1.

Pendahuluan

Selama bertahun-tahun, meningkatnya kekhawatiran akan pemanasan global dan penurunan

sumber energi yang berasal dari minyak bumi telah mengakibatkan pergeseran minat terhadap
sumber alternatif untuk produksi bahan bakar dan komoditas bernilai tinggi. Mikroalga adalah
salah satu sumber biofuel yang menjanjikan karena mereka dapat menyerap karbon dioksida dari
udara atau gas buang industri dan tumbuh lebih cepat dari pada tanaman terestrial. Selain itu,
konsentrasi sel alga yang lebih tinggi dapat diperoleh dari berbagai media kultivasi bahkan di
lingkungan ekstrem seperti air yang terkontaminasi (Jiang et al., 2011). Terlepas dari semua
kelebihannya, penelitian tentang biofuel yang berasal dari mikroalga masih menghadapi
rintangan untuk komersialisasi karena biaya produksi. Pada keseluruhan proses produksi
biodiesel, pengeringan sel alga diperlukan untuk meningkatkan efisiensi ekstraksi lipid.

Bahkan jika proses pengeringan dapat mempercepat hasil ekstraksi dan proses konversi, ini
adalah langkah yang sangat membutuhkan energi atau biaya lebih dan meningkatkan biaya
produksi biodiesel (Razon dan Tan, 2011). Dengan demikian, menghilangkan langkah
pengeringan dalam produksi biodiesel sangat penting dalam mengurangi biaya produksi secara
keseluruhan. Namun, mendapatkan biodiesel dari mikroalga basah tanpa proses pengeringan
masih menjadi pilihan.

Untuk tujuan ini, alternatif pendekatan 'in situ' yang mengintegrasikan ekstraksi lipida dan proses
konversi telah dirancang untuk mengurangi biaya pemrosesan dalam memproduksi biodiesel
(Leung et al., 2010). Pendekatan ini dapat mempercepat konversi triasilgliserida (TAG) dalam
mikroalga menjadi biodiesel dengan menggabungkan setiap ekstraksi dan tahap transesterifikasi
ke dalam satu proses operasi tunggal. Banyak karya sebelumnya telah berhasil menyelidiki
transesterifikasi in situ menggunakan metode konvensional microwave, cairan superkritis, dan
ekstraksi pelarut. (Im et al., 2014; Johnson and Wen, 2009; Koberg et al., 2011; Patil et al.,
2013). Percobaan in situ ini kecuali untuk metode superkritis biasanya dilakukan pada tekanan
ambien dengan kisaran suhu 60-100 C dan hanya terfokus pada produksi biodiesel.

Pada suhu yang lebih tinggi dari 100 C, bagaimanapun, pada penelitian ini menekankan
produksi bahan kimia baru seperti etil levulinate (EL), diethyl ether (DEE), dan etil format (EF)
selain biodiesel saat transesterifikasi in situ mikroalga basah. Senyawa kimia berharga ini
diproduksi saat transesterifikasi in situ sel alga basah terjadi dalam satu pot dengan etanol
sebagai reaktan, kloroform sebagai pelarut, dan asam sulfat sebagai katalis. Mereka memiliki
berbagai macam aplikasi. EL yang merupakan hasil esterifikasi asam levulinat (LA) dapat
digunakan sebagai zat penyedap (Leonard, 1956). Selanjutnya, dilaporkan bahwa EL memiliki
sifat yang mirip dengan biodiesel dan penambahan EL ke bahan bakar biodiesel dapat
memperbaiki sifat suhu rendah dari biodiesel (Demirbas, 2011; Joshi et al., 2011). EF produk
lain EF telah banyak digunakan sebagai fumigant untuk menyimpan biji-bijian dan buah (Ren
and Mahon, 2006). DEE juga dapat dicampur dengan diesel untuk properti bahan bakar yang
lebih baik karena DEE memiliki jumlah setana yang tinggi (lebih dari 125) dan miscibility pada
bahan bakar diesel tanpa pelarut (Bailey et al., 1997; Miller Jothi et al., 2007). Selanjutnya, satu
penelitian sebelumnya mengamati bahwa DEE diesel campuran menunjukkan pengurangan
simultan dalam emisi NOx dan asap (Mahalakshmi dan Anand, 2007).

Oleh karena itu, karya ini akan menunjukkan hasil tinggi dari FAEE dan senyawa kimia
sekunder yang berharga dari EL, EF dan DEE menggunakan transesterifikasi satu pot in situ
mikroalga basah. Kami akan menjelaskan mekanisme pembentukan EL dan EF dengan
memisahkan produksi LA dan asam format melalui hidrolisis sel alga, dan esterifikasi terhadap
EL dan EF. Kami juga akan menyelidiki pengaruh kadar air mikroalga, suhu reaksi, volume
etanol, volume kloroform, jumlah katalis asam sulfat, dan jumlah gliserol yang dihasilkan pada
FAEE dan hasil senyawa kimia lainnya. Hasil percobaan akan menunjukkan hasil FAEE yang
signifikan dan senyawa kimia lainnya pada suhu reaksi 125 C. Co-producing FAEE dengan
EL, DEE, dan EF dapat menurunkan biaya produksi biodiesel dan memperbaiki rantai nilai
biodiesel, yang meningkatkan daya saing sistem produksi biodiesel mikroalga.

2. Metode
2.1 Bahan Kimia dan Reagent
Bubuk Nannochloropsis gaditana dibeli dari AlgaSpring (Belanda) dan disimpan dalam
pada suhu 10 C. Kloroform kadar ekstra murni (95%) asam belerang dan reagen (99%)
dibeli dari JUNSEI (Jepang). Etanol ekstra murni (99,5%) dibeli dari Daejung (Korea).
Nilai etil format (etil format) etil format 95% etil format (E0, 99,7%) dibeli dari Sigma-
Aldrich (AS) dan digunakan sebagai referensi. Komponen untuk analisis kromatografi
gas (GC). Ethyl levulinate (EL) dengan kemurnian 98% diperoleh dari TCI (Jepang).
2.2 Analisa GC
Untuk kuantifikasi setiap sampel, fase organik cair termasuk FAEE dan bahan kimia
lainnya disuntikkan ke GC (Agilent 7890b, AS) yang dilengkapi dengan kolom HP-5
(30,0 m 0,32 mm? 0,25 lm). Analisis GC dilakukan dengan detektor ionisasi nyala (FID)
dan helium digunakan sebagai gas make up. Pada setiap analisis, 1 ll sampel cair
disuntikkan. Hasil FAEE dihitung berdasarkan rasio antara luas puncak etil ester C17
standar dan luas puncak FAEE yang dihasilkan dari mikroalga. Hasil bahan kimia
lainnya (EL, EF, dan DEE) diukur dalam GC dengan cara yang sama dengan
pengukuran hasil FAEE. Namun, faktor koreksi digunakan untuk menghitung hasil
masing-masing bahan kimia karena ada perbedaan besar dalam bobot molekul antara
masing-masing bahan kimia dan etil ester C17.
2.3 Hasil Maksimal FAEE
Untuk mengidentifikasi jumlah maksimum FAEE pada sel N. gaditana, eksperimen
berdasarkan metode Folch dilakukan (Folch et al., 1957). Dalam tabung sekrup yang
ditutupi Teflon, 10 mg sel terliofilisasi dicampur dengan 2 ml campuran kloroform dan
etanol (2/1 v / v) dan diendapkan selama 10 menit untuk ekstraksi lipid. 1 ml etanol dan
0,3 ml asam sulfat kemudian ditambahkan ke tabung sampel dan dipanaskan sampai 100
C selama 30 menit. Setelah reaksi transesterifikasi, tabung didinginkan sampai suhu
kamar dan larutan standar 1 ml kloroform yang mengandung 0,5 mg heptadecanoic acid
ethyl ester ditambahkan ke dalam tabung. Pada masing-masing sampel, pemisahan fasa
dilakukan dengan sentrifugasi pada 3500 rpm selama 10 menit dan fase organik
diekstraksi untuk analisis GC lebih lanjut.
2.4 Prosedur Transesterifikasi In Situ
Serbuk mikroalga kering dicampur dengan air deionisasi dan diendapkan selama 30
menit hingga keadaan jenuh endapannya dan kemudian transesterifikasi in situ basah
dilakukan di tabung tertutup sekrup Teflon. Sel alga basah, kloroform, etanol, dan asam
sulfat dicampur dalam tabung dan tabung sampel dipanaskan sampai kisaran suhu 95-
140 C dalam rendaman air (WCH-8, Jerman) dan dipertahankan pada suhu yang
 diinginkan selama 2 jam. Untuk menganalisis pengaruh masing-masing parameter reaksi
terhadap hasil FAEE dan bahan kimia lainnya, kondisi reaksi bervariasi pada kisaran
berikut: suhu (95-140 C), kadar air (0-90 wt.%), Kloroform (0- 3 ml), etanol hingga
rasio biomassa kering (0,15-9 ml / g), dan asam sulfat (0,03-0,7 ml / ml etanol). Setelah
percobaan dilakukan, 1 ml kloroform yang mengandung 0,5 mg heptadecanoic acid
ethyl ester ditambahkan sebagai pereaksi standar untuk analisis GC dan larutan natrium
hidroksida ditambahkan untuk menetralisir sampel cair.
2.5 Prosedure Pembentukan EL, EF dan DEE
Bagian selulosa dalam sel mikroalga dapat dikonversi ke LA dan asam format dengan
hidrolisis asam (Weingarten et al., 2012). Karena LA dan asam format adalah prekursor
esterifikasi EL dan EF, adanya etanol dalam transesterifikasi in situ secara alami
mengubah asam LA dan formik menjadi EL dan EF. Oleh karena itu, tingkat produksi
LA dan asam format melalui hidrolisis sel secara signifikan mempengaruhi hasil EL dan
EF selama transesterifikasi in situ. Gambar. 1a mengilustrasikan prosedur eksperimental
untuk mengkonfirmasi peembentukan EL dan EF yang merupakan produk bersama dari
transesterifikasi transgenifikasi sel tunggal pada sel mikroalga basah (Gambar 1b). Untuk
memverifikasi pembentukan EL dan EF, percobaan konfirmasi dilakukan dengan
memisahkan transesterifikasi satu langkah in situ menjadi dua tahap berikut: (1) hidrolisis
asam sel mikroalga dan (2) esterifikasi asam LA dan asam format.
Pertama, sel alga basah dihidrolisis hanya dengan asam sulfat pada 125 C untuk melihat
pengaruh hidrolisis asam pada hasil EL dan EF dari transesterifikasi in-situ basah satu
langkah. Setelah hidrolisis, tabung didinginkan sampai suhu kamar dan 2 ml etanol
ditambahkan untuk mengekstrak bahan kimia yang dihasilkan. Kemudian, tabung sampel
disentrifugasi pada 3.700 rpm selama 10 menit. Bagian cairan sampel diisolasi di tabung
lain untuk esterifikasi LA dan asam format dengan etanol dan tabung yang berisi bagian
cairan dipanaskan pada suhu 125 C selama 1 jam. Sejalan dengan ini, sel residu
mengalami transesterifikasi in situ untuk mengubah sisa asam lemak menjadi FAEE.
Untuk transesterifikasi in situ, 2 ml kloroform, 1 ml etanol dan 0,3 ml asam sulfat
ditambahkan ke sel sel residu dan dipanaskan pada suhu 125 C selama 1 jam. Setelah
kedua esterifikasi bagian cairan dan transesterifikasi situ padatan residu dilakukan,
kloroform yang mengandung etil ester heptadecanoic ditambahkan ke masing-masing
 tabung dan fase organik masing-masing tabung dianalisis dengan GC. DEE umumnya
diproduksi sebagai produk utama dari etanol di bawah asam dehidrasi pada kisaran suhu
sampai 180 C (Varisli et al., 2007). Karena etanol diberikan secara berlebihan pada
transesterifikasi situase basah, DEE dapat dihasilkan dari dehidrasi etanol.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1 Komposisi Asam Lemak dan Kandungan Lemak
Hasil FAEE maksimum yang menggunakan N. gaditana adalah 12,05% dari berat total
sel kering dengan melakukan prosedur percobaan pada Bagian 2.3. Komponen utama
total lemak dan komposisinya (% berat) adalah asam miristat (C14: 0 - 3.2%), asam
palmitat (C16: 0 - 24,4%), asam palmitoleat (C16: 1 - 31,7%), asam oleat (C18: 1 -
5.3%), asam linoleat (C18: 2 - 1,9%), dan asam eicosapentaenoic (C20: 5 - 28,1%).
Asam palmitat (C16: 0), asam palmitoleic (C16: 1), dan asam eicosapentaenoic (C20: 5)
adalah asam lemak utama yang mengandung 84,2% asam lemak total. Dari hasil
tersebut, N. gaditana, adalah sumber biodiesel yang sesuai mengingat produk ester C16-
C18 telah menjadi kandidat biodiesel yang tepat (Knothe, 2008).

3.2 Pembentukan Senyawa Kimia Tambahan dengan FAEE pada Suhu

Tinggi
Karena transesterifikasi adalah reaksi endotermik, kecenderungan hasil FAEE yang
biasa menunjukkan gerakan ke atas seiring dengan kenaikan suhu (Habaki et al., 2014)
dan dengan demikian, percobaan in situ dilakukan dengan meningkatkan suhu reaksi
apakah hasil FAEE meningkat Sehubungan dengan kenaikan suhu. Kandungan
kelembaban ganggang basah ditetapkan sebesar 65% berat dan berat biomassa kering
0,3 g dan volume etanol adalah 1 ml. Kloroform, etanol dan asam sulfat dipasok sebagai
perbandingan volume transesterifikasi 2: 1: 0,3 dan in situ dipertahankan selama 2 jam
di bawah kisaran suhu 95-140 C.
EL, EF dan DEE yang dihasilkan dianalisis dengan menggunakan GC dengan metode
yang sama untuk analisis FAEE. Seperti yang terlihat pada Gambar. 2a, pembentukan
EL dan EF dapat diabaikan dibandingkan dengan produksi FAEE, yang hasilnya adalah
0,78% dan 0,49% sedangkan hasil FAEE lebih tinggi dari 60% pada 95 C. Hasil FAEE
terus meningkat dan melebihi 90% karena suhu reaksi naik dari 95 menjadi 140 C.
 Gambar. 2b menggambarkan distribusi produk utama FAEE (C14: 0, C16: 0, C16: 1,
C18: 1, dan C20: 5) berdasarkan hasil penggunaan sel alga dengan kadar air 65%.
Komponen FAEE lainnya tidak ditunjukkan karena hanya mengandung 7,3% dari total
FAEE. Sementara semua komponen FAEE secara bertahap meningkatkan hasil
sehubungan dengan kenaikan suhu, EL dan EF meningkat secara dramatis saat suhu
meningkat dari 95 menjadi 125 C. Hanya 0,78% EL dan 0,49% hasil EF diamati pada
95 C dan mereka meningkat dengan cepat hingga 23,1% EL dan 10,3% hasil EF pada
125 C. Ren et al. (2013) juga melaporkan hasil yang sama bahwa EL tidak terdeteksi
pada suhu reaksi rendah dari 80 C dan 100 C.
Kemudian untuk senyawa DEE, produksi DEE juga diabaikan pada 95 C namun
hasilnya mengalami kenaikan hingga 52,1% pada suhu 125 C.
Beberapa penelitian sebelumnya telah dikhususkan untuk meningkatkan hasil biodiesel
dan Tabel 1 menunjukkan kondisi reaksi transesterifikasi in situ. Kecuali satu metode
ekstraksi superkritis menggunakan suhu reaksi di atas 200 C (Patil et al., 2013), yang
lain menggunakan suhu reaksi di bawah 100 C. Co-produksi EL, EF dan DEE dengan
biodiesel tidak pernah dimungkinkan karena suhu yang lebih rendah dari 100 C.
Dengan demikian, mekanisme penghitungan pembentukan yang rinci dan studi
sensitivitas reaksi dieksekusi pada bagian berikut, karena EL, EF dan DEE adalah
produk bersama yang belum pernah ada sebelumnya dari transesterifikasi in situ
mikroalga basah.

3.3 Mekanisme Pembentukan Senyawa EF dan EL dari mikroalga

Seperti yang terlihat pada bagian sebelumnya, jumlah hasil FAEE, EL, EF, dan DEE
sekitar 180% dan lebih besar dari 100% FAEE yield, menunjukkan bahwa bahan kimia
berasal dari sumber awal yang berbeda dari pada lipid. Sumber yang mungkin adalah
hidrolisis selulosa bagian sel mikroalga dan dehidrasi etanol berlebih. Paparan sel
terhadap asam sulfat pada suhu tinggi membuat kemungkinan hidrolisis sel tinggi (Fatih
Demirbas, 2009). Oleh karena itu, kami melakukan hidrolisis sel tanpa etanol untuk
melihat apakah kita dapat memperoleh asam folat dan LA dari hidrolisis sel yang
merupakan prekursor esterifikasi EL dan EF. Fasa cair mewakili produk hidrolisis sel
dan fasa padat residu mewakili sisa asam lemak dan sel alga yang belum terjaga setelah
hidrolisis sel. Tabel 2 menunjukkan hasil yang sesuai. Hasil total produk adalah jumlah
hasil setelah kedua esterifikasi fasa cair dan transesterifikasi in situ Fase padat residu.