UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE DIN CRAIOVA

COALA DOCTORAL

TEZ DE DOCTORAT

ANALIZA CROMATOGRAFIC A CLOPIDOGRELULUI.

STUDII FARMACOCINETICE

REZUMAT

CONDUCTOR DE DOCTORAT:
PROF.UNIV.DR. NEAMU JOHNY

STUDENT-DOCTORAND:
SPIRIDON ADELA-MARIA

CRAIOVA
2015

1
 CUPRINS
I. INTRODUCERE............................................................................................. 3
II. STADIUL CUNOATERII ............................................................................. 3
III. CONTRIBUII PERSONALE....................................................................... 4
III.1. Motivarea alegerii temei de cercetare ................................................... 4

III.2. Analiza simultan a clopidogrelului bisulfat, atorvastatinei calcice i

acidului acetilsalicilic din comprimate prin cromatografia de lichide de
nalt performan........................................................................................... 4

III.3. Contribuii la dezvoltarea unei metode cromatografice de lichide de

nalt performan cu faz invers pentru detecia simultan a
metabolitului de acid carboxilic al clopidogrelului i pantoprazolului din
plasma uman: Studiu pilot ........................................................................... 6

III.4. Contribuii la dezvoltarea i validarea unei metode cromatografice

de lichide de nalt performan cu faz invers pentru detecia
simultan a clopidogrelului bisulfat, metabolitului su de acid carboxilic
si atorvastatinei din plasma uman: Studiu farmacocinetic ....................... 7

IV. CONCLUZII ............................................................................................... 11

V. BIBLIOGRAFIE SELECTIV: .................................................................... 11

Cuvinte cheie: cromatografie de lichide de nalt performan, clopidogrel bisulfat,

eluie n gradient, studiu farmacocinetic

2
 I. INTRODUCERE

Analiza cromatografic a clopidogrelului din probe biologice a evoluat odat cu

necesitile terapeutice i strategia de reducere a rezistenei multifactoriale a acestui
medicament.
Cercetarea de fa propune estimri calitative i cantitative ale clopidogrelului i
metabolitului su de acid carboxilic din comprimate i din plasma uman prin
cromatografia de lichide de nalt performan. Elementul de noutate l constituie
studierea profilului farmacocinetic al clopidogrelului alturi de alte dou medicamente
incluse n schema terapeutic, atorvastatina i pantoprazolul.

II. STADIUL CUNOATERII

Aceast parte a tezei de doctorat este alctuit din trei capitole cu informaii din
literatura de specialitate (ghiduri cu recomandri internaionale, articole tiinifice).
Primul capitol al tezei de doctorat descrie incidena evenimentelor
cardiovasculare de natur aterotrombotic, mecanismele principale de producere i
manifestrile clinice ale aterotrombozei. Prevenia n bolile cardiace de natur
aterotrombotic a devenit o abordare pe via, implementndu-se recomandri precise
cu privire la diet, modul de via i scderea factorilor de risc [1].
Capitolul al doilea contribuie la definirea profilului farmacologic al
medicamentului clopidogrel, prin prezentarea particularitilor farmacocinetice,
farmacodinamice, indicaiilor i modului de administrare, interaciunilor
medicamentoase dintre clopidogrel-atorvastatin i clopidogrel-pantoprazol. Sunt
prezentate rezultatele studiilor clinice din literarura de specialitate i strategia
terapeutic recomandat de ctre ghidurile internaionale de cardiologie pentru pacienii
cu sindrom coronarian acut i riscuri cardiovasculare majore [2].
In capitolul al treilea sunt prezentate metodele cromatografice din literatura de
specialitate, aplicaiile lor n studiile de bioechivalen i biodisponibilitate precum i
studiile farmacocinetice ale clopidogrelului i a metabolitului su de acid carboxilic.
Clopidogrelul a fost analizat prin cromatografie de lichide de nalt performan :
HPLC-MS [3], HPLC-MS-MS [4-9], HPLC-UV[10-11]. Sunt descrise etapele analizei

3
cromatografice ncepnd de la pregtirea probelor de plasm, tehnicile recente de
extracie plasmatic, separarea prin eluie izocratic [12] i n gradient [4], optimizarea
compoziiei fazei mobile i a pH-ului acestora prin ajustarea cu soluii tampon.
Stadiul cunoaterii conine partea teoretic i include elaborarea pe baza analizei
literaturii de specialitate a unei liste de metode analitice de determinare a
clopidogrelului i a metabolitului derivat de acid carboxilic din probe biologice [13].

III. CONTRIBUII PERSONALE

III.1. Motivarea alegerii temei de cercetare

n acest capitol sunt menionate detaliile referitoare la motivarea alegerii studiilor
farmacocinetice clopidogrel-atorvastatin respectiv clopidogrel-pantoprazol i
importana determinrii profilului concentraiei plasmatice n timp a clopidogrelului la
pacienii cu riscuri cardiovasculare majore.

III.2. Analiza simultan a clopidogrelului bisulfat, atorvastatinei calcice i

acidului acetilsalicilic din comprimate prin cromatografia de lichide de nalt
performan
Acest capitol propune un studiu design pentru optimizarea compoziiei fazei
mobile (tampon KH2PO4 i acetonitril ) cu parametrii cromatografici rezoluie (Rs), timpul
de retenie (tR) i factorul de trenare (Tf). Au fost efectuate 11 experimente randomizate
pentru optimizarea metodei cromatografice folosind softul MODDE 9.1., modelul CCF
(Central Composite Face-Centered) cuadratic, ajustat cu PLS (Partial Least Squares
pentru mai multe rspunsuri).
Analiza cromatografic a fost determinat folosind cromatograful de lichide
Thermo Finnigan Surveyor echipat cu un detector cu reea de fotodiode i un soft de
achiziie a datelor Thermo Finnigan Xcalibur. Separarea a fost realizat folosind o
coloan cromatografic cu faze inversate de tip HDS Hypersil C 18 (250x4.6 mm; 5m).
Faza mobil a fost optimizat cu ajutorul rezultatelor obinute din designul propus i a
constat ntr-un amestec tampon KH2PO4 0.01 M (cu pH=2.6 ajustat cu acid ortofosforic
85%) :acetonitril :metanol 20:40:40 (v/v/v) ) cu debitul de 0.8 mLmin-1.

4
 Liniaritatea metodei a fost determinat n intervalul de concentraii de 0.03-5
gmL-1 pentru clopidogrel bisulfat, 0.03-2 gmL-1 pentru acidul acetilsalicilic i 0.04-
1.25 gmL-1 pentru atorvastatin. Precizia a fost determinat prin analiza de ase ori a
soluiilor probelor de control (0.05, 0.3, 1 gmL-1 pentru clopidogrel bisulfat, 0.08,
0.1,.0.8 gmL-1 pentru atorvastatin i 0.05, 0.5,1 gmL-1 pentru acidul acetilsalicilic).
Separarea prin cromatografia de lichide de nalt performan a clopidogrelului
bisulfat, acidului acetilsalicilic i atorvastatinei din comprimate este redat n figura1
[14]. Timpii de retenie pentru compuii de analizat au fost: 3.138 minute pentru acidul
acetilsalicilic, 4.133 minute pentru atorvastatin i 6.833 minute pentru clopidogrel
bisulfat.

Figura 1. Cromatograma din comprimate obinut pentru acidul acetilsalicilic ( peak 1)

atorvastatin (peak 2), clopidogrel bisulfat (peak 3) cu faza mobil tampon KH2PO4 0.01
M (pH=2.6) :acetonitril:metanol 20:40:40 (v/v/v)

5
 III.3. Contribuii la dezvoltarea unei metode cromatografice de lichide de
nalt performan cu faz invers pentru detecia simultan a metabolitului de
acid carboxilic al clopidogrelului i pantoprazolului din plasma uman: Studiu
pilot

In vederea analizei interaciunii medicamentoase clopidogrel-pantoprazol a fost

dezvoltat i validat o metod cromatografic simpl i specific pentru estimarea
simultan a metabolitului de acid carboxilic al clopidogrelului i pantoprazolului n
plasma uman.
Analiza s-a efectuat cu acelai sistem cromatografic Thermo Finnigan
Surveyor. Faza mobil a fost format din ap (pH=3 ajustat cu acid ortofosforic 85%):
metanol: acetonitril 36:10:54 (v/v/v) i debitul de 1 mLmin-1. Probele de plasm au fost
preparate prin adugarea de 25L SI (ibuprofen) 100 gmL-1 i 25 L de soluii de
lucru la 0.5 mL de plasm (obinut prin centrifugarea probelor de snge la 4000 rpm
pentru zece minute). Proteinele plasmatice au fost precipitate cu 1 mL de acetonitril.
Proba a fost centrifugat din nou. Supernatantul a fost evaporat sub un curent de azot ,
iar reziduul obinut a fost reluat n metanol. Volumul injectat a fost de 20 L.
Metoda a fost validat conform ICH [15] n vederea liniaritii, limitei de
cuantificare, preciziei, acurateei, specificitii i aplicat cu succes n detecia
concentraiei plasmatice a clopidogrelului i pantoprazolului la doi pacieni aflai sub
tratament cu 75 mg clopidogrel i 20 mg pantoprazol. Liniaritatea a fost observat n
domeniul de concentraii de 0.03-5 gmL-1 pentru metabolitul de acid carboxilic al
clopidogrelului i 0.04-5 gmL-1 pentru pantoprazol. Limitele de cuantificare au fost de
0.03 gmL-1 pentru metabolitul de acid carboxilic al clopidogrelului i 0.04 gmL-1
pentru pantoprazol. Timpii de retenie ai metabolitului de acid carboxilic, pantoprazolului
i ibuprofenului (5gmL-1) au fost 4.083 minute , 4.550 minute i 9.817 minute.

6
Figura 2. Cromatograma unei probe plasmatice de la un pacient la 45 de minute post-
doz sub tratament cu 75 mg clopidogrel i 20 mg pantoprazol cu metoda propus
(peak-ul 1-metabolitul de acid carboxilic al clopidogrelului, peak-ul 2- pantoprazolul,
peak-ul 3- SI (ibuprofen) 5gmL-1).

III.4. Contribuii la dezvoltarea i validarea unei metode cromatografice de

lichide de nalt performan cu faz invers pentru detecia simultan a
clopidogrelului bisulfat, metabolitului su de acid carboxilic si atorvastatinei din
plasma uman: Studiu farmacocinetic

Numeroase ghiduri internaionale ofer recomandri importante cu privire la

modalitatea de prescriere a antiagregantelor plachetare i statinelor pentru pacienii cu
aterotromboz (sindrom coronarian acut, accident vascular cerebral, boal arterial
periferic) [16]. Obiectivul principal ale cercetrii a fost detecia plasmatic a
clopidogrelului i a metabolitului su n prezena atorvastatinei. Pentru elaborarea
acestui obiectiv am considerat oportun folosirea ca metod de separare a analiilor de
interes cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC).

7
 Detecia simultan a clopidogrelului bisulfat, metabolitului su de acid carboxilic
i atorvastatinei din plasma uman a fost realizat cu acelai sistem cromatografic
Thermo Finnigan Surveyor cu eluie n gradient [17], a crei compoziie este
prezentat n tabelul 1.
Tabelul 1. Eluia n gradient pentru metoda cromatografic n gradient

Timp Solvent A Solvent B Solvent C

(min) (Tampon fosfat) (ACN) (CH3OH)
0.01 90 10 0
2.00 90 10 0
3.00 60 40 0
4.00 30 50 20
8.00 30 50 20
10.00 30 40 30
18.00 30 50 20
19.00 90 10 0
20.00 90 10 0

Toate probele de plasm au fost tratate identic conform urmtoarei tehnici de

lucru : la 0.5 mL plasm au fost adugai 20 L soluie standard intern ibuprofen (50
gmL-1), 20 L soluie standarde de lucru pentru fiecare analit n parte i 200 L soluie
de HCl (2 M). Precipitarea proteinelor s-a realizat cu 500 L acetonitril. Probele au fost
agitate energic pentru 5 minute i centrifugate pentru 10 minute la 4500 rpm.
Supernatantul a fost evaporat sub un curent de azot la temperatura ambiental.
Reziduul obinut a fost redizolvat n 500 L metanol i 20 L au fost injectai n coloana
cromatografic.
Liniaritatea metodei a fost determinat pentru 8 nivele de concentraie cuprinse
n intervalul 0.008-2 gmL-1 pentru clopidogrel bisulfat, 0.01-4 gmL-1 pentru
metabolitul de acid carboxilic al clopidogrelului i 0.005-2.5 gmL-1 pentru
atorvastatin. Curba de calibrare a fost realizat pornind de la limita de cuantificare de
0.008 gmL-1 pentru clopidogrel bisulfat, 0.01 gmL-1 pentru metabolitului de acid
carboxilic al clopidogrelului i 0.005 gmL-1 pentru atorvastatin. Timpii de retenie ai
metabolitului de acid carboxilic al clopidogrelului, atorvastatinei, ibuprofenului(2gmL-1)

8
i clopidogrelului bisulfat au fost 9.663, 10.998, 11.802, 12.682 minute conform
cromatogramei din figura 3. Au fost determinate studii de degradare forat pentru
determinarea stabilitii substanei active i interferena excipienilor.

Figura 3. Cromatograma unei probe plasmatice de la un pacient la 40 de minute de la

administrarea clopidogrelului 75 mg i atorvastatinei 40 mg folosind metoda n gradient
cu debitul de 1 mLmin-1

Metoda a fost aplicat ntr-un studiu farmacocinetic la pacienii cu polimedicaie

cu 75 mg clopidogrel i 20, 40 respectiv 80 de mg atorvastatin. Pentru metabolitul de
acid carboxilic al clopidogrelului au fost obinute urmtoarele rezultate: Cmax= 4.2 gmL-
1
, Tmax=1 h, t1/2=4.51 h pentru pacientul 1, Cmax= 4.77 gmL-1, Tmax=1.24 h, t1/2=3 h pentru
pacientul 2, Cmax= 3.32 gmL-1, Tmax=1 h, t1/2= 5.21h pentru pacientul 3. In cadrul
aceluiai studiu au fost determinai i parametrii farmacocinetici ai atorvastatinei,
obinandu-se urmtoarele valori : Cmax= 0.09 gmL-1, Tmax=3 h, t1/2= 8.51 h pentru
pacientul 1, pentru Cmax= 0.15 gmL-1, Tmax= 2.52 h, t1/2= 8.37 h pentru pacientul 2, Cmax=
0.19 gmL-1, Tmax= 3.06 h, t1/2= 9.32 h pentru pacientul 3. Pentru pacienii inclui in
studiu efectul atorvastatinei asupra parametrilor farmacocinetici ai clopidogrelului este
modest i nu se recomand ajustarea dozelor sau stoparea medicaiei hipolipemiante.

9
Figura 4. Profilul concentraiei plasmatice a clopidogrelului bisulfat, metabolitului su
de acid carboxilic i atorvastatinei n timp la trei pacieni dup administrarea a 75 mg
clopidogrel i 20 mg (pacient 1), 40 mg (pacient 2) i 80 mg (pacient 3) atorvastatin

10
 IV. CONCLUZII

Au fost propuse teste preliminare pe parcursul metodei cromatografice pentru

optimizarea compoziiei fazei mobile (tampon KH2PO4 i acetonitril) cu parametrii
cromatografici: rezoluie (Rs), timpul de retenie (tR) i factorul de trenare (Tf). Analiza
cromatografic din comprimate a fost posibil prin folosirea unei faze mobile optimizate
cu ajutorul rezultatelor obinute din designul propus, format din tampon KH2PO4 0.01M
(cu pH=2.6 ajustat cu acid ortofosforic 85%): acetonitril: metanol 20:40:40 (v/v/v).
Analiza cromatografic simultan a clopidogrelului i pantoprazolului din plasma
uman a fost determinat prin eluie izocratic cu faza mobil format din ap (pH=3
ajustat cu acid ortofosforic 85%): metanol: acetonitril 36:10:54 (v/v/v) i debitul de 1
mLmin-1. Metoda validat a fost aplicat cu succes n detecia concentraiei plasmatice
a clopidogrelului i pantoprazolului la doi pacieni aflai cu tratament antiagregant
plachetar cu clopidogrel.
Urmtoarea etap a constat n dezvoltarea i validarea unei metode
cromatografice cu eluie n gradient pentru determinarea simultan a clopidogrelului
bisulfat, metabolitului su de acid carboxilic i atorvastatinei din plasma pacienilor cu
tratament antiagregant plachetar cu 75 mg clopidogrel i 20, 40 respectiv 80 mg de
atorvastatin.
Analizele cromatografice se pot continua pe probe plasmatice la pacienii cu risc
cardiovascular major i se pot analiza posibilele interaciuni medicamentoase din
schema de tratament.

V. BIBLIOGRAFIE SELECTIV:

1. M.Z. Khalil, Role of Antiplatelet Therapies in Preventing Atherothrombosis, J.

Hematol. Thromb. Dis.2013, Vol.1, Issue 2.
2. 2015 ESC Guidelines for the management of acute coronay syndromes in patients
presenting without persistent ST-segment elevation, Eur. Heart.J., September 11, 2015.
3. H. Ksycinska, P.Rudzki, M. Bukowska-Kiliszek, Determination of clopidogrel
metabolite (SR26334) in human plasma by LC-MS, J Pharm Biomed Anal. 2006 May 3;
41 (2):533-9.

11
4. L. Silvestro, M.Gheorghe, A.Iordachescu, V.Cuica, A.Tudoroniu, S.Rizea Savu,
I.Tarcomnicu, Development and validation of an HPLC-MS/MS method quantify
clopidogrel acyl glucuronide, clopidogrel acid metabolite and clopidogrel in plasma
samples avoiding analyte back-conversion, Anal. Bioanal Chem. 401(2011)1023-1034.
5. A. Robinson, J.Hillis, C.Neal, A.C. Leary, The validation of a bioanalytical method for
the determination of clopidogrel in human plasma; J Chromatogr B Analyt Technol
Biomed Life Sci, 2007,848(2):344-54.
6. J-J. Zou, H-W Fan, D-Q.Guo, Y-B.Li, Simultaneous Determination of Clopidogrel and
Its Carboxylic Acid Metabolite (SR26334) in Human Plasma by LCESIMSMS:
Application to the Therapeutic Drug Monitoring of Clopidogrel, Chromatographia; 2009,
70(11):1581-1586.
7. G.Di Girolamo, P. Czerniuk, R.Bertuola, Bioequivalence of two tablet formulations of
clopidogrel in healthy Argentinian volunteers: a single-dose, randomized-sequence,
open-label crossover study, Clin Ther. 2010 Jan; 32(1):161-70.
8. S.R. Reddy, K.Rao Divi, I.S.Chandiran, Development and validation of high-
throughput liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for simultaneous
quantification of clopidogrel and its metabolite in human plasma, J. Chromatogr. B.,
2010, 873(3-4):502-8.
9. M. Karazniewicz-Lada, D.Danielak, A.Tezyk, HPLC-MS/MS method for the
simultaneous determination of clopidogrel, its carboxylic acid metabolite and derivatized
isomers of thiol metabolite in clinical samples, J. Chromotogr B; 911:105-12.
10. G. Bahrami, B. Mohammadi, S. Sisakhtnezhad, High-performance liquid
chromatographic determination of inactive carboxylic acid metabolite of clopidogrel in
human serum: Application to a bioequivalence study, J Chromatogr B.; 864(1-2).
11. M-R. Rouini, Y.H. Ardakani, A. Foroumadi, Sensitive Quantification of Carboxylic
Acid Metabolite of Clopidogrel in Human Plasma by LC with UV Detection,
Chromatographia, Volume 70, 953-956.
12. J-J. Zou, H-W Fan, D-Q.Guo, Y-B.Li, Simultaneous Determination of Clopidogrel
and Its Carboxylic Acid Metabolite (SR26334) in Human Plasma by LCESIMSMS:
Application to the Therapeutic Drug Monitoring of Clopidogrel, Chromatographia; 2009,
70(11):1581-1586.

12
13. Adela-Maria Spiridon, J. Neamtu, Ionela Belu, Adina Turcu-Stiolic, O. Croitoru.
Chromatographic Analyses of Clopidogrel and Its Carboxilic Acid Metabolite in
Biological Samples, Currenth Health Sciences Journal, vol.41, Supliment 6, 2015.
14. Adela-Maria Spiridon, J. Neamtu, Ionela Belu, Adina Turcu-Stiolic, O. Croitoru.
Simultaneous Analysis of Clopidogrel Bisulfate, Acetylsalicylic Acid and Atorvastatin
calcium in Tablets by HPLC Method, Current Health Sciences Journal , Vol. 41,
Nr.2,aprilie-iunie 2015
15. International Conference of Harmonization, ICH Q2B : Validation of Analytical
Procedures : Terms and Definitions,Step 5, 1996.
16. 2014 AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation
Acute Coronaty Syndromes: A Report of the American College of Cardiology /American
Heart Association Task Force on Practice Guidelines.
17. O.Croitoru, Adela-Maria Spiridon, Ionela Belu, Adina Turcu-Stiolic, J. Neamtu
Development and Validation of an HPLC Method for Simultaneous Quantification of
Clopidogel Bisulfate, its Carboxylic Acid Metabolite and Atorvastatin in Human Plasma:
Application to a Pharmacokinetic Study, Journal of Analytical Methods in Chemistry

13