Tarea 1: Tcnicas de aislamiento y medios de cultivo para hongos

Aislamiento

La obtencin de cultivo puro requiere la mayor asepsia posible para evitar contaminaciones que
puedan afectar el proceso del diagnstico. Se hace entonces necesaria la esterilizacin de agujas,
tijeras, asas y dems accesorios por medio de la llama de un mechero; y tambin mantener limpia
la mesa de trabajo.

El proceso de aislamiento y cultivo comienza realizando cortes de trozos de tejido, de ms o menos

2 milmetros de ancho por 3.5 milmetros de largo. Los trozos se sacan de aquellas partes en donde
las lesiones no estn muy avanzadas.

Sacarlo de los bordes de las lesiones, para incluir parte sana y parte infectada, y tratar de evitar la
presencia de agentes contaminadores.

Medios de cultivo

Papa Dextrosa Agar (PDA).

Se prepara a base de papas naturales o deshidratadas: se lavan de 200 a 300 gramos de papas,
rebanarlas y hervirlas hasta que estn suaves, y exprimir a travs de dos a tres capas de manta
delgada (gasa). Recibir el filtrado en un matraz, aadir 20 g de dextrosa y 20 de agar, aforar a un
litro. Esterilizar el medio 20 minutos a 15 libras de presin. Cuando el medio est casi frio (
40 C) verterlo en cajas Petri.

En este medio de cultivo hongos como, Neurospora, Mucor y Rhizopus, que frecuentemente son
contaminantes en los laboratorios, crecen rpidamente y enmascaran el desarrollo de otros hongos
ms lentos; otros medios, como el malta-sal-agar, con menos favorables para estos hongos
contaminantes de crecimiento rpido. Para eliminar bacterias se aade al medio, antes de vaciar a
las cajas Petri, 3ml de HCL al 1% por litro de medio.

Medio de cultivo CZAPEK.

Existen dos presentaciones de este medio, el caldo nutritivo Czapek-Dox y su equivalente con agar,
el Czapek-Agar. Si se usa el caldo se disuelven 35g del polvo en un litro de agua destilada y se aade
20g de agar. Otra forma es preparar el medio con las siguientes substancias: 3 g de NaNO3, 1.0 g de
K2HPO4, 0.5 g de MgSO4.7 H2O, 0.5 g de KCl, 0.01g de FeSO4.7 H2O, 30g de sacarosa, 15 g de agar y
1,000 ml de agua. Para producir la caramelizacin de la sacarosa agregarla justo antes de la
esterilizacin. Esterilice a 15 libras y 120 C por veinte minutos. Estos son algunos de los medios en
los que Raper y Fennell (1965) basaron las identificaciones de las especies de Apergillus; las
cantitades de sacarosa varan de acuerdo a las especies que se quieran identificar.

Malta Agar (MA).

Para un litro de agua se requieren 20g de extracto de malta y 20 g de agar. La cantidad de agar, en
cualquier medio de cultivo, puede variar de 15 a 20 g por litro dependiendo de la dureza que se
prefiera; en medios muy duros las semillas se resbalan al manejar las cajas de Petri, impidiendo o
dificultando la cuantificacin de las semillas invadidas por los diferentes hongos; as como la
identificacin de los mismos.

Malta Sal Agar (MSA).

Para la preparacin de un litro de este medio se requieren de 20g de extracto de malta, 15 20 g

de agar, y dependiendo de las especies de hongos que se desea aislar se le agrega de 40 a 150 g de
cloruro de sodio. El medio de cultivo Malta- sal- agar al 4 6 % de sal, permite aislar prcticamente
la mayora de hongos que invaden a los graos y semillas, tanto hongos de campo como de hongos
de almacn. La alta presin osmtica de los medios con alto contenido de sal (10 15 % de NaCl)
inhibe el desarrollo de ciertos hongos ( Rhizopus y Mucor) y limita el de otros, facilitando el
desarrollo de los hongos de los grupos A. glaucus y A. restrictus. Las especies del grupo A. glaucus
son las ms comunes en granos almacenados. Adems el cloruro de sodio inhibe la germinacin de
los granos, facilitando las tareas de cuantificacin de granos invadidos y la identificacin de los
hongos.

En cuanto a la calidad de la sal (NaCl) se recomienda usar de grado tcnico. Uno de los problemas
que frecuentemente se tienen para la cuantificacin e identificacin de los hongos en las cajas de
Petri, es que las colonias de stos se juntan y sobreponen; por ello aadir 0.2 ml de Tergitol NPX
para limitar el crecimiento de las colonias en el medio de cultivo, quedando stas pegadas al grano,
sin cambiar las caractersticas morfolgicas esenciales para su identificacin.

Jugo de Tomate, Sal, Agar (TSA).

Para un litro de agua se requieren 25g de jugo de tomate en polvo y 15 20g de agar; 40 60g de
cloruro de sodio (grado tcnico). El usos de este medio o del malta de sal agar da resultados similares
con variaciones en la velocidad del crecimiento de las especies. Para sus propsitos, pruebe ambos
con una misma muestra de grano o de alimento balanceado, y defina cual de ellos usar en el futuro.

Bibliografa:

- Moreno Martnez Ernesto, Manual para la Identificacin de Hongos en Granos y sus

Derivados, UNAM, Mxico, 1988, pp. 77-79.
- F. Schwartz Howard, Vesga Beln, Tcnicas para el aislamiento e Identificacin y
Conservacin de Hongos Patgenos del Frijol, Ciat, Colombia, 1981, pp. 17.