Apostila de Microbiologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CINCIAS DA SADE
DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
ROTEIRO DE AULAS PRTICAS DE
MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
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Roteiro de Aulas Prticas de Microbiologia e Imunologia
N D I C E
I - ESTERILIZAO E DESINFECO -------------------------------------------------------- 3
II TCNICAS DE COLORAO DE BACTRIAS -------------------------------------------- 9
III MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO ----------------------------------------------------16
IV ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS -------------19
V ANTIBIOGRAMA: TCNICAS DE PREPARAO E INTERPRETAO ---------------22
VI ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS ----------- 27
VII ASPECTOS MICROSCPICOS E MACROSCPICOS DOS FUNGOS -----------------33
VIII REAES ANTGENO ANTICORPO --------------------------------------------------41
IX REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ------------------------------------------------------50
Esterilizao e Desinfeco 3
I - ESTERILIZAO E DESINFECO
Esterilizao o processo de destruio por meio de agentes

fsicos ou qumicos de todas as formas de vida microbiana
(vrus, bactrias, fungos e esporos) presentes num material.
A esterilizao pode ser realizada por agentes fsicos e
qumicos.
ESTERILIZAO POR MTODOS FSICOS
1. Calor mido
2.
1.1. Autoclavao - um processo de esterilizao pelo
vapor sob presso em cmaras conhecidas como autoclaves
onde vapor de gua mantido em temperatura acima de
100oC, pelo emprego de presso maior que a atmosfrica, a
uma temperatura de 121oC. O tempo de exposio depende do
material a ser esterilizado. Este processo utilizado
para esterilizar vidraria, instrumentos cirrgicos, meios
de cultivo e outros.
1.2. Tindalizao ou esterilizao fracionada - Processo

de esterilizao na temperatura de 100oC durante 30
minutos, repetindo-se o aquecimento 2 a 3 dias
consecutivos. Este processo usado na bacteriologia para
a esterilizao de certos meios de cultura que se alteram
em temperaturas elevada, como meios contendo acares,
leite etc.
3. Calor Seco
2.1. Forno de Pasteur - Neste processo so empregados

fornos ou estufas, onde a temperatura pode ser regulada e
mantida pelo tempo necessrio para que haja
esterilizao. realizada em temperatura de 170-180oC,
em estufas eltricas por 1 a 2 horas. O material a ser
esterilizado deve ser distribudo de modo uniforme para
facilitar a distribuio do calor que emana das paredes
laterais e da base da estufa. Este processo indicado
para esterilizar vidraria, instrumentos cirrgicos
passveis de serem oxidados pelo vapor, e materiais
impermeveis como ceras, pomadas, p e leos.
2.2. Incinerao - um processo usado para materiais

descartveis e carcaa de animais utilizados em
experimentos.
2.3. Flambagem - Aquecimento direto na chama do bico de

Bunsen utilizado em rotina de laboratrio para
esterilizao de alas de platina e bordas da boca de
tubos e bales.
3. Filtrao - um processo usado para esterilizao de

gases e lquidos tais como soros, solues de enzimas e
vitaminas, acares, que no podem ser submetidos ao
calor. A filtrao consiste em passar o material a ser
esterilizado por filtros de poros muito pequenos que no
permitem a passagem de bactrias e fungos.
3.1. Tipos de filtros:
Disco de amianto - Filtro de SEITZ

Membrana de ester de celulose- Millipore
Filtros de partculas de ar de alta eficincia (HEPA)
removem quase todos os microrganismos maiores que
0,3 m de dimetro. So utilizados para reduzir o
nmero de micrbios transmitidos pelo ar.
4. Radiaes
4.1. Radiao ultra-violeta (UV) tem sido utilizada na

esterilizao do ar e de ambientes. Na indstria de
alimentos so aplicados para esterilizao de
superfcies de pes, xaropes, sacos plsticos, garrafas
de gua mineral, carnes mantidas sob refrigerao.
Porm, seu uso limitado, devido a seu baixo poder de
penetrao, pois trata-se de radiao no ionizante.
4.2- Raios gama e raios X (radiaes ionizantes)tm alto

poder de penetrao. Raios gama tm sido empregados
na esterilizao de certas vacinas e sanitizao de
alimentos embalados.
MTODOS QUMICOS
Glutaraldedo 2% - As solues de glutaraldedo so

indicadas para esterilizao ou desinfeco de instrumentos
mdicos cirrgicos sensveis ao calor, equipamentos de
anestesia gasosa, fibroscpios,partes pticas de endoscpios
etc. Exposio em torno de 18 horas.
Formaldedo (Soluo Alcolica 8%) - A frmula alcolica

apresenta 8% de Formaldedo. Sua atividade germicida
atribuda inativao de protenas e cidos nuclicos
microbianos. Exposio em torno de 18 horas.
Formaldedo (soluo aquosa 10%) - As solues aquosas alm

de no liberar vapores irritantes no possuem os
inconvenientes das solues alcolicas sobre lentes de
equipamentos pticos e artigos de poliestireno e borracha
em exposies prolongadas. Exposio em torno de 18 horas.
MTODOS FSICO-QUMICOS
Estes mtodos associam o produto qumico com o uso de

equipamentos, garantindo assim a efetividade ao processo e
a segurana dos profissionais de sade, sendo utilizado
para materiais termosensveis.
1 Esterilizao por xido de etileno: A esterilizao

realizada baixa temperatura em torno de 54C durante 8 a 12
horas. Para materiais de implantes e prteses se recomenda uma
aerao ambiental em torno de 7 dias.
Esterilizao por vapor de formaldedo baixa temperatura:

A esterilizao por vapor de formaldedo realizada em
autoclaves, em concentraes baixas em torno de 2% sob
forma de vapor, em temperaturas que variam entre 73C e
82C durante 90 e 180 minutos.
Precaues - As precaues recomendadas para estas solues

consistem em utilizar luvas ou pinas para o manuseio de
artigos nelas imersas e, nos casos das solues alcolicas,
mant-las em cubas de esterilizao fechadas em ambientes
ventilados.
DESINFECO E ASSEPSIA
* Desinfeco - A Desinfeco consiste na destruio ou

reduo dos microrganismos na forma vegetativa, presentes
num material inanimado ou superfcies inertes, mediante a
aplicao de agentes fsicos ou qumicos. A desinfeco no
implica a eliminao de todos microrganismos viveis, porm
elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfcies
ou local tratado.
* Assepsia - o termo usado para designar o processo de

desinfeco de tecidos vivos. Os anti-spticos so
preparaes contendo substncias microbiocidas ou
microbiostticas podendo ser usadasna pele, mucosas e
ferimentos. Exemplos: solues alcolicas, solues
iodadas, solues de permanganato de potssio, formulaes
base de sais de prata, iodforos, etc.
Observaes:
No so recomendados a utilizao de iodofros no recm-
nascido, pois pode ocorrer absoro transcutnea de iodo
com supresso da funo tireoideana.
Para a finalidade de antissepsia, no so permitidas as
formulaes contendo mercuriais orgnicos, acetona,
quaternrios de amnio, hipoclorito a 0,5%, ter e
clorofrmio.
A desinfeco pode ser realizada por agentes fsicos e

qumicos.
AGENTES FSICOS:
1.0. Pasteurizao - um processo empregado na indstria de

alimentos que elimina microrganismos patognicos (bacilos
tficos, paratficos e desintricos, brucelas,
estreptococos, bacilo da tuberculose) de produtos como o
leite pasteurizado, vinho, cerveja, submetendo-os a
temperatura de 63oC por 30 minutos ou 75oC por 15
segundos. Os tempos e as temperaturas de pasteurizao
dependem do mtodo e do produto a ser tratado. A
pasteurizao no um processo de esterilizao, uma vez
que esporos e bactrias no patognicas podem permanecer
viveis.
1.1.gua Fervente - Artigos de pequeno porte, depois de

lavados com detergente adequado, podem ser desinfetados
por imerso em gua a 100oC durante 10 minutos.
AGENTES QUMICOS:
Principais compostos utilizados em desinfeco e assepsia:
lcoois - solues a 70% e 80%

Fenis e Derivados - Fenol, Cresis, Ac. saliclico e c.
Benzico.
Halognios - Iodo, Iodforos (Polivinil Piralidona-
Iodo/PVP-I, cloro, Hipoclorito de Sdio ou clcio).
Metais Pesados - Mercrio (Mercrio Cromo,Mertiolato),
Prata (Nitrato de prata), Cobre (Sulfato de Cobre).
Corantes - Verde brilhante e malaquita. Violeta de
Genciana, Azul de Metileno.
Detergentes Sintticos
-Aninicos: laurilsulfato de sdio
-Catinicos: cloreto de cetilpiridnio.
Oxidantes - gua oxigenada, permanganato de potssio.
cidos, lcalis - c. Sulfrico, c. clordico, soda
(NaOH).
NOTAS:
As seguintes precaues devero ser tomadas para evitar
a sobrevivncia de microrganismos contaminantes, falhas de
esterilizao ou a recontaminao dos artigos esterilizados,
independentes do processo de esterilizao.
1. A escolha do processo de esterilizao
Processo de esterilizao mais eficaz o vapor saturado

sob presso, seguindo-se o calor seco e os esterilizantes
qumicos.A escolha depende da natureza do artigo a ser
esterilizado.
2. Limpeza prvia
A presena de matria orgnica (leo, gordura, sangue, pus

e outras secrees) protege os microrganismos contaminantes
do contato indispensvel com o agente esterilizante. Por
outro lado, quanto menor for o nmero de microrganismos
presentes, maior ser a possibilidade de esterilizao.
Assim, necessrio lavar cuidadosamente todos os artigos
em solues desencrostantes (hiploclorito de sdio,
detergentes sintticos etc), e enxagu-los abundantemente
com gua corrente e no ltimo enxague com gua destilada ou
deionizada antes de submet-los a qualquer processo de
esterilizao.
3. Invlucros e pacotes
Os invlucros devem permitir o contato dos artigos com o

agente esterilizante, bem como mant-los livres de
microrganismos durantea estocagem. A permeabilidade ao
vapor e ao xido de etileno, a impermeabilidade a
partculas, a ruptura e a flexibilidade so as
caractersticas mais importantes para a seleo de um
invlucro.
4. Estocagem
Aps a esterilizao, essencial que os pacotes estejam
ntegros secos e frios, a fim de conservarem a esterilidade
dos artigos neles contidos. Se o pacote, ao ser removido da
cmara ainda estiver quente, o vapor contido no papel
condensa na temperatura ambiente, criando uma presso
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do invlucro. Este atua como se fosse um filtro, deixando-
se penetrar pelo ar e retendo clulas, partculas
bacterianas ou no. Se este invlucro no estiver ntegro,
os artigos no pacote sofrero recontaminao. A umidade
alm de diminuir a resistncia de invlucros de papel,
facilita rupturas e interfere no mecanismo de filtrao do
ar. Para evitar a contaminao posterior, recomenda-se o
uso de cestos metlicos.
Os pacotes esterilizados devem ser manuseados o menos

possvel, sempre com delicadeza e estocados em ambientes
limpos e secos (30 a 60% de umidade) e temperatura em torno
de 25oC, reesterilizados quinzenalmente quando no
utilizados.
5. Medidas Preventivas
Uso de luvas, Avental e, se necessrio, mscara.
Materiais contaminados por agentes patgenos devem ser

esterilizados antes de serem descartados.
Aps o manuseio de materiais contaminados por agentes

microbianos, lavar cuidadosamente as mos com sabo ou
solues detergentes antisspticas, como solues aquosas
de Polivinil Pirrolidona-Iodo (PVP-I) a 10%, cloro-hexidina
a 4% ou hexaclorofeno a 3% adicionado de 0,3% de
clorofenol.
Aula Prtica - Anlise do efeito da ao de antisspticos
relacionada ao crescimento bacteriano.
Objetivo: Observar o efeito de antisspticos sobre o

crescimento bacteriano na superfcie da pele das mos.
Materiais:
Swab estril
Placa com meio de cultura gar nutriente.
Antisspticos: Sabo lquido e Soluo lcool-iodado,
lcool 70% e lcool gel.
Tcnica:
1. Abrir a placa rapidamente e colocar a ponta dos dedos,

sobre a superfcie do meio de cultura. Fechar a placa.
2. Lavar as mos com gua corrente e sabo lquido, deixar a
gua escorrer espontaneamente em seguida colocar a ponta
dos dedos sobre a superfcie do meio de cultura. Fechar a
placa rapidamente.
3. Friccionar a ponta dos dedos com soluo de lcool iodado
2%. Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos
sobre o meio de cultura, como item 2.
4. Friccionar a ponta dos dedos com soluo de lcool 70% e
depois com lcool gel. Esperar secar, em seguida colocar a
ponta dos dedos sobre o meio de cultura, como item 2.
5. Incubar a 37C por 24 horas.
Resultado:
Ao dos Agentes Crescimento Bacteriano
lcool Iodado
lcool 70%
Sabo
Sem anti-spticos
Tcnicas de Colorao de Bactrias 9
II TCNICAS DE COLORAO DE BACTRIAS
As tcnicas de colorao iniciadas por Paul Erlich e

Robert Koch (1843-1910) permitiram ao microbilogo distinguir
as clulas bacterianas quanto a sua morfologia, tamanho e
arranjo celular e diferenci-las de acordo com as suas
caractersticas tintoriais. Os corantes so divididos em dois
grupos: os cidos e os bsicos. Os corantes bsicos so sais
com base corada que se unem eficazmente a substratos cidos,
tendo uma grande afinidade para corar material nuclear (azul
de metileno, cristal violeta, fucsina bsica, safranina). As
bactrias comportam-se como material nuclear e desse modo,
quase todos os corantes utilizados em bacteriologia so
corantes bsicos. Os corantes cidos tendem a corar mais
eficientemente os substratos bsicos, como o citoplasma.
MORFOLOGIA
As clulas bacterianas so caracterizadas

morfologicamente pelo tamanho, forma e arranjo.
Tamanho - as bactrias so microscpicas medindo desde 0,3

por 0,8 m at 10 por 25 m. As espcies de maior
interesse mdico medem entre 0,5 a 1 m por 2 a 5 m.
Forma - as bactrias podem ser classificadas quanto a forma

em trs grupos bsicos:
Cocos - clulas esfricas.

Bacilos - clulas cilndricas, em forma de bastonetes.
Espirilos - clulas espiriladas. Algumas delas se comportam
como bacilos curvos, em forma de vrgula, que podem ser
denominados vbrios. Ex: Vibrio cholerae.
Arranjos - Grupamentos bacterianos.
Dependendo do plano e do nmero de divises atravs das

quais as bactrias continuam unidas, podem aparecer os
seguintes arranjos:
1.Cocos
Pares: diplococos (ex.: gonococos)
Cadeias: (ex.: estreptococos)
Ttrades ou cbicos (Sarcina)
Cocos em cachos (ex.: estafilococos)
2.Bacilos e espirilos apresentam-se em geral, como clulas

isoladas, porm ocasionalmente, pode-se observar: bacilos
aos pares (diplobacilos) ou em cadeia (estreptobacilos).
Aps a diviso de algumas bactrias, podem ocorrer
movimentos caractersticos, por exemplo: um movimento em
chicotada pode levar as bactrias a posies paralelas.
Divises repetidas e seguidas desses movimentos determinam

posies semelhantes a letras chinesas caractersticas do
bacilo diftrico.
PREPARAO DE ESFREGAO BACTERIANO PARA COLORAO
1-Preparao a partir de meio lquido
Usando ala de platina estril, colocar duas a trs

alquotas de cultura bacteriana preparada em meio lquido
sobre a superfcie de uma lmina de microscopia.
Espalhar sobre a lmina, fazendo movimentos circulares
de dentro para fora e deixar o esfregao secar a temperatura
ambiente. Em seguida, realizar a fixao passando duas a trs
vezes a lmina na chama do bico de Bunsen.
2-Preparao a partir de meio slido
Colocar uma pequena gota de gua destilada numa lmina.

Com ala de platina colocar sobre a lmina uma pequena poro
do crescimento bacteriano. Espalhar sobre a lmina e
prosseguir a preparao como no item anterior.
3-Preparao a partir de material biolgico
Usando um swab estril (zaragatoa), friccionar a

superfcie da mucosa ou leso oral por exemplo e fazer um
esfregao circular na superfcie de uma lmina. Deixar secar
temperatura ambiente. Recolocar o swab dentro do tubo de
ensaio e executar a fixao, como no item anterior.
COLORAO SIMPLES
Tcnica de colorao caracterizada pelo uso de apenas um
corante, permitindo a observao da forma, tamanho e
grupamento da clula bacteriana. Esta tcnica de colorao
bastante utilizada para a deteco de cocos que causam
meningite (Neisseria meningitidis), em amostra de lquido
cefalorraquidiano (LCR).
MTODO
1)Preparar o esfregao bacteriano em lminas;

2)Cobrir toda a lmina com soluo de azul de metileno, aguar
dar 5 minutos e desprezar o corante na pia;
3)Lavar a lmina rapidamente em gua corrente, secar com
papel de filtro ou temperatura ambiente (sem esfregar) e
observar em objetiva de imerso.
RESULTADO
Visualizar, descrever a morfologia e arranjo das

bactrias existente na lmina.
COLORAO DE GRAM (Colorao diferencial)
Este mtodo de colorao foi empiricamente desenvolvido

pelo bacteriologista dinamarqus, Christian Gram, em 1884, e
permite distino entre diferentes bactrias que podem
mostrar uma morfologia similar, porm com propriedades
tintoriais diferentes. A colorao de Gram classifica as
bactrias em dois grupos: Gram positivas e Gram negativas.
TCNICA DE COLORAO DE GRAM
1)cobrir toda a lmina com soluo de cristal violeta,

aguardar um minuto e desprezar o corante na pia;
2)cobrir a lmina com lugol, aguardar um minuto, desprezar o
lugol na pia;
3)inclinar a lmina e gotejar lcool-acetona at que no haja
desprendimento de corante (cerca de 30 segundos), lavar a
lmina rapidamente em gua corrente.
4)cobrir a lmina com fucsina de Gram e aguardar 30 segundos.
Lavar, secar e observar em objetiva de imerso.
NOTAS
1)O Cristal violeta s se liga a parede celular bacteriana

aps a adio da soluo de lugol (mordente)
2)O etanol poder ser usado como agente descorante fraco.
3)O material dos corantes empregados na tcnica,
principalmente sedimento do cristal violeta, poder
aparecer como artefato.
4)O descoramento para mais ou menos resultante da incorreta
diferenciao pelo lcool-acetona.
5)A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamental
na colorao de Gram. Em culturas envelhecidas, clulas
Gram Positivas freqentemente se tornam Gram Negativas.
Enzimas lticas excretadas normalmente por culturas

envelhecidas podem causar danos parede da clula, como por
exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes (lcool-
acetona). Conseqentemente, o complexo iodo cristal violeta
poder ser retirado da clula, nessa fase de colorao.
RESULTADO
Visualizar, desenhar a morfologia e classificar as

bactrias nas lminas de acordo com o seu comportamento
diante dos corantes de Gram:
Bactrias Gram positivas coradas em roxo
Bactrias Gram negativas coradas em rosa
INTERPRETAO
A colorao de Gram classifica as bactrias em Gram
positivas ou Gram negativas. O mecanismo da colorao de
Gram,
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Gram positivas possuem espessa camada de peptidoglicano e
cido teicico, e as Gram negativas, uma fina camada de
peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta
por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e
lipopolissacardeos. Durante o processo de colorao, o
tratamento com o lcool(ou lcool-acetona) extrai os
lipdeos, da resultando uma porosidade ou permeabilidade
aumentada da parede celular das bactrias Gram negativas.
Assim, o complexo cristal violeta iodo (CV-I) pode ser
retirado e as bactrias Gram negativas so descoradas. A
parede celular das bactrias Gram positivas, em virtude de
sua composio diferente, torna-se desidratada durante o
tratamento com lcool, a porosidade diminui, a permeabilidade
reduzida e o complexo CV-I no pode ser extrado.
COLORAO DIFERENCIAL PELO MTODO DE ZIEHL-NEELSEN (1882)
A colorao de Ziehl-Neelsen o mtodo para a pesquisa

de bacilos lcool cido resistentes (BAAR) incluindo-se o
bacilo da tuberculose, o bacilo de Hansen e micobactrias
atpicas. Este mtodo de colorao se baseia na propriedade
das micobactrias de se corarem inicialmente pela
carbolfucsina (a fucsina dissolvida numa soluo de fenol-
lcool-gua) e resistirem a uma descolorao por lcool-
cido.
Atravs desta colorao, podemos visualizar um grupo
restrito de bactrias que possuem sua parede celular
constituda delipdeos em grande concentrao, devido a
presena de cras e cidos graxos de cadeia longa(cidos
miclicos), que conferem clula a caracterstica de lcool-
cido resistncia.
COLETA DO MATERIAL
1- Coletar a amostra, antes da antibioticoterapia.

2- Obter, de preferncia o primeiro escarro da manha antes da
ingesto de alimentos.
3- Orientar o paciente para escovar os dentes com gua (no
utilizar pasta dental) e enxaguar a boca varias vezes,
inclusive com gargarejos.
4- Respirar fundo, umas oito ou dez vezes, e tossir
profundamente, recolhendo o material no frasco de coleta
estril.
5- Quando o material produzido for escasso, coletar amostra
aps nebulizao.
6- Enviar ao laboratrio o mais breve possvel.
O escarro obtido deve ser purulento. As amostras salivares

so imprprias para anlise bacteriolgica, pois no so
representativas do processo infeccioso.
PREPARAO DO ESFREGAO
Colocar as amostras em lminas (novas e desengorduradas)

com aplicador de madeira. Escolher a partcula mais densa ou
uma mistura da amostra, quando s existirem pequenas
partculas purulentas ou mucosas. E com aplicador estirar a
amostra em 1/3 da lmina, deixar secar temperatura ambiente
e fixar como no procedimento anterior.
Tcnica:
1)Cobrir toda a lmina com fucsina fenicada.

2)Com auxlio de uma chama, aquecer a lmina, pela sua parte
inferior at emitir vapores. Repetir duas vezes esperando o
corante esfriar. Aguardar 5 minutos, no deixando o corante
nem ferver nem secar.
3)Lavar a lmina com gua corrente, suavemente.
4)Inclinar a lmina descorar com soluo lcool cido
clordrico, at no sair mais corante.
5)Lavar a lmina com gua corrente.
6)Cobrir o esfregao com soluo de azul de metileno de
Loeffler durante 30 segundos.
7)Lavar a lmina em gua corrente.
8)Deixar secar e observar ao microscpio, com a objetiva de
imerso.
Notas:
1.Na colorao de Ziehl, o aquecimento no deve ser feito

muito intenso, a ponto de ferver o corante, mas apenas at
ligeira emisso de vapores.
2.A colorao de fundo feita para corar bactrias e outras
estruturas que foram diferenciadas, para o efeito
contrastante ou distino entre as bactrias e clulas
presentes no material.
RESULTADO:
Visualizar, esquematizar e classificar as bactrias

existentes nas lminas. A classificao dever ser quanto
resistncia ou no das bactrias ao descoramento em lcool
cido.
Bactrias lcool cido resistente (BAAR) permanecem
coradas de vermelho pela fucsina.
Bactrias no lcool cido resistente (BNAAR) no retm
a fucsina, aparecem coradas pelo azul de metileno.
BAAR por campo microscpico Resultado
Nenhum bacilo em 100 campos Negativo
observados
Menos de 1 bacilo por campo, em +
100 campos observados
De 1 a 10 bacilos por campo, em ++
Mais de 10 bacilos por campo, em +++
TCNICAS DE PREPARAO DOS CORANTES DE GRAM
Preparao do Cristal de Violeta:

Cristal violeta 1g
cido fnico 2g
lcool absoluto 10ml
gua destilada 100ml
Triturar num gral de vidro o corante e acrescentar o

lcool. Juntar aos poucos o cido fnico, misturando sempre,
de modo a obter uma mistura bem homognea. Juntar a gua
pouco a pouco, misturando bem. Filtrar aps 24 horas de
repouso, em papel de filtro.
Preparao do Lugol:
Iodo 1g
Iodeto de potssio 2g
gua destilada 300ml
Triturar o iodo com o iodeto de potssio em gral de

vidro. Juntar a gua e misturar bem. Preparar em quantidade
que seja usada antes de 30 dias.
Preparao de lcool acetona:

lcool 800ml
Acetona 200ml
Unir os dois componentes e misturar bem.
Preparao da Fucsina para Colorao de Gram:

Fucsina 2,5g
lcool etlico 100ml
gua destilada 90ml
A soluo estoque (fucsina e lcool etlico) deve ser

preparada unindo-se os dois componentes e misturando bem.
Para usar 10ml da soluo em 90ml de gua destilada, isto ,
diluir a 10% em gua destilada.
Armazenamento de corantes:
Os corantes devem ser estocados em frascos de vidro
mbar em local onde as condies ambientais sejam favorveis,
com temperatura entre 20 e 25C (T.A.) e sem teor de umidade.
TCNICAS DE PREPARAO DOS CORANTES DE ZIEHL-NEELSEN

Preparao de Fucsina fenicada:
Fucsina bsica 1g
lcool a 95% 10ml
Fenol fundido 5g
gua destilada 100ml
Dissolver num gral o corante no lcool. Adicionar aos

poucos o cido fnico, misturando sempre, de modo a obter uma
mistura bem homognea. Juntar a gua pouco a pouco, lavando o
gral.
Filtrar aps 24 horas de repouso.
cido clordrico
lcool 95% 100ml
cido clordrico (dens. 1,19) 1ml
Azul de Loeffler
A)Azul de metileno 10,3g
lcool a 95% 30ml
B)Soluo de hidrato de sdio a 0,01% 1ml
gua destilada 100ml
Misturar A) e B). Diluir 10 vezes em gua destilada.
Meios de Cultivo Bacteriano 16
III MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO
Meios de cultivo u m a m i s t u r a d e n u t r i e n t e s , s a i s
minerais e gua que propiciam o crescimento in vitro
de bactrias. A constituio de um meio de cultivo
b a s t a n t e v a r i a d a , p o i s o s micro-organismos apresentam uma
ampla diversidade metablica. Portanto os meios de cultivo possuem
componentes nutricionais variados promovendo o crescimento de
micro-organismos mais exigentes e menos exigentes.
At 1880 os micro-organismos eram cultivados em meios
lquidos, quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios
slidos, os quais permitiram o estudo de espcies isoladas
(culturas puras) separando-as de espcies contaminadas.
Os meios de cultivo so utilizados para o isolamento e
identificao de micro-organismos, teste para controle de
esterilizao ambiental, anlise de alimentos e de gua, etc. A
maioria das bactrias cresce em meios de cultura. Exceto as
riqutsias e clamdias por serem parasitas intracelulares
obrigatrios s se desenvolvem in vitro em meios celulares (cultivo
celular).
Basicamente, um meio de cultivo deve conter alm de
extrato de carne para o fornecimento de protenas,
carboidratos e sais, peptona e Cloreto de Sdio.
A preparao dos meios de cultivo pode ser realizada no

laboratrio de microbiologia de duas formas:
(1)a partir de seus ingredientes bsicos.
(2)a partir dos desidratados disponveis comercialmente, ou
podem ser comprados prontos para uso em tubos de ensaio ou placas
de Petri.
Didaticamente, os meios de cultivo cultivo podem ser
classificados quanto consistncia, quanto
procedncia, quanto composio, e quanto funo.
a) Quanto consistncia: os meios podem ser lquido, semi-slido e

slido.
Meio lquido: aquele em que os nutrientes esto
dissolvidos em aquosa. So os caldos (broth). utilizado para
ativao das culturas, repiques de micro-organismos, provas
bioqumicas dentre outros.
Meio semi-slido: Esse meio possui na sua composio alm dos
nutrientes, gar (polissacardeoextrado de algas
marinhas) na concentrao de 0,075% a 0,5%. usado para
Meio slido: um meio que possui na sua composio
nutrientes e uma concentrao de 1,0 a 2,0% de Agar e distribudo
em placas,tubos em vertical ou inclinados.
b)Quanto a procedncia: os meios podem ser:naturais,

artificiais sintticos, ou artificiais complexos.
- Meios naturais: So aqueles de origem vegetal (batata,po)

Animal( gema de ovo, carne, crebro etc.)
- Meios
Create PDF artificiais
with GetPDF on Windowssintticos:
7, Vista, XP, Server
So 2003, 2008. de
aqueles To remove the mark,qumica
composio buy a license.
definida. Ex: Glicose
- Meios artificiais complexos: So aqueles que se desconhece a
exata composio qumica. Ex:Extrato de carne.
c) Quanto funo: O meio de cultivo pode ser enriquecedor,

seletivo, diferenciador e de manuteno.
Meio enriquecedor ou enriquecido: aquele que t e m sua
capacidade nutricional, permitindo o
crescimento de micro-organis mos exigentes.
Ex: BHI, gar sangue,Agar ch ocolate.
Meio seletivo: aquele que contm substncias que inibem o

crescimento de certos micro-organismos, sem impedir o crescimento
de outros.
Ex: gar SS,(Salmonella , Shigella)
Meio diferenciador ou indicador: empregado para detectar

colnias bacterianas com propriedades distintas. As
bactrias acidognicas so conhecidas pela ao da cor do
indicador cido-base adicionado ao meio.
As bactrias que hidrolisam o amido podem ser conhecidas pelas
zonas claras produzidas nos meios contendo suspenses de amido.
Bactrias hemolticas so visualizadas pelas
alteraes produzidas no gar sangue.
Os produtores de gs sulfdrico formam uma zona escura de sulfito
de ferro no meio contendo excesso de ferro. Ex: gar EMB, gar
sangue.
- Meio de manuteno: um meio utilizado para estocagem de baixo

teor nutritivo para evitar a rpida morte celular, devido a
eliminao de substncias txicas resultantes do metabolismo dos
micro-organismos. Ex: gar nutriente.
- Meio para crescimento anaerbico: Como os anaerbios no

sobrevivem na presena de oxignio so utilizados meios
especiais denominados meios redutores, esses meios contm
ingredientes como o tioglicolato de sdio, que se combinam
quimicamente com o oxignio dissolvido e o eliminam do meio de
cultura.
Outros mtodos: Jarra de anaerobiose, estufas de dixido de
carbono.
Preparao:
Um fator que influencia na preparao do meio de cultivo a
temperatura. Ao preparar um meio de cultivo no podemos manter
temperatura ambiente uma soluo no estril por
mais de uma hora devido possibilidade de evaporao da
gua decrescimento microbiano.
Alguns componentes so utilizados pelos microrganismos e os
demais, pelo efeito do crescimento microbiano.Alguns
componentes so utilizados pelos micro-organismos e os
demais, pelo efeito da evaporao,se concentram. Aps preparados
os meios devem ser esterilizados pelo processo de esterilizao
adequada.
Tcnica:
Preparao de meio lquido: Meio de B.H.I. (Brain-Heart-

Infusion).
Componentes do meio:
Infuso de corao ................... 250g
Infuso de crebro ................... 200g
Peptona ............................... 10g
Dextrose................................ 2g
Cloreto de Sdio ....................... 5g
Fosfato de Sdio ..................... .2,5g
gua destilada ....................... 100ml
Execuo:
a)Adicionar 100ml de gua destilada aos ingredientes

previamente pesados;
b)Dissolver o meio aquecendo em chama de bico de Bunsen
ou forno de microondas;
c)Distribuir o meio em tubos 16x16 aproximadamente 10ml
por tubo. Colocar tampo de algodo em cada tubo;
d)Autoclavar (121C por 15 a 20 minutos).
Preparao de meio slido: Meio gar nutriente (gar Base) ou

gar Gelose.
Componentes do meio:
Extrato de Carne ....................... 3g
Peptona ................................ 5g
gar .................................. 15g
gua destilada ...................... 1000ml
Meios de Cultivo Bacteriano 18
Conservao dos meios de cultivo
Aps preparados, os meios devem ficar temperatura

ambiente at o esfriamento total. Quando a quantidade de meio
preparado for pequena e de uso imediato (uma semana), deve
ser armazenado em geladeira dentro de sacos plsticos para
evitar desidratao. Quando a quantidade de meio for grande e
no de uso imediato, deve ser distribudo em frascos com
rolha, selados com tampas dealumnio e logo aps
autoclavados.
A maioria dos meios de cultura na forma desidratada pode
ser conservada temperatura ambiente durante anos e outros
que contenham substncias termolbeis em sua composio so
guardados em geladeiras.
Para usar frascos de meio lquido, abrimos o selo de
alumnio, retiramos a rolha de borracha com cuidados
asspticos e, em ambiente estril, transferimos o meio para
tubos estreis (atravs de pipetas).
Para usar frascos de meio slido, fundimos o gar
imergindo o frasco fechado, em banho-maria fervente ou forno
de microondas a temperatura de 100oC. Aps a fuso do gar
abrimos o selo de alumnio, retiramos a rolha de borracha e
transferimos o meio para tubos (atravs de pipetas estreis)
ou para placas de Petri e deixamos solidificar a temperatura
ambiente.
TCNICAS DE SEMEIO
OBJETIVOS
- Identificao das tcnicas de semeadura mais empregadas na rotina

bacteriolgica.
- Cultivo de bactrias com finalidade de obteno de cultura pura,
ou seja, uma populao onde todas as bactrias se originam de uma
nica clula bacteriana.
Toda manipulao de culturas bacterianas, meios e instrumental

necessrio deve ser feita seguindo-se procedimentos bsicos de
assepsia visando evitar qualquer tipo de contaminao.
A) Meio inclinado
-Estria sinuosa- semear com ala de platina, em zigue-zague partindo
da base para a extremidade da superfcie inclinada do meio, este
tipo de semeadura permite a obteno de melhor massa de micro-
organismos.
-Em estria reta- semear com agulha de platina, em estria reta,
partindo da base para a extremidade da superfcie inclinada do meio,
ou em profundidade e superfcie, este tipo de semeio utilizado em
provas bioqumicas para identificao bacteriana.
B) Meio em p (camada alta)

- Em picada: com agulha de platina fazer o inculo penetrar de 0,5 a
1,0 cm no centro do meio de cultura.
Este tipo de semeadura bastante utilizado para conservao de
bactrias no meio de cultura e quando o meio de cultura semi-
slido utilizado para a verificao de motilidade.
C) Em placa de Petri
C.1 Em superfcie
- Estrias mltiplas ou esgotamento: Fazer o inculo em um ponto da
superfcie do meio, flambar a ala, deixar esfriar e da semear em
zigue-zague em toda superfcie do meio.
Este tipo de semeadura empregado para isolamento bacteriano,
obteno de u.f.c. isolados.
- Por distenso: Com pipeta estril, colocar no centro da superfcie

do meio 0,1 ml da suspenso e espalhar uniformimente com Swab ou
Ala de Drigalski. Com swab obteremos crescimento confluente e com
ala de Drigalski, utilizamos para contagem. Usa-se para
determinados testes e antibiogramas.
C.2 Em Profundidade ou Disseminao

- Por Plate: Depositar na placa de Petri 0,1 ml ou 1,0 ml da
suspenso bacteriana . Adicionar 10 ml do meio fundido em tubo de
ensaio e resfriado a 45-50C. Homogeneizar com movimentos giratrios
da placa sobre uma superfcie plana. Utilizado para isolamento,
contagem, identificao bacteriana, conforme o meio de cultura
utilizado.
D) Repique por pescaria: Colnia em placa de Petri retirada atravs

de uma agulha para um meio de cultura lquido ou slido. Mtodo
empregado para isolamento bacteriano.
Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Positivas 19
IV ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS
Em se tratando de material clnico para ser submetido a

exame bacteriolgico este deve ser colhido antes da
administrao de antimicrobianos, porque se a bactria for
sensvel quele antibitico, dificilmente ela crescer nos
meios de cultura. A bactria poder estar morta no momento da
colheita ou ento ter o seu crescimento inibido pelo
antimicrobiano presente no material clnico.
1- ISOLAMENTO - As bactrias podem ser cultivadas in vitro em

meios de cultura que lhes forneam todas as condies
nutricionais e ambientais necessrias ao seu crescimento.
As culturas so feitas pela semeadura dos materiais
clnicos em meios slidos distribudos em placa de Petri, em
tubos de ensaio ou em outros tipos de frascos.
Depois de semeados os meios devem ser incubados em
temperatura e atmosfera adequadas. O perodo de incubao
varia de acordo com a velocidade de crescimento da bactria.
A grande maioria das bactrias pode ser cultivada em 24 a 48
horas. Excees so feitas para o cultivo de Neisseria (14-
16hs) e Mycobacterium (at 21 dias).
Material para colheita e isolamento:
Abaixador de lngua
"Swab"
gar sangue
Procedimento:
Transferir a amostra colhida com o "Swab" para um ponto
da superfcie do meio distribudo em placa e semear pela
tcnica de estrias. Incubar a placa a 37C por 24h e fazer a
identificao bioqumica e diferenciao de atividade
hemoltica e enzimtica.
2- IDENTIFICAO:
2-1 Gnero: Streptococcus
As espcies de maior interesse clnico so:

Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae,
Streptococcus pneumoniae.
Os Streptococcus so identificados de acordo com:
1) Atividade hemoltica
a)-hemolticos: quando lisam completamente as hemcias
(in vitro) liberando hemoglobina e formando uma zona clara
ao redor da colnia.
b)-hemolticos: quando causam lise incompleta das
hemceas com liberao de pigmento verde (reduo da
hemoglobina) promovendo uma zona esverdeada ao redor da
colnia.
c)-hemoltico: ausncia de atividade hemoltica.
2) Morfologia celular:
Corados pelo mtodo de Gram, aparecem como Gram
positivos esfricos ou lanceolados, de tamanho varivel,
isolados ou em grupos formando cadeias curtas ou longas.
3) Diferenciao bioqumica:
So utilizados testes com antimicrobianos para

diferenciao de Streptococcus alfa, beta e gama
hemolticos, como tambm so realizados testes
presuntivos para pesquisa de enzimas produzidas
pelos isolados.
4) Composio antignica
Os estreptococos -hemolticos elaboram carboidratos que
so utilizados em reaes de precipitao com anti-soro
especfico, que possibilita a separao dos grupos. Rebeca
Lancefield padronizou a classificao deste gnero de acordo
com esta composio grupo especficos antignica da parede
celular.
Estreptococos -hemolticos
Utilizar o Teste de sensibilidade a Optoquina para

diferenciar o Streptococcus pneumoniae (sensvel a optoquina) de
estreptococos viridescentes (resistente a optoquina), e o Teste
de Solubilidade em Bile. As bactrias solveis em Bile so da
espcie Streptococcus pneumoniae, as bactrias insolveis em
Bile so de estreptococcos viridescentes.
Teste de optoquina
Finalidade:
A optoquina (etil-hidrocuprenahidroclordrica) um
farmaco solvel em gua que se difunde rapidamente em meio
de cultura slido. Para este teste, em geral, utiliza-se o
disco de optoquina de6 mm contendo 5 g da droga. O teste
tem sensibilidade maior que 95%, sendo considerado de
baixo custo e simples de ser realizado.
Procedimento:
Preparar uma suspenso do isolado em soluo salina a

0,85% estril com densidade tica de 0,08 a 0,1 ao
comprimento de onda de 625 nm, ou correspondente a 0,5 da
escala de McFarland;
Semear a suspenso em uma placa de gar sangue de carneiro

5% de forma a obter crescimento confluente;
Aps a absoro da suspenso pelo meio de cultura, colocar

um disco de optoquina na superfcie do meio semeado, com o
auxlio de uma pina;
Incubar a 352C e 5 - 7% de CO2 por 18 - 24 h;
Fazer a leitura do halo de inibio do crescimento

bacteriano.
Interpretao:
Presena de halo 14 mm indica que a cultura sensvel

optoquina, sendo identificado Streptococcus pneumoniae.
Estreptococos -hemolticos
Teste da Bacitracina
Finalidade:
O teste tem a finalidade de diferenciar S. pyogenes de outras
cepas do grupo A de outros grupos de Streptococcus -
hemolticos (Grupo B, C e G).
Procedimento:
Um disco de 0,04 U de bacitracina aplicado a uma placa

de gar sangue de carneiro que tenha um inculo com 4 ou 5
colnias puras de Streptococcus spp., a ser testado.
Incubar 12 horas (overnight) a 35 2C.
Interpretao:
A presena de halo de 10mm inibio ao redor do disco
interpretado como sensibilidade a bacitracina e indicativo
de S. pyogenes.
Teste de Camp
O teste visa a identificao de linhagens de S.

agalactiae (grupo B). Estas linhagens produzem o fator
CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen) que atua
sinergicamente com a -hemolisina produzida pelo
Staphylococcus aureus em gar sangue.
Procedimento:
Semear um inculo de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (ou

cepa de S. aureus com duplo halo de hemlise) de um ponto
a outro da placa de gar sangue;
Semear perpendicularmente (90) a colnia

de Streptococcus -hemoltico a ser testada, sem que haja
o contato com a estria de Staphylococcus aureus;
Incubar a 352C em atmosfera de 5% de CO2 por 48 h.
Interpretao:
A formao de uma seta ou meia-lua convergindo para

o S.aureus na interseco do crescimento das duas
bactrias indica que o teste positivo e indicativo
de S.agalactiae;
Se no houver formao de seta ou meia-lua, o teste

negativo e a cepa no pertence ao grupo B de Lancefield.
2-2 Gnero Staphylococcus

As trs espcies de maior interesse clnico so:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus.
Morfologia celular
So cocos Gram positivos que podem apresentar-se

isolados ou em pares, em pequenas cadeias ou aglomerados em
cachos.
Identificao e diferenciao
a)Atividade enzimtica
Prova de coagulase:
A 0,5ml de plasma de coelho, adicionar 0,1ml de cultura

em caldo. Incubar em banho-maria a 37C e verificar a
intervalos de 30 minutos, se h formao de cogulo. O
Staphylococcus aureus produtor de coagulase.
Staphylococcus epidermidis, no produtor de coagulase,
usualmente considerado no patognico mas pode estar
envolvido em certas situaes clnicas: endocardite
bacteriana, em cirurgia com prtese, em transplante de medula
e em cateterismo venoso.
b)Sensibilidade a novobiocina
Teste de novobiocina
Preparar uma suspenso em caldo e semear em gar. Colocar

um disco de novobiocina (5mg), incubar a 37C por 24 horas
e verificar a formao de um halo de inibio de 14mm.
Esse teste diferencia o S. saprophyticus (resistente ao
farmacoa) do S. epidermidis (sensvel a droga). O S.
saprophyticus causa relativamente freqente de infeco do
trato urinrio em pacientes jovens.
C) Teste de Fermentao do Manitol

Finalidade:
Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o

manitol contendo 7,5% de cloreto de sdio.
Procedimento:
Fazer pequenos crculos no gar com a colnia suspeita;

Incubar a 352C por 18 - 24 h.
Leitura:
Formao de halo amarelo ao redor das colnias.
Interpretao:
Formao de halo amarelo ao redor das colnias,

identifica Staphylococcus aureus;
Meio permanece inalterado ao redor das colnias,
identifica Staphylococcus coagulase negativa.
Obs.: Outras espcies de estafilococos, com pouca frequncia,

tambm podem produzir cido a partir do manitol, portanto tambm
devem ser testados quanto produo de coagulase.
d) Teste da Catalase
O teste da catalase utilizado para diferenciar os

estafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalase
negativa). Entretanto, existem relatos na literatura
de Staphylococcus aureus catalase negativa relacionados a
processos infecciosos, embora raros, descritos em vrios pases,
inclusive no Brasil.
Procedimento:
Colocar uma gota de perxido de hidrognio (gua oxigenada) 3%

sobre uma lmina;
Com auxlio de fio bacteriolgico, agregar a colnia em estudo
na gota de perxido de hidrognio.
INTERPRETAO
Positivo: Presena imediata de bolhas - a produo de

efervescncia indica a converso do H2O2 em gua e oxignio
gasoso.
Negativo: Ausncia de bolhas ou efervescncia.
RECOMENDAES
Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrcitos
podem produzir reao fraca de catalase.
Para controle utilizar outra linhagem de Staphylococcus para o
controle positivo e como controle negativo Streptococcus spp.
Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao 22
V ANTIBIOGRAMA: TCNICAS DE PREPARAO E INTERPRETAO
Introduo:
A anlise da sensibilidade das bactrias aos agentes
antimiccrobianos est relacionada vrias tcnicas ou
mtodos laboratoriais in vitro utilizados para determinar a
sensibilidade e a resistncia de determinado microrganismo a
antimicrobianos.
DETERMINAO DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS EM BACTRIAS
A identificao de bactrias isoladas de espcimens

clnicas necessita de teste complementar para determinar o
perfil de sensibilidade daquela espcie frente a
quimioterpicos antimicrobianos (Antibiograma). As drogas
disponveis no combate quela infeco, so estudadas por
grupos (aminoglicosdeos, betalactmicos, fluorquinolonas,
macroldeos, peptdeos e sulfas) e em concentraes
padronizadas (proporcionais s concentraes atingidas no
soro de pacientes em tratamento) obtidas por estudo "in
vitro". Drogas que mostraram-se inibidoras para determinado
isolado bacteriano so selecionadas pela seletividade txica,
efeitos secundrios, facilidade de administrao (oral e
parenteral), epelos custos do tratamento. Vrias tcnicas
foram desenvolvidas mas a metodologia desenvolvida por Kirby,
Bauer & Turck (1966) utilizada mundialmente por apresentar
resultados rpidos e seguros.
Um segundo tipo de teste de sensibilidade realizado
utilizando-se espcies no patognicos, para fins de pesquisa
bsica, quando se deseja estudar mecanismos de ao das
drogas ou modelos de resistncia antimicrobiana ou ainda para
marcar uma populao. Neste caso, so determinados os grupos
de drogas e a concentrao mnima inibitria (CMI) por mtodo
quantitativo.
Objetivos:
1) Avaliao da atividade e do espectro de ao de novos
agentes antimicrobianos;
2) Nos estudos de populaes bacterianas, para estabelecer o
padro de sensibilidade sob o efeito seletivo de
antimicrobianos;
3) Como marcadores epidemiolgicos.
Fundamento: Substncias antimicrobianas so incorporadas ao

meio de cultivo (lquido ou gar), emconcentraes
inibitrias para aqueles organismos sensveis. A concentrao
dada em g/ml ou Unidades Internacionais(UI).
Mtodos:
1.Qualitativo - Pesquisa que grupos de drogas antimicrobianas
so bactericidas para determinada espcie bacteriana numa
determinada concentrao. Ex.: Tcnica de Kirby
Bauer(1966).
2.Quantitativo - Pesquisa que concentrao de determinada
droga antimicrobiana inibitria para uma espcie
bacteriana isolada. Determinao da concentrao mnima
inibitria (CMI).
Mtodo de difuso com disco (Tcnica Kirby Bauer):

Difuso da droga, sob forma de disco ou comprimido na
superfcie do meio slido.
1. Padronizao do inculo bacteriano:
A partir da placa original da cultura bacteriana do
microrganismo a ser testado so transferidas 4 a 5 colnias
para um meio de cultura lquido (Caldo-Soja-Casena, Caldo
BHI, caldo Mueller-Hinton). Em seguida, incuba-se durante 2 a
4 horas. A densidade do inculo deve ser comparada com a
escala de turbidez de McFarland (cido sulfrico + cloreto de
brio), equivalente a 104 bactrias por ml de meio.
2. Semeio: Realizado atravs de swab estril embebido no

inculo bacteriano e passado em toda a rea da superfcie do
meio gar Mueller-Hinton (crescimento confluente). Deixar
secar por 2 minutos.
Com auxlio de uma pina estril colocar sob a
superfcie do meio inoculado os discos de antibiticos em
pontos eqidistantes (30 mm).
Incubar a temperatura ideal para o crescimento daquela
populao bacteriana por 18-24h.
Leitura: Observar halo de inibio em torno do disco de

antimicrobiano. O dimetro deste halo medido em mm
(halmetro) e comparado com a tabela recomendada pelo C L S I
(Clinical L a b o r a t o r y S tandards Institute, 2010). Para cada
agente antimicrobiano, o dimetro dohalo poder ser
interpretado como sensvel (S), resistente (R) ou
intermedirio (I).
Utilizao de Drogas de baixa difuso: molculas grandes e

polarizadas. Considerar pequenos halos como sensveis.
Drogas de alta difuso: molculas pequenas e apolares.

Considerar halos com maiores dimetros que os padres.
Considera-se uma populao sensvel a determinada droga
quando esta populao inibida por concentrao trs ou mais
vezes inferior a concentrao que a substncia atinge no
sangue. Amostras resistentes so inibidas por concentraes
intermedirias.
Ex.: Droga X atinge concentrao srica de
32 g/ml. Populaes que so inibidas por
8 g so consideradas sensveis e aquelas inibidas
por concentraes acima de 16 g
consideradas resistentes.
Fatores Intervenientes capazes de alterar a interpretao:

1.Utilizao de meio muito ricos ou muito pobres em
composio de "simular" falsos microrganismos resistentes ou
sensveis.
2.Utilizao de inculos muito concentrados (densos) e
formao de tapetes de clulas mortas entre bactrias vivas e
a droga.
3.Para algumas infeces como difteria (C. diphteriae),
meningite meningoccica no so realizados antibiogramas.
Utilizam-se drogas de escolha.
4.Devido a variabilidade de marcas de resistncia a
drogas devem ser realizados sempre nas bactrias
Enteropatognicas (Salmonella, Shigella, E. coli
soropatognicas e para Mycobacterium tuberculosis).
5.Observar a concentrao da droga que impregna o papel
de filtro que compe o disco ou comprimido.
6.Observar prazo de validade das drogas ensaiadas.
Seleo de substncias antibiticas:

Bactrias gram positivas: Penicilina, Eritromicina,
Clindamicina, Gentamicina e Tetraciclinas. Para
Staphylococcus no precisa testar Ampicilina e Carbenicilina
(Produtores de betalactamases). A meticilina representa
betalactmico (penicilina) no degradada pela betalactamase.
Bactrias gram negativas (Enterobacteriaceae):

Ampicilina, Cefalosporinas, Gentamicina, Tetraciclinas,
Cloranfenicol, Trimetoprim + Sulfametoxisazol e Amoxacilina.
Infeces urinrias: Ampicilina, Ac. Nalidxico,

Nitrofurantonas, Cefalosporinas, Sulfas e Fluorquinolonas.
Para infeces por Pseudomonas sp.: Carbenicilina,

Gentamicina, Tobramicina, Pipraciclina e Amicacina.
Para infeces por cpas de Anaerbios: Bacterides,

Peptococos, Fusobactrias e Clostrdios: Clindamicina,
Metronidazol, Rifampicina, Vancomicina e Tetraciclinas.
Microrganismos de referncia
Mantenha culturas-estoques de S. aureus (ATCC25923) e E.
coli (ATCC25922).
Teste esses microrganismos de referncia, pelo mtodo
que foi descrito, usando discos de antibiticos
representativos daqueles a serem empregados no teste de
isolados clnicos.
Comparaes de resultados para os microrganismos-

controle de teste para teste oferecem uma verificao na
reprodutibilidade do processo do teste e na credibilidade dos
discos-teste.
Limitaes do mtodo
O mtodo de interpretao descrito aqui se refere a
patgenos de crescimento rpido e no deve ser aplicado a
microrganismos de crescimento lento, para os quais os
critrios dos halos no so apropriados. E para antibiticos
que se difudem lentamente em gar, ex: polimixina B.
Mtodo Quantitativo
E-test: Teste epsilomtrico, mtodo de difuso mais avanado

que permite estimar a concentrao mnima inibitria (CMI), a mais
baixa concentrao de antibitico que impede o crescimento
bacteriano. Uma tira revestida de plstico contendo um gradiente de
concentrao do antimicrobiano, e a CMI pode ser lida em uma escala
impressa na tira.
Etapas para realizao da tcnica:
As etapas iniciais so semelhantes tcnica de Kirby Bauer, como a

preparao do inoculo bacteriano e semeio. As fitas do E-test
consiste numa fita plstica fina, inerte e no porosa de 5mm largura
e 50mm de comprimento. Um lado da fita marcado com uma escala de
leitura de CIM em mcg/ml. Um cdigo de letras designa a identidade
do antibitico. Um gradiente exponencial pr-definido do frmaco
seco e estabilizado mobilizado no outro lado da fita, com uma
concentrao mxima em "a" e mnima em "b", como demonstrado na
Figura abaixo.
Tabela 1.
Limites para interpretao do antibiograma com 24
antibacterianos de uso corrente na teraputica clnica.
Zonas de inibio (em mm)
Antibacteriano Smb. Conc. Resistente Interme Sensvel
disco dirio
Amicacina AM 30mcg 14 ou menos 15-18 17 ou mais
Ampicilina ao
testar
microrganismos AP 10mcg 11 ou menos 12-13 14 ou mais
Gram-negativos e
enterococos
Ampicilina ao
testar
estafilococos e AP 10mcg 20 ou menos 21-28 29 ou mais
microrganismos
sensveis
penicilina G
Ampicilina ao
testar Haemophilus AP 10mcg 19 ou menos 20 ou mais
sp.
Bacitracina BC 10un. 8 ou menos 9-12 13 ou mais
Carbenicilina ao
testar Proteus sp. CR 100mcg 17 ou menos 18-22 23 ou mais
E E. coli.
Carbenicilina ao
testar Pseudomonas CR 100mcg 13 ou menos 14-16 17 ou mais
aeruginosa
Cefalotina ao
relatar 18 ou mais
sensibilidade a CF 30mcg 14 ou menos 15-17
todas as
cefalosporinas
Clindamicina ao
relatar
sensibilidade CL 2mcg 14 ou menos 15-16 17 ou mais
clindamicina e
lindomicina
Cloranfenicol CO 30mcg 12 ou menos 13-17 18 ou mais
Colistidina CL 10mcg 8 ou menos 9-10 11 ou mais
Eritromicina EL 15mcg 13 ou menos 14-17 18 ou mais
Estreptomicina ET 20mcg 11 ou menos 12-14 15 ou mais
Gentamicina GN 20mcg 12 ou menos 13-14 15 ou mais
Konanilcina KN 30mcg 13 ou menos 14-17 18 ou mais
Nalidxico, cido AN 30mcg 13 ou menos 14-18 19 ou mais
Neomicina NO 30mcg 12 ou menos 13-16 17 ou mais
Nitrofurantona NT 300mcg 14 ou menos 15-16 17 ou mais
Novoblocina NV 30mcg 17 ou menos 18-21 22 ou mais
Oxocilina OX 6mcg 9 ou menos 10-13 14 ou mais
Penicilina G. ao
testar PN 10un. 20 ou menos 21-28 29 ou mais
Estafilococos
Penicilina G. ao
testar outros PN 10un. 11 ou menos 12-21 22 ou mais
microrganismos
Penicilina G. PL 50un. 8 ou menos 0-11 12 ou mais
Sulfazotrin
(Sulfatomoxazol + SFT 25mcg 10 ou menos 11-15 16 ou mais
Trimetoprin)
Sulfonamidas SF 300mcg 12 ou menos 13-16 17 ou mais
Tetraciclina TT 30mcg 14 ou menos 15-18 19 ou mais
Tobramicina TB 10mcg 12 ou menos 13-14 15 ou mais
Vancomicina VC 30mcg 9 ou menos 10-11 12 ou mais
Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Negativas 27
VI ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS
As bactrias gram-negativas incluem vrios gneros de

bacilos fermentadores de carboidratos(Enterobactrias;
famlia Enterobacteriaceae ) ou no fermentadores de
carboidratos (Ex.: Pseudomonas, Acinetobacter). As
enterobactrias (Ex: Escherichia coli, Klebsiella,
Enterobacter, Hafnia, Shigella, salmonella, Proteus,
Serratia, etc.)so os bacilos mais freqentemente isolados
de amostras clnicas em laboratrios de microbiologia. Esses
bacilos esto amplamente distribudos nanatureza e so
encontrados principalmente no trato intestinal do
homem e de animais. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae
e Pseudomonas aeruginosa so as bactrias gram-negativas mais
envolvidas em infeces hospitalares.
A identificao das bactrias Gram-
negativas baseiam-se principalmente em reaes bioqumicas
que ocorrem nos meios de cultura, resultantes do metabolismo
bacteriano.
1 - ISOLAMENTO
Para o isolamento dos bacilos gram-negativos so
utilizados principalmente meios seletivos diferenciais.
a) Meios de isolamento
gar salmonella Shigella (SS), gar Hektoen (HE), gar
MacConkey, gar Verde Brilhante, gar Eosina Azul de Metileno
(EMB), gar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e gar Bismuto
Sulfito, etc.
b) Tcnica de semeio para isolamento

Transferir o inculo bacteriano para um ponto da
superfcie do meio de cultivo distribudo em placa e semear
pela tcnica de estrias utilizando a ala de platina
flambada. Incubar a placa a 37oC por 18-24h e fazer a
diferenciao e identificao bioqumica.
2 - IDENTIFICAO (Provas bioqumicas)
2-1. Fermentao de carboidratos (lactose, sacarose,

glicose)
Nos sistemas de provas bacteriolgicas o processo de

fermentao detectado por observao visual das mudanas de
cor dos indicadores de pH do meio quando os produtos cidos
so formados pelas bactrias.
a) Princpio
Os testes de fermentao de carboidratos determinam a
capacidade de um microrganismo em hidrolizar determinado
acar, incorporado numa concentrao de 0,5 a 1,0% em meio
base de vermelho de fenol, produzindo cidos com ou sem gs.
Todas as enterobactrias fermentam a glicose pela via Embden-
Meyerhof, formando cido pirvico.
b) Meio: base de vermelho de fenol

Indicador de pH: Vermelho de fenol
cido (cor amarela) - pH < 6,8
Alcalino(cor vermelha)-pH >8,4
Neutro (cor laranja) - pH = 7,4
c) Tcnica
Transferir, com ala de platina estril, uma colnia
bacteriana isolada para o meio lquido vermelho de fenol
adicionado do carboidrato a ser fermentado. Incubar a 37oC
por 18-24h.
d) Resultado
POSITIVO: cor amarela -- presena de cido (carboidrato
fermentado)
NEGATIVO: cor vermelha -- ausncia de cido (Carboidrato
no fermentado)
2-2 Teste TSI (gar Trplice-acar-ferro)
a) Princpio
No meio TSI distribudo em tubos de ensaio observa-se a
fermentao ou no dos acares (lactose, glicose e sacarose)
pelas bactrias Gram-negativas, com produo ou no de gs
CO2. Tambm pode se observar a formao de H2S (gs sulfdrico
ou sulfeto de hidrognio) pela sua reao com o sulfato
ferroso (presente no meio TSI), resultando num precipitado de
sulfeto ferroso que se manifesta por uma reao visvel de
cor negra.
b) Meio TSI
Neste meio, alm do gar e das fontes de carbono e de
nitrognio, tambm esto presentes o tiossulfato de sdio que
uma fonte de enxofre para a produo de H2S e o indicador
de pH vermelho de fenol,que j foi visto no tpico anterior.
c) Tcnica
Transferir a colnia bacteriana isolada para o meio TSI,
utilizando-se a agulha de platina flambada. A inoculao
dever ter a profundidade de 2/3 do meio em uma nica picada.
Em seguida, fazem-se estrias na superfcie inclinada. Incubar
a 37oC por 18-24h.
d) Resultado e interpretao
O resultado obtido pela visualizao da mudana de cor
no pico (superfcie inclinada) e no fundo (profundidade) do
tubo de ensaio contendo o gar TSI:
Pico alcalino/fundo alcalino - Ausncia de fermentao dos
aucares. Ex: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter.
Pico alcalino/fundo cido - Fermentao apenas da glicose.
Ex: Shigella.
Pico alcalino/fundo cido e negro - Fermentao da glicose
e produo de H2S. Ex: Salmonella, Proteus, Citrobacter.
Pico cido/fundo cido - Fermentao dos trs aucares. Ex:
Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e outros
componentes do grupo coliforme.
2-3. Teste de Motilidade
a) Princpio e meio
O meio de cultivo apropriado para teste de motilidade
bacteriana deve ser semi-slido (0,5% de agar) para permitir
a difuso de bactrias mveis. O meio SIM (S= H2S,I=Indol,
M=Motilidade) um dos meios utilizados para o teste de
motilidade, como tambm para o teste de indol que ser visto
em seguida.
b) Tcnica
Inocular em uma nica picada a colnia bacteriana
isolada no meio, utilizando-se a agulha de platina estril.
Incubar a 37oC por 18-24h.
c) Resultado
A motilidade bacteriana detectada pelo exame
macroscpico do meio para se observar uma zona de crescimento
difuso (turbidez) que parte da linha de inoculao feita com
a agulha de platina.
2-4. Teste do Citrato
a) Princpio
Determinar se um microrganismo capaz de utilizar o
citrato como nica fonte de carbono para seu metabolismo e
crescimento. Se o citrato for utilizado, o nitrognio
(do fosfato de amnia) presente no meio tambm ser, havendo
liberao da amnia com a conseqente alcalinizao do meio.
b) Meio: gar Citrato de Simmons

Este um meio slido no qual a nica fonte de carbono
o citrato de sdio (obs: no contm protenas ou carboidratos
que so fontes de carbono,tendo como indicador de pH o azul
de bromotimol.
c) Tcnica
A bactria em estudo inoculada na superfcie do gar
inclinado em tubo fazendo-se estrias na superfcie do meio,
utilizando-se a ala de platina flambada. Incubar a 37oC por
18-24h ou at 3 dias, se necessrio.
d) Resultado
POSITIVO: meio azul (alcalino) - Utilizao do citrato
NEGATIVO: meio verde (neutro) - No utilizao do citrato
2-5. Teste da lisina descarboxilase
a) Princpio
Determinar a habilidade enzimtica de uma determinada
bactria em descarboxilar o aminocido lisina, com a
subsequente alcalinizao do meio devido a formao de amina
alcalina (cadaverina).
b) Meio LIA (gar lisina ferro)

Este meio contm como indicador o prpura de
bromocresol:
cido: cor amarela -- pH < 5.2
Neutro a bsico: cor prpura -- pH = 6.8
c) Tcnica
A bactria teste inoculada em uma nica picada no meio
LIA em tubo de ensaio, utilizando-se uma agulha de platina
estril. Em seguida, fazem-se estrias na superfcie
inclinada. Incubar a 37oC por 24h.
d) Resultado
POSITIVO: meio prpura (alcalino) - Ocorreu a descarboxilao
da lisina e conseqente formao de aminas.
NEGATIVO: meio amarelo (cido) - No ocorreu a descarboxilao

da lisina. A acidificao do meio ocorre porque a bactria
fermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio.
2-6. Teste de Indol
a) Princpio
Determinar a habilidade do organismo em produzir o indol
(benzil pirrol) a partir da molcula de triptofano ou
outros aminocido presentes no meio SIM. Quando ocorre a
degradao deste aminocido por bactrias que possuem a
enzima triptofanase ocorre a formao de: Indol,
cido pirvico e amnia. Este teste til para diferenciar a
E.coli (indol positiva) de outras enterobactrias.
b) Meio e reativo
Meio SIM
Reativo de Kovac ou Reativo de Ehrlich Composio: p-
dimetilaminobenzaldedo, HCL concentrado, lcool
isoamlico (Kovac), lcool etlico absoluto (Ehrlich).
c) Tcnica
Inocular com agulha de platina o meio SIM com a
bactria em estudo e incubar a 37oC por 18-24h.
Em seguida,adicionar gotas do reativo Ehrlich ou de Kovac
no tubo.
d) Resultado
O desenvolvimento de uma cor vermelha na superfcie do
meio aps a adio do reativo indica a presena de indol e
uma prova positiva. A cor vermelha aparece na camada de
lcool quando o indol produzido reage com o p-
Dimetilaminobenzaldedo presente nos reativos de Ehrlich ou
de Kovac.
2-7. Teste de urease
a) Princpio
Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar
enzimaticamente a uria pela urease com a formao de duas
molculas de amnia (NH3), resultando na alcalinizao do
meio.
b) Meio caldo uria

Este meio tem como indicador de pH o vermelho de fenol,
j visto anteriormente.
c) Tcnica
Inocular o caldo uria com uma ala de platina carregada
de cultura pura do organismo em estudo. Incubar a 37oC por
18-24h, ou at 48h se necessrio.
d) Resultado
POSITIVO: meio rosa (alcalino) - Presena de urease
NEGATIVO: meio amarelo (neutro) - Ausncia de urease
3 MTODOS RAPIDOS DE IDENTIFICAO
3-1. Sistema API 20E (bio Mrieux) Identificao de

Enterobactrias
O sistema de identificao API 20E consiste em tiras

plsticas com 20 compartimentos miniaturizadas que contm os
substratos desidratados (meio de identificao bioqumica) e
uma cmara plstica de incubao com tampa frouxa. Cada
compartimento possui um pequeno orifcio superior atravs do
qual a suspenso bacteriana diluda em soluo salina ou gua
destilada estril pode ser inoculada com uma pipeta. A ao
bacteriana sobre o substrato produz mudana de cor que
interpretada visualmente em 24 horas a 35C. O fabricante
fornece folhas de trabalho para registro das interpretaes
visuais das reaes coloridas, que em seguida so convertidas
em nmero do bitipo de 7 dgitos, levando a identificao da
espcie bacteriana.
Os 20 substratos includos para identificao de
enterobactrias so: ONPG, arginina diidrolase, lisina
descarboxilase, ornitina descarboxilase, citrato, sulfeto de
hidrognio, urease, triptofano desaminase, indol, Voges-
Proskauer, gelatina, glicose, manitol, inositol, sorbitol,
ramnose, sacarose, melibiose, amigdalina, arabinose.
Pelo sistema API 20E so identificadas mais de 100
espcies de bactrias gram-negativas. Esse sistema um dos
mais utilizados nos laboratrios clnicos e de pesquisa.
Obs: Tambm so comercializados outros sistemas API para
identificao de bactrias Gram-positivas.
3-2. Sistema VITEK (SISTEMA AUTOMATIZADO)

O sistema VITEK (bio Mrieux) um sistema
computadorizado que consiste em um mdulo gerador de vcuo,
leitor-incubador, computador-impressora e um monitor de
computador. Este sistema utilizado com cartes de teste
VITEK para identificao bacteriana e provas de
susceptibilidade a antibiticos, totalmente automatizadas.
Este sistema permite a identificao de enterobactrias em 8
horas, sendo aceito como um mtodo confivel para
identificao rpida de bacilos gram negativos nos
laboratrios de microbiologia clnica.
Cada carto de identificao possui 30 testes
bioqumicos que no necessita adio de reagentes, evitando
erros. VITEK capaz de detectar mais de 300 espcies de
microrganismos (bactrias gram-negativas e gram-positivas e
leveduras).
Tabela de Identificao Bioqumica de Enterobactrias
Indol + -/+ - - - -/+ - - - - + - + + +

Citrato de Simmons - - d + + + + + +/- + d + - + -
H2S (TSI) - - + + +/- - - - - - + + - - -
Urease - - - - dw +w +w - - dw + + + + -
Motilidade +/- - + + + - + + + + + + + + +
Lisina d - + + - + - + + + - - - - -
Ornitina d d + + d - + + + + - + + - -
Glicose + + + + + + + + + +/- +/- + d -/+ -
Lactose + - - d d + + + -/+ -/+ - - - - -
Sacarose d - - - d + + + d + + d - d d_
(+) positivo,( - ) negativo, (d) positiva tardia, reao pode ocorrer em at 72h, (w) reao fraca, (+/-) maioria positiva,
(-/+) maioria negativa
Aspectos Microscpicos e Macroscpicos dos Fungos 33
VII ASPECTOS MICROSCPICOS E MACROSCPICOS DOS FUNGOS
Os fungos so organismos eucariticos, heterotrficos,

obtendo sua alimentao a partir de matria orgnica
inanimada ou nutrindo-se como parasitas de hospedeiros vivos.
Estes microrganismos causam doenas humanas, em animais e
vegetais. De um modo geral, os fungos incluem os bolores (ou
mofos) e as leveduras. Os bolores so filamentosos e
pluricelulares e as leveduras se apresentam sob forma
unicelular.
Conhecer os aspectos microscpicos e macroscpicos dos
fungos de extrema importncia para a identificao destes
organismos que so agentes etiolgicos de processos
infecciosos, de reaes de hipersensibilidade imediata e
tardia e produtores de micotoxinas.
A coleta do material o primeiro passo para
obteno de um resultado laboratorial confivel. Deve-se
sempre questionar o paciente em relao ao uso de medicaes
antifngicas tpicas e/ou sistmicas. Caso o paciente esteja
fazendo uso da medicao, o mesmo dever ser orientado a
suspend-la por um perodo de 15 dias, em caso de uso tpico
e 1 ms, quando se tratar de drogas de uso sistmico. Esta
suspenso deve ser realizada com autorizao mdica.
de grande importncia que todos os espcimes
clnicos encaminhados para diagnstico laboratorial, venham
acompanhados de uma ficha, que contenha no mnimo as
seguintes informaes: identificao e procedncia do
paciente, tempo de evoluo da leso, localizao e aspectos
clnicos da leso, possveis contatos com animais e solo, uso
de drogas.
1)ASPECTOS MICROSCPICOS DOS FUNGOS
1.1- Exame microscpico direto
O diagnstico microbiolgico e imunolgico das micoses

pode ser feito pelo exame microscpico direto, exame
histopatolgico, cultivos, testes intradrmicos, pesquisa de
anticorpos sricos e de antgenos. O exame microscpico
direto o mtodo mais usado no diagnstico de rotina das
micoses por ser rpido e sensvel, permitindo a visualizao
do fungo e em muitas ocasies, sua identificao.
importante salientar que a realizao do cultivo
paralelamente ao exame direto imprescindvel para um
completo diagnstico laboratorial micolgico.
A tcnica de preparao para o exame direto, varia de
acordo com o material biolgico a ser investigado e da
suspeita clnica da etiologia do processo.
Preparao do exame direto com amostras clnicas densas

(p.ex.: escamas epidrmicas, ungueais e plos):
a) Clarificar a amostra clnica, j sobre a lmina, com 1 gota

da soluo de hidrxido de potssio (KOH) a 10-20%;
b) Aquecer suavemente a lmina na chama do bico de Bunsen; o
calor juntamente com o KOH vai dissolver a queratina
presente na amostra, clareando o material de fundo; esperar
10 minutos, tempo necessrio para clarear o material de
fundo.
c) Corar o material com 1-2 gotas de lactofenol azul-algodo
(ou azul de Amann);
d) Cobrir com lamnula;
e) Examinar ao microscpio com objetiva de 40X.
Exemplos de algumas caractersticas morfolgicas dos
fungos:
clula brotante
Pseudo-miclio Hifa cenoctica Hifa septada
Hifa artrosporada
Epidermophyton sp Microsporum sp Trichophyton sp
A- Macrocondeos
B- Microcondeos
Preparao da lmina a partir do cultivo de fungos:
a) Colocar 1 a 2 gotas do corante lactofenol azul-algodo;

b) Retirar uma pequena poro da colnia (do miclio
reprodutivo ou areo, no caso dos fungos filamentosos) e
colocar sobre a lmina;
c) Cobrir com lamnula;
d) Observar ao microscpio com objetiva de 40X.
Aps o preparo da lmina podemos visualizar os aspectos
microscpicos dos fungos.
Observaes:
9 As amostras de consistncia lquida e relativamente claras
podem ser examinadas diretamente ao microscpio aps a
mistura em uma gota de soluo salina em lmina de vidro.
9 A utilizao do corante lactofenol azul-algodo
importante porque o fenol inviabializa os microrganismos
vivos e o azul-algodo cora a quitina, presente nas paredes
das clulas fngicas.
1.2- Aspectos microscpicos dos fungos filamentosos ou bolores

O fungo filamentoso se origina a partir de um esporo,
que emite um filamento tubular microscpico, chamado hifa,
que posteriormente se ramifica formando um conjunto de hifas
denominado miclio, que pode ser vegetativo ou reprodutivo
(areo). Algumas hifas apresentam paredes transversais ou
septos e so chamadas hifas septadas, outras no possuem
septos e so chamadas hifas cenocticas .
Microscopicamente, os bolores so identificados
principalmente pelos tipos de esporos, corpos de frutificao
e hifas. Os esporos so muito importantes na classificao
dos fungos, sendo as classes diferenciadas, primariamente,
pelas caractersticas morfolgicas dos esporos.
A anlise conjunta das caractersticas microscpicas,
em geral, permite a classificao genrica do fungo. A
definio da espcie, geralmente, tarefa de laboratrios de
referncia.
1.3- Aspectos microscpicos das leveduras

Como leveduras, os fungos apresentam-se unicelulares
com forma oval ou arredondada. A reproduo assexuada das
leveduras ocorre principalmente por gemulao ou brotamento.
Algumas vezes, aps a gemulao, as leveduras e as clulas-
filhas ficam aderidas, formando uma estrutura conhecida como
pseudomiclio (p.ex., Candida). As leveduras tambm podem se
reproduzir sexuadamente atravs de ascosporos ou
basidiosporos. Portanto, aobservao microscpica de
estruturas assexuadas e sexuadas bastante empregada na
identificao genrica das leveduras.
2) ASPECTOS MACROSCPICOS DOS FUNGOS (Observao macroscpica
das colnias em meio slido).
Ao contrrio do que se verifica no estudo das
infeces bacterianas, em que o cultivo o principal mtodo
diagnstico, nas infeces fngicas ele um complemento do
exame microscpico direto. As razes que podem contribuir
para isso, so o crescimento lento dos fungos e as
dificuldades para cultivar alguns deles.
O isolamento primrio, seguido da correta
identificao dos agentes etiolgicos, uma condio
indispensvel para o diagnstico laboratorial das micoses, e,
para tanto, a escolha do meio de cultura adequado uma
tarefa de extrema importncia.
Uma ampla variedade de meios de cultura pode ser
utilizada num laboratrio de micologia, atendendo a diversos
fins, tais como: isolamento primrio do fungo a partir dos
espcimes clnicos, a identificao taxonmica dos gneros e
espcies, a estocagem e manuteno em micoteca, e, mais
recentemente a execuo de testes de susceptibilidade frente
a diferentes antifngicos.
A seleo do meio a ser empregado deve, basicamente,
levar em considerao o tipo de amostra biolgica a ser
semeado e a suspeita clnica.
Apesar da variedade de meios de cultivo
disponveis(muitos vendidos pronto para uso, outros
preparados artesanalmente), o gar Sabouraud ainda o meio
mais utilizado dentro de um labotatrio de micologia. A esse
meio podem ser acrescidos muitos inibidores,tais como o
cloranfenicol e a cicloeximida, objetivando otimizar o
isolamento em espcimes clnicas possivelmente contaminadas
por bactrias e fungos anemfilos (fungos que apresentam suas
estruturas de reproduo comumente vetorizadas por correntes
de ar). O meio de Sabouraud o principal meio de cultura
utilizado na micologia mdica. utilizado para o cultivo
primrio geral dos fungos (leveduras, filamentosos e alguns
dimrficos), emespecial para Dermatoftos, uma vez que as
principais caractersticas macro e microscpicas desse
grupamento fngico so descritas a partir do seu crescimento
nesse meio.
Porm importante salientar que alguns fungos
filamentosos dos gneros Aspergillus, Fusarium,
Scopulariopsis, ou algumas leveduras como o Cryptococcus
neoformans, por exemplo, podem ter seu crescimento inibido na
presena da cicloeximida.
As caractersticas principais deste meio so o seu pH
cido (5.8) e seu elevado teor em glicose, que o torna mais
seletivo para fungos, dificultando o crescimento bacteriano.
Entretanto, o meio no totalmente impediente para
bactrias, por esta razo deve ser acrescido de antibiticos
que inibem o crescimento destes microrganismos. O
clorafenicol um dos antibiticos mais utilizados, pela
comodidade do seu uso, pois pode ser esterelizado na
autoclave e pelo seu amplo espectro de ao.
A composio do gar Sabouraud foi,inicialmente
proposta pelo micologista Raymond Jacques Sabouraud, em 1904,
e vem apresentando diversas modificaes com o passar dos
anos, com alteraes na quantidade de alguns componentes,
tais como a dextrose e a adio de substncias inibidoras ,
como o clorofenicol e a cicloeximida.
COMPOSIO DO MEIO GAR SABOURAUD:

Dextrose (glicose) ---- 20g
Peptona -------------- 10g
gar ------------------ 20g
gua ---------------- 1.000ml
pH final = 5.6
Dissolver agar, peptona e dextrose em gua destilada,

aquecendo em banho-maria. Autoclavar, por 15 minutos, a
121C.
OUTROS MEIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA O ISOLAMENTO DOS

FUNGOS: gar batata dextrose, gar malte, gar fub, gar
extrato de levedura glicose, etc.
2.1- Aspectos macroscpicos dos fungos filamentosos
A morfologia das colnias dos fungos filamentosos um
importante dado e pode auxiliar bastante em sua
identificao. Para isso so feitas observaes quanto
textura, cor, topografia, consistncia, contorno da colnia,
etc.
TEXTURA A textura da colnia refere-se s caractersticas

dos miclios areos em seu conjunto e pode ter aspecto:
ALGODONOSO OU COTONOSO: miclio areo denso e alto;
AVELUDADO: miclio areo baixo, lembrando veludo;
PULVURULENTO: hifas planas, esfarelam-se facilmente devido
densa produo de condias;
CREO OU GLABROSO: superfcie lisa, pois no produzem
miclio areo.
COR- A colnia pode ser branca, amarelada, acinzentada,

alaranjada, verde, rosa, creme, marrom, etc. A cor do verso e
anverso da colnia e os anis concntricos de diferentes
cores so aspectos a serem considerados na identificao.
CONSISTNCIA- A colnias pode ser pastosa, branda, coricea,

mole, etc.
CONTORNO- A colnia pode ser circular, oval, elptica,

irregular, etc.
2.2- Aspectos macroscpicos das leveduras

A maioria das leveduras cresce adequadamente a 30oC ou
temperatura ambiente em gar Sabouraud. Caractersticas
como cor, consistncia, bordos, superfcie e topografia
tambm so observadas em meios de cultivo slidos. Com 2 a 3
dias de incubao formam-se colnias de cor branca a creme,
amarelada, alaranjada ou vermelha, de textura pastosa,
mucides ou secas, lisas ou enrugadas.
A habilidade da levedura crescer a 37oC uma
caracterstica importante; a maioria das leveduras
patognicas cresce bem a 30-37oC, enquanto as saprfitas no
crescem em temperaturas mais elevadas.
ASPECTOS DAS COLNIAS FNGICAS QUANTO AO RELEVO

1. Cerebriformes
2. Rugosas
3. Apiculadas
4. Crateriformes
ASPECTOS DE COLNIAS FNGICAS QUANTO TEXTURA

1.Algodonosas
2.Furfurceas
3.Penungentes
4.Arenosas
5.Veludosas
6.Glabrosas
Reaes Antgeno - Anticorpo 41
VIII REAES ANTGENO ANTICORPO
Introduo terica
A exposio de eptopos (antgenos=imungenos) a um

sistema de clulas e tecidos imunologicamente competentes,
origina estimulao de linfcitos B e T . Os primeiros(LB),
diferenciam-se aps divises mitticas, em plasmcitos que
so clulas munidas de um Sistema de membranas (Golgi e
RE)prprios de clulas produtores e secretoras de protenas.
Estas protenas so glicoprotenas globulares com funo de
se combinar quimicamente com os elementos que formam parte do
eptopo que deu origem a todo este fenmeno celular e
secretor.
Os linfcitos T, ao serem estimulados, secretam
interleucinas, que so protenas cuja funo estimular
outros linfcitos T e B (interleucinas 2,4) macrfagos, NK,
linfcitos citotxicos (interferon gama)por exemplo.
Apenas discutiremos, por enquanto, a ao das
globulinas produzidas pelos plasmcitos: Os anticorpos ou
imunoglobulinas.
AES IN VITRO: Reaes antgeno anticorpo
Estas acontecem entre a poro Fabdas molculas de

anticorpo e o eptopo dos imungenos. Nesta poro Fab, que
se estabelecem ligaes no covalentes fracas como :pontes de
Hidrognio, ligaes eletrostticas, hidrfobas e mediante
foras de Van der Waals. Conhecendo os tipos de ligaes que
se estabelecem e mantm unidos o complexo antgeno-
anticorpo, fica fcil entender o conceito de especificidade,
pois somente podero se formar estas ligaes em nmero
suficiente para se manterem estveis, SE O ANTICORPO
REALMENTE FR DIRIGIDO CONTRA ESSE EPTOPO. Se as ligaes se
formam tambm a nvel de estrutura primria e secundria do
anticorpo, formando numerosas ligaes de curto alcance, o
complexo estvel.
Ento, numa primeira instancia, deve haver interao

qumica entre imungeno (antgeno quando falamos de reao in
vitro
E FAB do anticorpo. Numa Segunda etapa, grande nmero de
molculas do complexo antgeno-anticorpo, tendem a formar
malhas que naturalmente sedimentam como grumos grosseiros ou
como sedimento fino, dependendo da condio fsica do
antgeno. Se particulado (hemcias, bactrias, protozorios)
se observam grumos; se solvel, se forma fino precipitado com
o imunocomplexo.
ALGUNS CONCEITOS IMPORTANTES:
Atravs das reaes sorolgicas pode-se pesquisar
anticorpos contra um determinado antgeno bacteriano,
parasitrio, mictico, ou at mesmo contra componentes do
prprio indivduo como acontece nas doenas autoimunes.
Nestes casos ,variaes no ttulo de anticorpos indicam
evoluo ou involuo da doena ou infeco. J ,quando
interessa utilizar estas reaes para detectar antgenos
circulantes no soro ou plasma, basta saber se estes existem
ou no, as reaes podem ser apenas qualitativas. Se quiser
quantificar o antgeno, basta comparar o resultado com
concentraes de padres bem quantificados.
Ttulo: a maior diluio do soro que ainda reage
positivamente numa reao antgeno-anticorpo. Assim, um
alto ttulo indica uma grande quantidade de anticorpos(foi
necessrio diluir muito os anticorpos presentes para que
estes desaparecessem na unidade de volume pr-fixada. Ex.:
ttulo 1/10<1/455.Este ltimo contm mais anticorpos que
1/10,pois foi necessrio diluir os soros 455 vezes, para
que no ficasse mais anticorpos no tubo de ensaio.
Sensibilidade da reao; Qualidade de uma determinada
tcnica, que permite detectar pequenas quantidade s de
antgeno ou anticorpo no material analisado. Por exemplo,as
tcnicas imunoenzimticas, detectam <1 g de anticorpo ou
antgeno, enquanto que as reaes que utilizam
radioimunoensaio, detectam anticorpos ou antgenos na ordem
de picogramas.
Especificidade: Qualidade de uma tcnica que permite que a
reao antgeno anticorpo acontea com eptopos que so
exclusivos de uma determinada doena. Quando h reao com
outros eptopos, outros anticorpos tambm entram a somar na
reao, e estamos frente a reaes cruzadas ou falso
positivas

REAO DE AGLUTINAO DIRETA
Na reao de aglutinao direta utilizam-se partculas
antignicas insolveis em sua forma integra ou fragmentada.
Hemcias, bactrias, fungos e protozorios podem ser
aglutinados diretamente por anticorpos.
REAES DE PRECIPITAO
Ao reagir antgenos solveis com seus respectivos anticorpos,
formam se redes que tendem a precipitar. Nesta reao
possvel observar que as reaes antgeno-anticorpo dependem
das concentraes do antgeno e dos anticorpos presentes.
Assim se formar um complexo estvel quando Antgeno e
anticorpo estejam em concentraes equivalentes, de outro
modo, haver dissoluo do complexo e o precipitado no se
forma, embora haja Ag e Ac.
As reaes de precipitao hoje em dia, so executadas em
meios semi slidos como gis de agarose (gel neutro,
incolor).
Tanto antgeno e anticorpo podem difundir neste meio,
dependendo do seu tamanho molecular, at encontrar as
propores timas de antgeno anticorpo, ento precipitam
formando linhas ou halos de precipitao no local. Varias
aplicaes existem na rotina laboratorial para estas
tcnicas:
Imunodifuso radial
Imunodifuso dupla
Imunoeletroforese
Contra imunoeletroforese
REAO DE FLOCULAO TCNICA DE VDRL
Teste no treponmico para o diagnstico de Sfilis: VDRL
A tcnica de VDRL ( Venereal Disease Research Laboratory)

um exemplo de reao de floculao, cujo objetivo a
pesquisa de anticorpos em um indivduo com suspeita de
sfilis, sendo esta doena causada pela espiroqueta Treponema
pallidum sub-espcie pallidum.
A tcnica de VDRL pode ser realizada atravs dos mtodos
qualitativo e quantitativo. utilizada como triagem
sorolgica para a pesquisa de anticorpos em um indviduo com
suspeita de sfilis e tambm para acompanhamento da resposta
teraputica do paciente positivo, atravs da titulao dos
anticorpos. A cardiolipina o antgeno utilizado na tcnica
que pesquisa anticorpos, chamados de reagina. Trata-se de um
fosfolpideo que atualmente preparado a partir do corao
bovino, sendo assim denominado cardiolipina. Aparentemente,
ocorre produo de um anticorpo denominado reagina na
sfilis, que reage com este complexo de cardiolopina-
lipoprotena. No se sabe exatamente por que a reagina
produzida; todavia, no se trata de um anticorpo especfico
contra o T. pallidum. Os espiroquetas possuem uma substncia
lipide, e possvel que esta substncia seja
suficientemente semelhante ao complexo de cardiolipina-
lipoprotena para que os anticorpos produzidos contra o
antgeno lipide dos espiroquetas tambm possam reagir com a
cardiolipina.
Um fato de grande importncia nesse teste de triagem
sorolgica para Sfilis, que nem todo sifiltico comprovado
atravs de provas treponmicas, produz reao positiva para
essa prova de VDRL. Outro dado de grande importncia
laboratorial, o fato de cerca de 2% de pacientes na sfilis
primria e secundria serem falsamente negativos devido a um
excesso deantgenos (fenmeno conhecido como pr-zona).
Devido a esta ocorrncia a OMS, sugeriu a realizao desse
teste de triagem, qualitatiamente e quantitativamente na
diluio de 1/8 para todos pacientes submetidos a esse meio
de diagnstico laboratorial.
Por outro lado, alguns pacientes apresentam resultados falso-
positivos, sem possuir a doena ou terem se submetido a algum
tipo de exposio. Segue abaixo as principais causas de
resultados falso-positivos:
1. Infeces virais ou bacterianas e em muitos estados
febris, como hipersensibilidade ou vacinao;
2. Doenas sistmicas crnicas, com presena de anticorpos
antifosfolpideos;
3. Doenas reumatides do colgeno;
4. Doenas infecciosas como Malria e Tuberculose;
5. Doenas treponmicas no-sifilticas, como bouba,
pinta, Borrelia (doena de Lyme) ou febre recidivante.
Material para um grupo
Mtodo qualitativo
VDRL, soro positivo e negativo, ponteiras, pipeta automtica

de 50 l, lminas, luva descartvel, culos protetor.
Procedimento:
Sobre a lmina limpa marcar retngulos.
Colocar 50 l de da amostra do soro positivo e do
soro negativo.
Colocar uma gota do antgeno (cardioplina).
Homogenizar durante um minuto com movimentos de vaivm
para que ocorra a reao Antgeno-Anticorpo e observar a
presena ou no de floculao na lmina.
Leitura dos resultados:

O resultado observado pela floculao que ocorrer,
poder ser uma floculao leve, moderada ou intensa,depender
da presena do ttulo dos anticorpos no soro do indivduo.
TESTE RPIDO DE TRIAGEM QUALITATIVA PARA DETECO DE
ANTICORPOS PARA HIV 1/2.
O teste rpido HIV 1/2 - Bio-Manguinhos um teste de

triagem, que usa um coquetel de antgenos para detectar
anticorpos para HIV 1/2 em soro, plasma ou sangue total
humano. O teste se baseia nas tecnologias de
imunocromatografia e fluxo lateral.
Resumo:
O Vrus da Imunodeficincia Humana (HIV) um retrovrus,
identificado em 1983 como agente etiolgico da Sndrome de
Imunodeficincia Adquirida. A AIDS caracterizada por
alteraes em funo e nmero na populao de linfcitos T (T
helper), que desempenha um papel chave na resposta
imunolgica do hospedeiro humano, deixando os portadores
deste vrus suscetveis a infeces oportunistas e certas
malignidades.
O HIV constitudo por uma molcula de RNA, protegida
por um capsdeo e um envelope. O envelope do vrus o
principal alvo da resposta imune. A presena do vrus faz com
que o sistema imune dos pacientes produza anticorpos anti-
HIV. A deteco destes anticorpos deve ser usada como parte
do diagnstico laboratorial para o HIV 1/2. Ensaios de ELISA,
Imunofluorescncia, Western Blot, tcnica da Cadeia de
Polimerase (PCR) entre outros, complementam o diagnstico
laboratorial definitivo para AIDS.
PRINCPIO DO TESTE:
O Teste Rpido HIV- 1/2 Bio-Manguinhos emprega a
combinao de uma protena conjugada com partculas de ouro
coloidal e antgenos de HIV 1/2 ligados a uma fase slida
(membrana). A amostra aplicada ao respectivo poo (S),
seguida da adio de um tampo de corrida. O tampo
proporciona o fluxo lateral dos componentes liberados,
promovendo a ligao dos anticorpos aos antgenos. Os
anticorpos presentes, em casos positivos, se ligam s
protenas especficas conjugadas ao ouro coloidal. No caso de
uma amostra ser positiva o complexo imuno-conjugado migra
na membrana de nitrocelulose, sendo capturado pelos antgenos
fixados na rea do TESTE(T), produzindo uma linha roxo/rosa.
Na ausncia de anticorpos para HIV 1/2, a linha no aparece
na rea do teste. Nos dois casos, a amostra continua a migrar
na membrana produzindo uma linha roxo/rosa na rea de
CONTROLE(C), o que caracteriza o funcionamento adequado dos
reagentes.
COLETA DA AMOSTRA:
O teste Rpido HIV 1/2, Bio-Manguinhos realizado com soro,
plasma, ou sangue total humano.
Soro: o soro obtido do sangue total coletado assepticamente

por puno venosa em tubo sem anticoagulante. Aguardar o
sangue coagular a temperatura ambiente e centrifugar a
2000rpm, durante 10 minutos. Separar o soro do cogulo para
evitar hemlise.
Plasma: coletar o sangue total em tubo com anticoagulante,

centrifugar a 2000rpm durante 10 minutos e separar o plasma
sobrenadante.
Sangue total: Coletar o sangue em tubo com EDTA, heparina ou

citrato de sdio. Para sangue de ponta digital, utilizar a
lanceta, conforme as instrues, desprezando a primeira gota.
Coletar a segunda gota com a ala coletora descartvel.
Para todos os materiais, seguir as instrues do procedimento

do teste, como demonstrado a seguir.
Procedimento para interpretao dos resultados a seguir:
Referncias Bibliogrficas 50
IX REFERNCIAS
1. AMATO NETO, V. et al. Antibiticos na Prtica Mdica.
2. BAILEY, R. et al. Diagnstico Microbiolgico.Editora mdica Pan

Americana S.A 1973. 3a ed.
3. Brasil (Ministrio da Sade)Deteco e Identificao de

Bactrias de Importncia Mdica.Agncia Nacional de Vigilncia
Sanitria. Mdulo V.2005.
4. JAWETZ, E. et al. Microbiologia Mdica. 18. ed. Guanabara
Koogan, 1996.
5. KONEMAN E.W.; ALLEN S.D.; JANDA W.M.; SCHRECKENBERGER P.C. & WINN JNIOR W.C.
Diagnstico Microbiolgico Texto e Atlas colorido 5aed. Medsi,
2001.
6. LACAZ, C.L. Micologia Mdica, 1995.
7. PELCZAR M.J., CHAN E.C.S; KRIEG N.R. Microbiologia: conceitos e

aplicaes. v.1, 2a ed. Makron Books, 1996.
8. ROITMAN, I. Tratado de Microbiologia. Vol. 1.
9. TRABULSI, L.R.; ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O F.; CANDEIAS J.A N.;

Microbiologia. 5a. ed. Atheneu, 2008.
10. RAVEL,Richard. LABORATRIO CLNICO: APLICAES CLNICAS DOS

DADOS LABORATORIAIS. 6 edio. Editora Guanabara Koogan, 1995.
11. SIDRIM, J.J.C & ROCHA, M.F.G. MICOLOGIA MDICA LUZ DE
AUTORES CONTEMPORNEOS. Editora Guanabara Koogan, 2004.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS DE

II TCNICAS DE COLORAO DE BACTRIAS -------------------------------------------- 9

III MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO ----------------------------------------------------16

IV ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS -------------19

V ANTIBIOGRAMA: TCNICAS DE PREPARAO E INTERPRETAO ---------------22

VI ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS ----------- 27

VII ASPECTOS MICROSCPICOS E MACROSCPICOS DOS FUNGOS -----------------33

VIII REAES ANTGENO ANTICORPO --------------------------------------------------41

IX REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ------------------------------------------------------50

Esterilizao o processo de destruio por meio de agentes

ESTERILIZAO POR MTODOS FSICOS

1.2. Tindalizao ou esterilizao fracionada - Processo

2.1. Forno de Pasteur - Neste processo so empregados

2.2. Incinerao - um processo usado para materiais

2.3. Flambagem - Aquecimento direto na chama do bico de

3. Filtrao - um processo usado para esterilizao de

3.1. Tipos de filtros:

Disco de amianto - Filtro de SEITZ

4.1. Radiao ultra-violeta (UV) tem sido utilizada na

4.2- Raios gama e raios X (radiaes ionizantes)tm alto

Glutaraldedo 2% - As solues de glutaraldedo so

Formaldedo (Soluo Alcolica 8%) - A frmula alcolica

Formaldedo (soluo aquosa 10%) - As solues aquosas alm

Estes mtodos associam o produto qumico com o uso de

1 Esterilizao por xido de etileno: A esterilizao

Esterilizao por vapor de formaldedo baixa temperatura:

Precaues - As precaues recomendadas para estas solues

* Desinfeco - A Desinfeco consiste na destruio ou

* Assepsia - o termo usado para designar o processo de

A desinfeco pode ser realizada por agentes fsicos e

1.0. Pasteurizao - um processo empregado na indstria de

1.1.gua Fervente - Artigos de pequeno porte, depois de

Principais compostos utilizados em desinfeco e assepsia:

lcoois - solues a 70% e 80%

1. A escolha do processo de esterilizao

Processo de esterilizao mais eficaz o vapor saturado

A presena de matria orgnica (leo, gordura, sangue, pus

Os invlucros devem permitir o contato dos artigos com o

Os pacotes esterilizados devem ser manuseados o menos

Uso de luvas, Avental e, se necessrio, mscara.

Materiais contaminados por agentes patgenos devem ser

Aps o manuseio de materiais contaminados por agentes

Objetivo: Observar o efeito de antisspticos sobre o

1. Abrir a placa rapidamente e colocar a ponta dos dedos,

Ao dos Agentes Crescimento Bacteriano

As tcnicas de colorao iniciadas por Paul Erlich e

As clulas bacterianas so caracterizadas

Tamanho - as bactrias so microscpicas medindo desde 0,3

Forma - as bactrias podem ser classificadas quanto a forma

Cocos - clulas esfricas.

Arranjos - Grupamentos bacterianos.

Dependendo do plano e do nmero de divises atravs das

2.Bacilos e espirilos apresentam-se em geral, como clulas

Divises repetidas e seguidas desses movimentos determinam

PREPARAO DE ESFREGAO BACTERIANO PARA COLORAO

1-Preparao a partir de meio lquido

Usando ala de platina estril, colocar duas a trs

2-Preparao a partir de meio slido

Colocar uma pequena gota de gua destilada numa lmina.

3-Preparao a partir de material biolgico

Usando um swab estril (zaragatoa), friccionar a

1)Preparar o esfregao bacteriano em lminas;