Journal of Clinical Virology

Journal homepage : www.elsevier.com/locate/jvc

Strategi Alternatif Western blot sebagai uji diagnostik konfirmasi untuk

Infeksi HIV

Xia Fenga,b, Jibao Wangc, Zhiyun Gaod, Yu Tiana, Ling Zhanga, Huichao Chene,Tong Zhangb, Lin Xiaof, Jun Yaoa,
Wenge Xinga, Maofeng Qiua, Yan Jianga,
aNational HIV/HCV Reference Laboratory, National Center for AIDS/STD Control and Prevention, China CDC, Beijing, China
bDepartment of Clinical Laboratory, Beijing Youan Hospital, Capital Medical University, Beijing, China
cCenter for Disease Control and Prevention in Dehong, Dehong, China
dDepartment of Pathogenic Biology, Hebei Medical University, Shijiazhuang, China
eCenter for Disease Control and Prevention in Yunnan Province, Kunming, China
fCenter for Disease Control and Prevention in Liangshan, Liangshan, China a

ABSTRAK
Latar Belakang: Di Cina, western blot (WB) merupakan prosedur yang direkomendasikan untuk
diagnosis infeksi HIV. Namun, teknik ini memakan waktu dan tenaga, serta kompleksitasnya
membatasi penggunaannya secara luas.
Objektif: Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi efikasi dari tes berpasangan
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ( ELISA) bercak darah kering (Dry Blood Spot/DBS)
dengan urin, bukan WB, untuk deteksi antibodi HIV.
Desain Penelitian: Plasma, DBS, dan sampel urin dikumpulkan dari 1.213 subyek dari berbagai
populasi. Dua strategi tes diagnostik dilakukan secara paralel. Kesetaraan uji ELISA
berpasangan dan WB dinilai.
Hasil: Diagnosis HIV ditemukan pada 250 subjek sesuai dengan uji ELISA berpasangan, dan
249 berdasarkan strategi WB. Kasus tersebut dinilai HIV positif selama masa follow-up. Secara
keseluruhan, 18 subyek didiagnosis dengan kemungkinan HIV menggunakan uji ELISA
berpasangan, di antaranya, 11 subjek negatif dengan WB, dan satu dikonfirmasi HIV-positif
selama masa follow-up. Untuk 945 subyek, kedua strategi menunjukkan hasil negatif. Tes kappa
menunjukkan kesesuaian yang baik (kappa = 0,954) antara dua strategi.
Kesimpulan: Uji ELISA berpasangan dengan DBS-urine bisa diterapkan sebagai alternatif untuk
WB dalam mendiagnosis HIV, yang akan berguna di daerah dengan keterbatasan sumber daya
karena keterjangkauan dan kemudahan penggunaannya.

Latar Belakang
Program dari Perserikatan Bangsa-Bangsa tentang HIV / AIDS (UNAIDS) yaitu 90-90-90
Program telah menjadi target global umum untuk menanggulagi (AIDS). 90 yang pertama adalah
yang paling penting; pada tahun 2020, 90% dari semua orang yang hidup dengan HIV akan
mengetahui status HIV mereka [1]. Sejauh deteksi HIV yang bersangkutan memenuhi kebutuhan
deteksi saat periode jendela adalah 14 hari dengan generasi keempat ELISA dan 10 hari dengan
Acid test nukleat (NAT) [2]. Namun, pada tahun 2014, diperkirakan bahwa hanya 45% dari
semua orang dengan HIV menyadari sero-status mereka [3]. tingkat yang rendah ini mungkin
terkait dengan kapasitas yang berbeda dari laboratorium, yang dihasilkan dari ekonomi regional
yang bervariasi, dan di antara kunci populasi, kemungkinan terkait dengan rasa takut
mengungkapkan informasi individu dan adanya diskriminasi. Oleh karena itu, strategi diagnostik
virus (HIV) telah ditingkatkan dan memenuhi kebutuhan yang belum terpenuhi
Di China, tes yang direkomendasikan untuk diagnosis konfirmasi infeksi HIV adalah
western blot (WB), yang secara luas digunakan dalam jaringan Tes HIV. Selama beberapa
dekade, metode ini telah memainkan peranan penting dalam pencegahan dan pengendalian HIV.
Namun, degan pengembangan metode diagnostik baru, popularitas WB menghadapi beberapa
tantangan seperti tingkat ketidakpastian yang tinggi, sensitivitas rendah, dan periode pengujian
yang panjang, yang dapat mengakibatkan hasil negatif palsu bagi pasien dalam periode jendela
[4-8] , juga dapat menghambat follow-up pasien [8,9]. Selain itu, di samping perbedaan suku,
ekonomi, dan populasi, terdapat distribusi yang tidak merata tidak hanya prevalensi infeksi HIV
tapi juga kompetensi laboratorium dalam uji HIV. Maka dari itu, strategi tunggal saja tidak
cukup untuk diagnosis HIV. Strategi diagnosis baru dengan sensitifitas yang meningkat,
kenyamanan, dan ketetapan regional diperlukan untuk pencegahan dan pengendalian HIV /
AIDS.

Objektif
Pada penelitian ini, bercak darah kering (DBS) dan uji urin ELISA dikombinasikan sebagai
alternative untuk WB. Kepraktisan Uji ELISA berpasang telah dievaluasi dengan perbandingan
langsung dua strategi tersebut.

Desain Penelitian
3.1 Pertimbangan etis
Desain penelitian ini telah disetujui oleh lembaga dewan review, dan persyaratan untuk
persetujuan telah didapatkan.

3.2 Subjek
Dari 21 Maret 2014 sampai dengan 31 Januari 2015, total 1.213 subyek yang terdaftar. Populasi
ini termasuk 261 subyek yang dipilih secara acak dari populasi yang menerima pemeriksaan
kesehatan dari (CDC), Liangshan Yi Prefektur Otonomi, Provinsi Sichuan; 101 subyek dengan
diagnosis infeksi HIV dikonfirmasi oleh WB, dengan rute transmisi yang tidak diketahui,
sampel oleh Xichang penyakit menular seksual (STD) dan pencegahan penyakit kulit; 251
sampel pengguna narkoba oleh Dehong Prefektur CDC, Provinsi Yunnan; dan 600 laki-laki yang
telah berhubungan seks dengan laki-laki (LSL) sampel oleh Yunnan CDC dan layanan rawat
jalan, Pusat infektif Penyakit, Rumah Sakit Beijing Youan, University Medical Capital.

3.3 Pengolahan sampel

Sampel darah dan urin dikumpulkan dari setiap subyek dan diberi nomor. sampel darah vena (3-
5 ml) disentrifugasi (3000 rpm / min), dan serum disimpan pada 4 C. sampel urin (20-50 mL)
dikumpulkan dalam tabung khusus yang berisi polimer untuk melindungi antibodi terhadap
degradasi selama transportasi, dan disimpan pada 4 C.

3.4 Reagen
Kit ELISA Urin HIV-1 antibodi disediakan oleh Beijing Junhe Farmasi Co, Ltd (Beijing, China).
kit ELISA HIV darah antibodi disediakan oleh Beijing Wantai Biologi Farmasi (Beijing, China).
WB kit untuk antibodi HIV disediakan oleh MP Biomedicals Asia Pacific Pte., Ltd (Singapura).
NAT dilakukan untuk deteksi asam nukleat menggunakan COBAS Ampli Prep / COBAS Taq
Man HIV-1 Test (versi 2.0) (Swiss). Intern kontrol kualitas untuk urine ELISA dirumuskan
dengan mencampur plasma antibodi HIV positif dan HIV urine negatif dengan sinyal untuk
cutoff (S / CO) rasio 3-5. kontrol kualitas internal untuk darah ELISA disediakan oleh Beijing
Kinghawk Pharmaceutical Co, Ltd (Beijing, China).

3.5 Prosedur pengujian

Setelah sampling, semua tes dilakukan dalam waktu tujuh hari oleh teknisi yang sama dari
National Reference Laboratory, Pusat Nasional untuk / STD Control dan Pencegahan AIDS,
China CDC. Sampel dari Dehong Prefektur diuji di situs, tapi semua sampel lainnya diangkut ke
Referensi Nasional

Laboratorium untuk pengujian. Sampel darah berturut-turut diputar, diuji ulang, dan
dikonfirmasi sesuai dengan Pedoman Nasional untuk Diagnosis HIV (revisi 2009). Sero-positif
dan WB-negatif Sampel diuji untuk asam nukleat HIV. Untuk sampel sero-negatif, 50-sampel
NAT dikumpulkan[10].

Gambar 1. DBS Paralel dan sampel urin pada uji ELISA berpasangan

3.6. Uji ELISA berpasangan DBS-urine

Sampel Urine dan DBS yang diuji sebagai strategi alternatif, juga disaring oleh ELISA.
Diagnosis HIV positif mengindikasikan hasil positif baik dari DBS dan urine sampel secara
paralel dengan tes ELISA. Diagnosis HIV negatif menunjukkan hasil ganda negatif. Dalam kasus
di mana baik DBS atau urin ELISA menunjukkan hasil positif, "mungkin" HIV didiagnosis dan
selanjutnya diperlukan tindak lanjut (Gbr. 1).
 Gambar 2. Proses sampling dan hasil kualitatif

3.7. Analisis statistik

Kesesuaian antara darah ELISA, urine ELISA, WB, dan NAT Hasil dihitung, dan kesesuaian
antara ELISA dipasangkan dan tes WB dievaluasi menggunakan nilai Kappa. Analisis data yang
dilakukan dengan menggunakan SPSS 19.0 (SPSS Inc, Chicago, IL) dan p <0,05 dianggap
signifikan secara statistic

4. Hasil
Untuk semua 1213 subjek, hasil ELISA pasangan konsisten dengan orang-orang dari analisis
darah WB. Gambar 2 menyajikan perbandingan tes WB dan tes ELISA berpasangan. Secara
total, 250 subyek dikonfirmasi HIV positif oleh uji EISA berpasangan DBS-urin.. Dari jumlah
tersebut, 249 subyek juga positif pada WB. Salah satu subjek memiliki HIV menunjukkan band
di gp160 dan viral load plasma dari 3,5 106 salinan / mL. Setelah satu bulan follow-up, hasil
untuk kasus ini adalah positif dengan band-band diamati pada p24, gp120, dan gp160. tes ini
Hasil dikombinasikan dengan manifestasi klinis dan epidemiologis. Sejarah menunjukkan
diagnosis dini infeksi HIV. Secara keseluruhan, hasil positif dari uji ELISA berpasangan
merupakan indicator yang baik dalam infeksi HIV.
Untuk 945 subyek yang tersisa kedua strategi menunjukkan hasil negative yang
dikonfirmasi oleh NAT. Terdapat 18 (1,48%) kasus "possible" HIV diidentifikasi oleh DBS-
urine dipasangkan ELISA. Dari sembilan kasus di mana DBS positif dan urine negatif, enam
disaring positif dengan WB. Yang lain tiga kasus negatif oleh WB. Sesuai tes viral load
menunjukkan bahwa, dari tiga kasus, dua negatif dan salah satu memiliki viral load dari 25106
kopi / mL. Setelah 49 hari follow-up, tes diulang dan tes WB menunjukkan hasil yang positif
dengan band-band hadir di p24, gp41, gp120, dan gp160 untuk subjek ini. Menunjukkan bahwa,
jika sampel diambil dalam periode jendela, hasil negative palsu lebih mungkin dengan WB dari
strategi pengujian alternatif.
Sebaliknya, untuk sembilan kasus di mana urin positif dan DBS adalah negatif, hasil WB
semua negatif. rasio S/CO untuk urin ELISA semua rendah (1,052-2,032). Hasil ini
menunjukkan potensi hasil positif palsu dengan tes deteksi antibodi urine. Namun, Organisasi
Kesehatan Dunia (WHO) melaporkan bahwa tes antibodi HIV urine positif dapat menunjukkan
Infeksi HIV sebelum antibodi HIV darah dapat dideteksi [11]. desain cross-sectional dan
kurangnya tindak lanjut dalam penelitian kami menunjukkan bahwa kita tidak bisa menilai
apakah tes urine positif adalah awal indikasi infeksi pada kasus ini. Oleh karena itu, penelitian
lebih lanjut diperlukan untuk menyelidiki nilai tes antibodi urine sedini mungkin sebagai
indikator infeksi HIV.

Tabel 1
Perbandingan hasil WB dan uji ELISA berpasangan

Sensitivitas dan spesifisitas strategi ELISA pasangan adalah 97,6% (249/255) dan 98,7%
(945/957) saat mengambil WB sebagai standar baku. Total kesesuaian antara dua strategi
pengujian diagnostik adalah 98,43% (1194/1213), dengan konsistensi baik (Kappa = 0,954>
0,85, P = 0,000) (Tabel 1). perbandingan langsung dari ELISA dipasangkan dengan WB
menunjukkan bahwa terdapat konsistensi sangat baik antara dua strategi tersebut.
5. Diskusi
Pedoman UNAIDS untuk menggunakan teknologi pengujian HIV negara surveilans
dengan ELISA dan tes diagnostik cepat (RDT) adalah metode yang paling tepat dan hemat biaya
[15], dan penggunaan ELISA dan RDT untuk deteksi HIV telah diadopsi secara luas secara
internasional, termasuk di Amerika Serikat dan di sebagian besar negara Eropa [16-20]. Saat ini,
hanya beberapa negara, seperti Cina dan Perancis, menggunakan WB untuk mendeteksi HIV.
Selanjutnya, WB menghadapi beberapa tantangan seperti tingkat ketidakpastian yang tinggi,
sensitivitas rendah, dan periode pengujian panjang yang mengarah pada hilangnya pasien. Di sisi
lain, penggunaan WB di China untuk konfirmasi diagnosis HIV bertentangan dengan
rekomendasi di WHO 2015 yang dikonsolidasikan ke pedoman layanan tes HIV [15]. Oleh
karena itu, Cina perlu mengevaluasi kembali strategi pengujian mereka. Sebuah teknik skrining
parallel menggunakan dua tes ELISA darah dari produsen yang berbeda telah digunakan dalam
program skrining donor darah di Cina selama lebih dari 30 tahun, yang telah membuktikan
bahwa aplikasi praktis dari parallel Metode ELISA adalah layak [21].

Tabel 2
Perbandingan Uji ELISA berpasangan dan Uji WB

Sejak pertama kali disetujui oleh Administrasi Makanan dan Obat AS pada tahun 1996,
DBS telah terbukti menjadi cara yang efisien untuk mengumpulkan sampel dan memiliki akurasi
setara dengan darah. DBS sekarang digunakan di banyak negara surveilans HIV [22-25]. Di
Cina, Xihui Zang [26] menunjukkan kesetaraan antara DBS dan metode pengambilan sampel
darah. Kesimpulan yang sama dapat ditarik dari penelitian kami. Uji kelompok riset kami juga
menunjukkan bahwa hasil yang sangat baik bisa diperoleh dengan menggunakan sampel urine
untuk mendeteksi antibodi HIV [27]. Sensitivitas dan spesifisitas urin tes antibodi HIV
dilaporkan menjadi 69,7% -97% dan 99% -100%, masing-masing [28,29], yang sejalan dengan
hasil kami. Ketika dipasangkan ELISA dengan strategi pengujian WB yang dibandingkan (Tabel
2), untuk WB, proses eksperimental memakan waktu, persyaratan teknis yang tinggi, dan
interpretasi hasil sulit. Oleh karena itu, untuk daerah-daerah terpencil dan terbelakang, sampel
harus dikumpulkan dan diserahkan ke laboratorium spesialis HIV, yang tidak hanya
meningkatkan beban pada laboratorium HIV tetapi juga meningkatkan waktu turnaround untuk
hasil tes yang dapat mengakibatkan kerugian.
Ini adalah studi pertama untuk mengevaluasi metode alternatif untuk deteksi antibodi
HIV menggunakan dua sampel biologis dan parallel ELISA. Teknik ini tidak hanya dapat
mengidentifikasi kasus infeksi HIV, tetapi juga bisa mendapatkan hasil konfirmasi dalam waktu
yang lebih singkat menggunakan ELISA. Selain itu, sangat cocok untuk pengambilan sampel
massa. Dan lagi, Strategi paralel ini menunjukan kemungkinan infeksi yang memerlukan follow-
up dan / atau tes diagnostik lebih lanjut, yang dapat mengurangi salah diagnosis dari kasus yang
diuji dalam periode jendela.

6. Kesimpulan
Kesimpulannya, Uji ELISA berpasangan DBS-urine dapat diterapkan sebagai strategi
alternatif untuk diagnosis HIV di daerah terpencil dan daerah dengan sumber daya terbatas. Ini
juga mungkin berguna untuk pengujian di populasi berisiko tinggi yang tidak ingin diuji karena
kekhawatiran diskriminasi. Dari uraian di atas, strategi alternatif ini dapat meningkatkan
aksesibilitas tes HIV.
Jumlah sampel dalam penelitian ini terbatas, yang mungkin menghasilkan hasil yang
bias. Oleh karena itu, penelitian berikutnya perlu dirancang untuk mengevaluasi kelayakan
strategi uji ELISA berpasangan di berbagai daerah dan pada populasi dengan tingkat insiden
AIDS yang berbeda.