Repository SITH-ITB (2015), Vol.
4
1
Analisis Protein Menggunakan Metode Bradford dan SDS-
PAGE
Sellma Muazarah 10613072 (Kelompok 14) Faniar Sukmasari
School of Life Sciences and Technology, Institut Teknologi Bandung (ITB)
Jalan Ganesha No. 10 Bandung 40132 Indonesia
e-mail: sellmamuazarah@students.itb.ac.id
Abstrak Protein merupakan polimer
dari asam amino. Beberapa metode
yang umum digunakan dalam analisis
protein adalah Bradford dan SDS-PAGE.
Prinsip dari metode Bradford adalah
mengukur konsentrasi protein
menggunakan absorbansi dan
spektrofotometri sedangkan metode
SDS-PAGE untuk mengukur berat protein
menggunakan elektroforesis. Tujuan dari
praktikum kali ini adalah untuk
menentukan konsentrasi protein Bovine
Serum Albumin (BSA) dengan metode
kuantitatif (Bradford) dan semi
kuantitatif (SDS-PAGE.) Kesimpulan dari
praktikum ini yatu konsentrasi protein
BSA berdasarkan metode Bradford adalah
sebagai berikut: sampel A 0.024 mg/mL, sampel B
0,2787 mg/mL, sampel C 0.3977 mg/mL, sampel D
0.3977 mg/mL, sampel E 0.5871 mg/mL, sampel F
0.6210 mg/mL, sampel G 0.8342 mg/mL dan
sampel H 0.7773 mg/mL sedangkan dengan
metode SDS-PAGE didapatkan berat protein BSA
sebesar 66.4 kDA.
Keywords. Protein, Metode Bradford, SDS-
PAGE, Larutan BSA, Kurva Standar.
Pendahuluan
Protein merupakan senyawa makromolekul
yang terbentuk hasil polimerisasi
kondensasi berbagai asam amino. Setiap
molekul protein mengandung sekitar 20
jenis asam amino yang berikatan. Dalam
suatu tubuh organisme, terdapat sangat
banyak sekali jenis protein yang memiliki
fungsi masing-masing. Mayoritas protein
merupakan enzim atau subunit enzim.
Protein terlibat juga dalam sistem imun
sebagai antibodi dan sistem kendali dalam
bentuk hormon . Jika suatu protein belum
diketahui fungsinya dapat dilakukan uji
analisis protein dilakukan guna mengetahui
fungsi dari suatu protein[1].
Beberapa metode yang umum dalam
analisis protein adalah metode Bradford dan
SDS-PAGE. Bradford assay yang merupakan
metode determinasi protein yang
melibatkan ikatan antara pewarna
Coomassie Brilliant Blue G-250 dengan
protein. Larutan pewarna tersebut dapat
membentuk 3 konformasi yaitu kation
(merah), netral (hijau), dan anion (biru).
Dalam kondisi asam, pewarna cenderung
terprotonasi sehingga membentuk
konformasi kation berwarna merah yang
terukur pada panjang gelombang 470 nm.
Ketika berikatan dengan protein,
konformasinya akan stabil unprotonated
dan berwarna biru yang terukur pada
panjang gelombang 595 nm. Analisis
protein menggunakan metode ini
sensitivitasnya sangat tinggi terhadap
pengotor di dalam sampe. Rentang
konsentrasi yang dapat diukur 0-2000
g/mL[2].
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati :::
Repository SITH-ITB (2015), Vol. 4
2
Metode SDS-PAGE akan memisahkan
protein berdasarkan ukurannya
menggunakan gel akrilamid. Struktur
sekunder dan tersier protein cenderung
menghasilkan struktur globular akibat
adanya ikatan disulfide, serta interaksi
hidrofobik dan hidrofilik dengan air di
lingkungan sekitarnya. Gugus sulfat dari
SDS bermuatan negatif sehingga sampel
protein yang berinteraksi dengan SDS akan
menjadi bermuatan negatif. Agen-agen
seperti beta-mercaptoethanol maupun
dithiothreitol (DTT) juga berperan dalam
memutuskan ikatan disulfide pada protein
tersier dan kuartener. Proses pemanasan
protein juga akan membantu proses
denaturasi protein, linearisasi dan
penyeragaman muatan mereduksi analisis
karakteristik protein berdasarkan berat
molekulnya[3]. Pada penelitian ini, protein
yang dianalisis adalah protein BSA (Bovine
Serum Albumin). Protein tersebut berasal
dari janin hewan famili Bovidae, yaitu
hewan ternak seperti sapi [4].
Materials and Methods
Uji semi kuantitatif protein dengan SDS
PAGE
Sebanyak 25 L sampel protein
ditambahkan dengan 25 L 2x SDS-PAGE
sampel buffer, lalu diresuspensi hingga
homogen. Selanjutnya larutan campuran
dipanaskan dengan suhu 98C selama 10
menit dan diresuspensi kembali. Load
sampel sebanyak 20 L pada gel akrilamid.
Kemudian dielektrolisis dengan arus 100
volt selama 2 jam atau hingga bromofenol
biru mencapai bagian bawah gel lalu arus
listrik dimatikan dan gel poliakrimalida
dilepaskan dari pelat kaca. Gel
poliakrimalida direndam dalam larutan
coomassie blue lalu disimpan ke dalam
shaker dan diinkubasi selama 1 jam. Gel
direndam dan dikocok dalam larutan
destaining (45% (v/v) methanol dan 10%
asam asetat glacial) selama 24 jam. Larutan
destaining diganti berkali-kali hingga warna
latar belakang memudar dan pita-pita
protein terlihat jelas. Setelah gel terwarnai
dengan baik, gel disimpan di dalam deion.
Berat protein sampel dapat dihitung dengan
cara mencocokannya dengan protein
ladder.
Uji kuantitatif protein dengan Bradford
Larutan BSA sampel diaquilot 100 L ke
dalam microtube. Kemudian ditambah 900
L larutan CBBS, dihomogenisasi, dan
didiamkan selama 2 menit. 1 ml larutan
sampel dan CBBS yang telah homogeny
dimasukan kedalam cuvvete. Larutan
campuran diukur absrobansinya pada
panjang gelombang 595 nm. Kurva baku dibuat
dengan cara memeriksa nilai absorbansi
sampel protein yang telah diketahui
konsentrasinya. Nilai absorbansi tersebut
kemudian diregresikan dan dibuat
persamaannya. Konsentrasi protein sampel
yang belum diketahui dapat diketahui
dengan cara memasukkan nilai absorbansi
sampel ke dalam persamaan.
Results and Discussion
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati :::
Repository SITH-ITB (2015), Vol. 4
3
Pada praktikum kali ini, digunakan 2 metode
untuk menganalisis protein sampel yaitu
metode Bradford dan metode SDS-PAGE.
Prinsip kerja dari metode Bradford adalah
pengikatan langsung larutan pewarna
coomassie brilliant blue G-250 oleh protein
yang mengandung residu asam amino
dengan rantai samping aromatik seperti
Tyrosine, Tryptophan, dan Phenylanalin atau
protein yang bersifat basa seperti Arginine,
Histidine, dan Leusin. Larutan pewarna
tersebut dapat membentuk 3 konformasi
yaitu kation (merah), netral (hijau), dan
anion (biru). Dalam kondisi asam, pewarna
cenderung terprotonasi sehingga
membentuk konformasi kation berwarna
merah yang terukur pada panjang
gelombang 470 nm. Ketika berikatan
dengan protein, konformasinya akan stabil
unprotonated dan berwarna biru yang
terukur pada panjang gelombang 595 nm.
Analisis protein menggunakan metode ini
sensitivitasnya sangat tinggi terhadap
pengotor di dalam sampe. Rentang
konsentrasi yang dapat diukur 0-2000
g/mL[2].
Prinsip kerja dari metode SDS-PAGE yaitu
memisahkan rantai polipeptida berdasarkan
berat molekulnya dan kemampuan untuk
bergerak dalam arus listrik. SDS merupakan
deterjen anionik yang dapat memberikan
muatan listrik negatif pada protein dalam
sampel. SDS bersifat sebagai deterjen yang
mengakibatkan ikatan dalam protein
terputus membentuk protein yang dapat
terelusi dalam gel begitu juga
mercaptoetanol. Pada SDS-PAGE, gel
poliakrilamid yang digunakan adalah
stacking gel dan separating gel. Stacking
gel berfungsi untuk menahan sampel,
sedangkan separating gel berfungsi untuk
memisahkan sampel berdasarkan
ukurannya. Stacking gel dan separating gel
memiliki komposisi yang sama, yang
membedakan hanya konsentrasi gel
poliakrilamid pembentuknya, dimana
konsentrasi stacking gel sebanyak 6% pada
pH 6,8 sedangkan separating gel 8% pada
pH 8,8. Komponen penting yang
membentuk gel poliakrilamida adalah:
1. Akrilamida, sebagai senyawa utama yang
menyusun gel dan merupakan senyawa
karsinogenik.
2. Bis akrilamida, berfungsi sebagai cross
linking agent yang membentuk kisikisi
bersama polimer akrilamida. Kisikisi
tersebut berfungsi sebagai saringan
molekul protein. Perbandingan antara
akrilamida dengan bis akrilamida adalah
29:1.
3. Amonium persulfat (APS), berfungsi
sebagai inisiator yang mengaktifkan
akrilamida agar bereaksi dengan molekul
akrilamida yang lainnya membentuk rantai
polimer yang panjang.
4. Deion sebagai pelarut
5. SDS berfungsi untuk menyeragamkan
muatan atau melinierasikan protein.
5. Tris sebagai buffer.
6.TEMED (tetrametilendiamin), berfungsi
sebagai katalisator reaksi polimerisasi
akrilamid menjadi gel poliakrilamid
sehingga dapat digunakan dalam
pemisahan protein[5]. Ada empat tahap
utama dalam analissis protein metode SDS-
PAGE yaitu pembuatan gel akrilamida,
penyiapan sampel, elektroforesis dan
destaining. Pembuatan gel dilakukan
dengan cara mencampur akrilamida dengan
bis-akrilamida agar membentuk gel yang
terbuat dari poliakrilamida. Reaksi ini
dikatalisis oleh TEMED dan APS. Penyiapan
sampel dilakukan dengan cara mencampur
sampel dengan buffer tris kemudian
diresuspensi dan dipanaskan. Elektroforesis
diawali dengan memuat sampel dan ladder
ke dalam sumur pada stacking gel.
Elektroforesis dilaksanakan menggunakan
tegangan 100V selama 2 jam atau sampai
warna biru mencapai dasar gel. Setelah itu
gel dilepas dari pelat kaca. Destaining
dilakukan dengan cara merendam gel pada
larutan methanol dan asam asetat sampai
warna latar belakang hilang dan pita protein
terlihat dengan jelas. Gel diletakkan dalam
deion agar awet[6].
Berikut adalah gambar gel akrilamida hasil
SDS-PAGE. Ladder yang ada tidak tampak
jelas, sehingga ditambah ladder ColorPlus.
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati :::
Repository SITH-ITB (2015), Vol. 4
4

Grafik 1. Kurva Baku untuk Protein BSA

1.8
1.6
f(x) = 1.18x + 0.46
1.4 R = 0.87
1.2

Absorbansi
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Konsentrasi

Dari perhitungan persamaan tersebut,

didapatkan konsentrasi sampel pada Tabel
1.

Gambar 1. Gel Hasil Elektroforesis SDS-
PAGE
Pada Gambar 1 dapat dilihat pita protein
tebal yang berada di bagian tengah gel. Jika
dibandingkan dengan ladder, pita tersebut
memiliki berat protein 66.4 kDa. Protein
BSA memiliki berat 66.4 kDa sehingga
dapat disimpulkan bahwa pita tersebut milik
protein BSA[7]. Selain protein BSA, terdapat
pita lain yang berada di bagian atas gel. Hal
tersebut menandakan kontaminasi sampel
BSA oleh protein lain. Jika sampel BSA
tersebut murni maka tidak akan terdapat
pita lain pada gel. Sampel BSA yang
digunakan merupakan protein buatan
sehingga kontaminasi dapat dipengaruhi
oleh grade sampel tersebut. Sampel yang
digunakan memiliki grade rendah sehingga
masih terdapat protein lain dalam sampel
tersebut.
Berikut ini adalah kurva baku hasil regresi
nilai absorbansi dengan nilai konsentrasi
sampel yang telah diketahui. Dari regresi
tersebut didapat persamaan, yaitu y =
1.1774x + 0.4598. Dengan memasukkan
nilai absorbansi sampel sebagai nilai y
dapat ditemukan nilai konsentrasi sampel.
Konsentrasi
Sampel Absorbansi (mg/mL)
a 0.488 0.0240
b 0.788 0.2787
c 0.928 0.3977
d 0.871 0.3492
e 1.151 0.5871
f 1.191 0.6210
g 1.442 0.8342
h 1.375 0.7773
Tabel 1. Konsentrasi Sampel Protein BSA
Dari Tabel 1 dapat dilihat hasil perhitungan
persamaan yang didapat dari regresi nilai
absorbansi dengan konsentrasi. Makin
tinggi nilai absorbansi makin tinggi pula
konsentrasi yang didapat.
Metode Bradford digunakan untuk
mengukur konsentrasi protein sedangkan
metode SDS-PAGE digunakan untuk
mengukur berat protein. Konsentrasi yang
terukut pada metode Bradford merupakan
konsentrasi seluruh jenis protein yang
terdapat dalam sampel (jika sampel protein
tidak murni) sedangkan metode SDS-PAGE
mengukur berat protein per jenis. Tiap pita
merupakan protein dengan berat molekul
tertentu. Walaupun memiliki keluaran yang
berbeda, kedua metode memiliki hubungan.
Pada tabel 1, dapat dilihat bahwa nilai
absorbansi berbanding lurus dengan

Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati :::

Repository SITH-ITB (2015), Vol. 4
5

konsentrasi. Sehingga disimpulkan bahwa Quantities of Protein in Utilizing

makin tebal pita protein makin tinggi The Principle of Protein-Dye
konsentrasi protein. Kesimpulan ini hanya Binding Analysis Biochemist.
berlaku untuk protein yang berasal dari Halaman 248-258. England :
sumber yang sama. Cambridge. 1976.
[3] Compton, S.J., dan Jones, C.G.
Mechanism of Dye Response
and Interferance in The Bradford
Protein Assay Analysis
Conclusion Biochemist. Halaman 369-374.
England : Oxford. 1985.
Konsentrasi protein BSA berdasarkan [4] Hermes, B.D. Gel Electrophoresis of
metode Bradford adalah sebagai berikut: Protein. New York : Oxford
sampel A 0.024 mg/mL, sampel B 0,2787 University Press. N. 1998.
mg/mL, sampel C 0.3977 mg/mL, sampel D [5] Wilson, K., Walker, J. Principles and
0.3977 mg/mL, sampel E 0.5871 mg/mL, Techniques of Practical
sampel F 0.6210 mg/mL, sampel G 0.8342 Biochemistry Fifth Edition.
mg/mL dan sampel H 0.7773 mg/mL United Kingdom : Cambridge
sedangkan dengan metode SDS-PAGE University Prss. 2000.
didapatkan berat protein BSA sebesar 66.4 [6] EnCor Biotechnology. 2015. SDS-
kDA. Polyacrilamide Gel
Electrophoresis.
Daftar Pustaka http://www.encorbio.com/protocol
s/SDS-PAGE.html diakses pada 24
[1] Tim Olipiade Biologi Indonesia Oktober 2015.
(TOBI). Buku Panduan [7] Wong, Shan S., Jameson, David M.
Praktikum. Bandung : TOBI. 2012. Chemistry of Protein and
2011. Nucleic Acid Cross-Linking and
[2] Bradford, M.M. A Rapid and Conjugation. Boca Raton: CRC
Sensitive Method for The Press.
Quantition of Microorganism,

Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati :::