Quim. Nova, Vol. 30, No.

8, 1809-1812, 2007

ISOLAMENTO E AVALIAO DA ATIVIDADE CITOTXICA DE ALGUNS ALCALIDES OXAPORFNICOS

OBTIDOS DE ANNONACEAE

Artigo
Denise Brentan da Silva, Maria de Ftima Cepa Matos, Simone T. Nakashita, Carina K. Misu, Ndia Cristiane Yoshida,
Carlos Alexandre Carollo, Joo Roberto Fabri, Hrcules da Silva Miglio e Joo Mximo de Siqueira*
Departamento de Farmcia, Centro de Ciencias Biolgicas e da Sade, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, CP 549,
79070-900 Campo Grande - MS, Brasil

Recebido em 23/6/06; aceito em 18/5/07; publicado na web em 25/10/07

ISOLATION AND CYTOTOXICITY EVALUATION OF SOME OXOAPORPHINE ALKALOIDS FROM ANNONACEAE. A

different methodology was used to isolate and purify oxoaporphine alkaloids, as they are difficult to separate by the usual workup when
in mixture. Alkaloid extracts from Annonaceae species were obtained by base/acid extraction. The extracts were concentrated and
submitted to partition in solutions of acids of different pKa values, followed by separation by preparative TLC using 1 mm thick silica
gel impregnated with oxalic acid (11.2% w/w). Liriodenine, lisycamine, lanuginosine, and O-methylmoschatoline were obtained and
tested against tumoral cells (line Hep2, ATCC-CCL 23, larynx carcinoma). Only O-methylmoschatoline (IC50 12.4 M) was more active
than cisplatin (18.0 M).

Keywords: oxoaporphine; chromatography; cytotoxicity.

INTRODUO

A classe dos alcalides aporfnicos, ou aporfinides, derivados do

esqueleto isoquinolnico, bastante destacada em diferentes espcies
de Annonaceae1, sendo tambm encontrada em outras famlias2. Esta
classe est divida em diferentes subclasses, cujos representantes apre-
sentam perfil estrutural caracterstico (Figura 1) e, sem dvida, pro-
priedades qumicas e biolgicas prprias dos subgrupos a que perten-
cem3. Esses alcalides caracterizam-se por apresentar esqueleto
aporfnico (Figura 1a), e um de seus subgrupos, o oxaporfnico (Figu-
ra 1b), possui esqueleto totalmente aromtico e com presena de gru-
po carbonlico em C-71. Em funo do padro de substituio encon-
trado no anel, diferentes alcalides oxaporfnicos j foram descritos.
Com relao s atividades biolgicas e farmacolgicas dos
alcalides oxaporfnicos, so conhecidas as seguintes: citotxica1,2,4,
anti-agregante plaquetria 5, antibacteriana, antifngica e a
antiplasmdica6, ainda que esta ltima seja pouco significativa, quan- Figura 1. Estrutura bsica dos esqueletos de alcalides aporfnicos (a) e
do comparada da cloroquina. Dentre essas atividades, a mais repre- oxaporfnicos (b)
sentativa nessa subclasse a citotxica, que tem sido demonstrada
frente a diferentes linhagens de clulas tumorais1,2. Este o caso, por Procedimentos para o isolamento e purificao dos alcalides
exemplo, da liriodenina, comumente isolada e, conseqentemente, um oxaporfnicos tm sido descritos e podem envolver vrias etapas e/
dos alcalides aporfnicos mais citados e testados2. A liriodenina foi ou requerer equipamentos menos acessveis, tais como aparelhos de
usada como modelo comparativo com outros dois alcalides cromatografia lquida de mdia eficincia9 e de cromatografia lqui-
aporfinides bulbocapnina e dicentrina para explorar a relao da de alta eficincia (CLAE)10, com o decorrente alto custo para a
entre estrutura e atividade inibidora sobre topoisomerase II. Vrias realizao. Geralmente, quando h dois ou mais representantes des-
caractersticas estruturais e propriedades fsico-qumicas so necess- sa classe de alcalide presentes em uma mesma frao, mesmo que
rias para avaliao da atividade farmacolgica7 ou biolgica, e a con- haja diferenas em seus padres de substituio, enfrenta-se maior
dio de que uma molcula seja totalmente planar no um fator grau de dificuldade no isolamento e purificao11, pois geralmente
determinante. Foi sugerido, porm, que a planaridade desses alcalides observa-se o mesmo comportamento cromatogrfico em mtodos
um fator limitante para a atividade acima mencionada ou seja, a usuais de cromatografia (cromatografia em coluna com slica ou
liriodenina, por ser totalmente planar, seguida da dicentrina, que ado- alumina, cromatografia em camada analtica ou preparativa).
ta uma conformao relativamente planar, foram potentes inibidoras Com o intuito de aprofundar o estudo do comportamento dos
catalticas de topoisomerase II, enquanto a bulbocapnina, que no alcalides oxaporfnicos perante diferentes meios, complement-lo
apresenta tal conformao, mostrou-se inativa8. com o estudo da atividade citotxica e tambm contribuir com o
conhecimento da relao estruturaatividade, desenvolveu-se uma
*e-mail: jmaximo@nin.ufms.br nova metodologia de baixo custo que se revelou eficiente no isola-
1810
mento e purificao desses compostos. Devido utilizao de pla-
cas cromatogrficas preparativas de slica-gel e impregnadas com
cido oxlico, foi possvel separar misturas de dois ou mais alcalides
oxaporfnicos que seriam de difcil separao em placas usuais de
slica-gel: liriodenina (1) e lisicamina (4), de Unonopsis lindimani;
lanuginosina (2), oxobuxifolina (3) e O-metilmoscatolina (5), de
Duguetia glabriuscula; e 1 e 2 tambm de Duguetia furfuracea.
Ainda com emprego de cromatografia em coluna de slica-gel e uti-
lizando eluentes aditivados com HCl, realizou-se a separao de
aterospermidina (6) e 1.
A utilizao de diferentes meios (suporte slido e aditivado com
cido; solvente de eluio aditivado com cido) proporcionou a se-
parao desses representantes da classe de oxaporfnicos de acordo
com seu comportamento em meio cido. Foram utilizadas ferramentas
de qumica terica (Gaussian 03 e GaussView), visando a interpreta-
o dos resultados experimentais obtidos no presente trabalho. Como
esses alcalides apresentam semelhanas estruturais, foram melhor
exploradas outras propriedades como densidade de carga, potencial
eletrosttico e interao entre o par inico, que auxiliaram no me-
lhor entendimento dessa metodologia de separao.
Figura 2. Comportamento dos alcalides oxaporfnicos liriodenina (1),
lanuginosina (2), oxobuxifolina (3), lisicamina (4) e O-metilmoscatolina (5)
em suportes de: (A) slica-gel, camada de 1,0 mm de espessura, revelador
HCl 5% em EtOH, eluente CHCl3:MeOH a 2%; (B) slica-gel (1,0 mm de
espessura) impregnada com cido oxlico a 12,1% (m/m), eluente
CHCl3:MeOH a 22%, sem revelao
RESULTADOS E DISCUSSO
A utilizao de suportes modificados e eluentes aditivados est
bem documentada na literatura12. Bons exemplos so o uso de pla-
cas de slica impregnadas com AgNO3 para separao de compostos
com ligao dupla e a adio de dietilamina em eluentes para me-
lhor resoluo de extratos alcalodicos em suportes com caracters-
ticas cidas. Recentemente, a utilizao de agentes surfactantes foi
proposta como uma metodologia mais rpida e de baixo custo para
obteno de extratos ricos em alcalides13. Essas metodologias geral-
mente envolvem o conhecimento das propriedades fsico-qumicas
do eluente, solvente e substncia (ou extrato) envolvidos e as tcni-
cas decerto visam a reduo de custo, uma vez que metodologias
mais eficientes so mais caras.
Durante os ltimos anos temos trabalhado com alcalides
oxaporfnicos da famlia Annonaceae11, classe de compostos bas-
tante comuns nessa famlia1, os quais apresentam amplo espectro
de atividades biolgicas e farmacolgicas. Por outro lado, a estru-
tura totalmente planar e a baixa diversificao encontrada no pa-
dro de substituio permitiriam justificar o comportamento seme-
lhante de seus derivados frente a diferentes eluentes e suportes s-
lidos comumente utilizados (slica e alumina).
da Silva et al. Quim. Nova
De maneira geral, o comportamento do esqueleto alcalodico
em funo do pH bastante conhecido14 e geralmente til durante
o procedimento usual de extrao e purificao. Dependendo do es-
queleto alcalodico presente, tal procedimento pode compor-se de eta-
pas especficas que podem se revelar etapas-chave do procedimento
usual de extrao e purificao14. Por analogia, as informaes j
descritas sobre o comportamento do esqueleto isoquinolnico em meio
cido diludo ou concentrado foram utilizadas como modelo: a popu-
lao presente das espcies correspondentes s formas neutra e
protonada deste esqueleto (isoquinolnico e isoquinolnio) conhe-
cida e dependente de pH15. Outra informao mais especfica e refe-
rente ao esqueleto oxaporfnico que este, em meio cido, apresenta
cor avermelhada bastante intensa, que decorre da protonao de N-6
e da deslocalizao da carga positiva em todo o sistema aromtico,
causando um deslocamento batocrmico1. Com essas informaes pre-
liminares, foi possvel avaliar o comportamento dos alcalides
oxaporfnicos em diferentes solues cidas.
Os extratos alcalodicos foram obtidos pelo mtodo usual ci-
do/base de trs espcies vegetais da famlia Annonaceae: Duguetia
furfuracea, D. glabriuscula e Unonopsis lindmanii. Aps concen-
trao a vcuo, foram solubilizados em clorofrmio e submetidos
a parties sucessivas com solues cidas a 5% de cido oxlico
(pKa 1,3), cido ctrico (pKa 3,1) e cido actico (pKa 4,7), obser-
vando-se uma maior proporo de alcalides oxaporfnicos na fase
aquosa mais cida.
A partir desse resultado preliminar, foram ento confecciona-
das placas cromatogrficas em camadas delgada e preparativa de
slica-gel impregnada com cido actico, ctrico e oxlico. As pla-
cas impregnadas com cido oxlico mostraram-se satisfatrias na
separao dos alcalides oxaporfnicos, mesmo nas misturas de
substncias que apresentam o mesmo fator de reteno em placas
usuais de camadas delgada e preparativa com slica-gel (Figura 2),
resultando na separao dos seguintes alcalides: lisicamina (4) e
liriodenina (1), das cascas do caule de U. lindimanii; lanuginosina
(2), oxobuxifolina (3) e O-metilmoscatolina (5), de uma mesma
frao obtida das cascas do caule de D. glabriuscula, sendo que 5
foi isolado pela primeira vez nessa espcie vegetal; aterospermidina
(6) e 1, foram separadas dos ramos areos de D. furfuracea, embo-
ra para esta espcie tenha sido utilizada cromatografia em coluna
com gradiente de solvente (CHCl3: MeOH, aditivada com 0,5% de
HCl), sendo as estruturas elucidadas a partir de dados espectrais de
RMN 1H em comparao com os encontrados na literatura16.
O comportamento observado para esses alcalides no suporte mais
cido foi muito similar ao observado para o modelo isoquinolnico j
citado, no qual a maior populao de espcie protonada pode ser en-
contrada em pH mais cido, dessa forma favorecendo a reteno dos
mesmos no suporte utilizado. A diferena no fator de reteno (Rf)
entre os alcalides oxaporfnicos 1-5, no suporte cido (Figura 2),
poderia ser funo do padro de substituio presente em cada repre-
sentante. O padro de substituio nas posies C-1, C-2 e C-3 do
anel A contribui de maneira distinta para o valor de pKa e seria um
fator determinante, se presente isoladamente. A insero de um
substituinte metoxila na posio C-2 poderia produzir, por exemplo,
um incremento de 0,5 unidade de pKa, quando comparado ao pKa de
um derivado com substituinte na posio C-1 ou C-3, ou mesmo com-
parado com derivados sem substituintes nessas posies17. Esse efei-
to sobre pKa, possivelmente ocorre pela contribuio na estabiliza-
o da carga, que o substituinte pode proporcionar. Todos os alcalides
apresentaram um padro de substituio muito semelhante no anel
A, e a variao que poderia ocorrer nessa contribuio seria em fun-
o do impedimento estrico entre os substituintes, uma vez que to-
das as substncias analisadas apresentam dois ou mais substituintes
nas posies C-1, C-2 e C-3. Os compostos 3 e 5 apresentam
Vol. 30, No. 8 Isolamento e avaliao da atividade citotxica de alguns alcalides oxaporfnicos
substituintes nas posies C-1, C-2 e C-3 e 4 as tem em C-1 e C-2,
sendo alguns destes grupos volumosos (-OCH3), o que dificultaria a
coplanaridade do substituinte em C-2 e, conseqentemente, a contri-
buio dessa posio na estabilizao da carga em N-6 seria menor.
J em 1 e 2, cujo substituinte nas posies C-1 e C-2 um grupo
metilenodioxila, a formao de um anel de cinco membros, que
mais rgido, favorece a coplanaridade.
Parte terica
Com o estudo qumico terico das propriedades eletrnicas des-
ses alcalides foi possvel obter informaes que tambm possam
contribuir para o esclarecimento do processo de separao em slica-
gel impregnada com cido oxlico, pois as diferenas mnimas ob-
servadas frente ao padro de substituio, que dificultam o isola-
mento e purificao em suportes normais, podem afetar considera-
velmente as propriedades eletrnicas. Com o pacote Gaussian 03 foi
utilizado o mtodo semi-emprico AM1 para uma primeira
otimizao. Posteriormente, para o refinamento dos clculos, utili-
zou-se o ab initio DFT/B3LYP/6-31g**, para obteno da densidade
de carga total de 1, 2, 3, 4 e 5. Atravs das imagens geradas pelo
pacote Hyperchem, com o qual se obteve uma viso qualitativa do
tema (Figura 3), observa-se a participao eletrnica do par de el-
trons do nitrognio na ressonncia do sistema anelar, o que reduziria
a disponibilidade deste para protonao perante o cido oxlico.
Figura 3. Densidade de carga total dos alcalides oxaporfnicos apresentadas
atravs das distribuies das nuvens eletrnicas sobre os tomos das
molculas
Foi possvel tambm otimizar e analisar18 as propriedades ele-
trnicas e termodinmicas. Ficou demonstrado atravs do clculo
terico ab initio, que mais quantitativo, que a afinidade protnica
praticamente a mesma (250 kcal mol1) para todos os alcalides,
exceto O-metilmoscatolina, com valor um pouco menor (243,2 kcal
mol1), mostrando uma menor liberao de energia ao ser protonada.
Atividade citotxica
As atividades biolgicas e farmacolgicas de alcalides aporfinides
constituem um tema de avaliao e discusso, sendo bastante explora-
das as potencialidades desses compostos como agentes citotxicos e
antitumorais. A relao estruturaatividade dos aporfinides geralmente
envolve o padro de substituio2,3 e, em especial, quando se conside-
ram os oxaporfnicos, a planaridade da molcula com relao aos de-
mais alcalides aporfinides motivo de destaque. Como j mencio-
1811
nado, h diferena na interao direta sobre o DNA de alcalides
aporfnicos e oxaporfnicos, o que exemplificado pela dicentrina e
liriodenina, respectivamente, sendo que, para esta ltima sugere-se ser
mais eficiente devido a sua estrutura mais planar8. A planaridade dos
oxaporfnicos ocorre em funo da carbonila em C-7, que favorece a
extenso da conjugao no sistema aporfnico.
O padro de substituio no anel A considerado fundamental.
Por exemplo, a insero de substituintes do tipo 1,2-metilenodioxila
em alcalides oxaporfnicos contribui para a atividade citotxica
desses alcalides, embora tambm tenha sido demonstrada uma
baixa seletividade, como ocorre com a liriodenina, enquanto a
asteropermidina, com substituintes em C-1, C-2 e C-3, mais se-
letiva2.
No presente trabalho, dos seis alcalides citados, quatro (1, 2, 4 e
5) foram testados contra clulas Hep2 (ATCC-CCL 23, de carcinoma
de laringe), as quais se mostraram mais sensveis ao alcalide 5, que
apresentou menor carter bsico. A Figura 3 mostra a densidade de
carga total dos alcalides oxaporfnicos, representada atravs das dis-
tribuies das nuvens eletrnicas sobre os tomos das molculas, com
maior densidade de carga sobre N-6 de 5, em comparao com os de-
mais alcalides. A O-metilmoscatolina poderia estar mais sujeita li-
gao covalente que inica, o que poderia explicar o efeito citotxico
apresentado por esse alcalide (Tabela 1).
Tabela 1. Efeito citotxico (CI 50 ) em M dos alcalides
oxaporfnicos em clulas Hep2 em 24 h.
Substncias CI50 Intervalo de
M confiana 95% M
Liriodenina (1) 44,3 39,1-50,3
Lanuginosina (2) 61,1 55,7-67,1
Lisicamina (4) 103,6 0097,5-110,10
O-metilmoscatolina (5) 12,4 9,3-16,6
Cisplatina 18,0 13,9-23,5
CI50: dose eficaz que inibe 50% do crescimento celular (M) (n = 3);
Probit Analysis.
PARTE EXPERIMENTAL
Marcha qumica para alcalides
O extrato alcalodico de cada espcie vegetal foi obtido da
maneira usual, ou seja, 100 g de planta foram submetidas
macerao em NH4OH a 10%, seguida da adio de CHCl3, com
volume suficiente para extrao e mantido em repouso por 72 h.
Aps a decantao, procedeu-se na extrao com soluo de cido
clordrico 5% e, posteriormente, a camada cida obtida foi ajustada
at pH 8,0 e novamente extrada com CHCl3. Os extratos alcalodicos
obtidos foram solubilizados em clorofrmio e submetidos parti-
o com solues 5% de diferentes cidos (com variao de pKa):
ctrico, actico e oxlico.
Cromatografia em camada preparativa de slica-gel
impregnada com cido oxlico
Inicialmente, as placas cromatogrficas foram confeccionadas
com slica-gel e soluo 5% dos cidos ctrico, actico e oxlico.
Para a produo de uma placa preparativa 20 cm 20 cm, com espes-
sura de 1,0 mm, utilizaram-se 20 g de slica-gel 60G, 2 g de slica-gel
GF254 (Type 60) (ambas Merck) e 55 mL de soluo desses cidos a
5%. As placas foram mantidas em local protegido de correntes de ar
e de luz por 24 h para secagem e posteriormente foram ativadas em
1812 da Silva et al.
estufa a 110 C por 1 h. (Cuidado! Vapores txicos.)
O mesmo procedimento foi utilizado nas placas de slica-gel
impregnadas com diferentes concentraes de cido oxlico, sendo
mais eficazes para a separao dos alcalides oxaporfnicos aque-
las que apresentaram concentrao de 12,1% p/p.
Cromatografia em coluna
Uma mistura dos alcalides 1 e 6 (15 mg) foi submetida a nova
separao em slica-gel (25 g), utilizando como eluente
CHCl3:MeOH em gradiente de polaridade, juntamente com 0,5%
de HCl concentrado. Foram recolhidas 22 fraes, verificando-se
que as fraes 5-8 (3 mg) consistiam no alcalide aterospermidina
(6) e as fraes 19-21 em liriodenina (1) (7 mg).
Liriodenina (1): 7,0 mg, slido cristalino amarelo, com baixa
solubilidade em CHCl3. Os dados de 1H RMN (300 MHz, CDCl3)
esto de acordo com os descritos na literatura16.
Lanuginosina (2): 9,2 mg, slido cristalino alaranjado, com
baixa solubilidade em CHCl3. Os dados de RMN de1H (300 MHz,
CDCl3) esto de acordo com os descritos na literatura16.
Oxobuxifolina (3): 2,0 mg, slido amarelo-escuro. Os dados
espectrais de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) esto de acordo com
os descritos na literatura19.
Lisicamina (4): 7,0 mg, slido cristalino amarelo, com baixa
solubilidade em CHCl3. Seus dados de RMN de 1H (300 MHz,
CDCl3) foram confirmados pelos descritos na literatura19.
O-metilmoscatolina (5): 10,3 mg, slido cristalino alaranjado,
solvel em CHCl3, RMN de 1H (300 MHz, CDCl3): 9,09 (1H, d,
J= 8,0 Hz, H-11), 8,95 (1H, d, J= 5,3 Hz, H-5), 8,56 (1H, d, J= 8,0
Hz, H-8), 8,20 (1H, d, J = 5,3 Hz, H-4), 7,73 (1H, m, H-10), 7,53
(1H, m, H-9), 4,18 (3H,s, OCH3 em C-3), 4.09 (3H,s, OCH3 em C-
1), 4,0 (3H,s, OCH3 em C-2)20.
Aterospermidina (6): 3,0 mg, cristais alaranjados. Os dados
espectrais de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) esto de acordo com os
descritos na literatura16.
Ensaio de citotoxicidade em linhagens de clulas tumorais
A inibio do crescimento celular, um indicador da citotoxicidade
causada pelas substncias que esto sendo avaliadas quanto ativida-
de antineoplsica, foi medida utilizando o mtodo MTT [3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide], essencialmen-
te conforme descrito20. Este um sal solvel de tetrazlio, e somente
clulas vivas so capazes de reduz-lo a um produto colorido insol-
vel, o formazan, que pode ser medido aps sua dissoluo com DMSO.
Clulas Hep2 (ATCC-CCL 23, carcinoma de laringe) foram
semeadas em placas de 96 cavidades (100 000 clulas/mL) e
mantidas em meio de cultura DMEM a 37 C em incubadora com
5% de CO2. Aps 24 h o meio foi removido para adio das subs-
tncias-teste e do controle positivo (cisplatina, Sigma). A concen-
trao de cada substncia variou de 1 a 50 g/mL, sendo cada uma
da quatro concentraes adicionadas em triplicata. Ao final da ex-
posio de 24 h, o meio foi substitudo por meio de cultura fresco
contendo MTT (concentrao final: 1,0 mg/mL) e as placas foram
incubadas por mais 4 h.
Ao final, o produto formazan foi dissolvido em DMSO durante
10 min e a absorbncia foi determinada a 570 nm com leitor de
microplacas (Rosys Anthos 2001).
A concentrao que inibe 50% do crescimento celular (CI50)
foi calculada com o programa Probitos21, a partir das diferenas de
leitura de absorbncia entre clulas no-tratadas (controle negati-
vo) e tratadas (substncia-teste).
Quim. Nova
AGRADECIMENTOS
FUNDECT/MS e PROPP-UFMS, pelo financiamento do pro-
jeto. As bolsas foram fornecidas pelo FUNDECT-CNPq. R. R. de
Oliveira (bolsista de apoio tcnico, CNPq), pelo suporte tcnico
durante a parte experimental do estudo. Agncia Estadual de
Defesa Sanitria Animal e Vegetal (IAGRO) e ao Departamento de
Morfofisiologia, CCBS, UFMS, por cederem os equipamentos. Ao
Prof. Dr. A. E. da H. Machado, do Laboratrio de Fotoqumica,
UFU, por disponibilizar o pacote Hyperchem para gerao das figu-
ras.
REFERNCIAS
1. Cav, A.; Leboeuf, M.; Waterman, P. G. Em Alkaloids: Chemical and
Biological Perspectives; Pelletier. S. W., ed.; John Wiley & Sons: Nova
Iorque, 1987, vol. 5; Leboeuf, M.; Cav, A.; Bhaumik, P. K.; Mukherjee,
B.; Mukherjee, R.; Phytochemistry 1982, 21, 2783.
2. Stvigny, C.; Bailly, C.; Quentin-Leclercq, J.; Curr. Med. Chem. 2005, 5, 173.
3. Boustie, J.; Stigliani, J-L.; Montanha, J.; Amoros, M.; Payard, M.; Girre,
L.; J. Nat. Prod. 1998, 61, 480.
4. Sonnet, P. E.; Jacobson, M.; J. Pharm. Sci. 1971, 60, 1254; Wu, Y. C.; Chen,
C. H.; Yang, T. H.; Lu, S. T.; McPhail, D. R.; McPhail, A. T.; Lee, K. H.;
Phytochemistry 1989, 28, 2191; Wijeratne, E. M. K.; Gunatilaka, A. A. L.;
Kingston, D. G. I.; Haltiwanger, R. C.; Eggleston, D. S.; Tetrahedron 1995,
51, 7877; Castro, I.; Villegas, J. R.; Soeder, B.; Castro, O.; Fitoterapia 1996,
67, 181; Guinaudeau, H.; Leboeuf, M.; Cav, M.; J. Nat. Prod. 1975, 38, 275.
5. Chen, K. S.; Ko, F. N.; Teng, C. M.; Wu, Y. C.; Planta Med. 1996, 62, 133.
6. Hufford, C. D.; Funderburk, M. J.; Morgan, J. M.; Robertson, L. W.; J.
Pharm. Sci. 1975, 64, 789; Hufford, C. D.; Sharma, A. S.; Oguntimein,
B. O.; J. Pharm. Sci. 1980, 69, 1180; Nieto, M.; Cav, A.; Leboeuf, M.; J.
Nat. Prod. 1976, 39, 350.
7. Barreiro, E. J.; Fraga, C. A. M.; Qumica Medicinal: As Bases Moleculares
da Ao de Frmacos, 1 ed., Artmed: Porto Alegre, 2002.
8. Woo, S. H.; Reynolds, M. C.; Sun, N. J.; Cassady, J. M.; Snapka, R. M.;
Biochem. Pharmacol. 1997, 54, 467; Woo, S. H.; Sun, N. J.; Cassady, J.
M.; Snapka, R. M.; Biochem. Pharmacol. 1999, 57, 1141.
9. Wijeratne, E. M. K.; Hatanaka, Y.; Kikuchi, T.; Tezuka, Y.; Gunatilaka, A.
A. L.; Phytochemistry 1996, 42, 1703.
10. Wu, Y. C.; Chang, G. Y.; Duh, C. Y.; Wang, S. K.; Phytochemistry 1993,
33, 497.
11. de Siqueira, J. M.; Ziminiani, M. G.; Resende, U. M.; Boaventura, M. A.
D.; Quim. Nova 2001, 24, 185; de Siqueira, J. M.; Bomm, M. D.; Pereira;
N. F. G.; Garcez; W. S.; Boaventura, M. A. D.; Quim. Nova 1998, 21, 557.
12. Stahl, E.; Thin-Layer Chromatography: A Laboratory Handbook, 6a reimp.
da 2a ed., Springer-Verlag: New York, l990; Wagner, H.; Bladt, S.; Plant
Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, 2nd ed., Springer: New
York, 1996.
13. Djilani, A.; Legseir, B.; Soulimani, R.; Dicko, A.; Younos, C.; J. Braz.
Chem. Soc. 2006, 17, 518.
14. Paris, M.; Hurabielle, M.; Abrg de Matire Mdicale (Pharmacgnosie)-
Tome I : Gnralits Monographies 1re Partie, Ed. Masson: Paris, 1981,
p. 261-265; Henriques, A. T.; Limberger, R. P.; Kerber, V. A.; Moreno, P.
R. H. Em Farmacognosia da Planta ao Medicamento; Simes, C. M. O.;
Schenckel, E. P.; Gosmann, G.; de Mello, J. C. P.; Mentz, L. A.; Petrovick,
P. R., orgs.; 5 ed., UFSC & UFRGS: Florianpolis Porto Alegre, 2003.
15. Schulman, S. G.; Capomacchia, A. C.; J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 2763.
16. Guinaudeau, H.; Leboeuf, M.; Cav, A.; J. Nat. Prod. 1994, 57, 1033;
Guinaudeau, H.; Leboeuf, M.; Cav, A.; J. Nat. Prod. 1988, 51, 389;
Guinaudeau, H.; Leboeuf, M.; Cav, A.; J. Nat. Prod. 1975, 38, 304.
17. Zielinski, W.; Kudelko, A.; Arkivoc 2005, 5, 66.
18. Gven, A.; gretir, C.; J. Molec. Struct. (Theochem) 1998, 434, 7; Kallies,
B.; Mitzner, R.; J. Molec. Struct. (Theochem) 1998, 428, 267; Tran, N. L.;
Colvin, M. E.; J Molec. Struct. (Theochem) 2000, 532, 127.
19. Harrigan, G. G.; Gunatilaka, A. A. L.; Kingston, D. G. I.; Chan, G. W.;
Johnson, R. K.; J. Nat. Prod. 1994, 57, 68.
20. Mosmann, T.; J. Immunol. Methods. 1983, 65, 55.
21. Finney, D. J.; Probit Analysis, Cambridge University Press: Cambridge,
1971, 3rd ed.