiene 1000 UI de PMSG


Cada frasco de diluyente contiene 5 ml de solucin tampn estril.

17

Indicaciones.

Se puede emplear en los problemas de fertilidad en los animales


domsticos: Anestro (induccin de celo y aumento de la actividad ovrica
que ocasionan un aumento de fertilidad) en la vaca, coneja y perra. Sper
ovulacin (necesaria para la trasferencia de embriones) en vacas, coneja y
cierva. Mejora de la tasa de fertilidad tras un tratamiento progestgeno
(induccin y sincronizacin del celo, aumento de la actividad ovrica) en la
vaca, oveja, cabra y cierva. Alteraciones de la espermatognesis en los
machos.

Utilizacin.

Coneja principalmente para induccin del celo.



Administracin

Se puede administrar 40 U.I., va I.M. S.C.

El anestro es a menudo causado por un manejo inadecuado (alimentacin y


confinamiento). Por consiguiente, una mejora en las condiciones de manejo
es un requisito previo para un tratamiento eficaz.

Advertencia: en caso de un tratamiento asociado a prostaglandinas, debe


respetarse el periodo de resguardo sealado en el rtulo para sta.

Presentacin.
Estuche con 5 frascos de material liofilizado que contienen 1000U.I. de
PMSG por frasco, acompaado de 5 frascos de diluyente de 5 ml c/u.

Condiciones de almacenamiento.
Almacenar en la oscuridad a una temperatura menor a 25C. Despus de
reconstituido el producto puede ser almacenado a una temperatura de entre
2C y 8 por hasta 24 horas.

Contraindicaciones.
Ninguna.

18
1.10.- CELO DE LA CONEJA.

El celo est relacionado con la presencia de vulos maduros, lo que impulsa


a la hembra a aceptar al macho para que se produzca el acoplamiento. Las
manifestaciones del celo son discretas; se nota porque se montan unas
encima de otra, se rascan el mentn contara la jaula y arquean el lomo.
Asimismo, la vulva vara de aspecto volvindose hmeda, de color violceo e
hinchada. En este momento se lleva a la hembra a la jaula del macho, para
que se produzca el acoplamiento, dado que esta no acepta extraos en su
jaula y es probable que ataque el macho o cuanto menos que lo rechace.
(Gordon, A. 2006)

1.11.- OVULACIN.
Con el coito se estimula, que tendr lugar al cabo de 10-12 horas del
acoplamiento sexual. La ovulacin puede asimismo provocarse por medios
artificiales, mediante estmulos vaginal inducido por la monta de un macho
castrado, mediante vibraciones vaginales elctricas, o con hormonas
gonadotrofinas. Estos mtodos son los ms usados para efectuar la
inseminacin artificial.

La ovulacin vara con la edad, con los factores genticos y con el estado
fisiolgico del animal, as como de la gestacin.

Con la edad, entre la primera y tercera cra crece el poder de ovulacin, de la


cuarta a la doceava se estabiliza, y decrece a partir de esta. (Rodrguez, C.
2003)

En lo que el estado fisiolgico se refiere, el nmero de vulos es mayor a los


15 das despus del parto que inmediatamente despus de este.
Entre los factores genticos la herencia incide en el nmero de ovulaciones,
en el porcentaje de la mortalidad embrionaria. (Rolados, M. 2003)

1.12.- SISTEMA DE INDUCCIN A LA OVULACIN EN CONEJAS.


La ovulacin de la coneja es inducida por estmulos asociados al coito y que
presenta entre 10 a 12 horas despus, por ende se dice que en la coneja la
ovulacin se produce por medio de una respuesta neuro-hormonal, que

19
cuenta con dos vas: va aferente-nerviosa, que se trasmite por estmulos
provocados por el coito al SNC y la otra aferente-hormonal que enva la
seal del SNC al ovulo, produciendo la ovulacin.

Para provocar la ovulacin en la coneja se utilizan los siguientes sistemas: el


servicio en blanco, excitacin sicgena de la hembra, estimulo elctrico y
mediante el empleo de las hormonas entre las cuales mencionamos la HCG
Y PMSG.

1.13.- DILUYENTE NATURAL UTILIZADO EN LA INSEMINACIN.

1.13.1.- Agua de coco.

El agua de coco es el lquido que se encuentra de forma natural en el hueco


interior del coco. Tiene un color transparente, a veces un poco opaco, y se
encuentra en el hueco interior, rodeado por la pulpa del coco, en la nuez del
coco. Posee un sabor caracterstico que puede variar por la especie hasta
por el estado del coco (seco o fresco), tambin el sabor puede depender del
terreno donde se encuentra la palma cocotero.
En ese mbito el agua de coco se utilizaba como agua para beber e incluso
como suero que a travs de un tubo de plstico y dos agujas, se introduca
en el coco por un lado y en vena por el otro, proporcionando agua estril y
mineralizada que ayud a salvar muchas vidas. (Jackson JC. 2005).

20
Cuadro Composicin del agua de coco

Composicin del agua


de coco Porcentajes
Agua 95.5
Nitrgeno 0.05
cido fosfrico 0.56
Potasio 0.25
xido de calcio 0.69
xido de magnesio 0.59
Protena 0,1
Grasa 0,1
Hidratos de carbono 4.0
Calcio 0,02
Fosforo 0,01

Composicin del agua


de coco g/100g
Hierro 0.05
Slidos totales 4.71
Azcares reductores 0.80
Los azcares totales 2.08
Fuente: (Jean Yong WH, Ge Liya, Yan Fei Swee,Tan Ngin Ngand. 2009)

1.13.2.- Azcares.

Los azcares en forma de glucosa y fructosa forman un componente


importante de la tuerca de agua de licitacin. La concentracin de azcares
en el agua de tuerca a un incremento constante de alrededor de 1,5 por
ciento a cerca de 5 a 5,5 por ciento en los primeros meses de maduracin y
luego cae lentamente alcanzando cerca de 2 por ciento en la etapa de la
plena madurez de la tuerca. En las primeras etapas de madurez de los
azcares en forma de glucosa y fructosa (azcares reductores) y sacarosa
(azcar no reductor) aparece slo en las etapas posteriores, que aumenta
con la madurez mientras que los azcares reductores otoo. En la madurez
tuerca a fondo aproximadamente el 90 por ciento del total de azcares es la
sacarosa.

21
1.13.3.- Minerales.

Agua de coco de licitacin contiene la mayora de los minerales como el


potasio, sodio, calcio, fsforo, hierro, cobre, azufre y cloruros. Entre los
minerales que ms de la mitad es la concentracin de potasio, que es
marcado por el abonado de potasio. Agua de coco de licitacin que es rico
en potasio y otros minerales juega un papel importante para aumentar la
produccin de orina.(Greenfield, H.2006)

1.13.4.- Protena.

El agua de coco contiene pequeas cantidades de protena. El porcentaje


de, alanina, arginina, cistina y sereno en la protena de agua de coco tierno
son ms altos que los de la leche de vaca. Ya que no contiene ninguna
protena compleja el peligro de producir una descarga a los pacientes se
reduce al mnimo.(Torres, L.2005)

1.13.5.- Vitaminas.

El agua de coco de licitacin contiene cido ascrbico y vitaminas del grupo


B. La concentracin de cido ascrbico rangos de 2.2 a 3.7mg por ml, que
gradualmente disminuye a medida que el ncleo que rodea el agua
comienza a endurecer. (Jean Yong WH, Ge Liya, Yan Fei Swee Tan Ngin
Ngand. 2009).

1.14.- CARBETOCINA AADIDO AL AGUA DE COCO.

1.14.1.- Composicin Qumica.

1 cido butanoico 2- (0-metil-l-tirosina)-1-carba-oxitocina.

La oxitcina es producida por el hipotlamo en donde se une a una pequea


protena llamada neurofisina, con la cual pasa a la pituitaria posterior, es en
este lugar en donde es liberadora a la sangre.

La estructura anatmica y las propiedades qumicas del musculo lisio son


totalmente diferentes del musculo estriado y otros diferentes se observan

22
tambin en el tero. Contiene carbetocina la cual posee efectos estimulantes
en el msculo liso del tero, se traduce en contracciones ms potentes;
selectivos, constantes y de larga accin que se sugieren que dicho
octapptido, a diferencia de las oxitcina poli pptidas, posee una funcin
hormonal verdadera en dicho rgano.

Por ejemplo en el tero las contracciones se inician por el proceso


relativamente lento de fosforilacin de las cadenas ligeras de miosina,
reaccin que se catalizado por la miosincinasa. Responden en forma
selectiva a la carbetocina produciendo una contraccin potente y largo
efecto.

1.15.- DILUYENTE UTILIZADO EN INSEMINACIN ARTIFICIAL

1.15.1.- Diluyente.

Por diluyente entendemos la solucin acuosa que permite aumentar el


volumen del eyaculado hasta conseguir las dosis necesarias y preservar las
caractersticas funcionales de las clulas espermticas y mantener el nivel
de fertilidad adecuado.

Los espermatozoides se encuentran en el plasma seminal que suministra los


nutrientes necesarios para mantener una elevada actividad metablica
necesaria para el proceso de transporte espermtico a travs del genital
femenino. En el eyaculado, esta actividad metablica solo puede mantenerse
durante un periodo de tiempo muy limitado, como es conocido desde los
primeros estudios sobre la conservacin del semen porcino (Lewis, 1911).
Para poder conservar los espermatozoides durante periodos prolongados es
necesario que se reduzca la actividad metablica de los espermatozoides,
mediante la dilucin en un medio adecuado y la reduccin de la temperatura.

La conservacin a estas temperaturas moderadamente reducidas limita la


capacidad de almacenamiento de las muestras por una parte porque no
puede reducirse el metabolismo celular y por otra porque no pueden
controlarse las condiciones microbiolgicas con la misma efectividad de
temperaturas inferiores (5C). (Waberski A. 2000).

23
Por otra lado, el efecto de dilucin lleva a que determinados compuestos
presentes en el plasma seminal estn en muy bajas concentraciones en el
semen diluidos y alteren la viabilidad espermtica, como por ejemplo la
reduccin de la concentracin de K+ (Harrison et al., 1978), o de protenas
plasmticas. Ests perdidas deben compensarse con la adecuada
formulacin del diluyente, as por ejemplo la adicin de albmina srica
bovina (BSA), ya que se ha demostrado que esta adicin estimula la
motilidad y mejora las tasas de fertilidad del semen conservado.(Jorda, M.
2011)

1.15.2.- Funciones del diluyente.

Para llevar a cabo su misin el diluyente debe aportar los nutrientes


necesarios para el mantenimiento metablico de la clula espermtica
(glucosa), la proteccin frente al shock trmico por fro (BSA), controlar el pH
del medio (Bicarbonato, TRIS, HEPES), la presin osmtica (sales NaCL,
KCl) y la inhibicin del desarrollo microbiano (antibiticos).

1.15.3.- Nutrientes.

El espermatozoide tiene capacidad de producir la energa necesaria para


mantener su metabolismo celular y generar el movimiento del flagelo,
principalmente a travs de las vas glicolticas. Estos procesos se desarrollan
en las mitocondrias localizadas en la porcin intermedia del espermatozoide.
La fuente de energa ms frecuentemente utilizada en la composicin de los
diluyentes es la glucosa, aunque se han usado otras (galactosa, fructosa,
ribosa o trehalosa) sin que los resultados hayan superado a la glucosa.
(www.biotay.com/ar/productoslista.php?linea=3&tipo=29)

1.15.4.- Regulacin del pH.

El pH del semen recin eyaculado se encuentra prximo a 7.4 0.2, al igual


que otros fluidos orgnicos, y cuando se reduce este pH al mismo tiempo se
reduce el metabolismo energtico del espermatozoide y su motilidad. El
metabolismo glicoltico que desarrolla el espermatozoide (carbohidrato
principal es glucosa) hace que el pH intracelular disminuya y el metabolismo
24
celular quede reducido. El cido lctico es el principal metabolito de este
proceso y ha sido utilizado como ndice de calidad seminal. (Revisado por
Foote, 2002).

La adicin de agentes taponadores ayudan, por tanto, a controlar el pH del


medio. Entre los taponadores ms simples se encuentran el bicarbonato y el
citrato (sdico) que presentan una capacidad de tamponar limitada, mientras
que otros taponadores ms complejos (TES, HEPES, MOPS, TRIS) pueden
regular el pH en un rango ms amplio y no son dependientes de la
temperatura (MOPS y HEPES).

El pH de los diluyentes normalmente utilizados oscila entre 6.8 y 7.2, pero


hemos de tener en consideracin que el pH de estos medios no se estabiliza
hasta pasado unos 60-90 minutos del inicio de la dilucin en agua y que los
distintos diluyentes presentan un diferente patrn de cambio de su pH a lo
largo del tiempo, por lo que se han de tomar las medidas oportunas en el
proceso de preparacin de los diluyentes antes de su uso, para evitar
problemas en el proceso de conservacin. (Newth y Levis, 1999).

1.15.5.- Presin osmtica.

En cualquier caso, los diluyentes isotnicos (300 mOsm) o ligeramente


hipertnicos son los que mejores resultados han dado en condiciones de
utilizacin comercial. Para regular la presin osmtica se utiliza
principalmente sales de iones inorgnicos como el cloruro sdico y potsico.
(Fraser, G., 2001)

1.15.6.- Tipos de diluyentes.

A nivel prctico en las condiciones actuales de produccin los diluyentes se


han clasificado en dos grandes grupos, los que tienen como objetivo la
conservacin a corto plazo (menos de 1-3 das), o aquellos que tienen por
objetivo la conservacin a largo plazo (ms de 4 das). Los primeros se
utilizan principalmente en estructuras de distribucin de las dosis seminales
a corta distancia (propias de los sistemas europeos, donde la produccin de
dosis seminales en la misma granja es frecuente) mientras que los de largo

25
plazo son propios de estructuras como las presentes en los USA o Noruega
donde las distancia entre el lugar de produccin seminal y el lugar donde va
a ser utilizado es grande.

Las ventajas que aportan los diluyentes de larga duracin son la posibilidad
de transporte a largas distancias, permiten realizar pruebas diagnsticas
sobre el semen antes de ser utilizadas, como pruebas mediante tcnicas
PCR (Polymerase Chain Reaction) para detectar la presencia de diversos
virus o anlisis completos de la calidad seminal, permite una mejor
organizacin de las tareas en los centros de recogida seminal y facilita en
gran medida la distribucin de las muestras a las granjas de
reproduccin.(Alvuto, J. 2000)

Los primeros diluyentes rusos estaban basados en soluciones de glucosa


con tartrato de sodio o potasio o sulfato sdico y peptonas, manteniendo en
cualquier caso bajos niveles de electrolitos (revisado por Foote, 2002).
Posteriormente en la dcada de los 50, se produjo el desarrollo de los
diluyentes para el ganado bovino, basados en yema de huevo con fosfato o
citrato y leche, y se hicieron algunas adaptaciones para conservar semen
porcino (revisado por Foote, 2002). De entre todos, cabe destacar la
adaptacin del diluyente Illinois Variable Temperatura que se utilizaba para
la conservacin de semen en el ganado vacuno a temperatura ambiente.
Este IVT medio est basado en una solucin de glucosa, citrato, bicarbonato
y yema de huevo, pero necesitaba ser gaseado con CO2 para reducir la
actividad metablica.

En la dcada de los 60, se produce una gran innovacin consistente en la


adicin de un agente quelante (EDTA), que permitira bloquear la accin del
calcio como mediador de los procesos de capacitacin y reaccin
acrosmica. Es cuando aparece el diluyente Kiev (Plisko, 1965) que
posteriormente ha sido modificado y recibido otras denominaciones (EDTA,
Merck I, Plisko, Guelph). Este medio Kiev permiti una amplia difusin de la
IA porcina y todava sigue utilizndose con xito en nuestros das. ( Gilmore,
F. 2001)

26
1.15.7.- Diluyente utilizado.

Es un producto innovador, diluyente especfico de conejo en polvo.




Preserva el semen vivo durante 24 horas.

Especfico
para la conservacin de semen fresco o refrigerado de conejo
desarrollado por el Dpto. de I+D+i


Libre de protenas de origen animal.


Contiene antibiticos segn la Directiva del Consejo Europeo 90 429 CEE.

Se utiliza como diluyente una solucin fisiolgica de Cloruro de Sodio al 0,9%



mantenida a 30C de temperatura (1cc de semen para 9cc de solucin
fisiolgica). Si el semen es de excelente calidad se puede utilizar 1cc de
semen en 9cc de solucin fisiolgica.( http://www.magapor.com/es/)

1.16.- PROCEDIMIENTO A LA INSEMINACIN ARTIFICIAL EN


CONEJA.

Es una tcnica que se aplica en distintas especies domsticas. En forma


reciente se la utiliza en cunicultura de carne, con fines de seleccin gentica
y produccin intensiva. La tcnica de inseminacin artificial, con semen
fresco, es simple y econmica. Es necesario tener nociones bsicas de
anatoma y fisiologa reproductiva de la hembra. (Valle. 2009)

1.16.1.- Ventajas de la Inseminacin Artificial.

Disminucin del nmero de machos necesarios. Con el eyaculado de un solo


macho se pueden inseminar de 10 a 20 hembras, dependiendo de la calidad
del semen.

Mejor aprovechamiento de las instalaciones, las jaulas disponibles se pueden
ocupar con hembras en produccin y se reducen los costos de sanidad y
alimentacin, al disminuir el nmero de machos en el criadero.

Mejoramiento gentico: la posibilidad de inseminar a un nmero elevado de
hembras con el eyaculado de un solo macho permiten evaluar las
caractersticas del reproductor y aumentar la produccin de los machos ms
aptos.

27
Control del semen que se va a utilizar: el control macroscpico y microscpico
del semen permite controlar el estado sanitario de los machos.

Reduccin de las posibilidades de contagio de enfermedades bacterianas por
contacto como Sfilis Pasteurelosis y tambin las que se puedan adquirir por
el pasaje de todas las hembras del criadero por las jaulas de los machos (Tia
Sarna).
Ahorro significativo de tiempo: se pueden inseminar un elevado nmero de
hembras sin esperar la presentacin del celo, ni que se produzca la monta.

Optimizacin en la organizacin del trabajo: se pueden destinar das fijos a la
semana para realizar los servicios, palpacin, preparacin del nidal etc.

Control del ciclo reproductivo: mediante la aplicacin de hormonas para inducir
la presentacin del celo y ovulacin en las hembras.

1.16.2.- Elementos a utilizar para la extraccin del semen.


Para la extraccin del semen se utiliza una vagina artificial que consta de las
siguientes partes:

Tubo rgido de PVC



Gomaespuma

Globos comunes adaptados

Tubo colector graduado

El cuerpo de la vagina (tubo PVC) est recubierto en su interior por una capa
de gomaespuma. Dentro del cuerpo de la vagina se coloca el ltex formando
una cmara aislada donde se coloca el agua caliente, de manera tal que el
agua nunca tome contacto con el semen. En el extremo posterior del tubo
rgido se coloca un tubo colector graduado para la recoleccin del semen.
Como lubricante se utiliza vaselina.

1.16.3.- Instrumento para la inseminacin.

Una pipeta de inseminacin de bovino adaptada, de 14 cm de largo, con


una curvatura de 140 en un extremo.

Una jeringa graduada de inseminacin con adaptador de goma.

Guantes descartables (Revista electrnica de Veterinaria. 2009)

28
1.16.4.- Tcnica para la inseminacin Artificial.

Un auxiliar toma la hembra entre sus rodillas y piernas, separando los


miembros posteriores del animal. El inseminador separa los labios de la
vulva con la mano izquierda y con la derecha introduce la pipeta de
inseminacin de manera tal que el extremo curvado est dirigido hacia la
columna del animal; de esta manera evitaremos que penetre en la uretra.
Cuando se percibe un obstculo (hueso de la pelvis) se gira la pipeta 180 y
se introduce aproximadamente 5 cm la pipeta, procedindose a depositar 1
cm de semen diluido. (Lefrancois, R.2001)

1.16.5.- Pautas Importantes.



Utilizar una vagina artificial por macho.

Utilizar
una sola pipeta por hembra.

agua destilada y
Lavar todo el material utilizado con detergente, luego

posteriormente alcohol cada vez que se lo utiliza.

Es necesario un buen manejo de los animales tanto para la extraccin del


semen como para la inseminacin.

Capacitacin del personal que va a aplicar la tcnica. (Revista Feagas N
35 enero-diciembre 2009)

29
II.- OBJETIVOS

Objetivo general:
- El objetivo del presente proyecto fue la congelacin del semen del conejo
a 3500 msnm atreves de un mtodo convencional.
- Obtener buenos resultados en la congelacin de semen, para poder
inseminar a las conejas de la Granja Agropecuaria Yauris.
Objetivos especficos:
- Diagnosticar preez en las conejas de la Granja Agropecuaria de Yauris.
- Recolectar semen en conejos usando distintos mtodos.
- Evaluacin del semen extrado del conejo.

III.- MATERIAL Y MTODOS

3.1. Material animal:


Los machos utilizados en este trabajo pertenecen: 2 a la Raza california, 1
hibrido y 1 hembra raza california; seleccionados por la Granja Agropecuaria de
Yauris y otros de diferentes lugares.
En este proyecto se utilizaron los espermatozoides de la cola del epiddimo de
1 macho de 1 ao de edad. Los machos empleados para la recogida del semen
estaban alojados en la G.A.Y en el galpn de conejos, se empez su
entrenamiento para colectar semen a los 11 meses de edad, fueron
estimulados 3 veces por semana. 1 macho perteneciente a la raza angora el
cual es de la G.A.Y y el segundo que pertenece a un colaborador de una
crianza familiar; el macho castrado provino del mercado modelo.

3.2. Condiciones de alojamiento:


Este galpn de conejos consta con 20 jaulas para conejas y 2 jaulas para
machos. El macho viable de la G.A.Y estuvo alojado desde 3 meses de edad,
mientras el segundo macho vino de una crianza familiar ubicada en Saos
Chico n 1406 y el ultimo macho fue comprado del mercado modelo.
El galpn no cuenta con el debido cuidado y limpieza adecuada, estando cerca
de otros animales, las paredes son de adobe y consta con 2 ventanas que dan
una buena ventilacin, pero no garantizan un adecuado aislamiento trmico.
La granja familiar lo mantena en una jaula rectangular junto a una hembra,
alimentado con restos de verduras y afrecho.
Ambos animales utilizados en el experimento fueron alojados en jaulas
individuales de 0,5
m x 0,6 m de base y 0,3 m de altura y alimentados con forraje producido por la
misma granja y concentrado (en comedero tipo lineal) y agua ad limitum (con
tazones circulares). El fotoperiodo empleado fue de 12 horas luz/da.

3.3. Extraccin de semen:


En el momento de la extraccin se llev una hembra a la jaula del macho. Se
ubic a la hembra en posicin de servicio, cuando el macho intento el salto, se
coloc la vagina artificial por debajo del vientre de la coneja de manera que el
pene del reproductor se introduzca en la vagina artificial.
La vagina artificial consta de:

30
- Cuerpo rgido (parte fundamental) de plstico (jeringa de 20 ml).
- Revestimiento interno o camisa. En este caso usamos globos previamente
desinfectados (2).
- Colector de eyaculado. Un tubo de ensayo de 3 a 5 ml.
- Para sujetar los globos a la jeringa se us ligas gruesas (para amarrar cada
extremo).
El cuerpo que es la jeringa (material rgido) con dos aberturas terminales; se
pas el globo por el medio y se sujet en ambos extremos, se pas el segundo
globo con un lado sujetado y el otro unido al tubo de ensayo, dejando una
abertura que permiti la entrada del pene del animal y la eyaculacin. La
jeringa tena un orificio por el cual permiti el ingreso de agua caliente y aire.
Al no obtener respuesta de los machos por el estrs ocasionado por la llevada
al INIA e IVITA, se opt por la castracin de un reproductor y extraer
espermatozoides de la cola del epiddimo.
En la castracin (intervencin quirrgica) se us:
- Bistur
- Guantes de ltex
- Yodo a discrecin
- Pinzas de sujecin
- Algodn
- Hilo de sujecin
- Lidocana
Se coloc al conejo con el vientre arriba, se busc los testculos y se procedi a
realizar el corte superficial (escroto), se cort la segunda capa () y se aplasto
hasta sacar el testiculo, una vez sacado todo () se hizo un nudo a los
conductos espermticos y se le aplico yodo en las heridas, as como 0.5 ml de
lidocaina.

Se ubic en el testculo la cola del epiddimo, se hizo un corte dejando su


interior a la superficie y se realiz el raspado y se mezcl con el dilutor.

3.4. Metodologa de congelacin:


Se congelo la coleccin de semen de la cola del epiddimo.

3.4.1. Medio de congelacin:


El medio de congelacin consta de un diluyente de semen de conejo cuya
composicin es: 10 gr de leche descremada en polvo, 4,85 de fructuosa, 5ml
de yema de huevo y 95 ml de agua destilada. 0,25 M de Tris[hidroximetil]-
aminometano, 88mM de cido ctrico, y 47mM de D-Glucosa
(diluyente 1), al que se adicionarn los crioprotectores dimetilsulfxido y
sacarosa a una concentracin de 3,5M y 0,1M respectivamente.

3.4.2. Tcnica de congelacin:


El medio de congelacin y el eyaculado se mezclaron a partes iguales (1:1) a
temperatura ambiente (en torno a 12-15C), la concentracin final de los crio
protectores fue, por tanto:
1,75M de dimetilsulfxido y 0,05M de sacarosa.
Consta de dos etapas: la primera etapa fue de 45 minutos de duracin en un
frigorfico a 5 C y la segunda de 5 minutos, suspendidas horizontalmente

31
sobre vapor de nitrgeno lquido (- 104C) a 5 cm del nitrgeno lquido, antes
de sumergir las pajuelas de 0,25ml en nitrgeno lquido (-196C).
Para la descongelacin del semen se sumergieron las pajuelas durante 10-15
segundos en un bao de agua caliente, atemperado a 38C.

3.5. Metodologa de evaluacin del semen:


El raspado de cada testculo fue inmediatamente procesado guardando dos
tubos colectores de plstico de 14 ml para su anlisis de movilidad, morfolgico
y vivos - muertos. El resto del eyaculado fue congelado segn el procedimiento
detallado anteriormente.

3.5.1. Movilidad:
Movilidad y parmetros cinticos del eyaculado y del semen antes de congelar
y post descongelacin: se valor la movilidad individual, tomando una gota del
semen diluido y colocndolo en un porta objetos calentado (38C), se coloc en
un microscopio binocular y se observ 40 60 y 100X.
3.5.2. Vivos - muertos:

Se realiz mezclando una gota del semen diluido con la tincin de eosina-
negrosina, se mezcl y se realiz un frotis; se observ en un microscopio
binocular a 100 X.

3.5.3. Anlisis morfolgicos


La evaluacin de las anormalidades morfolgicas y de la normalidad
acrsomica sobre el semen diluido y sobre el semen descongelado se
realizaron sobre la muestra con la tincin de eosina-negrosina contando los
espermatozoides y clasificndolos.

n de espermatozoides anormales x
Porcentaje de morfo anomalas = 100 n total de espermatozoides
contados

32
IV. RESULTADOS Y DISCUSIN:

Movilidad:
60% al diluirlo
40% a 5C
20% despus e la congelacin
VIVOS MUERTOS:
50% AL DILUIRLO
30% DESPUES DE CONGELAR
ANALISIS DE ANORMALIDADES:
40%ANTES DE CONGELAR
40% DESPUES DE CONGELAR

4.1. Caractersticas del semen diluido del extrado de la cola del epiddimo
del macho raza california:
No se pudo observar ya que el semen del conejo sacado de la cola del
epiddimo era en mnima cantidad.

4.1.2. Parmetros cinticos de los espermatozoides


Los espermatozoides eran muy lentos ya que el semen presenta un plasma
gelatinoso similar al de la alpaca.

4.2. Caractersticas del semen descongelado


Menor vitalidad, mayor porcentaje de espermatozoides muertos.

V. CONCLUSIONES

Se concluye que la congelacin de semen en conejos con el mtodo


aplicado no es viable al tener ms del 40% de espermatozoides
muertos.
Resultados no favorables con semen extrado del epiddimo para una
inseminacin masiva.

33
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Nicols F. Prraga Dvila (2003), Observacin macro y microscpica del


semen en conejos de piel y de carne, en diferentes granjas de la ciudad
de Huancayo. Universidad Nacional del Centro del Per.
lvarez A. Prez E. Cruz T. Torres J. Snchez A. (2009) Fisiologa
animal aplicada Editorial. Universidad de Antioquia ISBN: 9587142195-
9789587142198. Pp 380.

Aragons M. (2009) Estudio desertivo mltiple del resumen de patente


Editor. Peter Lany ISBN: 3039117718-9783039117710 Pp: 352.

Cadena S. (2005).Crianza Casera y Comercial Conejos. Cadena


Editores ISBN: Abril 2005-Cadena de editores-Quito.Pp.5.
Castellini, C. 2000. Recientes avances en la inseminacin artificial en
conejos, 6 to World Rabbit Congress, Toulouse, Universidad Autnoma
de Barcelona

Snchez C. (2002). Crianza y Comercializacin de conejos. <<Granja y


negocio>>: Primera edicin. ISBN: 9972-9641-2-4. Per PP.5.
Cuenca M. (2006) fundamentos de la fisiologa Editor. Editorial paraninfo
ISBN: 8497323408-9788497323406 Pp. 753.
Elas F. (2001) Agro meteorologa Editor. Mundi presa de libros ISBN:
8471149737-9788471149732 Pp.517.
Equipo editorial Lexus.(2004) Manual de Crianza de Animales. Primera
edicin Lexus Editores. ISBN: 9972-625-74-5 Pp.309.

Mara, P. Jouregui.(2006) Crianza de conejos, Coleccin de Granjas.


Empresa editora EIRL.Primera Ediccin. Per. ISBN: 9972-215-45-8
Pp.3.
Greenfield H (2006) Datos de composicin de alimentos Editor.food
Agriculture ISBN: 9253049499-9789253049493 Pp. 330.
Gordon A. (2006) Fisiologa Animal Editor. Medica Panamericana ISBN:
8479039906-9788479039905 Pp.1038.
Henberto R.Caldern. (2005).Conejos y Curies Primera edicin. Obra
completa, ISBN: 958-97435-8-7. Colombia: Pp. 105.
Jackson, J. (2006). Creencia de la alimentacin y la agricultura. Volumen
84. Dol: 10-1002/JSFO 1783. Roma, Italia.Pp.32
JEAN YONG WH, GE LIYA, YAN FEI SWEE TAN NGIN NGAND.
(2009). Composicin qumica y Propiedades Biolgicas de cocos
nucifera. Molculas, 14, 5144-5164. Primera edicin, ISSN: 1420-3049.
Singapur: Pp. 26.

Barbado, J. (2004) Microemprendimineto.Cria de Conejos Primero


edicin ISBN:950-24-1044-0 Pp. 14.

34
ANEXOS

35
PROCEDIMIENTO ENTRENAMIENTO
DE LA DEL MACHO
COLECCIN DE
MEDIANTE MADURO Y
SEMEN EN UNA VAGINA COMPLETO Y
CONEJOS ARTIFICIAL COLECCIN EN SU
PROPIA JAULA.

MEDIANTE LA
CASTRACION, NO SE PUDO
EXTRACCION CONCLUIR CON
DEL SEMEN INSEMINACI EL SEMEN DEL
DE LA COLA ON CONEJO,
DEL ARTIFICIAL PORQUE
EPIDIDIMO ESTABAN
INTIMIDADOS
CON LA
PRESENCIA DE
LAS
PERSONAS.

OBTENER UN
MACHO
MADURO Y
COMPLETO, Y
PROCEDER OBSERVACION DE
CON LA ESPERMATOZOIDES
VIVOS Y MUERTOS
CIRUGIA (DESCONGELAMIENTO)
(CASTRACION).

EXTRACCION,
DILUCION Y DETERMINACION CONGELAMIE
OBSERVACION DEL PORCENTUAL DE NTO
SEMEN ESPERMATOZOIDES
(ESPERMATOZOIDES) VIVOS, MUERTOS Y (NITROGENO
MORFOANORMALIDADES LQUIDO)
.

36
SELECCION DEL MACHO REPRODUCTOR

PREPARACION DE LA VAGINA ARTIFICIAL

37
TESTICULOS EXTIRPADOS DEL MACHO
DONANTE DE SEMEN

EXTIRPACION DE LOS TESTICULOS

38
MUESTRA LLEVARA AL MICROSCOPIO

39
TINCION CON EOSINA NEGROSINA
RESULTADOS OBSERVADOS

RESULTADOS OBSERVADOS
40