Anda di halaman 1dari 4

ELISA Salmonella Enteritidis

Dua sistem utama yang tersedia untuk deteksi IgG (IgY) spesifik untuk S.
Enteritidis: ELISA indirect (Barrow 1994) dan ELISA kompetitif tipe sandwich
(Zijderverd et al. 1992).
ELISA indirect melibatkan penggunaan antigen pendeteksi yang dilapisi
pada sumur plate mikrotiter. Reagen blocking mengurangi ikatan nonspesifik,
sampel uji dimasukkan ke sumur. Antibodi terikat secara khusus pada sampel
dideteksi oleh antibodi / enzim konjugat. Berbagai antigen, termasuk LPS,
flagella, SEF14 fimbriae, protein membran luar dan preparat antigen seluruh sel
kasar telah digunakan.
ELISA kompetitif tipe sandwich menggunakan reagen spesifik -
antibodi monoklonal (MAb) atau antibodi poliklonal untuk antigen pelapis ke
sumur. Kemudian dimasukkan antigen murni atau campuran. Sampel uji
dimasukkan diikuti oleh antibodi terkonjugasi, yang tidak akan mengikat antigen
jika sampel mengandung antibodi spesifik. Waktu uji dapat dipersingkat dengan
menambahkan kedua sampel uji dan konjugasi bersama. MABS telah disiapkan
untuk LPS, flagella dan SEF14 untuk S. Enteritidis.
Ada kelebihan dan kekurangan kedua sistem ini. Uji indirect lebih
sederhana dan reagen tersedia untuk semua serotipe salmonella ayam, kalkun, itik
dan mamalia. ELISA kompetitif dapat diterapkan pada semua spesies hewan dan
pada umumnya menunjukkan spesifisitas yang lebih tinggi. Namun, reagen tidak
tersedia secara komersial untuk semua serotipe. Ada juga beberapa masalah
afinitas dan mungkin kurang sensitif daripada tes indirect. Di lapangan, kedua
sistem telah menghasilkan reaksi positif palsu dan dalam beberapa kasus skrining
dengan ELISA LPS tidak langsung dapat diikuti dengan konfirmasi dengan
ELISA kompetitif.
Kedua jenis tes tersebut dapat digunakan dengan serum, kuning telur atau
darah kering yang dilarutkan dari cakram kertas saring. ELISA campuran
digunakan di Denmark dan negara-negara lain untuk mendeteksi infeksi
Salmonella pada babi (36). ELISA ini mengandung antigen "O 'LPS 1, 4, 5, 6, 7
dan 12, dari S. Typhimurium dan S. Choleraesuis, yang memungkinkannya
mendeteksi secara serologis 95% serogroup Salmonella yang ditemukan pada babi
di sebagian besar negara Eropa. Antigen Grup D juga telah ditambahkan ke
beberapa alat ELISA. Serum digunakan untuk penggandaan ternak, sedangkan
untuk babi di tempat pemotongan hewan, pengujian dilakukan pada cairan
jaringan ('jus-daging') yang terbebaskan saat sampel otot beku 10 g dicairkan.
Dengan beberapa diferensiasi ELISA dapat dilakukan antara infeksi yang
dihasilkan oleh serotipe Salmonella dari serogrup yang berbeda. Beberapa reaksi
silang terjadi antara kelompok B dan D dan serovar invasif lainnya. Namun,
biasanya ada respons antibodi yang lebih besar ketika LPS dari serotipe homolog
digunakan di ELISA. Metode optimal untuk memilih nilai absorbansi 'cut-off', di
atas sera yang ditetapkan berasal dari kawanan yang terinfeksi S.-Enteritidis,
tanpa menghasilkan tingkat tes positif palsu yang tidak dapat diterima, belum
diputuskan dan disepakati Internasional.
ELISA mudah disesuaikan dengan otomasi dan karenanya untuk program
pengujian berskala besar. Masalah utama adalah bahwa peralatan mahal
diperlukan dan banyak pereaksi juga mahal. Beberapa kit ELISA komersial untuk
S. Enteritidis, S. Typhimurium dan Group B / C mix-ELISA tersedia. Idealnya ini
harus divalidasi oleh uji coba cincin internasional sebelum diadopsi untuk tujuan
surveilans.
Contoh ELISA yang divalidasi adalah yang dikembangkan di
Laboratorium Referensi OIE di VLA Weybridge (lihat Tabel di Bagian 3 dari
Manual Terrestrial ini untuk alamat). Persyaratan diberikan di bawah ini.

Peralatan
Falcon microtest III pelat PVC; Pipet dan tabung pengukur yang tepat; Mesin
pencuci mikrotest ultrawash; Pembaca piring ELISA; Filter uji 405-410 nm dan
filter referensi 630 nm.
Antigen
i) Subtitusi S. Enteritidis LPS tersedia secara komersial (Sigma Cat No.
L6011). Ini dilarutkan dalam 1 ml air deionisasi dan disimpan pada suhu -
20 C dalam 100 l aliquot dalam larutan garam buffer fosfat (PBS), pH
7,2, pada konsentrasi 2,5 mg / ml. Untuk penggunaan, antigen harus
dicairkan dalam penyangga lapisan pada konsentrasi yang tepat.
ii) Ii) Antigen LPS juga dapat disiapkan dengan teknik Westphal & Luderitz
(Wray 2000) dan standar untuk konsentrasi karbohidrat dengan metode
Gerhardt (Gerhardt 1981), dan disesuaikan dengan 1000 g / ml.
Serum dan pengencer konjugat
\Tambahkan albumin serum bovine (BSA) (2 g) dan Tween 20 (0,05 ml)
ke PBS (100 ml). (Sebagai alternatif, susu bubuk [1 g] dapat menggantikan BSA.)
Simpan pada suhu 4 C dan buat larutan segar setiap minggu.
Pelapis penyangga: tambahkan natrium karbonat (1,59 g) dan natrium
bikarbonat (2,93 g) ke air deionisasi (1 liter) dan atur pada pH 9.6. (Sebagai
alternatif, larutkan satu tablet buffer 0,05 M Sigma carbonate / bicarbonate [Cat
No. C-3041] dalam air deionisasi [100 ml].) Simpan pada suhu 4 C dan perbarui
setiap 2 minggu.
Penyangga substrat: buat larutan dietanolamina 10% (v / v) dalam air deionisasi.
Dietilolamina harus diawetkan ke 37 C sebelum dikeluarkan, dan pH larutan
harus disesuaikan dengan pH 9.8 dengan asam hidroklorida 1 M. Simpan pada
suhu 4 C dan perbarui setiap 2 minggu.
Konjugat enzim: imunoglobulin anti-ayam kambing dikonjugasikan ke
alkali fosfatase (misalnya ICN Immunobiologicals, suplai alternatif Sigma:
A9171) atau spesies lain yang anti-globulin ayam. Simpan pada suhu 4 C yang
dilarutkan dalam pengencer pada konsentrasi yang sesuai dan perbarui setiap
minggu.
Enzim substrat: larutkan satu tablet p-nitrophenyl phosphate disodium (5
mg) ke dalam buffer substrat (5 ml) tidak lebih awal dari 30 menit sebelum
dikeluarkan, dan simpan dalam gelap.
Standar
i) Antiserum kontrol positif disiapkan dengan inokulasi dari empat telur
(SPF) berumur 1 minggudengan inokulum yang mengandung 106 S.
Enteritidis. Serum kemudian diperoleh 3-4 minggu kemudian bila titer
antibodi maksimal.
ii) Kontrol serum A negatif dari empat unggas SPF 1 minggu.
iii) Kontrol negatif serum B dari 58 peternak umur 1 minggu yang diketahui
terbebas dari infeksi Salmonella. Simpan dalam 100 l, pada -20 C.
PCR

PCR yang bekerja dengan cara memperbanyak potongan DNA spesifik


dari suatu organisme serta kemampuannya untuk bekerja pada sampel yang
kompleks dengan cepat dan memberikan hasil dengan tingkat akurasi tinggi
menyebabkan PCR memiliki potensi besar untuk diaplikasikan sebagai metode
deteksi bakteri patogen penyebab foodborne disease seperti Salmonella sp. (Amar
et al. 2010). Namun penggunaan PCR untuk mendeteksi Salmonella sp. tersebut
harus memperhatikan beberapa hal, utamanya tentang DNA sampel dan primer
yang akan digunakan. DNA sampel yang digunakan dalam deteksi Salmonella sp.
didapatkan dari hasil ekstraksi DNA bakteri Salmonella sp. dalam sampel yang
umumnya berupa makanan atau minuman. Proses ekstraksi DNA tersebut harus
dilakukan dengan tepat sehingga DNA bakteri dapat terekstrak dengan baik,
disamping itu dibutuhkan pula tahap preparasi DNA sampel berupa purifikasi dan
penyesuaian konsentrasi DNA sampel sebelum memasuki proses PCR. Purifikasi
DNA sampel berfungsi untuk memisahkan DNA sampel dari komponen sel
bakteri lainnya, sedangkan penyesuaian konsentrasi DNA sampel berfungsi untuk
menjadikan konsentrasi DNA sampel cukup untuk digunakan dalam PCR
(umumnya sebesar 500 ng) (Agrawal 2008). Selain DNA sampel, jenis primer
yang digunakan dalam mendeteksi Salmonella sp. dengan PCR juga harus
disesuaikan. Hal ini dikarenakan jenis primer sangat beragam, dimana setiap jenis
primer memiliki kesesuaian dengan suatu jenis bakteri tertentu yang memiliki
spesifitas tertentu. Jenis primer yang banyak digunakan untuk mendeteksi
Salmonella sp. secara umum menggunakan PCR adalah primer S139-S141 yang
komplemen dengan sekuen pada gen invA (Marlony et al. 2003).
Hasil PCR yang didapat tidak dapat diketahui secara langsung
menggunakan mata telanjang, sehingga diperlukan adanya analisis terhadap
produk PCR tersebut menggunakan suatu metode, yakni metode elektroforesis
(Sanderson et al. 2003). Elektroforesis merupakan metode standar untuk analisis,
identifikasi, dan purifikasi fragmen DNA dalam berbagai laboratorium biologi
molekuler. Elektroforesis pada dasarnya bekerja berdasarkan migrasi atau
perpindahan partikel-partikel bermuatan dalam lingkungan yang memiliki medan
listrik dan kemudian terpisahkan oleh gel elektroforesis tempatnya berpindah
(Agrawal 2008). Seluruh molekul atau fragmen DNA bermuatan negatif, sehingga
fragmen DNA akan bergerak menuju kutub positif (anoda) dengan perpindahan
yang sama dalam medan listrik. Fragmen DNA kemudian terpisahkan berdasarkan
kemampuan pergerakannya dalam matriks gel. Molekul DNA berukuran besar
akan mengalami kesulitan untuk melewati poripori gel agarosa, sedangkan
molekul DNA berukuran kecil akan lebih mudah melewati poripori gel tersebut.
Oleh sebab itu maka mobilitas molekul DNA dalam gel agarosa pada
konsentrasi gel yang sama akan berbeda bergantung pada ukuran molekul atau
fragmen DNA sampel (Agrawal 2008). Metode elektroforesis yang banyak
digunakan untuk menganalisis molekul DNA adalah elektroforesis horisontal
menggunakan gel agarosa (Agrawal 2008). Konsentrasi gel agarosa yang
digunakan untuk elektroforesis harus disesuaikan dengan panjang amplicon yang
diharapkan. Pengaturan kapilaritas gel elektroforesis akan meningkatkan resolusi
analisis hasil PCR secara signifikan, dan hal ini menyebabkan terjadinya
pemisahan molekul DNA berdasar ukuran molekul secara sempurna (Lo et al.
2006). Hasil elektroforesis DNA dapat dianalisis setelah melalui pewarnaan
menggunakan pewarna DNA, pewarna DNA yang paling banyak digunakan
adalah ethidium bromida (Lo et al. 2006). Fragmen DNA yang telah diwarnai
tersebut ketika diamati dibawah sinar ultraviolet akan terlihat sebagai pita-pita
dalam gel elektroforesis berwarna oranye-merah yang berpendar (Agrawal 2008).

Daftar Pustaka

Agrawal S. 2008. Techniques in Molecular Biology. International Book


Distributing Co. Lucknow.
Amar CFL. 2010. Molecular Diagnosis of Gastrointestinal Pathogens. Dalam
Kessler HH (ed.). Molecular Diagnostics of Infectious Diseases. Walter de
Gruyter GmbH & Co. KG., Berlin. PCR untuk Deteksi Salmonella sp -
Prayoga, dkk Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2): p.483-488.
Barrow PA. 1994. Serological diagnosis of Salmonella serotype Enteritidis
infections in poultry by ELISA and other tests. Int. J. Food Microbiol.
21(1): 5568.
Brown TA. 1992. Genetics : Molecular Approach, Second Edition. Chapman &
Hall, London.
Gerhardt P. 1981. Manual of Methods for General Microbiology. American
Society for Microbiology. Washington DC (USA). 332334.
Johnson WM and Tyler SD. 1993. Genes for enterotoxin, exfoliative toxin and
toxic shock syndrome toxin-1 in S. aureus. Di dalam : Persing DH, Smith
TF, Tenover FC, White TJ, editor. Diagnostic Molecular Microbiology :
Principles & Application. Washington DC.
Lo YMD and KCA. Chan. 2006. Introduction to the Polymerase Chain
Reaction. Dalam Lo YMD, RWK Chiu, and KCA Chan (ed.). Clinical
Applications of PCR, Second Edition. New Jersey (USA) Humana Press.
Malorny B, J Hoorfar, C Bunge and R Helmuth. 2003. Multicenter Validation of
the Analytical Accuracy of Salmonella PCR: towards an International
Standard. Applied and Environmental Microbiology. 69(1): 290-296.
Sanderson K and D Nichols. 2003 Genetic Techniques : PCR, NASBA,
Hybridisation and Microarrays. Dalam McMeekin, T.A. (ed.). Detecting
Pathogens in Food. Cambridge (UK): Woodhead Publishing Limited,
Cambridge and CRC Press LLC. Boca Raton.
Van Zijderveld FG, Van Zijderveld-Van Bemmel AM & Anakotta J. (1992).
Comparison of four different enzyme-linked immunosorbent assays for
serological diagnosis of Salmonella enteritidis infections in experimentally
infected chickens. J. Clin. Microbiol. 30(1): 25602566.
Wray C & Wray A, EDS 2000. Salmonella in Domestic Animals. Wallingford,
Oxon (UK): CAB International,.