Manual Del Laboratorio de Ingeniería Genética

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGA
MANUAL DEL LABORATORIO DE INGENIERA GENTICA
ELABORADO POR:
Dr. Jess Agustn Badillo Corona
Dra. Mara del Carmen Oliver Salvador
Dr. Claudio Garibay Orijel
IBt. Csar Agustn Jimnez Sierra
IBt. Hector Molina Jimnez
Mxico D. F. Agosto 2009

Instituto Politcnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa
Laboratorio de Ingeniera Gentica
Relacin de prcticas
Titulo Sesiones*
Transformacin gentica de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando 13

Agrobacterium tumefaciens
1. Preparacin de material y medios de cultivo
2. Cultivo de Agrobacterium en medio slido
3. Cultivo de Agrobacterium en medio lquido
4. Preparacin de Agrobacterium y modificacin gentica de N. tabacum
5. Transferencia de explantes a medio de seleccin
6. Preparacin de material y medios de cultivo
7. Transferencia de explantes a medio de seleccin fresco
8. Transferencia de transformadas a medio para formar races
9. Diseo de primers
10. PCR confirmatoria de la insercin del transgn
11. Anlisis de productos de PCR en gel de agarosa
12. Anlisis de resultados
13. Presentacin y discusin de resultados
Anlisis de la expresin de un gen exgeno en E. coli 8
a. Preparacin de medios de cultivo y material para la prctica
b. Preparacin de clulas competentes de E. coli BL21
c. Transformacin de las clulas de E.coli BL21 con el vector pET16b y

comprobacin de la insercin de este
d. Seleccin de clulas transformadas
e. Induccin del gen gfp
f. Separacin de las protenas en gel de poliacrilamida
g. Anlisis de resultados
h. Presentacin y discusin de resultados
*La sesiones necesarias para la realizacin de cada prctica no son necesariamente continuas.
Manual elaborado por Jess Agustn Badillo Corona, Mara del Carmen Oliver Salvador, Claudio Garibay Orijel, Csar Agustn 2
Jimnez Sierra y Hector Molina Jimnez
Prctica 1
Transformacin gentica de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando

Agrobacterium tumefaciens
1. INTRODUCCION
La modificacin gentica de plantas tiene varios objetivos, entre los que se encuentran: la
generacin de especies resistentes a condiciones de estrs (sequa, estrs osmtico, etc.),
la mejora nutricional de la especies (aumento en el contenido de aminocidos o
precursores de vitaminas, etc.), obtencin de plantas para fitoremediacin (remocin de
metales pesados), la obtencin de variedades con flores de color no convencional, la
produccin de alguna protena o metabolito con propiedades teraputicas (vacunas,
anticuerpos, alcaloides, etc.).
Esta ltima es de gran inters para los Ingenieros Biotecnlogos ya que la produccin de
metabolitos y protenas en plantas presenta varias ventajas en comparacin con el resto
de los sistemas de produccin. Algunas de estas ventajas son: el costo de produccin es
en muchos casos menor, hay una mayor facilidad de escalamiento, protenas ms
complejas (anticuerpos, protenas con varios enlaces disulfuro, protena que requieren un
procesamiento postraduccional, etc.) pueden ser producidas. Adicionalmente, las semillas
y granos pueden ser utilizados como sitio de almacenamiento.
La modificacin gentica de plantas puede llevarse a cabo utilizando diferentes mtodos

los cuales pueden ser qumicos, fsicos o biolgicos. Entre los mtodos qumicos se
encuentra el mtodo mediante el cual se permeabiliza la membrana con polietilenglicol
(PEG) con lo cual se facilita la introduccin del material gentico. Sin embargo, el
tratamiento con PEG tiene la desventaja de que requiere de protoplastos en lugar de
clulas con pared celular intacta (los protoplastos responden de manera menos eficiente
en cultivo in vitro). Entre los mtodos fsicos se encuentran principalmente la
microinyeccin y el bombardeo de micropartculas (tambin conocido como biobalstica).
Este ltimo, que consiste en la introduccin del material gentico al interior del ncleo
utilizando micropartculas aceleradas de oro o tungsteno, ha cobrado particular
importancia en la ltima dcada, a pesar del costo elevado, debido a que es altamente
efectivo y reproducible.
A pesar de ello, el mtodo por excelencia para la modificacin gentica nuclear de

plantas es el que utiliza Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens y otras especies
relacionadas como A. rhizogenes y A. vitis, son patgenos no destructivos de plantas que
tienen la capacidad de integrar establemente parte de su material gentico dentro del
genoma de su hospedero. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en
diversos campos de la biologa vegetal, agricultura y biotecnologa [1].
Desde el ao 1970 hasta la fecha se ha estudiado a detalle el mecanismo por el cual A.

tumefaciens induce la formacin de tumores en plantas y el conocimiento adquirido ha
sido fundamental para su uso como herramienta en la ingeniera gentica de plantas.
Durante el proceso de infeccin A. tumefaciens introduce en la clula vegetal una parte de
su ADN (ADN de transferencia; T-DNA) el cual es integrado dentro del genoma de la
planta. Los genes del T-DNA son expresados en su hospedero e inducen la formacin de
tumores y la sntesis de aminocidos no proteicos llamados opinas los cuales son
utilizados por A. tumefaciens como fuente de carbono y nitrgeno. El T-DNA esta
localizado en el plsmido Ti (Plsmido inductor de tumor; tumor inducing plasmid), que
adems contiene los genes vir que son necesarios para la transferencia e incorporacin
del fragmento de ADN en el genoma de la planta. La especie A. rhizogenes produce el
crecimiento vigoroso de las races infectadas mediante un mecanismo semejante al de A.
tumefaciens. En este caso el plsmido que contiene el T-DNA es llamado Ri (plsmido
inductor de races; root inducing plasmid).
Un hallazgo crucial que permiti el diseo de vectores para la transformacin

gentica de plantas mediante el uso de especies de Agrobacterium es el hecho que slo
las secuencias borde del T-DNA son requeridas para que la transferencia se lleve a cabo.
Algunos o todos los genes bacterianos del T-DNA pueden ser removidos originando
vectores desarmados, los cuales pueden transformar clulas vegetales sin los sntomas
generales de la infeccin bacteriana [3].
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Conocer y aplicar la metodologa para llevar a cabo la modificacin gentica

nuclear de Nicotiana tabacum (planta del tabaco) utilizando Agrobacterium
tumefaciens.
2.2 Objetivos especficos
Conocer el principio bsico de la modificacin gentica nuclear de plantas

utilizando un vector binario.
Conocer y llevar a cabo la metodologa bsica para la obtencin de plntulas
modificadas genticamente.
Conocer y llevar a cabo la metodologa para la identificacin de plantas
modificadas genticamente.
3. MATERIALES
3. 1 Materiales biolgicos
Plsmido pROK CRE. Este plsmido es un derivado del plsmido pBIN 19, el
cual contiene el gen CRE fusionado a la secuencia del pptido de transferencia
RbcS y se encuentra bajo el control del promotor 35S. Contiene adems el gen
nptII que codifica para la enzima neomicin fosfotransferasa la cual confiere
resistencia a kanamicina en las clulas portadoras del gen.
Cepa de A. tumefaciens LBA4404 que contiene en plsmido binario desarmado
que porta los genes vir.
Plantas de N. tabacum cultivadas en condiciones de asepsia en un cuarto de
cultivo a 25C durante 4-6 semanas.
Primers para la amplificacin total o parcial por PCR del gen nptII.
3.2 Equipos
Campana de flujo laminar, autoclave, potencimetro, balanza analtica, agitadora

orbital, incubadora a 37C, parrilla, micro centrifuga,
3. 3 Material de laboratorio
Matraces Erlenmeyer, vasos de precipitados de 250 mL, juego de micropipetas,

cajas Petri desechables, algodn, bistur, pinzas de diseccin, papel filtro, papel
aluminio, tubos desechables de 1.5 mL, tubos desechables de 50 mL, un
horadador de 0.5 cm de dimetro.
3.4 Reactivos y medios de cultivos
Medio LB, Ampicilina 100 mg/mL, Carbamicilina 500 mg/mL, Kanamicina 100
mg/mL, etanol al 70%, solucin de hipoclorito de sodio 5.5 % de cloro libre
(solucin al 10% de cloro comercial), HCl 1.0 N, NaOH 1N, agua grado biologa
molecular.
4. MTODOS
Primera sesin. Preparacin de material y medios de cultivo
Preparar los siguientes materiales y reactivos (Ver anexos para composicin de

soluciones y reactivos)
ampicilina 100 mg/mL

kanamicina 100 mg/mL
estreptomicina 100 mg/mL
carbamicilina 500 mg/mL
Medio LB
Medio NBM
5 cajas Petri con medio LB y antibiticos: kanamicina 25 g/mL y estreptomicina

300 g/mL.
5 cajas Petri con un disco de papel filtro que cubra toda la superficie
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio LB liquido con antibiticos:
kanamicina 25 g/mL y estreptomicina 300 g/mL.
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio MS0
5 cajas Petri con medio NBM sin antibiticos
5 cajas Petri con medio NBM con antibiticos: kanamicina 100 g/mL y
carbamicilina 500 g/mL.
Segunda sesin. Cultivo de Agrobacterium en medio slido.
1. Tomar el stock de la cepa de A. tumefaciens LBA4404 y sembrar por estra

simple en una de las placas con medio LB con kanamicina y estreptomicina.
2. Control positivo. Inocular una cepa silvestre de Agrobacterium en otra placa con
medio LB con kan y estr.
3. Incubar ambas cajas a 28 C por 36-48 h.
Tercera sesin. Cultivo de Agrobacterium en medio lquido.
1. Transferir una colonia de Agrobacterium a un matraz de 250 mL con 50 mL de

medio LB con kan 50 mg/L, estrep 300 mg/mL e incubar en agitacin constante (200
rpm) a 28C durante 36-48 h.
Cuarta sesin. Preparacin de Agrobacterium y modificacin gentica de N.

tabacum
1. Centrifugar el cultivo de A. tumefaciens obtenido como resultado del trabajo

experimental de la tercera sesin a 7500 rpm por 10 min a 4 C en un tubo de
estril de 50 mL.
2. Decantar el sobrenadante
3. Resuspender la pastilla celular en 5 mL de MS0 (mantener en hielo).
4. Cortar 3-4 hojas de plntulas de tabaco cultivadas en condiciones de asepsia.
5. Colocar las hojas sobre el papel filtro contenido en las cajas Petri.
6. Cortar las hojas con el bistur y pinzas (o con un horadador) para obtener
explantes de 0.5 cm x 0.5 cm aproximadamente. Realizar este paso de forma
rpida evitando daar de manera excesiva el tejido.
7. Recuperar los explantes e incubarlos directamente en la suspensin de A.
tumefaciens agitando ocasionalmente durante 30 min.
8. Recuperar los explantes con unas pinzas, secar por contacto ligero en papel filtro
estril.
9. Colocar en las cajas con medio NBM con la epidermis inferior hacia arriba.
Presionar ligeramente para que los explantes entren en contacto con el medio.
10. Incubar los explantes a 25 C con un fotoperiodo de 16 h luz durante 48 h.
Quinta sesin. Transferencia de explantes a medio de seleccin
1. Despus de 48 h tomar los explantes (cuarta sesin) y transferirlos a las cajas de

Petri con medio NBM (kan 100 g/mL, car 200 g/mL). Tener cuidado de que los
explantes mantengan la misma orientacin y de daarlos lo menos posible.
2. Colocar las cajas en incubacin a 25 C con un fotoperiodo de 16 h luz durante 3-
4 semanas.
Sexta sesin. Preparacin de material y medios de cultivo
1. Preparar el siguiente material:
Medio NBM
5 cajas Petri con medio LB y antibiticos: kanamicina 25 g/mL y estreptomicina

300 g/mL.
5 cajas Petri con un disco de papel filtro que cubra toda la superficie
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio LB liquido con antibiticos:
kanamicina 25 g/mL y estreptomicina 300 g/mL.
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio MS0
5 cajas Petri con medio NBM sin antibiticos
5 cajas Petri con medio NBM con antibiticos: kanamicina 100 g/mL y
carbamicilina 500 g/mL.
Sptima sesin. Transferencia de explantes a medio de seleccin fresco
a. Despus de 4 semanas, transferir los explantes a medio fresco NBM con

kanamicina 100 g/mL. Tener cuidado de mantener la misma orientacin y de no
daar el tejido. Si los explantes se han expandido mucho y son demasiado
grandes, transferirlos a dos cajas.
Octava sesin. Transferencia de transformadas a medio para formar races
a. Conforme vayan apareciendo, transferir los brotes resistentes a kanamicina a

medio MSB5 con kanamicina (100 mg/ml) y carbamicilina (200 mg/ml) para
favorecer la formacin de races.
Novena sesin. PCR confirmatoria de la insercin del transgn
a. Tomar una porcin de brote no mayor a 1 mm e incubarla con 20 L de solucin

(2 L buffer 10X, L dNTP 2mM, 2.5 L de primer F (3pm/ L), 2.5 L de
primer R (3pm/ L), 3 L MgCl2 25mM, 1 L Taq pol 1u/mol y 7 mol agua).
Realizar estos pasos en hielo.
b. Realizar la PCR bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo de 5 min a 94 C, 35
ciclos de 30s a 94C, 30 s a 55C, 30s a 72C y 1 ciclo de 5 min a 72C.
c. Almacenar a -70C o a -20C.
Dcima sesin. Anlisis de productos de PCR en gel de agarosa
a. Prepara un gel de agarosa al 1% siguiendo las instrucciones dadas por el profesor.

b. En el pozo nmero 1 del gel correr el marcador de peso molecular
c. Correr el producto de PCR obtenido en la novena sesin en un gel de agarosa al
1%.
d. Correr tambin controles negativos y positivos a la par.
e. Teir el gel con Rojo Texas.
Undcima sesin. Anlisis de resultados
Esta sesin ser dedicada al anlisis de resultados de forma grupal con la moderacin del
profesor.
Duodcima sesin. Presentacin y discusin de resultados
Presentacin y discusin de los resultados por parte de los estudiantes de forma grupal.
5. Cuestionario y recomendaciones para el informe
1-. Mencionar 5 recomendaciones para la elaboracin de primers.

2-. Qu primers se utilizaron en la prctica? Y cul es el objetivo de su uso en la
presente prctica?
3-. Qu es el T-DNA?
4-. Mencionar 5 componentes bsicos del sistema binario de vectores utilizado en la
prctica
5-. Mencionar otros mtodos de transformacin de plantas as como sus ventajas y
desventajas.
6-. Cul es el objetivo de modificar genticamente las plantas?
7-. Logr transformar plntulas de N.tabacum? Cmo se observan estas
fenotpicamente en comparacin con las lneas silvestres? Cmo se observa esto en el
gel de electroforesis?
8-. Cul es el objetivo de realizar una PCR en la prctica?, podra eliminar este paso?,
bajo que condiciones?
El informe de la prctica debe contener los resultados de los todos los equipos y hacer la
discusin y conclusiones de los experimentos realizados.
6. BIBLIOGRAFIA.
[1] Valderrama Fonseca A. M ; Arango Isaza R. ; Afanador Kafuri L. Transformacin de

plantas mediada por Agrobacterium: Ingeniera gentica natural aplicada.
Rev.Fac.Nal.Agr.Medelln.Vol.58, No.1.p.2569-2585.2005.
[2] Tzfira, t.; Vaidya, m. and Citovsky, V. Increasing plant susceptibility to

Agrobacterium infection by overexpression of the Arabidopsis nuclear protein VIP1.
Proceedings of the Natural Academy of Sciences USA. Vol. 99, No.16 (2002); p.10435-
10440.
[3] Garfinkel, D. J. et al. Genetic analysis of crown gall: fine structure map of the TDNA
by site-directed mutagenesis. Cell. Vol. 27 (1981); p. 143-153.
[4]Bioline. HyperLadder I. Bandas de referencia para un gel de 1% agarosa.

www.bioline.com/images/guides/ladderguide/HL1_PopUp.jpg Consulta: 14/Junio/2009
[5] Hansen, G. and Chilton, M-D. Lessons in gene transfer to plants by a gifted microbe,
in Current Topics in Microbiology and Immunology (Vol. 240), Plant Biotechnology
Prctica 2
Anlisis de la expresin de un gen exgeno en E. coli
1-. INTRODUCCION
La produccin de protenas para diversas aplicaciones ha ido en aumento, pasando de la

escala experimental hasta la industrial, en algunos casos. Para ello se han estudiado y
desarrollado diversos sistemas de expresin. De todos estos, los sistemas de expresin
bacterianos son los ms atractivos debido a su rpido crecimiento con alta densidad en
sustratos de bajo costo, genomas ampliamente caracterizados y un creciente nmero de
vectores y cepas hospederas mutantes (Terpe 2006).
E. coli y sistema de expresin T7
El sistema bacteriano ms utilizado es el que emplea a Escherichia coli, en especial E.

coli BL21 la cual es usada principalmente para la produccin de protenas dado que es
una cepa ampliamente estudiada, adems posee algunas caractersticas en su genotipo
que la hacen idnea para dicho propsito, dentro de las que destacan las siguientes:
lon: deficiente en esta proteasa que degrada las protenas heterlogas
ompT negativa degrada protenas extracelulares
F- incapaz de generar una sola hebra de DNA
gal: deficiente en el metabolismo de galactosa
dcm: deficiente en metilacin de citocinas
Posee un gen de RNA pol T7
Con las propiedades antes mencionadas y aprovechando la expresin de la RNA pol T7

se puede emplear en conjunto con esta cepa un vector que posea un promotor del mismo
bacterifago (T7), por lo cual el sistema de vectores pET son la opcin adecuada para
introducir transgenes de inters.
Vectores pET
Es una familia de vectores derivada del plsmido pBR322. Poseen una secuencia
consenso de alta afinidad a la T7 Pol, y de muy baja afinidad a la polimerasa de E. coli.
El gen de inters esta clonado despus de esta regin promotora, por lo que su expresin
en cepas que carecen de la polimerasa del bacterifago T7 es sumamente baja.
Cuando se conjuga una cepa como BL21 y un plsmido de la familia pET se tiene alto
control sobre la expresin de la protena de inters pues esta solamente es inducida
cuando se aade al medio de cultivo un inductor del opern lac. Generalmente se utiliza
un inductor gratuito como el IPTG.
2-. OBJETIVOS
2.1-. General:
Expresar un gen exgeno en una cepa de E. coli BL21.
2.2-. Especficos:
Preparar clulas competentes de E. coli BL21

Transformar clulas competentes con el plsmido pET16b
Seleccionar clulas transformadas por cultivo en medio con penicilina
Inducir la expresin de transgn.
Detectar la protena de inters en PAGE.
3-. MATERIAL
3.1-. BIOLOGICOS:
Cepa E.coli BL21, vector pET16b con el gen de la protena verde fluorescente gfp de
Aquea victoria.
3.2-. EQUIPOS
Autoclave, cmaras para electroforesis en gel de agarosa, centrifuga, agitadora de

matraces, incubadora a 37C
3.3-. MATERIAL DE LABORATORIO
Matraces, micropipetas y puntas, cajas petri, tubos eppendorf de 0.5 mL y de 1.5 mL,
4. METODOLOGA
Sesin 1. Preparacin de medios de cultivo y material para la prctica.

Preparar el siguiente material:
4 matraces de 250 mL con 50 mL de medio LB
2 tubos de 25 mL con 5 mL de medio LB
500 mL de Cloruro de Calcio 0.1 M.
Tubos de 1.5 mL y de 0.5 mL y puntas estriles de 200 L y 1000 L
Sesin 2. Preparacin de clulas competentes de E. coli BL21

Uno de los pasos cruciales en cualquier metodologa de Biologa Molecular es la
obtencin de clulas competentes, listas para poder amplificar plsmidos o para sobre
producir protenas de inters. El mtodo para hacer clulas competentes por cloruro de
calcio es uno de los ms rutinarios y eficientes, adems de ser extremadamente barato.
1. Incubar E. coli a 37C por 16 h en placas de agar LB

2. Transferir una colonia de E. coli a 5 mL de medio LB e incubar a 37C con agitacin
a >200 rpm durante toda la noche (12-16 h).
3. Transferir 0.5 mL del cultivo a 50 mL de medio LB e incubar a 37C con agitacin,
hasta que la densidad ptica a 590 nm sea de 0.3 a 0.4 (aproximadamente 3-4 horas)
4. Transferir 50 mL de clulas a un tubo de propileno fro y estril y mantenerlo por 10
min a 4C.
5. Centrifugar a 6000 rpm por 10 min
7. Resuspender el paquete celular en 25 mL de CaCl2 estril (0.1 M, fro)
8. Colocar el tubo en hielo durante 10 min a 4C.
9. Centrifugar a 6000 rpm por 10 min a 4C.
11. Con la ayuda de una pipeta pero con extremo cuidado, resuspender el paquete celular
en 1-2 mL de CaCl2 estril (0.1 M, fro).
12. Las clulas competentes pueden ser usadas inmediatamente o almacenadas por 24-48
h a 4C.
13. Para periodos de almacenamiento ms largos, guardar en alcuotas de 100 L en
tubos estriles de 1.5 mL.
14. Guardar la clulas competentes a -70C. Las clulas se mantienen viables por
aproximadamente 3 meses.
Sesin 3. Transformacin de las clulas de E.coli BL21 con el vector pET16b y

comprobacin de la insercin de este.
1. Tomar una alcuota de clulas competentes y dejar descongelar en hielo.

2. Manteniendo las clulas en hielo, adicionar 1-5 L del vector.
3. Mezclar suavemente con la punta de la pipeta.
4. Mantener en hielo por 5-10 min.
5. Opcional: Transferir el tubo a un bao de agua a 42C por 30 s.
5 a. Adicionar 1 mL de medio rico en nutrientes SOC.
5 b. Incubar por 1 h a 37C con agitacin suave.
6. Tomar 100 L de las clulas competentes y sembra por extensin con varilla en
medio LB suplementado con el antibitico adecuado.
7. Si se realiz el paso 5, tomar 50, 100 y 200 L y sembrar igual que en el paso 6.
8. Incubar las cajas a 37C durante toda la noche (12-16 h).
9. Llevar a cabo los controles correspondientes
Sesin 4. Seleccin de clulas transformadas.
1. Hacer observaciones de las cajas Petri. Poner especial atencin a los controles.
2. Almacenar las cajas a 4C hasta el momento de usarlas
3. Tomar una colonia y transferirla a un tubo con 5 mL de medio LB con ampicilina
100 g/mL.
4. Incubar los tubos en agitacin durante toda la noche (12-16 h) con agitacin
constante (>200 rpm) a 37C
Sesin 5. Induccin del gen gfp
1. Transferir 0.5 mL del cultivo obtenido en la sesin 4 a 50 mL de medio LB (Amp

100 g/mL) en matraces de 250 mL.
2. Incubar los matraces en agitacin durante 4-5 h con agitacin constante (>200
rpm) a 37C.
3. Despus de 4-5 h tomar una muestra de 1 mL
a. Centrifugar por 5 min a 7500 rpm a temperatura ambiente
b. Desechar el sobrenadante
c. Congelar la pastilla celular a -20C hasta su uso posterior
4. Despus de tomar la muestra, adicionar IPTG 1 mM y continuar incubando los
matraces en agitacin durante 6 h con agitacin constante (>200 rpm) a 37C.
5. Tomar y procesar muestras cada hora como se describe en el paso 3.
6. Despus de 6 h esterilizar y desechar el cultivo
Sesin 6. Separacin de las protenas en gel de poliacrilamida
1. Preparar el gel de poliacrilamida siguiendo las instrucciones recibidas.

2. Adicionar 5-10 L del buffer de carga directamente a las muestras congeladas.
3. Mezclar suavemente y hacer un orificio en la tapa del tubo
4. Incubar por 5-10 min a 95C en un bao de agua o en un termobloque
5. Retirar del calor y colocar inmediatamente en hielo durante 10-15 min.
6. Centrifugar brevemente para colectar la muestra en el fondo del tubo.
7. Cargar en los pozos del gel.
8. Correr el gel a 70 mA hasta que el buffer de carga llegue casi a la base del gel.
9. Desmontar el equipo
10. Colocar el gel en una solucin de azul de Coomassie durante toda la noche.
Sesin 7. Anlisis de resultados
Esta sesin ser dedicada al anlisis de resultados de forma grupal con la

moderacin del profesor.
Sesin 8. Presentacin y discusin de resultados
Presentacin y discusin de los resultados por parte de los estudiantes de forma

grupal.
5-. CUESTIONARIO Y RECOMENDACIONES PARA EL INFORME ESCRITO
1. Qu caractersticas tiene la cepa de E.coli BL21

2. Mencione como funciona el sistema de vectores PET y que ventajas tiene en
comparacin con otros vectores
3. Cul es el peso molecular de la protena codificada?
4. Qu es el IPTG?
5. Una vez que adicion IPTG a la muestra, Qu paso con la biomasa?, aumento,
diminuy, permaneci igual cmo puede confirmarlo?
6. Incluir en su informe, al menos un artculo, reciente, sobre el tema
7. Cul sera el comportamiento observado en el gel, si se continuara con la cintica?
En una produccin de una protena recombinante X, cuyo material gentico es insertado a
la clula por un sistema de vectores PET, segn lo experimentado cul es el tiempo
recomendado para inactivar a las clulas? Porqu?
6. BIBLIOGRAFA
1-. Terpe Kay (2006). Overview of bacterial expresin systems for heterologous protein
production: from molecular and biochemical Fundamentals to comercial systems.
Microbiol Biotechnol.
ANEXO I
Medio Luria Bertani (LB) .

Extracto de Levadura 5 g/L
Triptona de Casena 10 g/L
Cloruro de Sodio 10 g/L
pH 7.0
Medio SOC
Extracto de Levadura 5 g/L

Triptona de Casena 20 g/L
Cloruro de Sodio 0.5 g/L
Cloruro de potasio 2.5 mM
pH 7.0
Despus de esterilizar adicionar 20 mL/L de glucosa 1 M (filtrado 0.22 m).
Antibiticos
Estreptomicina 300 mg/ml
Kanamicina 25 mg/ml
Ampicilina 100 mg/ml
Carbamicilina 200 mg/ml
Medio Base Murashigue y Skoog (MS)
MS I ( Macronutrientes ) mg/L
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2.2H2O 440
MgSO4.7H2O 370
KH2PO4 170
MS II ( Micronutrientes )
IK 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4.4H2O 22.3
ZnSO4.7H2O 8.6
NaMoO4.2H2O 0.25
CuSO4..5H2O 0.025
CoCl2.6H2O 0.025
MS III ( Fe- EDTA )
EDTA 37.3
FeSO4.7H2O 27.8
MS0
Medio Base MS
Sacarosa 30 g/L
pH 5.5
MSB5
Medio MS0
Inositol 1 mg/L
Piridoxina 0.1 mg/L
Tiamina 2 mg/L
cido Nicotnico 0.1 mg/L
pH 6
NBM
Medio MSB5
cido Naftalen Actico (NAA) 0.1 mg/L
Benzil Aminopurina (BAP) 1 mg/L
pH 5.9
ANEXO II
PROCEDIMIENTOS DE SEGURIDAD
En Biologa Molecular se emplean algunos reactivos qumicos peligrosos, por esta razn
el frasco que contiene el reactivo, deber llevar una etiqueta que describa la naturaleza de
riesgo y los procedimientos de seguridad que debern seguirse, cuando se trabaja en un
laboratorio con tcnicas de Biologa de Molecular.
Los qumicos peligrosos se pueden clasificar en tres categoras:
Solventes orgnicos. Uno de los disolventes orgnicos ms peligroso, que se emplea en

Biologa Molecular, es el fenol. Este es altamente corrosivo y puede causar quemaduras
severas; cuando se emplee este reactivo se deben utilizar guantes y lentes de seguridad,
su manejo debe hacerse en campana de extraccin.
Mutgenos y carcingenos. La mayora de los qumicos que se unen al DNA son

mutgenos y/o carcingenos. Un ejemplo es el bromuro de etidio empleado para la
deteccin del DNA en geles de agarosa.
Qumicos txicos. En el laboratorio de Biologa Molecular se emplea la acrilamida, este

compuesto puede tener efectos neurotxicos (si hay contacto con la piel o por inhalacin.
Otro qumico con el que se debe tener sumo cuidado es el laurel sulfato de sodio (SDS).
Al pesar SDS se recomienda usar una mascara al terminar de pesar limpiar bien la
balanza, ya que los cristales se dispersan fcilmente.
El manejo adecuado de cualquier compuesto txico reduce notablemente su peligrosidad.

Por lo que se recomienda usar siempre guantes; al medir soluciones con pipeta, nunca
deber hacerse con la boca, para este fin se recomienda el uso de una propipeta y si por
accidente se tiene contacto con alguno de estos compuestos en la piel, el rea afectada
debe lavarse con agua en abundancia y se informar de inmediato al encargado del
laboratorio.
Los desperdicios conteniendo los qumicos peligrosos mencionados se deben depositar en

contenedores apropiados y no mezclarse con los desechos comunes. Y se debe tomar en
cuenta las siguientes indicaciones:
1. Es importante usar un sistema para el manejo adecuado de residuos contaminados con

bromuro de etidio (EtBrom) tanto slidos o lquidos. No se deben desechar junto con los
dems desechos. Y sobre todo es importante jams calentar el bromuro de etidio. El
buffer de electroforesis se puede re usar pero jams usar este para preparar la agarosa
pues ya contiene EtBrom. Se recomienda usarlo nicamente cuando sea estrictamente
necesario. Y en lugar de este, usar otros reactivos para tincin de DNA en geles como:
SYBR Green, SYBR Safe, Gel Red o Syber Gold.
2. La disposicin de la acrilamida debe de ser en forma similar. Y de preferencia la

acrilamida que se compre debe de ser ya disuelta, en una solucin al 30 % que solo
requiere ser diluida. Con lo que se ahorran todos los problemas de pesarla cuando esta en
polvo y disminuye los riesgos de toxicidad. Aun ya polimerizada hay siempre residuos
que son txicos, por lo que jams debe de ser tocada con las manos.
Bibliografa
Sambrook, J. & D. Russel 2001. Molecular Cloning Book 1. 3ra. ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press USA

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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

MANUAL DEL LABORATORIO DE INGENIERA GENTICA

Dr. Jess Agustn Badillo Corona

Dra. Mara del Carmen Oliver Salvador

Dr. Claudio Garibay Orijel

IBt. Csar Agustn Jimnez Sierra

IBt. Hector Molina Jimnez

Mxico D. F. Agosto 2009

Transformacin gentica de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando 13

1. Preparacin de material y medios de cultivo

2. Cultivo de Agrobacterium en medio slido

3. Cultivo de Agrobacterium en medio lquido

4. Preparacin de Agrobacterium y modificacin gentica de N. tabacum

5. Transferencia de explantes a medio de seleccin

6. Preparacin de material y medios de cultivo

7. Transferencia de explantes a medio de seleccin fresco

8. Transferencia de transformadas a medio para formar races

10. PCR confirmatoria de la insercin del transgn

11. Anlisis de productos de PCR en gel de agarosa

12. Anlisis de resultados

13. Presentacin y discusin de resultados

Anlisis de la expresin de un gen exgeno en E. coli 8

a. Preparacin de medios de cultivo y material para la prctica

b. Preparacin de clulas competentes de E. coli BL21

c. Transformacin de las clulas de E.coli BL21 con el vector pET16b y

d. Seleccin de clulas transformadas

e. Induccin del gen gfp

f. Separacin de las protenas en gel de poliacrilamida

h. Presentacin y discusin de resultados

Transformacin gentica de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando

La modificacin gentica de plantas puede llevarse a cabo utilizando diferentes mtodos

A pesar de ello, el mtodo por excelencia para la modificacin gentica nuclear de

Desde el ao 1970 hasta la fecha se ha estudiado a detalle el mecanismo por el cual A.

Un hallazgo crucial que permiti el diseo de vectores para la transformacin

2.1 Objetivo general

Conocer y aplicar la metodologa para llevar a cabo la modificacin gentica

2.2 Objetivos especficos

Conocer el principio bsico de la modificacin gentica nuclear de plantas

Campana de flujo laminar, autoclave, potencimetro, balanza analtica, agitadora

Matraces Erlenmeyer, vasos de precipitados de 250 mL, juego de micropipetas,

3.4 Reactivos y medios de cultivos

Primera sesin. Preparacin de material y medios de cultivo

Preparar los siguientes materiales y reactivos (Ver anexos para composicin de

ampicilina 100 mg/mL

5 cajas Petri con medio LB y antibiticos: kanamicina 25 g/mL y estreptomicina

Segunda sesin. Cultivo de Agrobacterium en medio slido.

1. Tomar el stock de la cepa de A. tumefaciens LBA4404 y sembrar por estra

3. Incubar ambas cajas a 28 C por 36-48 h.

Tercera sesin. Cultivo de Agrobacterium en medio lquido.

1. Transferir una colonia de Agrobacterium a un matraz de 250 mL con 50 mL de

Cuarta sesin. Preparacin de Agrobacterium y modificacin gentica de N.

1. Centrifugar el cultivo de A. tumefaciens obtenido como resultado del trabajo

Quinta sesin. Transferencia de explantes a medio de seleccin

1. Despus de 48 h tomar los explantes (cuarta sesin) y transferirlos a las cajas de

Sexta sesin. Preparacin de material y medios de cultivo

1. Preparar el siguiente material:

5 cajas Petri con medio LB y antibiticos: kanamicina 25 g/mL y estreptomicina

Sptima sesin. Transferencia de explantes a medio de seleccin fresco

a. Despus de 4 semanas, transferir los explantes a medio fresco NBM con

Octava sesin. Transferencia de transformadas a medio para formar races

a. Conforme vayan apareciendo, transferir los brotes resistentes a kanamicina a

Novena sesin. PCR confirmatoria de la insercin del transgn

a. Tomar una porcin de brote no mayor a 1 mm e incubarla con 20 L de solucin