1 Article

2 Freeze Drying Ratu Rayap Macrotermes gilvus Hagen.,

3 dan Uji Potensi Antibakteri staphylococcus aureus
4 ATCC 25922
5 Yohannes Alen 1, Delisa Putri 2 and Marhani Dwithania 2,*, Molinda Damris 2,*, Stefany Faula
6 R.P 2,*, and Netty Suharti 1,*.
7 1 Dosen Fakultas Farmasi Universitas Andalas, Sumatra Barat, Padang 25163; yohannesalen@yahoo.co.id;
8 nettysuharti59@gmail.com
9 2 Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Andalas, Sumatra Barat, Padang 25163; delisaaputri@gmail.com;

10 marhani_dwithania@yahoo.com; molindarie_damris@yahoo.com; Stefanyfrp@yahoo.co.id

11 * Correspondence: yohannesalen@yahoo.co.id; Tel: 0813-6336-3339

12 Academic Editor: name

13 Received: date; Accepted: date; Published: date
14 Abstract: Ratu rayap Macrotermes gilvus Hagen., cukup banyak digunakan oleh masyarakat sebagai
15 obat tradisional sebagai pengobatan penyakit diantaranya penggunaan obat penyakit kulit. Uji
16 aktivitas antibakteri konsentrat (sari larut air) ratu rayap Macrotermes gilvus Hagen., telah dilakukan
17 terhadap 13 bakteri uji dengan meggunakan metoda difusi. Didapatkan hasil aktivitas antibakteri
18 terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25922 pada konsentrasi 150 g/cakram. Untuk uji
19 lanjutan, dilakukan uji aktivitas antibakteri ekstrak heksan ratu rayap dan didapatkan aktivitas pada
20 bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25922 pada konsentrasi 150 g/cakram. Sedangkan pada uji dilusi
21 untuk konsentrat (sari larut air) dan ekstrak heksan dalam penentuan minimum inhibitory
22 concentration (MIC) tidak dapat ditentukan karena daya hambat bakteri pada uji difusi memberikan
23 aktivitas antibakteri yang rendah.
24
25 Keywords: Antibacterial, Freeze drying, Queen termite Macrotermes gilvus Hagen, Staphylococcus
26 aureus ATCC 25922.
27

28 0. How to Use this Template

29 The template details the sections that can be used in a manuscript. Note that each section has a
30 corresponding style, which can be found in the Styles menu of Word. Sections that are not
31 mandatory are listed as such. The section titles given are for Articles. Review papers and other article
32 types have a more flexible structure.
33 Remove this paragraph and start section numbering with 1. For any questions, please contact
34 the editorial office of the journal or support@mdpi.com.

35 1. Introduction

36 Pada penelitian sebelumnya telah berhasil didapatkan empat jenis jamur simbiotik sarang
37 ratu rayap Macrotermes gilvus Hagen., yaitu Aspergillus flavus, Mucor sp., Aspergillus niger, dan
38 Cladosporium sp (Alen et al., 2015b). Dari jamur Aspergillus niger, sudah berhasil diisolasi senyawa

Insects 2017, 8, x; doi: FOR PEER REVIEW www.mdpi.com/journal/insects

 Insects 2017, 8, x FOR PEER REVIEW 2 of 8

39 antibiotika yang aktif terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Enterococcus faecalis dengan MIC
40 masing-masing 1000 dan 125 ppm (Alen et al., 2016d). Dari jamur Mucor sp., juga telah diisolasi
41 senyawa antibiotika yang aktif terhadap bakteri Escherichia coli MIC 500 ppm, dan bakteri
42 Staphylococcus bacillus dan Enterococcus faecalis dengan MIC 1000 ppm (Okta, 2016). Isolasi senyawa
43 metabolit sekunder jamur Apergillus flavus Link., simbiotik sarang ratu rayap Macrotermes gilvus
44 Hagen., didapatkan satu senyawa murni GS-12-1 yang merupakan golongan senyawa fenol (Alen et
45 al., 2016f). Profil KLT fraksi etil asetat metabolit sekunder isolat jamur Aspergillus flavus Link., dengan
46 penambahan tanah sarang ratu rayap M. gilvus pada biakan generasi ke 6 menunjukkan 4 bercak
47 noda baru yang menyimpulkan dengan penambahan tanah sarang, isolat jamur membentuk
48 senyawa metabolit sekunder baru (Alen et al., 2017b).
49 Alen et al. (2015a) telah melakukan pengukuran kadar metabolit sekunder pada ratu rayap
50 yang menunjukkan kadar protein 43,54%, lemak 23,31%, serat kasar 1,49%, kadar air 1,22%, kadar
51 abu 8,74%, karbohidrat total 29,19% dan energi total 5765,84 Cal/g. Hasil Freeze drying ratu rayap
52 terbukti memiliki aktivitas sebagai imunomodulator pada dosis 10 mg/kgBB (Alen et al., 2016b) dan
53 juga diketahui berpotensi sebagai obat luka bakar pada dosis 5% (Alen et al., 2016c). Selain itu dari
54 uji pendahuluan diketahui bahwa pada dosis 75 mg/kgBB, ratu rayap berpengaruh terhadap
55 penurunan kadar kolesterol total (Alen et aI., 2016a). Uji toksisitas akut dan sub akut menunjukkan
56 bahwa hasil freeze drying ratu rayap tidak toksik pada organ hati (Alen et al., 2016e).
57 Ratu rayap hidup dan berkembang biak dalam sarang kokoh yang dibangun oleh rayap kasta
58 pekerja. Didalam sarang, ratu rayap dapat hidup dan mempertahankan diri dari mikroba lingkungan
59 yang terdapat pada sarang sehingga diduga ratu rayap memiliki senyawa antibakteri yang dapat
60 melindungi dirinya dari mikroba lingkungan yang terdapat pada sarang. Lamberty et al. (2001) telah
61 berhasil mengisolasi dua senyawa peptide sebagai antimikroba, yaitu termicin dan spinigerin dari
62 jamur yang tumbuh pada termite Pseudacanthotermes spiniger. Solavan et al. (2007) juga melakukan uji
63 antibakteri dari Macrotermes obes Holmgren, Macrotermes estherae (Desneux), dan Odontotermes
64 formosanus Shiraki yang aktif terhadap bakteri Escherichia coli, Pseudomonas putida, Klebsiella sp.,
65 Strataphoromoans bhaumini, Vibrio eltar, Vibrio classical dan Bacillus subtilis (Zeng et al., 2014).
66 Berdasarkan penelusuran pustaka, belum ditemukan penelitian tentang uji antibakteri dari ratu
67 rayap Macrotermes gilvus Hagen.,. Sehingga sangat penting untuk dilakukan uji potensi antibakteri
68 yang dimiliki ratu rayap Macrotermes gilvus Hagen.
69 Skrining senyawa antibakeri masih diperlukan karena berbagai masalah timbulnya
70 resistensi mikroba terhadap jenis-jenis antibiotika tertentu, disamping penyebaran penyakit infeksi
71 yang masih sangat tinggi. Peningkatan penyakit infeksi yang resisten terhadap antibiotik yang
72 umum digunakan telah menjadi masalah di seluruh dunia (Sudha, 2012). Bakteri menjadi resisten
73 untuk dapat bertahan hidup setelah melalui beberapa proses tertentu. Pada akhirnya konsekuensi
74 yang ditimbulkan sangat merugikan baik bagi kesehatan maupun ekonomi (Utami, 2011). Hal ini
75 mendorong untuk ditemukannya produk alternatif pengganti sumber bahan obat yang lebih poten,
76 murah, memiliki efek samping yang lebih kecil, dan tersedia secara kontinu dalam jumlah besar
77 sehingga resistensi bisa diatasi. Oleh karena itu, seiring dengan meningkatnya jenis penyakit dan
78 resistensi bakteri harus diimbangi dengan ekplorasi bahan baku obat serta penemuan obat baru.

79

80
 Insects 2017, 8, x FOR PEER REVIEW 3 of 8

81 2. Materials and Methods

82 Bahan-bahan yang digunakan adalah ratu rayap Macrotermes gilvus Hagen,. yang diperoleh
83 dari kebun kelapa sawit Teluk Kuantan, Riau, media Nutrien Agar (NA), aquadest steril, metanol
84 (MeOH), NaCl fisiologis steril, dimetil sulfoksida (DMSO), etanol 70%, heksan, kloramfenikol,
85 mikroba uji Bacillus subtilis ATCC 6633, Enterococcus faecalis ATCC 10541, Escherichia coli ATCC 11775,
86 Micrococcus luteus ATCC 10240, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella thyphi, Salmonella
87 typhimurium ATCC 14028, Salmonella typhosa NCTC 786, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228,
88 Streptococcus mutans ATCC 25175, Vibrio cholerae, dan Staphylococcus aureus ATCC 25922.
89 Alat yang dibutuhkan untuk pengerjaan ini adalah Laminar Air Flow (Biobase BBS-V800),
90 vortex (Iwaki TM 151), Erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), tabung reaksi (Pyrex), pipet
91 mikro (Gilson), pipet tetes, corong (pyrex) , cawan petri (Normax), pinset, timbangan analitik
92 (Mettler), kapas, kain kasa, benang jagung, lampu spiritus, jarum ose, kertas saring, pembolong
93 kertas, kertas perkamen, batang pengaduk, botol semprot, vial, aluminium foil, autoklaf (YXG.SG41),
94 inkubator, freezer, freeze dryer (Christ).
95 Ratu rayap Macrotermes gilvus Hagen,. di ambil di kebun sawit Teluk Kuantan, Riau sebanyak
96 123 ekor. Disortir dan dilakukan penimbangan, dibekukan didalam freezer di Laboratorium Sentral,
97 Fakultas Farmasi Universitas Andalas. Kemudian dilakukan Frezee drying sampai di peroleh ratu
98 rayap dalam bentuk serbuk.
99 Alat-alat yang digunakan terlebih dahulu dicuci bersih dan dikeringkan. Erlenmeyer di
100 tutup mulutnya dengan kapas dan kassa, kemudian dibungkus dengan kertas koran, kertas cakram
101 di bungkus menggunakan aluminium foil. Kemudian semua alat di sterilkan dengan autoklaf pada
102 suhu 121oC tekanan 15 lbs selama 15 menit. Pinset dan jarum ose disterilkan dengan cara falmbier
103 pada lampu spiritus. Laminar air flow cabinet dibersihkan dari debu dan kemudian disemprot dengan
104 etanol 70%, biarkan selama 15 menit. Setelah itu, disterilkan dengan menyalakan lampu UV selama
105 5 menit, lalu nyalakan bunsen selama lebih kurang 10 menit sebelum digunakan.
106 Serbuk NA dilarutkan dalam 1 liter aquadest sebanyak 28 gram dalam erlenmeyer dan
107 dipanaskan sambil diaduk sampai terbentuk larutan yang jenih. Kemudian disterilkan di dalam
108 autoklaf pada suhu 1210 C tekanan 15 lbs selama 15 menit.
109 Mikroba uji dari stok kultur murni diinokulasi pada medium agar miring NA, lalu diinkubasi
110 selama 24 jam pada suhu 370C, diremajakan setiap satu bulan sekali.
111 Satu ose koloni mikroba uji diambil dari biakan murni dan disuspensikan ke dalam NaCl
112 fisiologis steril, kemudian dihomogenkan dengan vorteks. Kekeruhannya diseragamkan dengan
113 menggunakan standar 0,5% Mc-Farland pada latar belakang hitam dan cahaya terang. Standar
114 kekeruhan 0,5% Mc-Farland dibuat dengan cara 0,5 mL larutan BaCl2 1,175% ditambah dengan 99,5
115 mL H2SO4 1%.
116 Sebanyak 30 mg hasil freeze dying ratu rayap yang telah digerus halus dilarutkan dalam 1 ml
117 aquadest steril, dihomogenkan dengan vorteks hingga didapatkan konsentrasi 3% sebagai larutan
118 induk, kemudian diencerkan hingga diperoleh konsentrasi 1,5%. Larutan ini digunakan untuk
119 skrining antibakteri terhadap 13 mikroba uji.
120 Sebanyak 5 gram sampel hasil freeze dying ratu rayap direndam menggunakan heksan sebanyak
121 50 mL, didiamkan selama 3 hari diikuti dengan pengocokan. Diambil maseratnya dengan cara
122 disaring, maserat diuapkan untuk mendapatkan ekstrak kental heksan. Ekstrak kental heksan lebih
 Insects 2017, 8, x FOR PEER REVIEW 4 of 8

123 lanjut digunakan untuk uji antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25922. Ekstrak
124 dibuat dengan konsentrasi 3% dan 1,5%. Ekstrak heksan dilarutkan menggunakan DMSO.
125 Penelitian ini dilakukan dengan metode difusi menggunakan kertas cakram. Selanjutnya media
126 diinkubasi selama 24 jam dan diamati adanya zona bening di sekitar kertas cakram. Jika terdapat
127 zona bening, maka senyawa tersebut memiliki aktivitas antibakteri. Sebagai kontrol negatif
128 digunakan aquadest steril untuk uji skrining dan uji ekstrak sisa (aquadest) ratu rayap dari ekstraksi
129 heksan sedangkan untuk uji ekstrak heksan kontol negatif yang digunakan adalah DMSO. Sebagai
130 kontrol positif untuk semua uji digunakan kloramfenikol.

131 3. Results

132 Dari uji aktivitas konsentrat serbuk (sari larut air) yang dilakukan terhadap 13 bakteri uji,
133 didapatkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25922 pada konsentrasi
134 150 g/cakram dengan diameter hambat 8 0,163 mm. Pada penelitian ini juga dilakukan uji aktivitas
135 terhadap bakteri Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Untuk memastikan bahwa
136 bakteri yang diujikan adalah strain yang resisten maka dilakukan uji resistensi bakteri terhadap 3
137 jenis antibiotika golongan Beta-laktam yaitu ampisilin (30 g/cakram), cefotaxim (30 g/cakram), dan
138 ceftriaxon (30 g/cakram) (Katzung, 2006). Dari hasil uji resistensi menunjukkan bahwa bakteri yang
139 digunakan dalam penelitian adalah bakteri Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA).
140
141 Tabel 1. Uji aktivitas konsentrat (sari larut air) terhadap 13 bakteri uji
Dia. Hambat (mm) SD

No Bakteri C serbuk (g/cakram)

300 150 Kontrol positif Kontrol
negatif
1 Staphylococcus aureus 13,0 1,414 8,0 0,163 20,0 0,707 -
ATCC 25922
2 Bacillus subtilis ATCC - - 10,5 0,707 -
6633
3 Enterococcus faecalis - - 14,0 1,414 -
ATCC 10541
4 Escherichia coli ATCC - - 10,5 0,707 -
11775
5 Micrococcus luteus ATCC - - 14,0 1,414 -
10240
6 Pseudomonas aeruginosa - - 14,5 0,707 -
ATCC 27853
7 Salmonella thyphi - - 14,0 1,414 -

8 Salmonella typhimurium - - 16,5 0,707 -

ATCC 14028
9 Salmonella typhosa NCTC - - 13,0 2,828 -
786
 Insects 2017, 8, x FOR PEER REVIEW 5 of 8

10 Staphylococcus epidermis - - 14,5 3,535 -

ATCC 12228
11 Streptococcus mutans - - 12,0 2,828 -
ATCC 25175
12 Vibrio cholerae Inaba - - 12,5 0,707 -

13 Methicillin Resistant - - 10,5 0,707 -

Staphylococcus aureus
(MRSA)
142
143 Tabel 2. Uji resistensi bakteri MRSA terhadap antibiotik
Nama Konsentrasi Diameter Hambat (mm) Diameter Hambat (K+)
Antibiotik Kloramfenikol
(g/cakram)
I II (10 g/cakram)
Ampisilin 30 - -

Ceftriaxon 30 - - 18

Cefotaxim 30 - -

144
145 Setelah dilakukan uji aktivitas konsentrat (sari larut air) maka dilakukan uji aktivitas dari
146 ekstrak heksan (liphophilic) ratu rayap terhadap bakteri Sthaphylococcus aureus ATCC 25922. Uji ini
147 dilakukan untuk mengatahui aktivitas dari asam lemak ratu rayap M. gilvus.
148 Pada uji ekstrak heksan (liphophilic), didapatkan aktivitas antibakteri pada konsentrasi 150
149 g/cakram dengan diameter hambat rata-rata 7 0,408 mm. Kandungan lemak ratu rayap
150 Macrotermes gilvus Hagen., sebelumnya telah di analisis oleh Alen et al. (2016) yang mana asam lemak
151 yang dikandung oleh ratu rayap M. gilvus diantaranya adalah asam oleat, asam linoleat, asam
152 eikosapentaenoat (EPA), asam palmitat , dan asam stearat.
153
154 Tabel 3. Uji aktivitas Ekstrak heksan (liphophilic) terhadap S. aureus ATCC 29522

Konsentrasi (g/cakram) Rata-rata (mm) SD Dia. Hambat

Staphylococcus aureus ATCC 25922
Ekstrak heksan
150 7 0,408
300 11 0,244
Kontrol positif
10 20.5 3.535
Kontrol negatif -
155
156

157
 Insects 2017, 8, x FOR PEER REVIEW 6 of 8

158 4. Discussion

159 Aktivitas konsentrat (sari larut air) menunjukkan bahwa kandungan asam amino yang
160 dimiliki ratu rayap M. gilvus dapat memberikan daya hambat tehadap bakteri. Alen et al. (2016c) telah
161 melakukan analisa kandungan asam amino ratu rayap M. gilvus diantaranya L-Fenilalanin, L-Valin,
162 L-Threonin, L-Triftofan, L-Isoluecine, L-Metionin, L-Leusin, dan L-Lysin HCl. Uji aktivitas
163 antibakteri dari masing-masing asam amino tersebut juga telah dilakukan oleh beberapa peneliti
164 yang menunjukkan aktivitas terhadap bakteri Sthaphylococcus aureus dengan mekanisme
165 menghambat sintesa dinding sel bakteri (Zhao et al., 2017: Anwar et al., 2010: Sakiyan et al., 2004:
166 Bodkhe et al., 2012: Oskay et al., 2004: Anufrieva et al., 2015). Telah dilaporkan juga bahwa ratu rayap
167 digunakan sebagai obat penyakit kulit oleh masyarakat (Alen et al, 2016a) yang mana bakteri
168 Staphylococcus aureus merupakan bakteri yang dapat menyebabkan penyalit kulit (DeLeo et al., 2009).
169 Sehingga dapat disimpulkan bahwa kandungan asam amino ratu rayap M. gilvus memiliki aktivitas
170 antibakteri terhadap Sthapylococcus aureus ATCC 25922.
171 Uji ekstrak heksan (liphophilic) dilakukan untuk mengatahui aktivitas dari asam lemak ratu
172 rayap M. gilvus. Untuk memisahkan asam lemak dari serbuk ratu rayap maka dilakukan ekstraksi
173 menggunakan pelarut heksan. Proses ekstraksi asam lemak dilakukan dengan metoda maserasi.
174 Maserasi dipilih karena dapat digunakan untuk menyari sampel dengan jumlah yang besar dengan
175 menggunakan alat yang sederhana untuk sampel yang tidak tahan panas (Djamal, 2010). Maserasi
176 menggunakan pelarut heksan karena heksan adalah pelarut yang baik untuk melarutkan lemak dan
177 biasanya digunakan untuk menghilangkan lemak dari simplisia yang mengandung lemak.
178 Proses maserasi dilakukan selama 3 hari diikuti dengan pengocokan untuk meratakan difusi
179 pelarut. Senyawa metabolit akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan senyawa
180 metabolit yang ada di dalam sel dengan yang diluar sel, maka larutan yang konsentrasi lebih tinggi
181 akan terdifusi ke luar (Heinrich, 2004). Setelah mencapai 3 hari, diambil maseratnya dengan cara
182 disaring, maserat diuapkan untuk mendapatkan ekstrak kental heksan. Ekstrak kental heksan lebih
183 lanjut digunakan untuk uji antibakteri dengan meggunakan metoda difusi.
184 Menurut tinjauan literatur telah dilakukan uji antibakteri dari asam palmitat, asam strearat,
185 asam linoleat , asam oleat (Zheng et al., 2005) dan EPA (Desbois et al., 2013). Merujuk pada hasil ini
186 dapat disimpulkan bahwa kandungan asam lemak ratu rayap Macrotermes gilvus Hagen., memiliki
187 aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 29522. Masih belum jelas
188 bagaimana mekanisme antibakteri dari asam lemak, namun target utamanya adalah membran sel
189 bakteri. Desbois et al. (2009) menjelaskan beberapa mekanisme antibakteri asam lemak dimana asam
190 lemak mengganggu rantai transport elektron sehingga produksi ATP terganggu dan bakteri menjadi
191 kekurangan sumber energi penting. Asam lemak juga mempengaruhi produksi ATP dengan
192 mengikat ATP sintase sehingga gradien proton dan potensial membran menurun yang
193 mengakibatkan ADP tidak dapat diubah menjadi ATP. Karena bentuk strukturnya, penyisipan asam
194 lemak kedalam membran sel bakteri menyebabkan membran menjadi lebih cair dan permeabel
195 sehingga isi internal bocor dari dalam sel dan mengakibatkan penghambatan pertumbuhan bakteri
196 bahkan kematian. Le et al. (2010) juga menjelaskan bagaimana mekanisme antibakteri dari asam
197 lemak oleat dalam mempengaruhi membran sel dimana asam lemak oleat masuk kedalam sel dengan
198 cara menembus dinding sel bakteri dan menembus membran sehingga merusak pertumbuhan sel
199 bakteri.
200
 Insects 2017, 8, x FOR PEER REVIEW 7 of 8

201 5. Conclusions

202 Konsentrat (sari larut air) ratu rayap Macrotermes gilvus Hagen., memiliki aktivitas antibakteri
203 terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25922 pada konsentrasi 150 g/cakram. Aktivitas konsentrat
204 (sari larut air) menunjukkan bahwa kandungan asam amino yang dimiliki ratu rayap M. gilvus
205 diantaranya L-Fenilalanin, L-Valin, L-Threonin, L-Triftofan, L-Isoluecine, L-Metionin, L-Leusin, dan
206 L-Lysin HCl diduga dapat memberikan daya hambat tehadap bakteri. Ekstrak heksan (liphophilic)
207 ratu rayap Macrotermes gilvus Hagen., memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus
208 ATCC 25922 pada konsentrasi 150 g/cakram. Aktivitas ekstrak heksan menunjukkan bahwa
209 kandungan asam lemak yang dimiliki ratu rayap M. gilvus diantaranya asam oleat, asam linoleat,
210 asam eikosapentaenoat (EPA), asam palmitat, dan asam stearat diduga dapat memberikan daya
211 hambat tehadap bakteri.

212 Supplementary Materials: The following are available online at www.mdpi.com/link, Figure S1: title, Table S1:
213 title, Video S1: title.

214 Acknowledgments: All sources of funding of the study should be disclosed. Please clearly indicate grants that
215 you have received in support of your research work. Clearly state if you received funds for covering the costs to
216 publish in open access.

217 Author Contributions: For research articles with several authors, a short paragraph specifying their individual
218 contributions must be provided. The following statements should be used X.X. and Y.Y. conceived and
219 designed the experiments; X.X. performed the experiments; X.X. and Y.Y. analyzed the data; W.W. contributed
220 reagents/materials/analysis tools; Y.Y. wrote the paper. Authorship must be limited to those who have
221 contributed substantially to the work reported.

222 Conflicts of Interest: Declare conflicts of interest or state The authors declare no conflict of interest." Authors
223 must identify and declare any personal circumstances or interest that may be perceived as inappropriately
224 influencing the representation or interpretation of reported research results. Any role of the funding sponsors in
225 the design of the study; in the collection, analyses or interpretation of data; in the writing of the manuscript, or
226 in the decision to publish the results must be declared in this section. If there is no role, please state The
227 founding sponsors had no role in the design of the study; in the collection, analyses, or interpretation of data; in
228 the writing of the manuscript, and in the decision to publish the results.

229 Appendix A
230 The appendix is an optional section that can contain details and data supplemental to the main
231 text. For example, explanations of experimental details that would disrupt the flow of the main text,
232 but nonetheless remain crucial to understanding and reproducing the research shown; figures of
233 replicates for experiments of which representative data is shown in the main text can be added here
234 if brief, or as Supplementary data. Mathematical proofs of results not central to the paper can be
235 added as an appendix.

236 Appendix B
237 All appendix sections must be cited in the main text. In the appendixes, Figures, Tables, etc.
238 should be labeled starting with A, e.g., Figure A1, Figure A2, etc.

239 References
240 References must be numbered in order of appearance in the text (including citations in tables and legends)
241 and listed individually at the end of the manuscript. We recommend preparing the references with a
242 bibliography software package, such as EndNote, ReferenceManager or Zotero to avoid typing mistakes
243 and duplicated references.
244
245 Citations and References in Supplementary files are permitted provided that they also appear in the
246 reference list here.
 Insects 2017, 8, x FOR PEER REVIEW 8 of 8

247
248 In the text, reference numbers should be placed in square brackets [ ], and placed before the punctuation;
249 for example [1], [13] or [1,3]. For embedded citations in the text with pagination, use both parentheses and
250 brackets to indicate the reference number and page numbers; for example [5] (p. 10), or [6] (pp. 101105).
251
252 1. Author 1, A.B.; Author 2, C.D. Title of the article. Abbreviated Journal Name Year, Volume, page range,
253 DOI or other identifier. Available online: URL (accessed on Day Month Year).
254 2. Author 1, A.; Author 2, B. Title of the chapter. In Book Title, 2nd ed.; Editor 1, A., Editor 2, B., Eds.; Publisher:
255 Publisher Location, Country, 2007; Volume 3, pp. 154196.
256 3. Author 1, A.; Author 2, B. Book Title, 3rd ed.; Publisher: Publisher Location, Country, 2008; pp. 154196.
257 4. Author 1, A.B.; Author 2, C. Title of Unpublished Work. Abbreviated Journal Name stage of publication
258 (under review; accepted; in press).
259 5. Author 1, A.B. (University, City, State, Country); Author 2, C. (Institute, City, State, Country). Personal
260 communication, 2012.
261 6. Author 1, A.B.; Author 2, C.D.; Author 3, E.F. Title of Presentation. In Title of the Collected Work (if
262 available), Proceedings of the Name of the Conference, Location of Conference, Country, Date of
263 Conference; Editor 1, Editor 2, Eds. (if available); Publisher: City, Country, Year (if available); Abstract
264 Number (optional), Pagination (optional).
265 7. Author 1, A.B. Title of Thesis. Level of Thesis, Degree-Granting University, Location of University, Date of
266 Completion.
267 8. Title of Site. Available online: URL (accessed on Day Month Year).

268 2017 by the authors. Submitted for possible open access publication under the
269 terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license
270 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).