ALFENAS - MG
2015
Mrcio de Souza Dias
ALFENAS - MG
2015
Dias, Mrcio de Souza
Diversidade e potencial de utilizao de bactrias fixadoras de N2
em Brachiaria brizantha.Mrcio de Souza Dias.Alfenas, 2015.
62f.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
minha orientadora, Professora Dra. Ligiane Aparecida Florentino, e ao meu coorientador professor
Dr. Adauton Vilela de Rezende, pela oportunidade, pelos ensinamentos e confiana.
Aos membros da banca examinadora, Dra. Giselle Prado Brigante, Dra. Ligiane Aparecida Florentino
e Dr. Adauton Vilela de Rezende pela disponibilidade, contribuies e sugestes apresentadas.
Aos professores Dr. Joo Evangelista Fiorini, Dra. Nelma de Mello Silva Oliveira, pelas
orientaes e contribuies ao trabalho.
Aos colegas do curso de ps-graduao, Denner Lemos, Max Rossi, Mariana Spinelli; e aos colegas de
graduao, Flvia Romam, Larissa Compri, Gustavo Quiroga, Gustavo Matheus Barbosa, Rosane Veiga
Rose, pela amizade, companheirismo, pelo auxlio na conduo do experimento e pela tima
convivncia.
Aos amigos Tnia Venga, Jaqueline dos Santos, Adriana Maria Francisco, Sheila Silvrio Neves, Nilton
Oliveira Silva, Joo Batista Neves, Fran Ruffino, Drcio Rabelo, Hyelen Talita, Fabiano Dias Moreira,
Sidnei Marques, Elton Bueno, Alexandra Maria Dias, Marcos Donizete Silva, Anglica Rodrigues,
Rosana Mara Gonalves, Danusa Dias, Climene Cristina Siqueira, Marli Woelbert, Luiz Gonzaga
Ribeiro Neto, Wanderley Ferreira , Claudiomir da Silva dos Santos, J Alves, Anglica P. Todescato,
Ndia Cristina S. Mello, Camila Chioda de Almeida, Heber Garcia Bueno, Teresinha de Souza Tavares,
Elisngela Santos, Elton dos Santos, Renata Tavares, Marcos Bueno Miguel, Narayana de Deus N.
Bregagnoli, Pastor Carlos Roberto Pereira Silva pelo apoio, incentivo e pela amizade.
A todos os meus queridos professores do curso de ps-graduao, Dra. Ligiane Aparecida Florentino,
Dr. Adauton Vilela de Rezende, Dra. Patrcia Frana, Dr. Kleber Pelcia, Dra. Laura rfo, Dr. Paulo,
Dr. Amoracir, Dra. Roberta Bessa, Dra. Adlia Cel, pelo apoio, incentivo, ensinamentos, conselhos e
carinho.
Ao meu companheiro, amigo, referncia e pai, Maurcio Cndido Dias (in memrian), que sempre estar
comigo. Por todo amor, dedicao e ensinamentos; minha me, Anair de Melo Dias, minha querida
e amada irm Vera Lcia de Souza Dias, pelo incentivo e companheirismo, e s minhas tias Rosngela
Nannetti Dias e Aparecida Melo, pela compreenso, incentivo e carinho.
minha esposa Juliana Ramalho Bolognani Dias, pelo carinho, amor, e pacincia ao longo de toda esta
caminhada e aos meus queridos e amados filhos Mrcio Vincius Bolognani Dias e Carlos Eduardo
Bolognani Dias, por todas as vezes que sentia o fardo pesado e eles me recompensavam com um olhar,
um abrao, um sorriso.
"Jamais considere seus estudos como uma obrigao, mas como uma oportunidade invejvel
para aprender a conhecer a influncia libertadora da beleza do reino do esprito, para seu
prprio prazer pessoal e para proveito da comunidade qual seu futuro trabalho pertencer"
(A. Einstein)
RESUMO
The objective of this research was to analyze the diversity of nitrogen fixing bacteria
associated and endophytic B. brizantha, study the potential the solubility of inorganic
phosphates of iron and aluminum, produce acid-3-indole acetic (AIA) and to evaluate the effect
of inoculation of these isolates in Brachiaria brizantha cv MG 05 Victoria. The bacteria were
isolated from soil samples grown under Brachiaria and parts of plant tissue this grass, the dry
and wet periods in the municipalities of Alfenas and Machado, southern Minas Gerais. Five
semisolid culture media and semi-selective were used: FAM (Azospirillum amazonense), JMV
(Burkholderia sp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) and NFb (Azospirillum
spp.). The phosphate solubilization tests and AIA production were performed in vitro and were
used as of 22 bacterial isolates selection criteria used in the inoculation of B. brizantha cv MG
5 Victoria, grown in pots containing 20 dm3 of soil. There were two cuts, in what form evaluated
the following parameters: height (Al), width (LF) and leaf length (CF), number of tillers (NP),
length (CR) and root dry mass (MSR) dry matter (DM), dry matter yield (PMS), neutral
detergent fiber (NDF) and acid (ADF) and crude protein in dry matter (PBMS). A total of 332
isolates were obtained, most endophytic. The greatest number and diversity were from the city
of Alfenas. During the rainy season was verified greater number and diversity of isolates in
both municipalities, when compared to the dry season. Thirty-five isolates solubilized iron
phosphate and 78 produced AIA, especially the isolated UNIFENAS 100-17, 21, 40 and 78,
able to do both simultaneously. The inoculation of nitrogen fixing strains of endophytic origin
and rhizospheric influenced the development of B. brizantha cv MG 5 victory, contributing to
the production of MS, PMS and PBMS in the two cutting heights highlighting the UNIFENAS-
100-16 isolated, 21, PBMS 78 whose content was more than 7%.
Key words: Bacteria promoting plant growth, nitrogen fixing bacteria, pasture recovery
LISTA DE TABELAS
ARTIGO 1
Tabela 2. Caractersticas qumicas dos solos das reas de estudo dos municpios de Alfenas e
Machado. .................................................................................................................................. 36
Tabela 4. ndice de solubilizao (IS) de fosfato de ferro (FePO4.2H2O) em meio slido GELP
por bactrias diazotrficas de Brachiaria brizantha. ............................................................... 40
ARTIGO 2
Tabela 2. Altura (Al), Largura (LF) e comprimento da folha (CF), nmero de perfilhos (NP) e
matria seca (MS) de Brachiaria brizantha cv MG05 Vitria cutivada sob diferentes
tratamentos no primeiro corte e segundo corte. Massa seca radicular (MSR) e crescimento
radicular (CR) segundo corte. ................................................................................................... 54
Tabela 3. Porcentagem de matria seca total (MS), produtividade de matria seca g/vaso (PMS)
de B. Brizantha cv MG05 Vitria cultivada sob diferentes tratamentos no primeiro corte e
segundo corte. Fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente cido(FDA) e protena bruta na
matria seca (PBMS) segundo corte......................................................................................... 58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIA cido-3-indolactico
Al Altura
BDA Batata Dextrose Agar
BPCV Bactrias Promotoras de Crescimento Vegetal
CF Comprimento da Folha
CR Crescimento Radicular
DIC Delineamento Inteiramente Casualizado
FBN Fixao Biolgica de Nitrognio
FDA Fibra em Detergente cido
FDN Fibra em Detergente Neutro
IAM cido ndole-3-acetamida
IpyA cido-3-pirvico
IS ndice de Solubilizao
LF Largura da Folha
MAPA Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
MS Matria Seca Total
MSR Matria Seca Radicular
NI Nmero de Isolados
NP Nmero de Perfilhos
PB Protena Bruta
PBMS Protena Bruta na Matria Seca
PMS Produtividade de Matria Seca
RPCPs Rizobactrias Promotoras de Crescimento de Plantas
SRCV Substncias Reguladoras do Crescimento Vegetal
SUMRIO
CAPTULO 1 ...................................................................................................................... 15
1. INTRODUO .............................................................................................................. 16
2. REFERENCIAL TERICO ......................................................................................... 17
2.1 Fixao biolgica de nitrognio ............................................................................ 17
2.2 Associaes de diazotrficos com espcies vegetais ............................................ 17
2.3 Bactrias promotoras de crescimento vegetal ....................................................... 19
2.4 Solubilizao de fosfato ........................................................................................ 20
2.5 Produo de cido-3-indolactico ......................................................................... 21
2.6 Brachiaria brizantha cv MG05 Vitria ............................................................... 22
2.7 Anlise bromatolgica de pastagens.....................................................................23
2.8 Uso de inoculantes ou biofertilizantes .................................................................. 25
CAPTULO 2 ...................................................................................................................... 31
ARTIGO 1:Diversidade de bactrias diazotrficas em pastagens B. brizantha ........... 32
INTRODUO .................................................................................................................. 33
MATERIAL E MTODOS ............................................................................................... 35
RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................... 38
CONCLUSES................................................................................................................... 42
AGRADECIMENTOS ....................................................................................................... 42
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................. 42
ARTIGO 2: Bactrias diazotrficas e as caractersticas morfolgicas e bromatolgicas
de Brachiaria brizantha cv MG05 Vitria ........................................................................ 49
INTRODUO .................................................................................................................. 50
MATERIAL E MTODOS ............................................................................................... 51
RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................... 54
CONCLUSES................................................................................................................... 61
AGRADECIMENTOS ....................................................................................................... 61
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................. 61
15
CAPTULO 1
16
1 INTRODUO
2 REFERENCIAL TERICO
diversas espcies vegetais sem formar ndulos. Embora tambm possam ser encontrados em
dicotiledneas, os resultados demonstram que esta ocorrncia mais generalizada em
gramneas e outras monocotiledneas. Espcies mais comumente encontradas so: Azospirilum
spp. (A. lipoferum, A. brasilense, A.amazonense, A. halopraeferans, A. irakense), Azotobacter
paspali, Bacillus polimixa, B. azotofixans, Azoarcus indigens, A.communis, Acetobacter
diazotrophicus (syn. Gluconobacter diazotrophicus), Herbaspirillum seropedicae, H.
rubrisubalbicans e Burkholderia spp.. Espcies dos gneros Azoarcus, Acetobacter e
Herbaspirillum so consideradas obrigatoriamente ou predominantemente endofticas, uma vez
que sua ocorrncia praticamente restrita aos tecidos internos vegetais.
Experimentos conduzidos pelo mtodo de incorporao do 15N2 confirmaram que vrias
gramneas tropicais se beneficiam de nitrognio fixado biologicamente (Vinhal-Freitas, 2010).
Bactrias diazotrficas isoladas de gramneas foram identificadas como pertencentes ao
gnero Burkholderia (Van et al. , 1996; Baldani et al., 2000) e a espcie de Burkholderia isolada
de leguminosas apresentou alta similaridade com isolados de gramneas (Moulin et al., 2001).
Estes resultados mostram uma interessante relao ecolgica entre a fixao de nitrognio em
gramneas e leguminosas que deve ser estudada no sentido de verificar como isto atua na
sustentabilidade dos ecossistemas.
O manejo da FBN em gramneas depende, entre outros, da identificao da (s) espcie
(s) que contribui (em) significativamente para o processo. Como elas no formam estruturas
anatmicas diferenciadas (como os ndulos de leguminosas), sua localizao e ocorrncia na
rizosfera e no interior dos tecidos vegetais pesquisada colocando-se amostras de solo,
rizosfera, raiz ou outro material vegetal em meios de cultura seletivos para cada espcie. A
ocorrncia de espcies endofticas (que ocorrem dentro dos tecidos) pesquisada
desinfestando- se superficialmente a amostra com produtos como Cloramina-T ou gua
sanitria, entre outros. Frequentemente, mais de uma espcie e at mais de um gnero so
encontrados na mesma espcie vegetal. Alm disso, outras espcies no detectadas pelos meios
de cultivo utilizados ou espcies no cultivveis podem tambm estar ocorrendo. No entanto,
alguns resultados mostraram correlao com a incidncia de determinadas espcies e as
demandas nutricionais da planta. Por exemplo, o nmero de clulas de Azospirillum spp.
constante no solo e na rizosfera (ecto + endorhizosfera) de milho durante todo o ciclo da planta,
porm quando as bactrias da ectorrizosfera so eliminadas atravs da esterilizao superficial
com Chloramina-T, verifica-se que o nmero destas bactrias na endorhizosfera da raiz
aumenta bastante na florao e posteriormente no enchimento de gros, justamente quando a
demanda de nitrognio e de outros nutrientes pela planta maior (Magalhes et al., 1979). Alm
19
disso, os nmeros totais de Azospirillum spp. no interior das razes se correlacionaram com o N
acumulado em trigo (Baldani et al., 1983).
Apesar da pesquisa sobre diazotrficos associativos no Brasil ter se iniciado na dcada
de 50 por Dbereiner e colaboradores, com os gneros Azotobacter e Beijerinckia, ela s foi
intensificada a partir da descoberta de novas espcies de Azospirillum (Dobereiner, 1978), que
coincidiu com a chamada crise do petrleo, despertando o interesse por alternativas
biolgicas aos fertilizantes nitrogenados utilizados na agricultura. A partir de ento, vrias
espcies novas tm sido descobertas e ensaios de inoculao de diazotrficos associativos em
plantas tm sido realizados no Brasil e em outros pases.
Os clculos da contribuio de N fixado para gramneas esto em torno de 25 a 50 kg N
ha-1 o que equivale ao suprimento mdio de cerca de 17% das demandas da cultura (Moreira,
2010). Considerando a importncia que as espcies produtoras de gros, como trigo, arroz e
milho, entre outras, so a principal fonte de carboidrato da dieta humana e o alto potencial
fotossinttico das gramneas C4 nos trpicos, esta taxa de FBN, mesmo baixa, representa uma
grande economia nos custos de produo, o que justifica estudos visando seu manejo.
no s pelo micro-organismo, mas tambm pela prpria planta, como as auxinas. Fatores como
disponibilidade de nutrientes, temperatura, pH, composio e quantidade de substrato na
rizosfera afetam a sntese de SRCV (Moreira & Siqueira, 2006).
A maior parte dos estudos envolvendo as BPCV esto relacionadas com a aplicao na
agricultura. Estudos mostram que alm da capacidade de fixar nitrognio, algumas estirpes dos
gneros Bradyrhizobium e Rhizobium apresentam potencial de utilizao de como BPCV em
no leguminosas, como o rabanete (Raphanus sativus L.), na produo de fitormnios,
solubilizao de fosfato e produo de siderforos (Antoun et al., 1998). Juntamente com
resduos orgnicos, Bacillus subtilis, uma BPCV, apresentou potencial para incrementar a
nutrio e crescimento de algodo (Gossypium L.) e soja (Glycine max L.) (Araujo, 2008).
As BPCV tambm so utilizadas associadas a bactrias nodulferas para o melhor
desenvolvimento do vegetal. Silva et al.(2007) observou que quando inoculado BPCV,
Paenibacillus e Bacillus, na simbiose entre caupi (Vigna unguiculata L.) e Bradyrhizobium
(BR2001), ocorreu um aumento na nodulao e como consequncia, promovendo uma melhor
fixao de nitrognio. Petersen et al., (1997), observou que a inoculao de Paenibacillus
polymyxa, juntamente com Rhizobium etli em sementes de feijo (Phaseolus vulgaris L.)
aumentou a densidade de rizbio na superfcie da raiz, mostrando a ao indireta de P. polymyxa
sobre o rizbio, e tambm o aumento do nmero de ndulos e de razes laterais da planta.
Apesar da importncia, as pesquisas sobre a utilizao de BPCV ainda so pouco difundidas.
em solos brasileiros sob pastagem, cultivo de milho, mata e florestas, demonstraram que a mais
frequente foi a de fosfato de ferro, seguida de fosfato de alumnio e fosfato de clcio.
Alguns fungos e bactrias possuem a capacidade de disponibilizar este fosfato ligado a
outro elemento, processo responsvel por aumentar a disponibilidade de P no solo. Estudo com
diferentes espcies bacterianas quanto a sua capacidade de solubilizao mostram que espcies
de Rhizobium, Pseudomonas e Bacillus apresentam o maior potencial de solubilizao
(Rodrguez & Fraga, 1999).
Segundo a literatura, estes micro-organismos solubilizam o fosfato inorgnico por dois
mecanismos principais, sendo pela produo de cidos orgnicos ou pela secreo de prtons
(H+) (Illmer et al., 1995). A solubilizao do fosfato tambm varia de acordo com a natureza
do mineral de fosfato fornecido e a composio meio que o micro-organismo inoculado
(Gyaneshwar et al., 1998). Em campo, esta eficincia varia de acordo com o tipo de solo e a
cultura (Rodrguez & Fraga, 1999).
Inicialmente, Gerretsen (1948) observou que a quantidade de fsforo assimilado pelas
plantas inoculadas com micro-organismos rizosfricos foi maior do que o tratamento sem
inoculao, demonstrando a capacidade dos micro-organismos em solubilizar fsforo
inorgnico, contribuindo assim para o desenvolvimento da planta. Dentre os micro-organismos
solubilizadores de fosfato, merecem destaque as bactrias fixadoras de nitrognio atmosfrico,
que, alm de fornecer o N para o desenvolvimento vegetal, podem tambm contribuir com o
fornecimento de P para as plantas (Rodriguez & Fraga, 1999; Marra et al., 2012).
A B. brizantha (Hochst.) Stapf. cv. MG05 Vitria uma gramnea forrageira com
caractersticas especficas, como sendo uma gramnea perene, poliploide, de reproduo
apomtica (Bogdan, 1977). Excelente vigor vegetativo, alta produtividade, com crescimento
entouceirado e talos prostrados que podem se enraizar quando em maior contato como o solo,
podendo atingir at 1,60m de altura. Suas folhas so lanceoladas com pouca pubescncia, com
inflorescncia em forma de pancula que mede de 40 a 50cm. A MG05 Vitria apresenta uma
ampla adaptao edafoclimtica e pode ser recomendada para regies onde o perodo de seca
pode chegar a 5 meses e em regies com precipitaes superiores a 3.000 mm anuais.
Uma de suas caractersticas a capacidade de adaptao a solos cidos e arenosos e com m
drenagem sendo a mais importante a sua boa produo de matria seca. Apresenta um teor em
torno de 13% de protena bruta e digestibilidade em torno de 62,3%.
Embora as diferentes espcies de Brachiaria sejam tolerantes ao manejo inadequado e
deficincia da disponibilidade de nutrientes, estes e outros fatores contribuem no aumento da
degradao de reas cultivadas com a respectiva gramnea. Por outro lado, uma pastagem bem
manejada favorece a maior cobertura vegetal, contribuindo assim com a conservao do solo e
gua (Bonfim-Silva et al., 2011).
O termo biofertilizante usado para definir todos os produtos que contenham micro-
organismos, os quais apresentem a capacidade de influenciar de forma positiva o
desenvolvimento das plantas (Reis, 2006).
A utilizao de inoculantes ou biofertilizantes, contendo bactrias diazotrficas tem
como objetivo proporcionar um nmero suficiente de clulas capazes de promover a rpida
colonizao da rizosfera, o que permitiria um aumento na produtividade, segundo Catroux
(1991).
Deaker et al. (2004) descreve a necessidade dos inoculantes apresentarem determinadas
caractersticas, como qual a estirpe utilizada e sua competitividade, o nmero de clulas
necessrias ou viveis para a rpida colonizao da rizosfera e do tecido vegetal (razes),
obtendo assim o maior potencial de utilizao destes organismos.
A produo de inoculantes utilizando-se de veculos no txicos, solveis em gua e
associadas a estirpes competitivas deve ser levada em considerao para novos estudos e para
o desenvolvimento de novos biofertilizantes, no se esquecendo da responsabilidade social,
ambiental e inovao tecnolgica (Fernandes Jnior, 2006).
Segundo Reis, (2006) para que se obtenha sucesso quanto ao uso da inoculao,
necessrio que se faa a seleo de estirpes eficientes e que estas sejam tolerantes ao estresse,
j que as bactrias diazotrficas so encontradas em diferentes tipos de solo e sua sobrevivncia
est condicionada a fatores como a salinidade, seca e o pH do solo.
Ferreira et al. (1987) observaram que estirpes do gnero Azospirillum atuam no
crescimento vegetal atravs do processo de reduo do nitrato, o que contribuiria com a planta
para que a mesma no dispensasse energia na reduo do nitrato amnia, o que permitiria um
ganho de energia, a qual seria gasta em outros processos vitais planta.
No entanto, embora os benefcios apresentados, observa-se que os estudos de FBN ainda
so incipientes para as gramneas do gnero Brachiaria spp, uma vez que ainda no se encontra
disponvel no mercado estirpe aprovada como inoculante para este gnero pelo Ministrio da
Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA, 2011).
26
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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30
VAN SOEST, P.J. Nutritional ecology of the ruminant. 2ed. New York: Cornell University
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CAPTULO 2
32
ARTIGO 1
(Artigo formatado de acordo com as normas da Revista Cincia Rural- ISSN 0103-8478 B1- a ser submetido)
foram isoladas de amostras de solos cultivados sob B. brizantha e partes do tecido vegetal desta
gramnea, coletadas nos municpios de Alfenas e Machado, nos perodos seco e chuvoso. Foram
amazonense), JMV (Burkholderia sp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) e
NFb (Azospirillum spp.). Foi obtido um total de 332 isolados, sendo a maioria endofticos. Os
isolados foram agrupados de acordo com as caractersticas morfolgicas, que foram utilizadas
fosfato e produo de AIA foram realizados in vitro para todos os isolados. O maior nmero e
perodo da seca. Trinta e cinco isolados solubilizaram fosfato de ferro e 78 produziram AIA,
funes simultaneamente.
crescimento vegetal.
________________________
1
Universidade Jos do Rosrio Velano UNIFENAS. 2*Faculdade de Agronomia UNIFENAS. E-mail:
ligianeflorentino@gmail.com (Autor para correspondncia). 3Faculdade de Agronomia UNIFENAS, Alfenas,
MG.
33
Abstract - The objective of this study was to analyze the diversity of nitrogen fixing bacteria
associated and endophytic B. brizantha in two seasons and study the capacity the solubility of
inorganic phosphates and produce acid-3-indole acetic (AIA). The bacteria were isolated from
soil samples grown under Brachiaria and parts of the plant tissue of this grass, collected in the
cities of Alfenas and Machado, the dry and wet periods. Five semisolid culture media and semi-
selective were used: FAM (Azospirillum amazonense), JMV (Burkholderia sp.), JNFb
(Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) and NFb (Azospirillum spp.). A total of 332
isolates were obtained, most endophytic. Isolates were grouped according to the morphological
characteristics that were used to estimate the diversity using the Shannon index. Phosphate
solubilization and AIA tests were performed in vitro production of all isolates. The greatest
number and diversity were from the city of Alfenas. During the rainy season was verified
greater number and diversity of isolates in both municipalities, when compared to the dry
season. Thirty-five isolates solubilized iron phosphate and 78 produced AIA, highlighting the
Key words: Biological nitrogen fixation, degradation pastures, promoting bacteria plant
growth.
INTRODUO
processo de degradao, fenmeno este que pode ser explicado, principalmente, pela baixa
fertilidade natural dos solos das regies tropicais e pela falta de reposio de nutrientes
(N2) (FBN), mediada pelas bactrias diazotrficas ou fixadoras de N2, apresenta-se como uma
34
produo e tambm possveis impactos ambientais provocados pelas reaes bioqumicas deste
elemento no solo.
No entanto, a FBN tem sido mais difundida no cultivo de leguminosas, formando uma
(MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). Mas, diversos estudos indicam o benefcio da inoculao
CAVALLET et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2007). Nesse caso, no ocorre a formao de
ndulos e essas bactrias podem se estabelecer na rizosfera dessas plantas, formando uma
ha-1 (BODDEY & VICTORIA, 1986; BRAZ et al., 2013). Alm do fornecimento do nitrognio,
estudos indicam que essas bactrias podem contribuir para a promoo do crescimento vegetal
incipientes para as gramneas do gnero Brachiaria spp. Nesse sentido, o objetivo deste estudo
MATERIAL E MTODOS
em reas de pastagens cultivadas com B. brizantha, sendo trs nos municpios de Alfenas (P01:
S 21 27,638' e W 045 55, 692'; P02: S 21 23,921' e W 045 56, 199'; P03: S 21 23,167' e
W 045 56, 474') e trs no municpio de Machado (P01: S 21 39.836' e W 045 59.707'; P02:
S 21 38.883' e W 046 01.681'; P03: S 21 37.707' e W 046 01.385'), localizados na regio Sul
do Estado de Minas Gerais, nos perodos seco e chuvoso, respectivamente, julho e dezembro
adotada por GUIMARES et al., (2012). Esses mesmos pontos foram utilizados para coleta de
razes de B. brizantha. O material coletado (solo e razes) foram conservados em caixas trmicas
a 4C. As amostras de solos foram submetidas a anlises das caractersticas qumicas conforme
Tabela 2. Caractersticas qumicas dos solos das reas de estudo dos municpios de Alfenas e
Machado.
pH (H2O) P K Ca+ Mg+ Al+ H + Al SB t T V m MO
Local
mg dm-3 cmolc dm-3 % dag Kg-1
Alfenas
P03 5,5 0,5 114 2,4 0,8 0,1 3,8 3,5 3,6 7,3 48 3 42
Machado
P01 5,3 1 128 1,8 0,8 0,5 7,2 2,9 3,4 10,1 29 15 35
P02 5,2 0,5 68 0,7 0,6 0,6 4,7 1,5 2,1 6,2 24 28 45
P03 5,6 0,5 120 1,6 0,7 0 2,5 2,6 2,6 5,1 51 0 33
O isolamento das bactrias diazotrficas foi realizado por meio da inoculao das
NFb (Azospirillum spp.), JNFb (Herbaspirillum spp.), LGI (A. amazonense) (DBEREINER
et al., 1995), JMV (Burkholderia spp.) (REIS et al., 2004) e FAM (Azospirillum amazonense)
diferentes meios de cultivo foi de acordo, respectivamente, com DINIZ et al. (2012) e SANTOS
novamente nos meios de origem para confirmao da capacidade de fixao de N2, evidenciada
(amarelo, creme), forma (regular, irregular), absoro de indicador (sim, no), produo de
exopolissacardeo (escassa, baixa, mdia, alta). Essas caractersticas foram utilizadas para
= [ ln ]
al. (2012). A cada trs dias, por um perodo de 12 dias, com o auxlio de um paqumetro digital,
solubilizao (IS) de acordo com BERRAQUERO et al. (1976), que classifica os isolados em
baixa (IS < 2 mm), mdia (2 IS < 4 mm) e alta (IS > 4mm) capacidade de solubilizao. Foi
2011).
RESULTADOS E DISCUSSO
Foi obtido um total de 332 isolados, dos quais, 203 oriundos do municpio de Alfenas,
sendo 135 de origem endoftica e 68, do solo. No municpio de Machado foram obtidos 129,
sendo 79 de origem endoftica e 50 oriundos do solo. Esses isolados bacterianos foram isolados
dos cinco diferentes meios de cultivo, de acordo com a seguinte distribuio: 15% foram
isolados a partir do meio FAM, 20% do meio JMV, 21% do meio LGI, 21% do meio NFb e
gramneas, como a Brachiaria sp., (DBEREINER, 1988; REIS JNIOR et al., 2004; BRASIL
et al., 2005). A tabela 3 apresenta o nmero e diversidade desses isolados de acordo com o
cultivado sob Brachiaria brizantha e de tecidos vegetais (endofticas) desta gramnea, nos
Solo Endoftica
Alfenas
Machado
municpio de Alfenas. Esse resultado pode estar relacionado s melhores condies qumicas
apresentadas pelos solos coletados no municpio de Alfenas (tabela 2). Segundo KENNEDY et
comparado ao perodo da seca. Resultados semelhantes foram encontrados por REIS JR et al.
decumbens cv. Basilisk e B. brizantha cv. Marandu em solos do Cerrado e da Mata Atlntica.
dados referentes ao nmero de isolados, ou seja, a maior diversidade foi obtida no municpio
de Alfenas, sendo que no perodo chuvoso foi observada maior diversidade de isolados de
por ROESCH et al. (2007). Alm disso, a melhoria das condies qumicas dos solos coletados
no municpio de Alfenas pode ter contribudo para o aumento da diversidade das bactrias
diazotrficas.
40
semelhantes em diferentes regies do Brasil (REIS JNIOR et al., 2004; BRASIL et al., 2005).
fsforo ligado ao alumnio (AlPO4.2H2O), o que pode ser devido toxidez deste elemento
Tabela 4. ndice de solubilizao (IS) de fosfato de ferro (FePO4.2H2O) em meio slido GELP
Estirpes IS (mm)
100-40 10,34 a
100-05 8,27 b
100-35; 100-14; 100-16; 100-70; 100-71; 100-78; 100-82; 100-32 4,35 0,48 f
variabilidade entre os isolados em solubilizar fosfato de ferro, sendo que cerca de 50% dos
41
isolados apresentaram IS > 4 mm, sendo considerados, segundo BERRAQUERO et al. (1976),
como alta solubilizao de P. SILVA FILHO & VIDOR (2000), relatam que a capacidade de
A maioria dos isolados que solubilizaram fosfato de ferro foi obtida no perodo da
seca, sendo somente os isolados 100-116, 100-265 e 100-280 capturados no perodo chuvoso.
Esses resultados apresentam grande relevncia para o fornecimento de fsforo para as plantas,
uma vez que no perodo da seca a disponibilidade de fsforo reduz devido sua baixa
mobilidade no solo (NOVAIS et al., 2007). Nesse sentido, verifica-se que apesar da reduo no
Quanto produo de AIA, dos 332 isolados analisados, 78 (100-03; 17; 19; 21; 26;
34; 38; 40; 47 e 48; 50; 52 a 55; 61 a 63; 72; 73; 78; 85; 88; 105; 125; 129; 130; 137; 138; 142
a 145; 147; 150 a 153; 159; 163; 167; 170 a 173; 178; 181; 184; 185; 198; 212; 223; 227; 228;
230; 238 a 240; 263; 274; 281; 282; 303; 307; 308; 310; 311; 313 a 315; 317; 318; 321 a 323;
325; 330; 331) produziram AIA quando cultivados no meio contendo triptofano.
demais isolados, 29, foram oriundos das amostras de solos, sendo que seis do perodo da seca
AIA, destacam-se os isolados 100-17, 21, 40 e 78, capazes de desempenhar ambas as funes.
vegetal produzidos por Azospirillum e outros gneros de bactrias diazotrficas, sendo este o
diferentes plantas, e verificaram que isolados associados raiz so mais eficientes na sntese de
pode produzir repostas rpidas como o aumento da elongao celular, como respostas lentas no
que diz respeito diviso e diferenciao celular (DOBBELAERE et al., 2003). So vrias as
vias de sntese da auxina, sendo que o Triptofano um precursor deste hormnio, pois a sua
adio nos meios de cultura (Salkowski) promove o aumento da sntese. O gnero Azospirillum
amplamente estudado em funo da sua interao com gramneas e por produzir auxina por
diferentes vias.
CONCLUSES
AGRADECIMENTOS
Cientfica.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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48
SARWAR, M.; KREMER, R.J. Enhanced suppression of plant growth through production of
ARTIGO 2
(Artigo formatado de acordo com as normas da Revista Cincia Rural- ISSN 0103-8478 B1- a ser submetido)
brizantha cv MG 05 Vitria
Resumo - Objetivou-se com esse trabalho avaliar o efeito da inoculao de diferentes isolados
MG05 Vitria. O experimento foi conduzido em vasos contendo 20 dm3 de solo durante 83
dias, com dois cortes, cujos tratamentos foram constitudos por: inoculao com 22 estirpes
sem inoculao sendo o primeiro apenas com N-plantio e o segundo com N-plantio e N-
cobertura. Foi utilizado o delineamento em blocos casualizados com quatro repeties. Foram
de perfilhos, peso seco da raiz e comprimento da raiz, matria seca, produtividade de matria
seca, fibra em detergente neutro e cido, e a protena bruta na matria seca. A inoculao de
UNIFENAS-100-16, 21, 78, cujo teor de protena bruta na matria seca foi superior a 7%.
_______________________
1
Universidade Jos do Rosrio Velano UNIFENAS. 2*Faculdade de Agronomia UNIFENAS. E-mail:
ligianeflorentino@gmail.com (Autor para correspondncia). 3Faculdade de Agronomia UNIFENAS, Alfenas,
MG.
50
Abstract - The objective of this study was to evaluate the effect of inoculation of different
Victoria. The experiment was conducted in pots containing soil 20 dm3 for 83 days, two courts,
whose treatments were: inoculation with 22 isolated bacterial strains B.brizantha and with
Azospirillum brasilense strain, and two controls: without inoculation with the first only with N-
planting and the second N-planting and N-coverage. The design was used in a randomized block
design with four replications. The following anatomic parameters were analyzed: height, width
and length of the sheet, number of tillers, dry root weight and root length, dry weight, dry matter
yield, neutral and acid detergent fiber, and crude protein in dry matter. Inoculation of
endophytic strains and rhizospheric influenced the development of the grass B. brizantha cv
MG05 Victoria, positively contributing to the production of dry matter, dry matter yield and
crude protein in dry matter, highlighting the UNIFENAS-100- isolated 16, 21, 78, which crude
INTRODUO
vias de degradao, devido, principalmente, ao excesso de pastejo, baixa fertilidade natural dos
2005), indicando a necessidade de medidas de manejo visando recuperar estas reas e garantir
51
ndulos radiculares e/ou caulinares (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). No entanto, diversos
gramneas forrageiras (DIDONET et al., 1996; CAVALLET et al., 2000; OLIVEIRA et al.,
2007a). Nesse caso no ocorre a formao de ndulos e essas bactrias podem se estabelecer
na rizosfera dessas plantas, formando uma associao, ou serem encontradas no interior dos
tecidos (endofticas).
ha-1 (BODDEY & VICTORIA, 1986; BRAZ et al., 2013). No entanto, embora se considerem
gramneas do gnero Brachiaria spp, uma vez que ainda no se encontra disponvel no mercado
estirpe aprovada como inoculante para este gnero pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e
MATERIAL E MTODOS
perodo de conduo foi de agosto a novembro de 2014, perodo em que a temperatura mdia
52
registrada foi de 17,3 a 27,6C, pluviosidade de 382 mm e altitude de 860 metros (latitude 21
experimento.
saturao por bases a 70% e a adubao de implantao foi constituda por 500 kg ha-1 de P2O5
Para o plantio, utilizaram-se mudas de B. brizantha que foram cultivadas por 21 dias
em bandejas de isopor contendo substrato orgnico. Aps, estas foram transferidas para vasos
contendo 20 dm3 de solo (latossolo vermelho escuro com textura argilosa), sendo cultivadas
seis plantas por vaso, Durante o perodo do experimento, o solo foi mantido irrigado de acordo
com sua capacidade de campo. Foram utilizados 2,28 g vaso-1 de uria (N plantio) cinco dias
pertencentes coleo da UNIFENAS (UNIFENAS-100-02, 06, 16, 17, 21, 28, 30, 31, 33, 34,
35, 40, 42, 43, 49, 51, 67, 69, 71, 78, 82 e 280) isoladas de B. brizantha e de comprovada
Alm disso, foram utilizados mais trs tratamentos: um inoculado com a estirpe Azospirillum
brasilense, aprovada como inoculante para as culturas do milho, trigo e arroz (MAPA, 2011) e
outros dois controles sem inoculao, o primeiro contendo somente N plantio (2,28g vaso-1
/controle negativo) e o segundo contendo N plantio (2,28 g vaso-1) e N cobertura (2,28g vaso-1
53
/controle positivo), sendo a cobertura realizada em dois momentos 20 e 58 dia. Foi utilizado
o delineamento em blocos ao acaso, com quatro repeties por tratamento, onde os dados
incubados por trs dias, sob agitao, a 28C, tempo suficiente para que as culturas atingissem
a fase log de crescimento, contendo, aproximadamente 108 clulas mL-1. Uma alquota de 5 mL
desta suspenso de clulas foi inoculada nas plantas sete dias aps serem transplantadas. Vinte
dias aps o transplantio, foi realizada a adubao de cobertura (2,28 g vaso-1) no tratamento
corte a 10 cm acima da superfcie do solo para uniformizao dos tratamentos. Nesse perodo,
da folha, nmero de perfilhos e comprimento e peso seco das razes. A porcentagem de matria
seca total (MS), fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente cido (FDA) e teor da
protena bruta na matria seca (%PBMS) foram realizadas segundo metodologia descrita por
RESULTADOS E DISCUSSO
Brachiaria foram observados, no primeiro e no segundo corte, em relao aos parmetros altura
peso da matria seca e comprimento da raiz, foram observados apenas no segundo corte,
Tabela 2. Altura (Al), Largura (LF) e comprimento da folha (CF), nmero de perfilhos (NP) e
matria seca (MS) de Brachiaria brizantha cv MG05 Vitria cultivada sob diferentes
tratamentos no primeiro corte e segundo corte. Massa seca radicular (MSR) e crescimento
1 Corte 2 Corte
1
Al LF1 CF1 Al1
LF1
CF 1
MSR1 CR1
Tratamentos NP1 NP1
(cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (g) (cm)
No
inoculados
N plantio +
41,75a 1,77a 32,30a 37,0a 43,80a 1,76a 54,27a 57,5a 16,42a 61,82a
N cobertura
N plantio 29,68a 1,20c 19,05i 15,3b 42,12a 1,41b 35,82g 25,5b 9,42b 35,57c
Inoculados
Azospirillum 39,45a 1,18c 15,78j 18,5b 29,82b 1,30b 26,50k 31,0b 11,27b 45,15b
100-02 44,23a 1,46b 23,93e 18,8b 42,37a 1,60a 40,20e 31,2b 10,12b 40,95b
100-06 34,78a 1,33c 21,75g 16,5b 43,65a 1,45b 36,55g 27,5b 13,80a 48,62a
100-16 43,25a 1,14c 11,05l 16,5b 42,15a 1,24b 18,55l 27,5b 8,25b 41,35b
100-17 44,38a 1,23c 26,38c 14,8b 42,12a 1,35b 44,32c 24,5b 14,57a 48,92a
100-21 41,98a 1,45b 25,00d 17,3b 38,22a 1,59a 42,02d 29,0b 13,35a 49,70a
100-28 45,08a 1,39b 15,15k 14,3b 44,05a 1,53a 25,45k 23,5b 9,87b 50,32a
100-30 43,65a 1,25c 21,55g 17,8b 41,82a 1,33b 36,25g 29,2b 10,8b 50,50a
100-31 43,40a 1,41b 21,95f 18,0b 44,52a 1,54a 36,85f 30,0b 11,10b 42,90b
100-33 45,78a 1,43b 16,88j 16,5b 43,95a 1,57a 28,37j 27,5b 8,97b 42,70b
100-34 40,93a 1,28c 19,23i 18,3b 45,05a 1,41b 32,32i 30,5b 8,72b 31,25c
100-35 40,55a 1,40b 20,98g 19,3b 43,90a 1,53a 35,27g 32,0b 11,12b 51,10a
100-40 45,13a 1,50b 20,33h 18,5b 41,30a 1,65a 34,12h 30,7b 13,30a 44,40b
100-42 43,88a 1,43b 30,00b 17,8b 42,67a 1,55a 50,42b 29,5b 11,07b 24,60c
100-43 44,43a 1,30c 19,23i 17,0b 44,50a 1,44b 32,27i 28,2b 9,92b 42,70b
55
100-49 43,10a 1,29c 22,93f 16,3b 42,27a 1,41b 38,55f 27,2b 8,75b 51,92a
100-51 44,50a 1,40b 18,93i 17,3b 43,67a 1,52a 31,80i 28,7b 9,05b 44,82b
100-67 45,95a 1,34c 18,58i 18,0b 43,17a 1,46b 31,20i 29,7b 12,25a 43,35b
100-69 43,00a 1,23c 21,30g 16,8b 43,22a 1,34b 35,80g 27,7b 6,80b 34,45c
100-71 42,80a 1,38b 19,03i 19,3b 43,60a 1,52a 31,97i 32,0b 11,02b 33,97c
100-78 43,50a 1,34c 21,95f 20,3b 43,35a 1,47b 36,85f 33,7b 14,20a 45,65b
100-82 44,28a 1,32c 22,40f 17,8b 42,22a 1,46b 37,65f 29,5b 11,85a 52,65a
100-280 41,78a 1,22c 22,10f 21,3b 40,67a 1,34b 37,12f 35,5b 8,55b 41,62b
CV(%) 17,72 9,85 2,78 17,58 6,97 9,62 2,83 17,98 29,81 15,27
1
Mdias seguidas da mesma letra, na coluna, no diferem entre s pelo teste de Scott-Knott,
que no houve efeito significativo em ambos os cortes, pois todas as plantas inoculadas
inferior aos demais tratamentos. GUIMARES et al. (2011) relata que, em se tratando de
pastagens constitudas por Brachiaria, o parmetro altura, em especfico altura elevada, facilita
al.(2010) destaca que o parmetro altura deve estar relacionado idade da planta e qualidade
Houve efeito significativo dos diferentes tratamentos sobre a largura das folhas em
02, 21, 28, 31, 33, 35, 40, 42, 51 e 71 foram semelhantes entre si e superiores ao controle
o que colaboraria com a eficincia fotossinttica, o que de acordo com TAIZ & ZEIGER
aumento em sua largura permitiria a proteo de mecanismo que atua na fotossntese em relao
ao excesso de radiao.
alcanada pelos demais tratamentos e pelo controle negativo onde pode ser observada a
contribuio dos isolados em relao a este parmetro foi significativa, sendo observado um
negativo.
UNIFENAS-100-06, 17, 21, 40, 67, 78, 82 e o controle positivo foram idnticos entre si e
28, 30, 31, 33, 34, 35, 42, 43, 49, 51, 69, 71 e 280, estes semelhantes entre si e o controle
negativo.
as estirpes bacterianas UNIFENAS 100-06, 17, 21, 28, 30, 31, 35, 49 e 82 foram semelhantes
57
ao controle positivo, e superior aos resultados obtidos pela A. brasilense indicando o potencial
destes isolados em contribuir para o crescimento radicular, o que pode ser atribudo produo
do solo.
100-34, 42, 69, 71 e controle negativo que foram semelhantes entre si e inferiores aos demais
tratamentos. OLIVEIRA et al. (2007a) constataram em seus estudos com B. brizantha cv.
Marandu, que esta gramnea, em especfico, apresentava uma maior produo de forragem
obtidos para fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente cido (FDA) e protena
Tabela 3. Porcentagem de matria seca total (MS), produtividade de matria seca g/vaso (PMS)
segundo corte. Fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente cido(FDA) e protena bruta na
1 Corte 2 Corte
MS1 PMS1 MS1 PMS1 FDN1 FDA1 PBMS1
Tratamentos
(%) (g) (%) (g) (%) (%) (%)
No
inoculados
N plantio +
18,92 b 8,15 a 15,06 b 25,62 a 65,37 b 45,10 a 14,01a
N cobertura
N plantio 20,00 b 5,22 b 15,69 b 8,34 b 61,87 b 48,85 a 4,50 e
Inoculados
Azospirillum 25,94 a 0,91 c 17,61 a 5,15 c 64,05 b 42,53 a 7,23 c
100-02 21,38 b 6,05 b 16,52 b 8,65 b 66,02 b 44,64 a 5,68 d
100-06 20,69 b 5,32 b 16,13 b 6,82 c 68,28 a 44,81 a 4,95 e
100-16 22,38 b 1,90 c 15,89 b 4,95 c 63,82 b 44,99 a 9,24 b
100-17 26,20 a 2,86 c 16,55 b 6,19 c 65,64 b 52,04 a 7,12 c
100-21 23,49 b 4,10 b 16,72 b 10,74 b 65,29 b 50,23 a 7,42 c
100-28 24,17 a 3,83 b 17,77 a 4,10 c 70,13 a 42,51 a 4,66 e
100-30 22,17 b 5,41 b 18,05 a 8,26 b 69,85 a 49,23 a 5,69 d
100-31 23,17 b 5,30 b 17,06 b 6,40 c 65,65 b 43,55 a 6,36 d
100-33 21,72 b 3,60 b 15,97 b 6,00 c 66,73 b 45,95 a 7,17 c
100-34 21,52 b 4,80 b 17,47 a 7,00 c 66,73 b 48,03 a 5,99 d
100-35 20,36 b 4,78 b 16,61 b 8,20 b 67,95 a 44,57 a 6,03 d
100-40 20,33 b 4,89 b 16,82 b 8,47 b 63,68 b 51,78 a 6,44 d
100-42 23,09 b 4,67 b 17,42 a 6,41 c 65,14 b 43,23 a 5,07 e
100-43 25,95 a 4,53 b 17,99 a 6,04 c 71,75 a 47,60 a 5,95 d
100-49 22,44 b 5,07 b 16,66 b 7,01 c 66,21 b 48,81 a 7,05 c
100-51 23,06 b 4,90 b 16,70 b 6,90 c 67,99 a 54,49 a 5,78 d
100-67 25,95 b 5,91 b 18,77 a 7,34 c 72,06 a 45,69 a 5,10 e
100-69 20,78 b 5,11 b 19,29 a 7,56 b 69,21 a 47,81 a 5,64 d
100-71 20,94 b 4,52 b 16,58 b 7,09 c 69,11 a 43,38 a 5,32 e
100-78 22,62 b 4,44 b 17,52 a 6,63 c 63,92 b 44,87 a 7,48 c
100-82 22,30 b 4,54 b 17,12 b 6,13 c 69,16 a 46,93 a 5,11 e
59
houve efeito significativo, pois as mdias observadas foram superiores ao controle positivo e
100-17, 28, 30, 34, 42, 43, 67, 69, 78 e 280. SILVA et al. (2004) destaca que pastagens
formadas com Brachiaria apresentam uma relao entre altura da gramnea e produo de MS,
ou seja, quanto maior for a altura da planta maior ser a produo de MS. Segundo BORGES
et al. (2002), o intervalo existente entre os cortes influencia diretamente na porcentagem de MS,
onde, quanto maior for o intervalo entre os respectivos cortes, maior ser a produo de MS.
contendo os isolados UNIFENAS-100-02, 21, 30, 35, 40, 69 foram semelhantes ao controle
positivo e superiores aos tratamentos Azospirillum e UNIFENAS-100-06, 16, 17, 28, 31, 33,
34, 42, 43, 49, 51, 67, 71, 78, 82 e 280, estes semelhantes entre si e inferiores ao controle
negativo.
16, 17, 21, 33, 49 e 78, no que se refere protena bruta na matria seca, apresentaram mdias
percentual alcanado foi superior 7%; tais resultados so expressivos, e de acordo com VAN
SOEST (1994), plantas forrageiras com teores de protena bruta abaixo deste percentual podem
60
de matria seca. Dessa forma, valores acima de 7%, alcanados pelos tratamentos estariam
dentro dos valores necessrios para se atender s exigncias proteicas do animal, destacando-
de solubilizar fosfato de ferro e produzir AIA, fatos estes que podem ter contribudo
positivamente com o teor de PBMS, entretanto, este pode variar em relao ao vegetal, sua
respectiva idade, a parte do vegetal que ser avaliada e at mesmo a adubao utilizada
(BUTOLO, 2002).
Os tratamentos UNIFENAS-100-06, 28, 30, 35, 43, 51, 67, 69, 71 e 82, no que diz
concluir que no houve efeito significativo e que todos os tratamentos apresentaram mdias
que valores mdios de FDN acima de 72% e FDA em torno de 40 % esto de acordo com os
encontrados por outros autores (OLIVEIRA et al., 2007b); em B. brizantha constatou-se FDN
78,6% e FDA de 49,6% (GOMES, 2003). Quanto maior for o valor do FDA encontrado na
forrageira, menor ser a digestibilidade do alimento, pois a fibra indigestvel contm uma
CONCLUSES
produo de MS, PMS e PBMS nas duas idades de corte destacando-se os isolados
AGRADECIMENTOS
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