Atividade de diferenciao celular

Lancaster

1- O que so os organoides cerebrais?

R: Sistema de cultivo 3D derivado de clulas pluripotentes com regies cerebrais
interdependentes.

2- Quais os motivos levaram o autor a desenvolver o mtodo de organides

cerebrais? - (lacuna na literatura)

R: Dificuldade de estudar doenas cerebrais nos organismos modelos. Falta de um

modelo in vitro para o desenvolvimento do crebro humano.
O objetivo dos autores foi criar um modelo "in vitro" de crebro humano para
o estudo de doenas ou condies fisiolgicas que no so bem modeladas por
roedores ou por cultivo de clulas humanas.Os camundongos e humanos exibem
diferenas marcantes neuroanatmicas, o que s vezes dificulta ou at
impossibilita o uso deles como estudo de doenas neurolgicas e o cultivo de
clulas dissociadas no capaz de estudar mecanismos neuroanatmicos e de
circuito cerebrais.

3- Cite uma vantagem e uma desvantagem em relao ao uso de organoides cerebrais

humanos para o estudo de doenas neurolgicas:

Vantagem: Clulas de origem humana, uso de clulas iPS de pacientes para

modelagem de doenas

Desvantagem: Como todo modelo, ele apresenta limitaes. No h interao com

sistema imune e participao de outros elementos presentes em um organismo, como
sistema circulatrio, barreira hematoceflica. No recapitulam o mesmo grau de
maturidade da organizao em camadas que vista in vivo.

4- Qual foi o mtodo utilizado para formar os organides cerebrais?

R: Gerao de neuroectoderma a partir de corpos embriides, que foi mantido em
cultura tridimensional (gotas de matrigel, matriz para o crescimento celular de maneira
mais complexa). Depois, as gotas de matrigel foram transferidas para um biorreator,
para aumentar a absoro de nutrientes.

5- O organide cerebral apresenta subespecificao regional? Como isto foi avaliado?

R: Sim. Para estudar isto os autores seccionaram o tecido e usaram marcadores
de vrias regies enceflicas.

6- Qual foi o objetivo dos experimentos para deteco de oscilaes de clcio?

R: Verificar se os neurnios apresentavam atividade neural - funcionalidade

7- Quais foram os 4 fatores usados pelo autor para reprogramao celular? So os 4

fatores do Yamanaka

R:Oct4, Sox2, c-myc e Klf4.

8- Aps comparar os organides derivados de clulas ips de um indivduo controle e de

um paciente com microencefalia, que diferenas foram notadas?
Paciente: corpos embriides menores, menos progenitores neurais e mais neurnios
sugesto de diferenciao neural prematura.

Alves

9- O que motivou a realizao desse trabalho? lacuna

R: Existing protocols for CM differentiation of iPSCs besides being highly dependent on

the application of expensive growth factors show low reproducibility and scalability. The
aim of this work was to develop a robust and scalable strategy formass production of
iPSC-derived CMs by designing a bioreactor protocol thatensures a hypoxic and
mechanical environment.

10- Cite 2 desvantagens relacionadas ao uso de fatores de crescimento exgenos nos

protocolos de diferenciao.

R: Those protocols typically involve a complex stagespecific application of exogenous

growth factors which are costly, degrade rapidly, do not readily diffuse into complex 3D
aggregates and exhibit lot-to-lot variation in their bioactivity.

11- Cite uma vantagem em relao ao uso de biorreatores

R: Bioreactor systems that continuously assure monitoring and control of the

environmental conditions (pH, pO2 and agitation profile), forma de aumentar a
produo de derivativos celulares.

12- Os autores apresentam a hiptese de que a diminuio da concentrao de

oxignio seria um fator benfico para o cultivo de clulas ips. Por qu?

R: Indeed,it is well known that cells in the early developing embryo are exposed to low
oxygen levels. In hamsters and rabbits, for example, intrauterine oxygen concentrations
decrease during blastulation and implantation to 5.3 % O2 and 3.5 % O2, respectively
[28]. Thus, lowering the oxygen concentration from normoxic atmospheric levels (20 %
O2) to more physiological levels (25%O2 or atmospheric hypoxia) might be beneficial
in PSC cultures due to the importance of this environmental condition during embryonic
development.

13- Como foi feita a purificao dos cardiomicitos induzidos no artigo?

R:Eles usaram o antibitico puromicina. Usaram clulas murinas transgnicas que
continham gene de resistncia puromicina sob o controle do promotor do gene
alfa-MHC (miosina de cadeia pesada).

14- Qual a concluso da figura 2?

R: The results showed that a DO of 4 % O2 maximizes cell proliferation and CM

differentiation (Fig. 2). In these culture conditions, the size of aggregates, the total
number of cells and aggregates were higher throughout the culture (Fig. 2ac) resulting
in a significantly higher expansion fold on day 9 of differentiation when compared to
normoxic conditions (44.92.7 versus 12.21.4 cells/ initial iPSC, p=0.001, Table 1).
Moreover, first eGFP positive cells and contracting areas in aggregates cultured under
hypoxia were observed already on day 7 of differentiation, contrasting with cell
aggregates cultured at 20 % O2 where eGFP-positive cells and beating areaswere
rarely observed throughout culture time (Fig. 2a).
15- O controle do ambiente fsico foi mostrado como algo essencial para guiar o
destino cellular (cell fate). Verdadeiro ou falso?

R: Verdadeiro. Several variables including force magnitude, frequency, direction,

duration of application, and at what stage of differentiation the force is applied, have
been shown to affect cell fate decisions [39, 40, 46]. In fact, these aspects were noted
to also be critical for the success of the protocol described herein. - pH, pO2 and
agitation profile